Mikrobiální a molekulární ekologie lidského střeva, probiotika, prebiotika

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie Mikrobiální a molekulární ekologie lidského střeva, probiotika, prebiotika (Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie směr Mikrobiologie) Petra Vídeňská Brno, 2008

2 Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucí mé bakalářské práce doc. RNDr Aleně Španové, Csc za poskytnutí potřebné literatury, cenných rad a za čas, který mi věnovala.

3 Obsah 1. Seznam použitých zkratek: Úvod Cíl práce GIT a jeho mikroflóra Mikroflóra v gastrointestinálním traktu Vývoj mikroorganizmů v gastrointestinálním traktu Funkce tlustého střeva Prebiotika a prebiotika Probiotika Prebiotika Molekulární a mikrobiální ekologie lidského střeva Strategie výzkumu za použití sond Využití tečkové (dot-blot) analýzy Fluorescenční hybridizace in situ (FISH) Další metody využívající sondy Analýzy mikrobiálních společenstev založené na PCR DGGE Využití DGGE DGGE a knihovna klonů Kvantitativní PCR (qpcr) Využití qpcr DNA čipy Probiotika a prebiotika u chorob GIT Akutní gastroenteritidy Rotavirové infekce Postantibiotická kolitida způsobená C. difficile Gastroenteritidy spojené s výskytem Helicobacter pylori Chronické gastroenteritidy Rakovina tlustého střeva

4 Ulcerózní kolitida Crohnova choroba Diskuze Závěr Seznam literatury

5 1. Seznam použitých zkratek: CD (crohn s disease) crohnova choroba CDAD (Clostridium difficile associated disease) průjem způsobený Clostridium difficile CDCE (constant denaturant capillary electrophoresis) konstantní denaturační kapilární elektroforéza CqPCR (competitive quantitative PCR) PCR s kvantitativně kompetitivním stanovením DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) denaturační gradientová gelová elektroforéza Dot blot hybridizace tečková EGF (epidermal growth factor) epidermální růstový faktor EPEC (enteropathogenic E. coli) enetropatogenní E. coli FAO (Food and agriculture organization) Organizace spojených národů pro výživu a zemědělství FISH (fluorescence In situ hybridization) fluorescenční hybridizace in situ FOS fruktooligosacharidy GBF (germinated barley foodstuff) mladý ječmen GIT gastrointestinální trakt GOS galaktooligosacharidy IBD (inflammatory bowel dinase) idiopatické střevní záněty LDL (low density lipoprotein) cholesterol s nízkou hustotou NDO (nondigestible oligosaccharides) nestravitelné oligosacharidy qpcr (quantitative PCR) kvantitativní PCR RFLP (restriction fragment length polymorphic) polymorfizmus délky restrikčních fragmentů SCFA (short chain fatty acid) mastné kyseliny s krátkými řetězci TGGE (temperature-gradient gel electrophoresis) teplotní gradientová gelová elektroforéza UC (ulcerative colitis) ulcerózní koltida WHO (World health organization) Světová zdravotnická organizace 5-ASA 5-aminosalicylová kyselina 5

6 2. Úvod Probiotika a prebiotika provází lidskou společnost již tisíciletí. Mléčným fermentovaným výrobkům se už dříve přičítala schopnost prodloužit život. Podle archeologických výzkumů je také nyní zřejmé, že naši předci konzumovali v různém poměru rostliny obsahující prebiotika, která jsou důležitou složkou lidské stravy mnoho století (Gibson a Rastall, 2006). Už před 9000 lety byly cíleně pěstovány v severní Americe rostliny s velkým podílem prebiotik, jako jsou například agáve (Agave spp.), sotol (Dasylirion spp., rostlina pocházející z Ameriky) a divoká cibule (Alium spp.). Jelikož je v současnosti v západních zemích jídla dostatek, začíná být vnímáno jako něco víc, než jen zdroj energie. V mnoha zemích narůstá počet obyvatel, zvyšuje se životní úroveň a z toho vyplývá i vyšší zájem o zdravotní péči. Také roste povědomí o správné výživě, která může pomoci v boji s nemocemi hlavně u stárnoucí populace. Jedná se o nemoci, které souvisejí se životním stylem, jako jsou například různé alergie, diabetes, osteoporóza, kardiovaskulární onemocnění a rakovina. V souvislosti s těmito poznatky vznikl koncept tzv. funkčních potravin. Ty jsou charakterizovány jako složky stravy, které mají příznivý účinek na fyziologickou aktivitu organismu hostitele, a tedy nejsou jen základními živinami, ale jsou také zdraví prospěšné (Milner, 2002). V České republice zatím nebyl termín funkční potravina zaveden do legislativy. Mezi funkční potraviny patří potraviny obsahující probiotika a prebiotika. Produkty dostupné na trhu jsou například mléčné výrobky, dětská výživa, cereálie, pekařské výrobky, masné výrobky, instantní potraviny a doplňky stravy. Protože probiotika a prebiotika mají pozitivní vliv nejen na lidi, ale i na zvířata, začínají se objevovat i jim určená funkční krmiva. Využití probiotik a prebiotik při léčbě různých nemocí se zdá být slibné. Nicméně jsme teprve na počátku jejich uvedení do praxe a zatím známe jen některé jejich možnosti. Musíme nejdříve sekvencovat a analyzovat genom probiotik a v tom nám pomáhají stále se velmi dynamicky rozvíjející molekulární metody. Ty jsou nezbytné ke studiu nejen probiotik a hledání genů kódujících probiotické vlastnosti, ale i k poznání lidské střevní mikroflóry. Můžeme sledovat dopad aplikací probiotických a prebiotických preparátů na jedince a z toho vyvozovat patřičné závěry, což jsme předtím pouze s pomocí kultivačních metod nemohli. 6

7 3. Cíl práce Cílem této práce je seznámit čtenáře s mikroflórou gastrointestinálního traktu (GIT), zhodnotit používané přístupy, shrnout současné znalosti o mikrobiální ekologii lidského střeva a nastínit budoucí cesty výzkumu GI mikroflóry (včetně možností jejího ovlivnění) a jejího kladného působení na hostitelovo zdraví. Dále práce shrnuje základní informace o probiotikách a prebiotikách a jejich využití při léčbě či prevenci různých nemocí s tím, že podrobněji jsou uvedené některé choroby, u nichž mají probiotika a prebiotika velkou budoucnost. 7

8 4. GIT a jeho mikroflóra 4.1. Mikroflóra v gastrointestinálním traktu GIT je pro člověka významný ze 3 důvodů. Prvním je příjem potravy, dále následuje zpracování potravy a nakonec vstřebávání živin. Z hlediska mikrobiologického osídlení nás nejvíce zajímají tyto části: žaludek, tenké střevo a tlusté střevo. Jsou to tři anatomicky velmi odlišné části GIT s rozdílným chemicko-fyzikálním prostředím, které ovlivňuje výskyt přirozené mikrobiální populace (obr.1) (Holzapfel a kol., 1998; Rabiu a Gibson, 2002). Obr.1 Výskyt přirozené mikrobiální populace v GIT (upraveno podle V žaludku zdravého jedince je velmi nízké ph, navíc je zde potrava přítomna jen krátkou dobu, takže osídlení bakteriemi je minimální (Guarner a Malagelada, 2003). Nejznámější bakterií přežívající v žaludku je hlavně díky své patogenezi Helicobacter pylori. Je velmi pohyblivý pomocí mnoha unipolárních bičíků. Je usídlen mezi sliznicí žaludku a hlenovou vrstvou, která jej chrání proti působení nízkého ph. 8

9 Žluč, pankreatická šťáva a jiné sekrety tenkého střeva spolu s žaludeční šťávou inhibují většinu bakterií v duodenu a jejunu. Lze zde nalézt laktobacily a streptokoky. Populace bakterií dosahuje v této části GIT buněk na mililitr obsahu. Nicméně pomalá motilita distální oblasti tenkého střeva a nízké ph umožňuje vyšší mikrobiální kolonizaci ilea. Je osídlené řadou bakteriálních rodů a obsahuje 10 6 až 10 8 bakteriálních buněk na mililitr obsahu (Gibsona a Rastall, 2006). Navíc je zde větší diverzita bakterií než v horní části GIT (žaludku, duodenu a jejunu). Vyskytují se zde obligátní anaeroby, G - fakultativně-anaerobní bakterie, laktobacily a enterokoky. Nejvíce je bakteriemi osídleno tlusté střevo, kde se tráví strava asi 55-77h (u zdravého jedince) (Macfarlane a kol., 1998; Bourlioux a kol., 2003). V tlustém střevě je neutrální ph, nižší rychlost toku a hojné zásobení živinami, což je důvod extrémního osídlení tlustého střeva mikroorganismy. Hustota osídlení zdravého dospělého jedince přirozenou mikroflórou dosahuje až bakteriálních buněk na gram obsahu (Guarner a Malagelada, 2003). Také mikrobiální diverzita je velká až na padesát různých bakteriálních rodů s více než 400 druhy (Ziemer a Gibson, 1998). Na obr. 2 je uveden fylogenetický strom dominantních druhů fekální mikroflóry. Nejvíce jsou v tlustém střevě zastoupeny nesporulující obligátní anaeroby (Gibson a Roberfroid, 1995). 30% z kultivovatelných bakterií jsou bakteroidy, dále jsou nejvíc zastoupeny eubakterie a bifidobakterie (Gibson a Rastall, 2006). Další součástí střevní mikroflóry jsou jak obligátní anaeroby, tak i fakultativní anaeroby, jako jsou peptostreptokoky, fusobakterie, laktobacily, enterobakterie, enterokoky, methanogeny a síru redukující bakterie (Tuohy a kol., 2001). Fakultativně anaerobní, gram pozitivní streptokoky jsou reprezentovány např. Streptococcus faecalis, S. bovis, S. equinus, a S. salivarus, který bývá izolován z úst (Gibson a Roberfroid, 1995). Mezi přítomné G- anarobní koky patří Veillonella a Acidaminococcus. 9

10 Obr. 2 Fylogenetický strom dominantních druhů fekální mikroflóry u zdravých dospělých jedinců. Data byla získána pomocí sond cílených na 16S rrna. (upraveno podle Walker a kol., 2006) Střevo také osídlují sporotvorné bakterie. Asi nejběžnějším rodem je Clostridium, hlavně Clostridium perfringens (Gibson a Roberfroid, 1995). Ačkoliv tento rod představuje jen malou součást mikroflóry, zahrnuje významné střevní patogeny. Rody z čeledě Enterobacteriaceae, zejména E. coli, jsou obvykle typické střevní bakterie, ale také se zde vyskytují patogenní zástupci významní v humánní medicíně (Gibson a Rastall, 2006). Poměrně nedávno byl ustanoven nový pojem mikrobiom, který je definován jako suma genů všech mikrobiálních druhů, které kolonizují střevo. Obsahuje odhadem stokrát více genů než má vlastní lidský genom. Bakterie v trávicím traktu mohou mezi sebou komunikovat (vnitrodruhová komunikace). Využívají k tomu tzv. quorum sensing a látky podobné hormonům (autoinducery). Tento signální systém umožňuje bakteriím mezi sebou koordinovaně regulovat expresi svých genů. Tím mohou synchronizovat své chování a chovat se v mnoha ohledech jako mnohobuněčný organizmus. Je pravděpodobné, že signální systém quorum sensing je schopen jisté míry komunikace s epitelovými buňkami hostitele (tzv. cross talk, mezidruhová komunikace, pozorována byla například mezi probiotikem a epiteliálními buňkami střeva) (obr 3) (Krejsek a kol., 2007b). 10

11 Obr. 3 Buněčné interakce ve střevě (upraveno podle Walker a kol., 2006) 4.2. Vývoj mikroorganizmů v gastrointestinálním traktu Složení a četnost mikroflóry lidského tlustého střeva ovlivňuje mnoho rozmanitých faktorů, jako jsou například genetické faktory hostitele, způsob porodu, zralost plodu při narození, délka kojení, strava, věk, zdraví, prostředí a buněčné interakce (mezi hostitelem a bakteriemi stejně jako mezi bakteriemi navzájem). Další faktory podílející se na složení mikroflóry ve střevě jsou shrnuty v tab. 1. Komplexnost a dynamika přirozené mikroflóry také hraje důležitou roli v lidském zdraví. Poskytuje totiž ochranu proti přerůstání alochtonních mikroorganismů (mohou způsobit onemocnění) a stimuluje imunitní systém (Gibson a Rastall, 2006). Bakterie osidlují lidské střevo krátce po narození v závislosti na způsobu porodu. U dětí narozených císařským řezem se GIT osidluje a střevní mikroflóra rozvíjí později než u dětí porozených přirozenou cestou (Grönlund a kol., 1999; Mackie a kol., 1999). U předčasně narozených dětí s nízkou porodní váhou je podle současných výzkumů GIT osídlen se zpožděním a zastoupení mikroorganizmů je v neonatální mikroflóře odlišné. Sedmileté děti narozené císařským řezem mají ve střevní mikroflóře větší zastoupení klostridií než přirozeně porozené dětí stejného věku i pohlaví (Salminen a kol., 2004). Kolonizaci střeva lze rozlišit do pěti fází. Neonatální mikroflóra se skládá zpočátku hlavně z fakultativních anaerobů, které pocházejí z mateřské vaginální a fekální bakteriální flóry (fáze 1, primární kolonizace). Snižují redox potenciál ve střevě, což umožňuje kolonizaci obligátními anaeroby, jako jsou bifidobakterie, bakteroidy a klostridia (fáze 2). 11

12 Novorozenecká strava má během fáze 2 základní úlohu nejen pro získání fekální mikroflóry, ale ovlivňuje i její složení a vývoj (Mountzouris a kol., 2002). Tab. 1 Faktory podílející se na složení mikroflóry ve střevě (upraveno podle Fooks a kol., 1999) Typ stravy Množství, chemické složení a dostupnost růstových substrátů Dostupnost kolonizačních míst Imunologické interakce Způsob bakteriální fermentace Rychlost trávení Hodnota ph ve střevě Redox potenciál Dostupnost anorganických elektronových receptorů Produkce bakteriálních metabolitů Přítomnost antimikrobiálních látek Xenobiotické látky Peristaltika Bylo publikováno mnoho prací, ve kterých se srovnávala fekální mikroflóra u dětí krmených mateřským mlékem a kojeneckou výživou. Většina těchto prací zahrnuje data získaná kultivačními metodami, ale novější práce využívají molekulárně biologické metody. Mezi výsledky jednotlivých autorů jsou rozdíly, ale všichni se shodují na tom, že je u zkoumaných dvou skupin rozdílná fekální mikroflóra. Děti krmené moderními kojeneckými výživami, které obsahují prebiotika, mají podobnější střevní mikroflóru jako děti kojené mateřským mlékem (Boehm a kol., 2002). Rozdíly mezi jednotlivými studiemi jsou nejspíše způsobeny různou metodologií (získávání a manipulace se vzorky, kultivace a identifikační strategie), faktory prostředí (například geografické, kulturní nebo sociálně-ekonomické rozdíly) nebo kojeneckou výživou. Základní zjištění je, že u dětí krmených výhradně mateřským mlékem (nebo kojeneckou výživou s prebiotiky) se vyskytuje mikroflóra, kde dominují bifidobakterie (ve fázi 2), zatímco u dětí krmených standardní výživou se rozvíjí mikroflóra různorodá (Gibson a Rastall, 2006). Třetí fáze bakteriálního osídlení kojeneckého GIT je spojeno se začátkem příjmu pevné stravy. U dětí krmených mateřským mlékem se změní mikrobiální zastoupení v mnohem různorodější populaci, která se podobá zastoupení u dětí krmených kojeneckou 12

13 výživou ve fázi 2. Predominantní skupinou se stávají bakteroidy (Mackie a kol., 1999). Fáze 4 je spojena s dosažením obdobného složení mikroflóry, jako mají dospělí. Kolonizace během 5 fáze zatím není zcela objasněna a dochází k ní v pozdějších letech života. Gorbach a kol. prokázali, že střevní mikroflóra starších lidí obsahuje nižší zastoupení bifidobakterií a vyšší zastoupení enterobakterií a kvasinek než u dospělých (Gorbach a kol., 1967 v Gibson a Rastall, 2006). Mitsuokovy výsledky potvrzují, že tyto mikrobiální změny nastávají ve vyšším věku (Mitsuoka, 1992 v Gibson a Rastall, 2006). Poslední studie využívající 16S rrna analýzu ukazují, že střevní mikroflóra starších lidí je různorodější než u mladších lidí (Saunier a Doré, 2002). Tyto výsledky mohou mít přímý dopad na zdraví ve stárnoucí populaci Mohou pomoci vysvětlit, proč vzrůstá riziko vzniku GI infekcí a chronických onemocnění (jako je rakovina tlustého střeva, která má přímou souvislost se zvyšujícím se věkem) Funkce tlustého střeva Člověk žije v úzkém kontaktu s ohromným množstvím mikroorganismů, které jsou přítomny na kůži, v ústech a v GIT. V lidském těle se nachází asi 1kg mikroorganismů. Tělo má 20 krát více bakteriálních buněk než lidských. Nejvíce mikroorganizmů se nachází v tlustém střevě (viz 4.1). Dříve se předpokládalo, že hlavní funkce tlustého střeva je vstřebávání vody a solí a že slouží pouze jako místo k uskladnění odpadního materiálu z potravy. Dnes už víme, že má i mnoho jiných důležitých biologických funkcí. Příkladem může být aktivní transport sodných a chloridových iontů, pravděpodobně sodík za vodík a chlorid za uhličitan (Gibson a Rastall, 2006). Dále absorbuje produkty bakteriální fermentace, jako jsou mastné kyseliny s krátkými řetězci (SCFA), amoniak a další metabolity (tab. 2). Sliznice tlustého střeva také vylučuje sekret, který je potencionálním zdrojem hormonů a neuropeptidů, které se podílejí na lokálním řízení střevních funkcí (Gibson a Rastall, 2006). Tlusté střevo a přirozená mikroflóra přispívají k lepšímu trávení složek potravy, jako jsou škroby, rostlinné polysacharidy a proteiny, které nejsou stráveny a neabsorbují se v tenkém střevě. Voda, nestrávená potrava a endogenní zdroje živin postupují z tenkého střeva do vzestupného tračníku a jsou pro zde sídlící bakterie bohatým zdrojem živin. Bakterie se zde množí velmi rychle a produkce SCFA snižuje střevní ph. Jak střevní obsah postupuje tlustým střevem, tak sacharidy a jiné bakteriální substráty jsou vyčerpávány, snižuje se hladina kyselosti a ph se blíží k neutrálnímu (Gibson a Rastall, 2006). 13

14 Pomocí tzv. bezmikrobních (germfree) zvířat lze sledovat, jak střevní mikroflóra ovlivňuje celkovou homeostázi organismu (Tannock, 1998). Experimenty ukázaly, že biochemické, fyziologické a imunologické vlastnosti silně souvisí se složením mikroflóry ve střevě. Dietetické faktory, jako jsou probiotika a prebiotika, ovlivňují a regulují složení střevní mikroflóry a pomáhají snížit počet patogenních bakterií kompetitivní okluzí. Dále mohou pomoci hostiteli posílit imunitní systém a ustanovit homeostázi (Roberfroid, 2001). Tab. 2 Dominantní produkty metabolismu sacharidů v lidském tlustém střevě (upraveno podle Gibson, 1999) Konečný produkt Acetát Příslušné bakterie Bakteroidy, bifidobakterie, eubakterie, laktobacily, klostridia,ruminokoky, peptokoky, veillonelly, peptostreptokoky, propionibakterie, fusobakterie, butyvibrio Osud metabolitu Je metabolizován ve svalech, ledvinách, srdci a mozku Propionát Bakteroidy, proponibakterie, veillonelly Přečištěný játry může sloužit jako glukogenní prekurzor, potlačuje syntézu cholesterolu Butyrát Klostridie, fusobakterie, butyrovibrio, peptostreptokoky Je metabolizován buňkami střevního epitelu, reguluje buněčný růst a proliferaci Etanol, sukcinát, laktát, pyruvát Bakteroidy, bifidobakterie, eubakterie, laktobacily, klostridie, ruminokoky, peptostreptokoky, propionibakterie, fusobakterie, enterokoky a aktinomycety Absorpce tlustým střevem Vodík Klostridie, ruminokoky, fusobakterie Částečně je vylučován dechem, je metabolizován bakteriemi Z imunologického hlediska je střevo největším sekundárním imunitním orgánem. Podle současných názorů je klíčovým obdobím pro nastavení individuální imunitní reaktivity období těsně po narození, tj. kojenecké a batolecí období vývoje, které je ovlivňováno kvalitativním i kvantitativním složením stravy. Během tohoto období bývá nejdůležitější součástí stravy mateřské mléko obsahující rozmanité proteiny s unikátními vlastnostmi. Trávením těchto proteinů jsou rychle rostoucímu kojenci dodávány v optimální podobě aminokyseliny. Další proteiny jsou součástí enzymů, které napomáhají kojenci trávit lipidy a škroby. Význam tlustého střeva však spočívá v již zmíněném rozvoji imunitní odpovědi jedince. 14

15 Mateřské mléko obsahuje peptidy s antibakteriálními účinky, jako jsou například defenziny, které usmrcují bakterie prostřednictvím poškození cytoplazmatické membrány. Dále byly prokázány desítky látek charakteru cytokinů. Na maturaci střevní sliznice působí epidermální růstový faktor (EGF). V neposlední řadě mateřské mléko obsahuje řadu látek s prebiotickými vlastnostmi a to především oligosacharidové substance, které v kolostru dosahují podílu cca 20g/l. Toto množství se s věkem snižuje až na hladinu asi 12g/l. Individuální stravou se modeluje střevní mikroflóra jedince do tzv. osidlovacích vzorů mikroorganizmů. Průmyslově vyráběné potraviny jsou během výrobního procesu zbavovány mikroorganizmů. Člověk je při konzumaci takto připravené potravy zbaven expozice živými mikroorganizmy. I to má nepochybně negativní vliv na rozvoj individuální imunitní reaktivity. Kojení, aplikace látek s prebiotickými vlastnostmi a probiotických mikroorganizmů by mohly pozitivně ovlivnit nežádoucí trend v prevalenci imunopatologických nemocí v populaci (Krejsek a kol., 2007a). 15

16 5. Prebiotika a prebiotika 5.1. Probiotika První zaznamenané probiotikum bylo fermentované mléko. Kladné účinky fermentovaného mléka na člověka byly známé již před mnoha stoletími. Vědecký zájem o význam potravy pro zdraví člověka však nastal až po publikaci knihy nazvané Prodloužení života od Mečnikova v roce Upozornil na to, že lidé by měli konzumovat fermentované mléko, které obsahuje laktobacily, aby si prodloužili život (Suvarna a Boby, 2005). Definice probiotik se stále mění. Podle nejnovější definice jsou probiotika charakterizována jako monokultury nebo směsné kultury živých mikroorganismů, které po konzumaci prospěšně ovlivňují hostitele zlepšením vlastností jeho vlastní střevní mikroflóry. Mezi probiotika jsou v současné době řazeny laktobacily, bifidobakterie, streptokoky, enterokoky a sacharomycety. Nejčastěji používaná probiotika jsou shrnuta v tab. 3 (Nevoral, 2005). Tab. 3 Nejčastěji používaná probiotika (upraveno podle Nevoral, 2005) Laktobacily L. acidophilus L. casei, spec. rhamnosus (Lactobacillus GG) L. casei Shirota L. delbrueckii subsp. bulggaricus L. reuteri L. brevis L. cellobiosus L. curvatus L. fermentum L. plantarum Gram pozitivní koky Lactococcus lactis subsp. cremonis Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Enterococcus faecium S. diacetylactis S. intermedius Bifidobakterie B. bifidum B. adolescentis B. animalis B. infantis B. longum B. thermophilum E. coli (sérotyp O83:K24:H1) Kvasinky Saccharomyces boulardii 16

17 Probiotika mohou přinášet člověku užitek mnoha způsoby. Například při intoleranci laktózy, která je způsobená nedostatečnou aktivitou laktázy v lidském střevě. Více než polovina světové populace není schopna v dospělosti využívat laktózu a již při požití malého množství se u nich dostavují zažívací potíže. Laktóza je totiž ve střevě metabolizována bakteriemi a důsledkem je průjem, zvracení a bolesti břicha. Tito lidé lépe snášejí fermentované mléčné výrobky. Vysvětluje se to delší dobou průchodu zažívacím ústrojím a delším účinkem živých bakterií, které produkují laktázu. Toleranci k laktóze mohou zlepšit i kmeny produkující β galaktosidázu (Nevoral, 2005; Suvarna a Boby, 2005). Dále je probiotikům přisuzován i protirakovinný účinek. Epidemiologické studie ukazují, že konzumace tuků s vysokým obsahem nasycených mastných kyselin představuje zvýšené riziko kolorektální rakoviny. Na zvířecích modelech se osvědčil kmen Bifidobacterium longum. Při bakteriální fermentaci většího množství vlákniny ve střevech je produkován butyrát a SCFA, které mají protirakovinné účinky (Yuan a kol., 2004). Střevní mikroflóra je také schopna ovlivňovat tvorbu karcinomu produkcí enzymů, které zabraňují v přeměně prekarcinogenů v karcinogen. Probiotika se uplatňují i u koronárního onemocnění srdce. Podle provedených studií probiotika mohou ovlivnit koncentraci cholesterolu v plazmě a tím i incidenci onemocnění srdce. Je známo, že hladina cholesterolu je odrazem složení stravy. Probiotické bakterie významně snižují obsah LDL cholesterolu v krvi tím, že jej metabolizují jako svůj zdroj energie (např. L. casei). Velký význam pro nás mají probiotika i při střevních infekcích. Dále mohou být nápomocné při trávení některých hůře stravitelných potravin a při zažívacích potížích. Fermentované mléko obsahuje mírně odlišné živiny. Fermentační proces činí proteiny dostupnějšími proteolytické aktivitě. Pro preventivní a terapeutické využití probiotik je důležitá jejich schopnost stimulovat specifickou i nespecifickou imunitu. V tab. 4 jsou uvedeny mechanizmy možného působení probiotik (Fooks a kol., 1999). Pro zařazení mezi probiotika musí jednotlivé kmeny splňovat řadu požadavků, které jsou shrnuty v tab. 5. Bakteriální kmeny musí mít prokazatelně pozitivní vliv na zdraví hostitele a musí být zdravotně nezávadné, izolované ze stejného živočišného druhu jako je předpokládaný příjemce a nesmí být toxické ani patogenní. Forma, ve které je probiotikum podáváno musí obsahovat dostatečné množství životaschopných bakterií (Nevoral, 2005). 17

18 Tab. 4 Mechanizmy možného působení probiotik (upraveno podle Nevoral, 2005) Stabilizace střevní flóry kompeticí s patogenními mikroorganizmy o vazebná místa na receptorech a o živiny Produkce mastných kyselin s krátkými řetězci (SCFA, zvl. kyselina máselná) Pokles ph střevního obsahu Zvýšení rozpustnosti minerálních látek Omezení zpětné resorpce žlučových kyselin Stabilizace střevní slizniční bariéry, úprava střevní permeability Produkce antimikrobiálních substancí Modifikace toxinů a toxinových receptorů Zeslabení virulence Stimulace imunitní odpovědi na patogeny (zvýšená produkce sekrečního IgA, IgG, IgM, protizánětlivě působících cytokinů IL-10, TGF-β; snížená produkce prozánětlivých cytokinů TNF-α, interferonu-γ, stejně jako mediátorů zánětu např. matrixmetalloproteináz). Tab. 5 Nejdůležitější charakteristiky probiotik (upraveno podle Nevoral, 2005) Prospěšnost pro zdraví Schopnost kolonizace a adherence Antagonistický vliv na patogenní flóru Schopnost tvorby antimikrobiálních substancí Schopnost imunomodulace Měřitelná a klinicky dokumentovatelná užitečnost pro zdraví příjemce Mikrobiologické bezpečnostní požadavky Přesné taxonomické zařazení Humánní původ Netoxické a nepatogenní Geneticky stabilní Schopnost přežívat, růst a být metabolicky aktivní v trávicím ústrojí příjemce Potencionálně resistentní proti antimikrobiálním látkám původní mikroflóry příjemce Resistentní proti žaludeční kyselině a žlučovým kyselinám Průmyslové parametry Stabilita žádaných vlastností během výroby, transportu a skladování potravinového výrobku Příznivé organoleptické vlastnosti Prospěšnost pro zdraví U aplikace probiotik je zvolení dávky velmi důležitým aspektem. Při příliš nízké dávce se účinek probiotik nemusí projevit, naopak velká dávka může způsobit zažívací potíže. 18

19 Potraviny s probiotiky by měly obsahovat živých bakterií. Velikost dávky může ovlivnit i výsledky studií, kdy se stejné výsledky jako u kontroly zdůvodňují příliš nízkou dávkou probiotika (Dendukuri a kol., 2005). Probiotika mohou ou být podávána ve formě prášku, tabletek nebo kapslí, dále v tekutém stavu např. ve spreji. Nejčastější formou příjmu probiotických kultur je fermentované mléko (Fooks a kol., 1999). Při dodávání nových probiotik na trh musí být splněny ny směrnice, které byly ustanoveny roku 2002 FAO a WHO. Je to souhrn doporučených pravidel a metodických postupů vedoucích k identifikaci a charakterizaci nových probiotik. Bylo také ustanoveno, jaký by měl být minimální zdravotní přínos probiotik. Obr. 4 zobrazuje postupy, které platí pro hodnocení probiotik v potravinách (Reid a kol., 2003). Obr.4 Směrnice pro hodnocení probiotik v potravinách (upraveno podle Reid a kol., 2003) 19

20 5.2. Prebiotika Prebiotika jsou nestravitelné složky potravy, které podporují selektivně růst nebo aktivitu jednoho druhu nebo omezeného počtu druhů střevních bakterií a tím pozitivně ovlivňují složení střevní mikroflóry, čímž mají celkově pozitivní vliv na zdraví a celkovou pohodu jedince (Gibson a Roberfroid, 1995). Takovéto potravinové doplňky musí splňovat následující kritéria: odolnost proti nízkému ph v žaludku a tenkém střevě rezistence k trávicím enzymům hydrolýza a fermentace střevními bakteriemi selektivní stimulace růstu pouze limitovaného počtu prospěšných střevních mikroorganizmů Hlavním cílem prebiotik jsou bakterie mléčného kvašení a bifidobakterie, protože ovlivňují mnohé funkce tlustého střeva a stimulují imunitní systém (Fuller a Gibson, 1997). Jakákoliv nestrávená strava vstupující do tlustého střeva může být potencionálním prebiotikem (Collins a Gibson, 1999). Jedná se např. o sacharidy, jako jsou odolné škroby a vláknina z potravy, dále také proteiny a lipidy (Ziemer a Gibson, 1998). Hlavním cílem prebiotik jsou bakterie mléčného kvašení a bifidobakterie, protože ovlivňují mnohé funkce tlustého střeva a stimulují imunitní systém (Fuller a Gibson, 1997). Nicméně, aby bylo prebiotikum efektivní, musí splňovat několik atributů (tab. 6). Nejčastěji se jedná o některé nestravitelné oligosacharidy, které splňují požadovaný stupeň fermentační selektivity (Gibson a kol., 1995). Tab. 6 Navržené charakteristiky pro prebiotika (upraveno podle Gibson a Rastall, 2006) Žádané vlastnosti prebiotik Stabilita při trávení Stálost ve střevě Nemít vedlejší efekty Účinné v nízkých dávkách Kontrola změn mikroflóry Inhibice adheze patogenů Měnící se sladkost Vlastnosti oligosacharidů Mít volná 1-6 vazebná místa a pyranosylový kruh Vysoká molekulová hmotnost Být selektivně metabolizován prospěšnými bakteriemi, ale neprodukovat plyn, nepodporovat růst hnilobných organismů, atp. Být selektivně a efektivně metabolizován bifidobakteriemi nebo laktobacilů Být selektivně metabolizován omezeným počtem bakterií Obsahovat receptorové sekvence Složení z různých monosacharidových jednotek 20

21 Prebiotické doplňky stravy, hlavně inulin a fruktooligosacharidy (FOS), bývají dávány do různých potravin, aby ovlivnily mikroflóru v tlustém střevě. Prebiotika mají nízkou energetickou hodnotu (< 9kJ/g) a zvyšují objem stolice. Nadměrným užíváním potom vzniká nadbytek produktu, což se projevuje plynatostí, nadýmáním, abdominálními křečemi a průjmem (Gibson a Rastall, 2006). Zvýšená produkce SCFA střevní mikroflórou, která využívá tyto nestravitelné oligosacharidy, může být obranou proti rozvoji kolorektální rakoviny (Hughes a Rowland, 2001; Augenlicht a kol., 2002). Další možností v terapii prebiotiky je jejich užívání při prevenci proti střevním infekcím a v modulaci střevní imunitní odpovědi při idiopatických střevních zánětech (IBD). Užívání živých bakterií (probiotik) jako potravinového doplňku při léčbě určitých nemocí (IBD etc.) je poměrně dobře zdokumentováno. Užívání prebiotik poskytuje určité výhody oproti probiotikům pokud jde o schopnost přežít v GIT a o dlouhotrvající stabilitu v potravinách. Prebiotika nabízejí potenciál v prevenci a léčbě významných gastrointestinálních chorob. Budoucí studium prebiotik pravděpodobně bude více zaměřeno na přímý vliv na patogenní mikroflóru. Například přítomnost celobiózy značně snižuje u Listeria monocytogenes expresi genů odpovídajících za její virulenci (Park a Kroll, 1993). Ballongue a kol. potvrdili prebiotické vlastnosti laktulózy při experimentu s dobrovolníky. Dobrovolníkům, kterým bylo podáváno buď prebiotikum, nebo placebo dvakrát denně po 10g, byly odebírány vzorky stolice a určovány bakterie pomocí selektivních médií. Cílovými populacemi byli Bacteroides, Clostridium, koliformní bakterie, Eubacterium, Lactobacillus a Streptococcus. Autoři zaznamenali během experimentu významné zvýšení počtu bifidobakterií, laktobacilů a streptokoků, zatímco klesl počet bakteroidů, klostrídií, koliformních bakterií a eubakterií. To by mohlo být způsobeno prebiotickou aktivitou laktulózy, přestože použití selektivního agaru na rozlišení bakterií není přesné (Ballonge a kol., 1997 v Gibson a Rastall, 2006). Fruktooligosacharidy se přirozeně vyskytují v mnoha různých rostlinách, nejvíce potom v česneku, cibuli, chřestu, čekance, artyčoku, banánu, pšenici, pórku a topinamburu (Gibson a Rastall, 2006). Bylo provedeno několik studií na dobrovolnících, které potvrdily jejich prebiotickou aktivitu, třebaže dávka, strava, trvání studie a zkoumané subjekty byly rozdílné. Gibson a kol. (1995) zveřejnil výsledky experimentu, kdy dospělí dobrovolníci jedli kontrolovanou stravu doplněnou denně o 15g FOS. Jako kontrola byla použita sacharóza. Vzorky stolice byly zpracovány během třiceti minut po odebrání. 21

22 Důležité je, že tato studie využila k identifikaci bakterií, které se pomnožily během speciálního stravovacího režimu, ověřené techniky fenotypové charakterizace. Studie ukázala, že příjem potravy s FOS významně mění kompozici fekální mikroflóry. Několikanásobně je stimulován především růst bifidobakterií, které se po dvou týdnech užívání upravené stravy staly predominantní bakteriální skupinou. Dále se užíváním FOS významně snížil počet bakteroidů, fusobakterií a klostrídií. Tento efekt trval po celou dobu konzumace prebiotik. I po následovném dvoutýdenním ověřování obsahovala fekální flóra všech dobrovolníků více bifidobakterií, než měla před doplněním stravy o prebiotika. Prebiotika, která vynikají antiadhezivními vlastnostmi proti patogenům, by také mohla ovlivnit střevní patogenezi. Střevní patogeny využívají obvykle proteiny vážící sacharidy k tomu, aby mohly napadnout buňky a iniciovat onemocnění. Exogenní látky (prebiotika) obsahují stejné zbytky sacharidů, jaké jsou vyžadovány patogeny, což potlačuje bakteriální adhezi na buňky střevního epitelu a zamezuje kolonizaci. Prebiotika obsahující takovéto sacharidové zbytky mohou působit jako blokující faktor (Gibson a Rastall., 2006). Některé z těchto sacharidů byly již dříve identifikovány v mateřském mléku, které je považováno za kompletní stravu a stimulanta růstu bifidobakterií (Collins a Gibson, 1999). V tab. 7 jsou shrnuty základní mechanizmy účinku prebiotik. Tab. 7 Mechanizmy účinku prebiotik Jsou substrátem pro člověku prospěšné bakterie Mají přímý vliv na patogenní mikroflóru Vykazují antiadhezivní vlastnosti proti patogenům Neutralizují toxiny (toxin A u C. difficile) Kombinace probiotika a prebiotika se nazývá synbiotikum. V synbiotiku je probiotikum kombinováno s prebiotikem, které je pro ně specifické (tab. 8). Tato kombinace potom přispívá k prodloužení přežívání probiotika, pro které je prebiotikum specifickým substrátem vhodným k fermentaci. Tento přístup nachází největší uplatnění u nekojených dětí a starších lidí (Fooks a kol., 1999). Tab. 8 Synbiotika (upraveno podle Collins a Gibson, 1999) Probiotikum Bifidobacterium Lactobacillus Bifidobacterium Prebiotikum FOS Laktikol GOS 22

23 6. Molekulární a mikrobiální ekologie lidského střeva Mnoho ze starších prací, zabývajících se výzkumem mikrobiální ekologie lidského GIT, využívalo kultivační metody a následnou charakterizaci bakteriálních izolátů. Z počátku byla k rozlišení a identifikaci jednotlivých izolátů využívána fenotypová charakterizace. Tyto testy zahrnovaly popis tvaru kolonií a morfologii jednotlivých buněk, růstové požadavky, stanovení rezistence k různým látkám a charakterizace metabolizmu bakteriálních izolátů. Pomocí fenotypizace však nelze jednotlivé izoláty přesně taxonomicky klasifikovat. Například stejné fenotypové vlastnosti mohou vykazovat i geneticky velmi nepříbuzné biotypy. Analýza se často potýkala s problémem reprodukovatelnosti, nebo dávala nejednoznačný výsledek způsobený plasticitou bakteriálního metabolizmu. Z toho logicky vyplývá, že stanovení fenotypových parametrů je nedostačující. Příchod molekulárních technologií umožňuje genotypovou klasifikaci bakteriálních kmenů, jejíž výsledek je taxonomicky i fylogeneticky nadřazený fenotypovým identifikačním postupům (McCartney, 2002). Navíc, molekulární genotypové analýzy umožňují rychlejší a spolehlivější klasifikaci jednotlivých izolátů a umožňují rozšíření jejich aplikací, včetně studia diferenciace (Olive a Bean, 1999). Nicméně, hlavní přínos kultivačních metod a fenotypové charakterizace je to, že poskytují základní informace a znalosti mikrobiální fyziologie. Molekulární analýza (včetně metody DNA fingrprintů, využití sond a hybridizací a analýzy společenství) umožňuje spolehlivou diferenciaci nižších fylogenetických taxonů (například druhů a poddruhů). Nejprve se molekulární analýzy využívaly hlavně k identifikaci bakteriálních izolátů získaných během kultivačních studií a zahrnovaly zejména metody nepřímé, jako DNA fingrprinty založené na polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP) (McCartney, 2002). Velmi rychle se rozvíjely i metody založené na stanovení sekvence DNA. Díky stále se rozšiřujícím databázím s bakteriálními sekvencemi genů pro ribozomální RNA se tato metoda stala rychlou a přesnou pro identifikaci genotypu. Dále se rozvíjejí metody, které využívají sondy. Podobně i vznik a následné využívání amplifikačních technik (PCR), společně s metodami, pomocí kterých se dají zjišťovat fylogenetické vztahy (například denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE)), se rozšířily naše možnosti vedoucí k porozumění lidské střevní mikroflóry. Molekulární technologie využíváme v mikrobiologii lidského střeva hlavně k identifikaci bakteriálních izolátů, stanovení specifických fylogenetických skupin, sledování organismů, které mají pro nás zvláštní význam (jako jsou probiotika) a pro charakterizaci 23

24 bakteriální diverzity a dynamičnosti v čase a mezi jednotlivci nebo studovanými skupinami. Aktuální rozvoj studia molekulární ekologie lidského střeva umožňuje využívání vysoce výkonných systémů (včetně mikročipů) a funkční genomiky (jako je metabonomika, proteomika a nutrigenomika) Strategie výzkumu za použití sond Molekulární analýzy využívající sondy se uplatňují při sledování převládajících bakteriálních skupin ve smíšených bakteriálních populacích. Existuje velké množství metodologických přístupů, například hybridizace na pevných podkladech, tečkové (dot blot) hybridizace a in situ hybridizace. Jádrem těchto technologií je hybridizace oligonukleotidů (sond), obvykle připravených synteticky, s cílovou specifickou sekvencí bakteriální DNA. Teoreticky může být takto využita jakákoliv sekvence DNA, rozhodující je její specificita a selektivita. Fyzikální a chemické vlastnosti bakteriálního genomu, včetně sekundární a terciální struktury, vylučují použití této metody na některé oblasti genomu. Specificita oligonukleotidových sond je závislá na cílové sekvenci a na hybridizačních podmínkách (Charteris a kol., 1997). Většina metod založených na použití sond se při výzkumu smíšených bakteriálních populací zaměřuje na bakteriální ribozomy, především na16s rdna sondy. Výhoda genů pro 16S rrna je přítomnost vysoce konzervativních, variabilních a vysoce variabilních oblastí (umožňujících selekci oligonukleotidových sekvencí s různou taxonomickou specificitou), a dostupnost rozsáhlé databáze těchto sekvencí. Vysoce konzervativní oblast obsahuje univerzální cílové sekvence (např. doménová sonda, Bact 338), variabilní oblast skupinové sekvence (jako je EREC 482, sonda pro skupinu Clostridium coccoides/eubacterium rectale) a hypervariabilní oblast pro rodově a druhově specifické sekvence (např. Bif 164 pro Bifidobacterium spp a Bdis 656 pro Bacteroides distasonis) (Franks a kol., 1998; Harmsen a kol., 2002). V tab. 9 jsou uvedeny příklady sond využívané pro detekci potencionálních probiotik z rodu Lactabacillus a Bifidobacterium. Další studie se zabývaly potenciálem jiných bakteriálních genů, jako je například gen pro enzym fruktosa-6-fosfátfosfoketoláza, specifický pro druhy Bifidobacterium a Gardnerella (Gibson a Rastall, 2006). Použití sond je limitováno mírou specificity a detekčním limitem. Jak se rozšiřuje naše poznání v oblasti střevní mikroflóry, objevují se a identifikují nové druhy, tak se i zvětšuje nabídka oligonukeotidových sond (zejména sondy cílené na 16S rrna). Nejvíce se ke studiu lidské střevní mikroflóry využívají metody tečkové hybridizace a fluorescenční hybridizace in situ (FISH). 24

25 Tab. 9 Olignukleotidové sondy pro identifikaci potencionálních probiotických laktobacilů a bifidobakterií (Charteris a kol., 1997) Sonda 5,3 sekvence Cílová rrna Specifita pro druhy Lactobacillus a Bifidobacterium: Lba(1) TCT TTC GAT CC.4 TCC ACA 23S L. acidophilus Lba(2) AGC GAG CUG AAC CAA CAG AUU C 16S L. acidophilus Lbcp CAA TCT CTT CCC TAG CAC 23S L. crispatus Lbg TCC TTT CAT ATG CAT CC.4 23S L. gasseri Lbj ATA ATA TAT GCA TCC ACA G 23S L. johnsonii Lbcr GCAGGCAATACA CTGATG 23S L. casei/rhamnosus Lbcrp CTG ATG TGT ACT GGG TTC 23S L. casei/paracasei/rhamnsus Lbpa CAC TGA CAA GCA ATA CAC 23S L. paracasei Lbr CAT CCA TCG TC.A ATC AGG 16S L. reuteri Lbfe( 1) GCG ACC AAA ATC AAT CAG G 16S L. fermentum Lbfe(2) AAC GCG UUG GCC CAA UUG AUU G 16S L. fermentum Lbp AAC GAA CUA UGG UAU UGA UUG G 16S L. plantarum Lbpp ATC TAG TCG TAA CAG TTG 23S L. plantarum a1 GGA TC CTG AAA ACC CGG 16S rod Bifidobacterium a2 GGA TCC CTT AAA ACC CGG 16S B. adolescentis/coryneforme a3 GAC GCG GCG ACG CGG A 16S B. longum/infantis/suis a4 GAC CTC GTG AGG GGG A 16S B. adolescentis a5 GAC AGT GCG AGC TGG A 16S B. breve a6 GAC ACG GCG ACG TGG A 16S B. pseudocatenualtum Bif164 CAT CCG GCA TTA CCA CCC 16S rod Bifidobacterium Bif662 CCA CCG TTA CAC CGG GAA 16S rod Bifidobacterium Bif1278 CCG GTT TTC AGG ATC C 16S rod Bifidobacterium PAD GCT CCC AGT CAA AAG CG 16S B. adolescentis PBI GCA GGC TCC GAT CCG A 16S B. bifidum PBR AAG GTA CAC TCA ACA CA 16S B. breve PIN TCA CGC TTG CTC CCC GAT A 16S B. infantis PLO TCT CGC TTG CTC CCC GAT A 16S B. longum a1-a6 potencionální sondy Využití tečkové (dot-blot) analýzy Při tečkové analýze se sondy hybridizují s DNA extrahovanou z bakteriálních izolátů nebo přímo ze vzorku. Výsledkem je procentuální index z celkové 16S rrna, která zahrnuje 25

26 každou specifickou populaci. Větší počet oligonukleotidových sond nebo vzorků může být simultánně testován s využitím tečkové hybridizace využívající šachovnicový formát (DNA nebo sondy), při kterém se používají stejné podmínky hybridizace pro všechny sondy (McCartney, 2002). Tuto metodu využily ve svých výzkumech dva týmy při sledování dominantní fekální mikroflóry zdravých lidí (Sghir a kol., 2000; Marteau a kol., 2001). Sghir a kol. (2000) ve své studii uvedli, že dominantní je skupina Bacteroides, podskupina Clostridium leptum a skupina Clostridium coccoides/eubacterium rectale. Zastupují 37, 16 a 14% z celkové rrna. Jiné výsledky se objevily v druhé studii, v práci Marteau a kol. (2001), kde výše jmenované tři skupiny bakterií zastupují 44% z celkové rrna. Hopkins a kol. (2001) využili tečkové analýzy a tradičních kultivačních metod k výzkumu mikrobiálního zastoupení lidské střevní mikroflóry u čtyř skupin dobrovolníků (děti, dospělí, starší lidé a starší pacienti trpící průjmem způsobeným Clostridium difficile (CDAD)). Zajímavé bylo, že výrazně vyšší zastoupení enterobakterií bylo pozorováno u dětí (ve srovnání s dospělými). Dále byl prokázán rozdíl v zastoupení bifidobakterií v závislosti na věku, kdy obě skupiny starších jedinců měly méně bifidobakterií než děti a dospělí. Ovšem i mezi skupinou starších lidí byla pozorována velká individuální variabilita v zastoupení bifidobakterií (někteří měli vysoké zastoupení a někteří extrémně nízké). Nicméně pacienti trpící CDAD měli nejnižší zastoupení bifidobakterií ze všech skupin. U této skupiny byl také prokázán nižší obsah bakteroidů a zvýšený obsah klostridií v porovnání s ostatními skupinami. V dodatečných studiích bylo prokázáno, že starší lidé a zdraví dospělí se liší v zastoupení fekálních 16S rrna. Byl pozorován nižší rrna index bakteroidů, bifidobakterií a Clostridium leptum, a zvýšený rrna index laktobacilů. Tato studie tedy prokazuje, že se zvyšujícím se věkem se zároveň zvyšuje i diverzita bakterií ve střevě. Zatímco u dospělých sondy pokryjí 80% z celkové rrna, u starších lidí už jen 50% (Gibson a Rastall, 2006) Fluorescenční hybridizace in situ (FISH) Fluorescenční hybridizace in situ umožňuje přímou kvantifikaci bakteriálních buněk ve smíšené populaci (jako je mikroflóra lidského střeva). Pro detekci hybridizovaných buněk ve vzorku se využívá epifluorescenční mikroskop nebo flow cytometr. Výstupem je kvantitativní vyjádření cílové populace (počet buněk na vzorek nebo vzájemný poměr z celkové rrna). FISH analýza se stala jednou z metod, která změnila studium dominantních bakteriálních skupin v lidském GIT. Tuto metodu využívá velké množství studií věnujících se výzkumu 26

27 mikroflóry ve vztahu ke zdraví a dietetickým zásahům (Franks a kol., 1998; Harmsen a kol., 2002; Zoetendal a kol., 2002b). Jedna průběžná studie využila metodu FISH ke sledování fekální mikroflóry u devíti dobrovolníků (Franks a kol., 1998). Více než 90% buněk obarvených DAPI bylo hybridizováno s univerzální bakteriální sondou (Bact 338). Stejně jako u dat z tečkové analýzy, je predominantní flóra podle této práce složena z rodů Bacteroides a Clostridium coccoides/eubaterium rectale (tvoří téměř 50% z celkového obsahu bakterií). Další dominantní populace je skupina eubakterií s nízkým obsahem G+C a bifidobakterie (Franks a kol., 1998). Bylo pozorováno, že se fekální mikroflóra v průběhu času mění a že nejvíce kolísá obsah bifidobakterií. Současné studie s využitím širšího výběru sond potvrzují, že rod Bacteroides z celkového obsahu činí cca 28% a skupina Clostridium coccoides/eubaterium rectale 23%. Pomocí dalších sond byly identifikovány následující dominantní rody: Atopobium (12%), Eubacterium s nízkým G+C poměrem/fusobacterium prausnitzii (reklasifikováno jako Faecobacterium prausnitzii) (11%) a skupina Ruminococcus (10%). Bifidobakterie reprezentují přibližně 5% z celkového obsahu. Dalšími zástupci dominantní fekální mikroflóry zdravého jedince jsou Eubacterium hallii, Lachnospira a Eubacterium cylindroides. Byly identifikovány i subdominantní skupiny bakterií vyskytující se s četností nižší než 1% (Harmsen a kol., 2002). Znalosti získané pomocí dalších molekulárních strategií upozornily na významné bakteriální skupiny ve fekální mikroflóře. Například genová knihovna ribozomálních klonů ze vzorku lidské stolice často obsahuje sekvence podobné Ruminococcus obeum. Vyvstává tedy otázka, zda predominance tohoto druhu vyplývá z jeho skutečného zastoupení ve vzorku, nebo zda jde o chybu při analýze klonů. Problematikou se zabýval Zoetendal a kol. (2002b) a vyvinul sondu Urobe 63, která je specifická pro Ruminococcus obeum. Předběžně byly vyšetřovány vzorky devíti holandských dobrovolníků (pěti mužů a čtyř žen). Bylo demonstrováno, že rod Ruminococcus obeum je poměrně dominantní (zahrnuje ~2,5% z buněk hybridizovaných s univerzální sondou Bact 338 a ~16% v RNA ze skupiny Clostridium coccoides/eubacterium reptale). Fylogenetický strom konstruovaný s využitím 16S rdna bakterií GIT je uveden na obr. 4. Podobná práce byla vypracovaná pro skupinu Faecalibacterium prausnitzii.(gibson a Rastall, 2006). 27

28 Obr. 4 Fylogenetický strom Na tomto fylogenetickém stromě lze pozorovat příbuznost mezi sekvencemi 16S rdna nekultivovatelných bakterií jako je R. obeum (jsou vyznačené tučným písmem) a některých blízce i vzdáleně příbuzných bakterie (upraveno podle Zoetendal, 2002b) Další metody využívající sondy Byla vytvořena knihovna oligonukleotidů a vypracována nová generace metod využívajících sondy, například metoda mikrouspořádání na čipu, která umožňuje vysoce výkonnou analýzu smíšených mikrobiálních společenství. Byly publikovány dvě studie stejné skupiny autorů, kteří využívají tuto metodu a zkoumají 60 oligonukleotidových sond pokrývajících 20 bakteriálních druhů (Wang a kol., 2002b). Výsledky získané ze zdravých jedinců odpovídají závěrům již výše zmíněných prací. Týká se to druhů Bacteroides sp., Clostridium clostridioforme, Clostridium leptum, Faecalibacterium prausnitzii, Ruminococcus sp. a Bifidobacterium, které tvoří predominantní mikroflóru. Opět je zde pozorována variabilita mezi zdravými jedinci. Mikroflóra jedince s dlouhodobým průjmem obsahovala méně běžných bakteriálních druhů, které jsou predominantní u zdravých jedinců (Wang a kol., 2002a) 28

29 Genetické metody využívající sondy umožňují studovat predominantní mikroflóru. Vývoj nových sond neustále pokračuje. Jsme ale omezeni prahem detekce, obzvlášť ve sledování méně dominantních druhů ve smíšené populaci (Franks a kol., 1998). Avšak metody se stále vylepšují, knihovna sond se neustále rozšiřuje a vědci se snaží vyvinout postupy s větší specifitou a senzitivitou a s celkovým jednodušším provedením Analýzy mikrobiálních společenstev založené na PCR DGGE Hledat významné bakteriální skupiny (na úrovni rodu nebo druhu) můžeme i pomocí metody PCR. Je to rychle se vyvíjející technologie, která nám může pomoci zkoumat predominantní druhy u takových společenstev, jakým je například i lidská střevní mikroflóra. Metody analýzy DNA, jako je DGGE, mohou být využity ke zkoumání predominantních druhů ve vzorku pomocí programu snapshot. Výběr zaměření těchto snapshotů se může nastavovat i během selekce primerů. Například za použití univerzálních primerů můžeme získat celkový přehled, zatímco chceme-li detailnější informace, můžeme využít skupinově, rodově nebo druhově specifické primery při amplifikaci. Takto můžeme pomoci DGGE zmapovat (s různou úrovní detailů) mikrobiální diverzitu ve vzorcích z prostředí, jako jsou fekálie, biopsie a další klinický materiál (Gibson a Rastall, 2006). Amplikony jsou separovány podle chemické stability nebo podle teploty tání jednotlivých sekvencí genů. Omezující je fakt, že i fylogeneticky nepříbuzné sekvence se mohou chovat podobně. Ale to lze vyřešit nastavením gradientu. Dalším omezujícím faktorem je limit detekce, kdy se nemusí kvůli malé senzitivitě zachytit méně dominantní bakteriální druhy ve smíšené kultuře (Zoetendal a kol., 1998). Výhodou této metody je možnost rychle vyšetřit a srovnat bakteriální diverzitu v komplexních bakteriálních vzorcích. Skupiny bakterií, které jsou obzvlášť zajímavé, např. ty, co jsou v různých vzorcích zastoupeny různě, lze vyšetřovat s využitím dalších metod (například vyříznutím amplikonu, jeho klonováním a sekvencováním) Využití DGGE Narůstá počet prací, které vyžívají metodu DGGE (popř. TGGE) ke sledování fekální mikroflóry (včetně experimentů se změnou stravy) (Zoetendal a kol., 1998; Satokari a kol., 2001; Walter a kol., 2001; Favier a kol., 2002; Zoetendal a kol., 2002a). Pomocí metody DGGE navíc sledujeme nejen individuální výkyvy, ale i individuální stabilitu (stanovení profilu pomocí DGGE v čase). Můžeme rovněž sledovat přítomnost běžných skupin bakterií u 29

30 různých subjektů. Byl prokázán lineární vztah mezi genetickou příbuzností hostitelů a podobností indexů DGGE profilů. Nicméně, už nebyla zaznamenána korelace mezi DGGE profily a pohlavím či stylem života u nepříbuzných subjektů. DGGE analýza tedy prokázala, že hostitelský genotyp koreluje s bakteriálním složením lidské střevní mikroflóry (Gibson a Rastall, 2006). Favier a kol. (2002) využili PCR DGGE k výzkumu bakteriální diverzity a dynamičnosti u dvou chlapců v prvních dvanácti měsících jejich života. Počáteční profily byly u obou chlapců podobné, ačkoliv byly zaznamenány i drobné individuální variace. Bylo pozorováno, že se zvyšující se diverzitou mikrobiálního osazení v GIT v čase měli oba kojenci relativně stabilní mikroflóru po dobu několika týdnů. Změna stravy (částečně mléčná, ale začátek přechodu na pevnou stravu fáze odstavování dítěte) znamenala změnu ve složení střevní mikroflóry a DGGE profil byl složitější. Zajímavé bylo, že odstavení mělo výrazný vliv na diverzitu mikroflóry chlapce, který byl až do odstavení krmen pouze mateřským mlékem. U chlapce krmeného smíšenou stravou byla prokázána zvyšující se rozmanitost a relativní rovnováha dominantních amplikonů. U obou chlapců byly v prvních 6 měsících dominantní složkou mikroflóry bifidobakterie. Jedna ze studií se zabývala aplikací PCR-DGGE cílenou na gen kódující transaldolázu pro identifikaci a detekci fekálních bifidobakterií. Bylo vyšetřováno devět druhů a jenom druhy Bifidobacterium angulatum a Bifidobacterium catenulatum nebyly být při této analýze rozlišeny. Výzkum diverzity bifidobakteriální flóry u deseti zdravých dospělých jedinců odhalil, že 4 osoby byly osídleny Bifidobacterium adolescentis a Bifidobacterium longum, u jedné osoby byly detekovány dva odlišné amplikony Bifidobacterium adolescentis, u další osoby Bifidobacterium adolescentis a jeden nedefinovaný amplikon, u dvou osob se detekovaly amplikony Bifidobacterium longum a Bifidobacterium bifidum a u jedné osoby se netvořil žádný PCR-DGGE produkt (tab.10) (Requena a kol., 2002). Stejný výzkum bifidobakteriální flóry byl proveden ještě u deseti vzorků pocházejících ze dvou zdravých dětí. Ukázalo se, že osm z těchto vzorků obsahovalo Bifidobacterium bifidum (z nichž jeden ještě obsahoval druhý neidentifikovaný amplikon), jeden vzorek obsahoval Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum a neidentifikovaný amplikon, poslední vzorek nedal žádný PCR-DGGE produkt (tab. 10) (Requena a kol., 2002). K potvrzení bakteriální diverzity u všech dvaceti fekálních vzorků (deset z dospělých a deset z dětí) použil Matsuki a jeho kolegové cílené PCR primery odvozené z druhově specifické 16S rrna a zjistil určitý nesoulad mezi oběma metodami. Obecně se dá říci, že větší diverzita byla zaznamenána za použití PCR metody cílené na 16S rrna než pomocí DGGE. 30