Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze Katedra parazitologie

Transkript

1 Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze Katedra parazitologie Hydrogenosomy trichomonád, anaerobních hub a nálevníků Věra Zedníková Bakalářská práce Praha, letní semestr 2009 Vedoucí práce: RNDr. Ivan Hrdý, Ph.D. 1

2 Prohlašuji, že jsem zadanou bakalářskou práci vypracovala sama a že jsem uvedla veškeré použité informační zdroje. Souhlasím se zapůjčováním práce. V Praze dne

3 Obsah: 1. Abstrakt...4 Abstract Úvod Hydrogenosomy nálevníků Basální metabolismus hydrogenosomů N. ovalis Hydrogenosomy ostatních nálevníků Metabolismus Dasytricha Metabolismus Trimyema Hydrogenosomy anaerobních hub Hydrogenosomální metabolismus Piromyces a Neocallimastix Vliv fruktózy na podíl konečných produktů Hydrogenosomy trichomonád Metabolismus hydrogenosomů trichomonád Metabolismus polyaminů Metabolismus aminokyselin Glycin dekarboxylázový komplex a serin hydroxymethyltransferáza Mechanismus tvorby Fe-S skupin Import proteinů do hydrogenosomů Antioxidační mechanismy trichomonád Porovnání metabolismu hydrogenosomů chytridiomycetních hub, trichomonád a nálevníků Hydrogenosomy a mitochondrie Obrázková příloha Seznam použité literatury

4 1. Abstrakt Hydrogenosomy jsou velmi zajímavé organely vyskytující se u anaerobních organismů jako jsou někteří nálevníci (např. Nyctotherus ovalis, Trimyema, Dasytricha), chytridiomycetní houby (např. Neocallimastix a Piromyces) či parazitičtí bičíkovci (např. Trichomonas vaginalis, Tritrichomonas foetus patřící do skupiny Parabasala). Ačkoli všechny typy hydrogenomosů produkují vodík jako jeden z konečných produktů metabolismu glukózy, jsou hydrogenosomy mikroorganismů rozdílné, co se morfologie i metabolismu týče. Tyto odlišnosti vedou k velkým debatám o jejich evolučním původu, příbuznosti s mitochondriemi a skutečném příspěvku a výhodách poskytnutých buňkám mikroorganismů. Tato práce si klade za cíl zmapovat metabolismus hydrogenosomů výše uvedených organismů, kdy se zaměřuje na souhrn typických znaků jejich hydrogenosomů, mezi než patří například konečné produkty metabolismu glukózy, syntéza ATP, genom, antioxidační mechanismy, tvorba Fe-S center a další. Důraz je kladen na enzymy zpracovávající pyruvát na konečné produkty, což jsou především pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáza, pyruvát: formát lyáza, pyruvát dehydrogenázový komplex. Speciální kapitoly se pak věnují porovnání metabolismu hydrogenosomů těchto organismů a vztahu hydrogenosomů s mitochondriemi. Klíčová slova: Metabolismus hydrogenosomů, hydrogenosomy trichomonád, hydrogenosomy anaerobních nálevníků, hydrogenosomy anaerobních hub. 4

5 Abstract Hydrogenosomes are very interesting organelles found in non-mitochondrial organisms such as anaerobic ciliates (N. ovalis, Trimyema, Dasytricha), anaerobic chytrids (Neocallimastix, Piromyces) or parabasalid flagellates trichomonads (Trichomonas vaginalis, Tritrichomonas foetus). Although all hydrogenosomes produce hydrogen as a final product in glucose metabolism, hydrogenosomes of these microorganisms differ in metabolism and morphology. All differences lead to debates of hydrogenosomal origin, relationship with mitochondria and the real benefit and advantages they provide to microorganism cells. This work is focused on hydrogenosomal metabolism and typical features of the above-mentioned organisms, particularly on final products of glucose metabolism, genome, Fe-S cluster assembly, antioxidant mechanisms or enzymes transforming pyruvate. These enzymes are pyruvate:ferredoxin oxidoreductase, pyruvate:formate lyase, pyruvate dehydrogenase complex. In individual chapters I summarise characteristic features of hydrogenosomes from various anaerobic microorganisms and their relationship to mitochondria. Key words: Metabolism of hydrogenosomes, hydrogenosomes of trichomonads, hydrogenosomes of anaerobic ciliates, hydrogenosomes of anaerobic chytrids. 5

6 2. Úvod Řada anaerobních či mikroaerofilních eukaryot jako jsou někteří nálevníci (např. Nyctotherus ovalis), chytridiomycetní houby (např. Neocallimastix a Piromyces) či parazitičtí bičíkovci (např. Trichomonas vaginalis, Tritrichomonas foetus patřící do skupiny Parabasala) neobsahují mitochondrie, ale vlastní jiné, avšak neméně zajímavé, organely zapojené do energetického metabolismu, a to hydrogenosomy. Tato organela má jednu velmi pozoruhodnou funkci v anaerobních podmínkách vytváří molekulární vodík jako jeden z konečných produktů metabolismu. Podle tohoto produktu jí také bylo uděleno pány Lindmarkem a Müllerem v roce 1973 jméno (Lindmark and Müller 1973). Hydrogenosomy jsou kulaté či lehce podlouhlé organely, jejichž velikost se pohybuje dle organismu a typu podmínek (stres, působení chemických látek) v průměru od 200 do 1000 nm, avšak mohou dosáhnout i 2µm (Monocercomonas) (Benchimol 1999). Jsou to organely se selektivně propustnou dvojitou membránou (Müller 1993) (obrázek 1) a obsahují homogenní granulární matrix, velmi odlišnou od cytosolu, se solubilními proteiny karbohydrátového metabolismu a dalšími enzymatickými systémy. V periferii hydrogenosomů se vyskytují speciální váčky lišící se velikostí, počtem (T. foetus obsahuje 1 či 2, T. vaginalis jich má mnoho) a složením (obsahují například vápník, hořčík či fosfor), které je velmi odlišné od matrix hydrogenosomů, avšak značně podobné prostředí endoplasmatického retikula (ER) (Benchimol 2008). Obr. 1: a) Tenký řez hydrogenosomy (H) T. foetus a b) Neocallimastix frontalis. Oba hydrogenosomy vlastní dvojitou membránu. Příležitostně byly pozorovány invaginace v hydrogenosomech (šipky na obrázku a). Černé místo na (a) reprezentuje depozitum vápníku v periferních váčcích. (CW) buněčná stěna. (Obrázek a od Benchimol, nepublikováno; obrázek b od Benchimol et al. 1997) 6

7 Vnější membrána hydrogenosomů je schopna se spojit s mikrotubuly a byla prokazána i blízká asociace s ER, které pravděpodobně zajišťuje tvorbu nové membrány při růstu hydrogenosomů (Benchimol 1999). Hydrogenosomy jsou degradovány v procesu autofágie, kdy tento děj začíná obalením organely drsným ER, které isoluje organelu od cytoplasmy a následuje její degradace v lysosomech. Hydrogenosomy se dělí třemi různými cestami segmentací (nejčastěji u T. foetus), příčným dělením (Neocallimastix) a procesem připomínajícím tvar srdce ( heart form ) (trichomonády), přičemž se mohou dělit v kterékoli fázi buněčného cyklu (Benchimol 1999). Až na jednu výjimku, N. ovalis, nebyla v hydrogenosomech objevena DNA (Akhmanova et al. 1998), což poukazuje na to, že jsou hydrogenosomální proteiny kódovány v jádře, nasyntetizovány na volných ribosomech v cytoplasmě a následně importovány do organely, kdy je pro tento děj potřeba neporušená organela, ATP, cytosolické faktory a u většiny proteinů i signální N-terminální presekvenci (Bradley et al. 1997; Mentel et al. 2008). Distribuce těchto organel je velmi široká. Hydrogenosomy byly objeveny v rozličných eukaryotních liniích, často i fylogeneticky velmi vzdálených. Doposud nebyly hydrogenosomy objeveny v rostlinách ani živočiších (Müller 1993). 7

8 3. Hydrogenosomy nálevníků Nálevníci představují vysoce komplexní, druhově bohatou, monofyletickou skupinu jednobuněčných eukaryot. Většina nálevníků žije v aerobním prostředí a vlastní mitochondrie. Existují však i anaerobní druhy, které obsahují hydrogenosomy (Müller 1993; Hackstein et al. 1999). Rozvoj biologických technik umožnil objev hydrogenosomů u volně žijících nálevníků jako je Plagiopyla a Trimyema (Plagiopylea), Metopus (Armophorea), dále u nálevníků osídlujících gastro intestinální trakt přežvýkavců a vačnatců jako jsou Isotricha či Dasytricha (Trichostomatia), stejně jako u nálevníků žijících v zadním střevě švábů Nyctotherus ovalis (Armophorea). K identifikaci hydrogenosomů nálevníků významně pomohlo i zkoumání jejich symbiózy s metanogenními archebakteriemi, které potřebují k produkci metanu CO 2 a H 2 (van der Gijzen et al. 1991). V následujících odstavcích popíši metabolismus hydrogenosomů nálevníků N. ovalis, které vykazují určité podobnosti i rozdíly s metabolismem Dasytricha a Trimyema. Všechny doložené studie však poukazují na to, že se tyto hydrogenosomy vyvinuly modifikací mitochondrií aerobních nálevníků, jak se v průběhu času přizpůsobovali různým mikroaerobním či anaerobním podmínkám (Martin 2005). 3.1 Basální metabolismus hydrogenosomů N. ovalis Nejvíce prostudované a v mnoha ohledech unikátní jsou hydrogenosomy anaerobního nálevníka Nyctotherus ovalis, který obývá zadní střevo švábů, žab či plazů. Jeho hydrogenosomy obsahují genom (Akhmanova et al. 1998; Martin 2005), který se velmi podobá mitochondriálnímu genomu nálevníků, protože kóduje ribosomální proteiny a také některé komponenty mitochondriálního dýchacího řetězce jako jsou například komplex I, který je pravděpodobně používán k pumpování protonů ven z organely, a komplex II, který nejspíše redukuje fumarát. Organela je schopna vytvářet membránový potenciál a vnitřní membrána tvoří kristy a obsahuje lipid kardiolipin, což jsou typické znaky mitochondrií (Boxma et al. 2005). Do dnešní doby nebyly identifikovány homology FoF1 ATPázy, ani komplex III a IV. Předpokládané schéma metabolismu glukózy nálevníka N.ovalis je na obrázku 2. 8

9 Ke zkoumání energetického metabolismu byly izolované buňky N. ovalis inkubovány v přítomnosti stopového množství radioaktivně značené glukózy (na pozicích C1-C6 či pouze na C6). Tato studie odhalila, že největší část glukózy byla přeměněna na laktát, acetát a sukcinát a jen malá část glukózy byla degradována na etanol, přičemž přítomnost kyslíku nijak významně neovlivnila konečné množství produktů (Boxma et al. 2005). Tyto výsledky tak nabízejí hned několik zajímavých závěrů: 1. N. ovalis nepoužívá k degradaci glukózy kompletní cyklus kyseliny citrónové, protože CO 2 značený 14 C je získáván z [6-14 C] glukózy výlučně postupnou dekarboxylací po sobě jdoucích kroků citrátového cyklu. Byly však identifikovány geny, o kterých se předpokládá, že kódují enzymy cyklu kyseliny citrónové jako je malát dehydrogenáza, sukcinát dehydrogenáza, sukcinyl-coa syntetáza či alfaketoglutarát dehydrogenáza. 2. Formát (kyselina mravenčí) není jeden z konečných produktů metabolismu, N. ovalis tedy nepoužívá enzym pyruvát formát lyásu (PFL) v metabolismu pyruvátu, jako je tomu v případě hydrogenosomů anaerobních chytridiomycet (konečné produkty jsou formát, laktát, etanol). 3. Produkt cytosolické glykolýzy, pyruvát, je podle všeho konvertován na laktát či etanol, nebo je transportován do hydrogenosomů, kde je přeměněn na acetát za vzniku ATP. 4. K produkci acetátu je využíváno dekarboxylace pyruvátu, což s velkou pravděpodobností zajišťuje pyruvát dehydrogenázový komplex (PDH), jako je tomu u normálních mitochondrií, protože byly identifikovány geny pro všechny 3 podjednotky PDH a nebyly objeveny žádné geny pro pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázu (PFO), která se vyskytuje u mnoha anaerobních prokaryot (eubakterie, archebakterie) a některých anaerobních prvoků (trichomonády). 5. Vylučování podstatného množství sukcinátu poukazuje na to, že fumarát produkovaný uvnitř hydrogenosomů je používán jako terminální akceptor elektronů. Redukci fumarátu pravděpodobně katalyzuje membránově vázaný enzym fumarát reduktáza (anaerobní varianta komplexu II). Jako další akceptor elektronů pak vystupují protony, které vznikají při reoxidaci NADH a dávají vzniknout molekulárnímu vodíku. Jelikož tato organela spojuje charakteristické znaky mitochondrií (genom či komponenty elektron-transportního řetězce) se znaky typickými pro hydrogenosomy (produkce vodíku), můžeme ji nazvat chybějícím článkem mezi aerobními a anaerobními organelami mitochondriálního typu (Tielens et al. 2002; Martin 2005; Hackstein et al. 2006). 9

10 Obr. 2: Spekulativní metabolické schéma hlavních drah metabolismu sacharidů v N. ovalis (Hackstein et al. 2006). Zkratky: AcCoA, acetyl-coa; CI, komplex I; Citr, citrát; FRD, fumarát reduktáza; FUM, fumarát; Hyd, hydrogenáza; α-kg, α ketoglutarát; MAL, malát; OXAC, oxaloacetát; PDH, pyruvát dehydrogenáza; PEP, fosfoenolpyruvát; PYR, pyruvát; RQ, rhodochinon; SUCC, sukcinát; SUCC-CoA, sukcinyl-coa. 10

11 3.2 Hydrogenosomy ostatních nálevníků Metabolismus Dasytricha Metabolické studie byly uskutečněny i na hydrogenosomech bachorového nálevníka Dasytricha ruminantium. Předpokládané schéma metabolismu glukózy Dasytricha je na obrázku 3. Tento organismus zpracovává celulózu či škrob, ze kterých získává glukózu jako substrát pro fermentaci. Hlavní konečné produkty metabolismu jsou vodík, acetát, laktát, butyrát a CO 2, v malém množství byla detekována i kyselina propionová (Yarlett et al. 1981; Ellis et al. 1991). Množství, v jakém jsou tyto produkty vytvářeny, jsou však ovlivněna koncentracemi CO 2 a O 2 přítomných v bachoru, kdy vysoká koncentrace oxidu uhličitého a nízká koncentrace kyslíku vede k poklesu tvorby butyrátu a acetátu a nejrychlejší příjem glukózy byl pozorován při koncentraci kyslíku typickou pro prostředí bachoru (1-3 µm) (Ellis et al. 1991). Hydrogenosomální enzym využívaný těmito nálevníky k přeměně pyruvátu na acetyl- CoA je pravděpodobně enzym PFO, což bylo dokázáno v hydrogenosomální frakci (Yarlett et al. 1985), čímž se liší od N.ovalis. Acetyl-CoA je následně přeměněn na acetát či je transportován do cytosolu, kde je přeměněn přes meziprodukt butyryl-coa na butyrát, a to pomocí enzymu butyrát kinázy. Tento děj je doprovázený tvorbou ATP stejně jako tvorba acetátu (Yarlett et al. 1985). Obr. 3: Spekulativní schéma hlavních drah metabolismu sacharidů Dasytricha sp. (Ellis et al. 1991). Zkratky: AcCoA, acetyl-coa; Hyd, hydrogenáza; PEP, fosfoenolpyruvát; PFO, pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáza; PYR, pyruvát, X ox red, neznámý přenašeč elektronů. Konečné produkty jsou v rámečku. 11

12 3.2.2 Metabolismus Trimyema Další publikovaná studie metabolismu hydrogenosomů nálevníků pojednává o volně žijícím plagiopylidním nálevníku rodu Trimyema. Na obrázku 4 je znázorněno spekulativní schéma metabolismu glukózy. Tento nálevník umí zpracovávat substráty i v mikroaerobních podmínkách, přičemž spotřebovává kyslík a produkuje formát jako hlavní konečný produkt společně s malým množstvím acetátu a laktátu, avšak není produkován ani vodík, ani etanol (Goosen et al. 1990). Ve zcela anaerobních podmínkách je situace jiná. Hlavní produkt metabolismu je etanol, v malém množství se tvoří acetát, laktát, formát a vodík (Goosen et al. 1990). Toto spektrum produktů anaerobní fermentace se velmi podobá modelu nalezenému u anaerobních chytridiomycetních hub Piromyces sp. E2 z gastro-intestinálního traktu býložravců (Boxma et al 2004). Tyto houby uplatňují bakteriální typ smíšené fermentace využívající enzym PFL k degradaci pyruvátu místo PDH či PFO, které používají N. ovalis a trichomonády. Obr. 4: Spekulativní metabolické schéma hlavních drah metabolismu sacharidů v nálevníkovi Trimyema compressum (Goosen et al. 1990). Konečné produkty jsou v rámečku. Zkratky: AcCoA, acetyl-coa; Hyd, hydrogenáza; PEP, fosfoenolpyruvát; PFL, pyruvát:formát lyáza; PFO, pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáza; PYR, pyruvát, X ox red, neznámý přenašeč elektronů. 12

13 4. Hydrogenosomy anaerobních hub Houby tvoří monofyletickou, avšak morfologicky a biochemicky velmi rozmanitou říši eukaryot. Tento taxon nezahrnuje jen velmi dobře prostudované modelové organismy jako jsou pekařské kvasinky Saccharomyces cerevisiae, dále kvasinky Schizosaccharomyces pombe a plísně Neurospora crassa či Aspergillus nidulans, ale také pouze sporadicky prozkoumané půdní, vodní či symbiotické houby jako jsou například anaerobní chytridiomycetní houby gastro-intestinálního traktu býložravých savců jako je Neocallimastix frontalis nebo Piromyces. Většina zkoumaných hub patří do taxonů Ascomycota, Basidiomycota a Zygomycota a obsahují mitochondrie, které mají různě velký genom (Bullerwell and Lang 2005). Většina mitochondriálních proteinů je kódována v jádře, enzymy jsou syntetizovány v cytoplasmě a následně importovány do mitochondrií. Pro zajímavost byly provedeny pokusy, které ukázaly, že určité skupiny mutantních organismů si byly schopny udržet funkční mitochondrie i při absenci mitochondriálního genomu. Některé kvasinky známé jako petites, což jsou právě mutanty postrádající funkční mitochondriální genom, jsou plně schopné růstu, avšak neumí respirovat a růst na nefermentativních substrátech (Contamine and Picard 2000). Tato rarita však byla objevena i v přírodě, kdy byly izolovány dva kmeny kvasinek, Schizosaccharomyces japonicus var. japonicus a S. japonicus var versatiles, které postrádají cytochromy a jsou deficientní v respiraci, přesto si udržely plně funkční mtdna (Bellerwell and Lang 2005). Tyto kvasinky jsou proto považovány za přechodný evoluční článek mezi houbami schopnými respirovat (díky mitochondriím) a těmi, které úplně postrádají mtdna. Existují však tzv. chytridiomycetní houby, mezi něž patří například Piromyces sp. Neocallimastix sp. či N. frontalis, které nemají mitochondrie, obsahují však hydrogenosomy (van der Giezen et al. 1997) a vykazují bakteriální typ smíšené fermentace. Což dokazuje fakt, že jsou-li tyto organismy kultivovány v médiu s celulózou, glukózou a fruktózou, produkují kromě vodíku a CO 2 i formát, acetát, sukcinát, laktát a etanol (Akhmanova et al. 1999; Boxma et al. 2004). Tato smíšená fermentace je velmi blízká bakteriálnímu typu smíšené fermentace dobře známé u fakultativně anaerobních střevních bakterií Escherichia coli. Anaerobní chytridiomycetní houby zahrnují mnoho druhů podstatných pro správné fungování ekosystému bachoru (předžaludek přežvýkavců) a produkují širokou paletu enzymů glykosyl hydroláz, xylanáz či celuláz, které jsou nezbytné pro trávení rostlinné biomasy na jednodušší a lépe metabolizovatelné substráty, jako jsou jednoduché cukry (Teunissen 1993; Chen et al. 1995). 13

14 4.1 Hydrogenosomální metabolismus Piromyces a Neocallimastix Hydrogenosomy těchto organismů jsou doposud nejvíce prostudované hydrogenosomy chytridiomycet a významně se odlišují od hydrogenosomů trichomonád i anaerobních nálevníků, co se metabolismu i struktury týče. Velký rozdíl je v tom, že u nich nebyla nalezena PFO, kterou vlastní například Trichomonas vaginalis, ani PDH, kterou si udržel N. ovalis, ale jejich klíčový enzym metabolismu pyruvátu je pyruvát:formát lyáza (PFL) (Akhmanova et al 1999). Tento enzym byl detekován jak v hydrogenosomech, tak v cytoplasmě (viz obrázek 5) (Hackstein 1999). V obou případech pak tento enzym katalyzuje reakci, kdy z pyruvátu vzniká acetyl-coa a formát. V Neocallimastix a Piromyces je lokalizovaná glykolýza v cytoplasmě, kdy je v procesu degradace sacharidů tvořen laktát, sukcinát, etanol. Podíl výsledných produktů však velmi závisí na koncentraci fruktózy (viz obrázek 6), která mění charakter fermentace, jak bylo dokázáno na Piromyces sp. E2 (Boxma et al. 2004). V cytoplasmě je také lokalizován i nekompletní cyklus trikarboxylových kyselin (TCA) (Akhmanova et al. 1998), přičemž byly identifikovány enzymy malát dehydrogenáza, akonitáza a acetohydroxyacid reduktoizomeráza (Akhmanova et al. 1998). Jak bylo řečeno výše, hlavní roli v metabolismu chytridních hydrogenosomů hraje PFL, která nevytváří žádné redukční ekvivalenty, jako je tomu u PFO či PDH. V rozporu s tímto tvrzením však byla naměřena nízká aktivita PFO v Neocallimastix sp. L2 a N. patriciarum (Yarlett et al. 1986; O Fallon et al. 1991). Nicméně pozorování údajné aktivity PFO nebylo nikdy podloženo charakterizací enzymu či identifikací PFO genu v těchto organismech, tudíž by se tato skutečnost musela více přezkoumat (Hackstein 1999). Přesto není PFO světu hub úplně cizí. Je známo, že Saccharomyces a jiné houby obsahují enzymy nezbytné pro biosyntézu methioninu, což jsou v podstatě sfúzované proteiny domén PFO a fragmentů redoxních enzymů (Horner et al. 1999). 14

15 Obr. 5: Spekulativní schéma hlavních metabolických drah glukózy Piromyces sp. E2. zahrnující konečné metabolity (Akhmanova et al. 1999). Zkratky: malát DH, malát dehydrogenáza; LDH, laktát dehydrogenáza; PFL, pyruvát:formát-lyáza; PEPCK, fosfoenolpyruvát karboxykináza; ADH, alkohol dehydrogenáza; AST, acetát:sukcinát CoA-transferáza; sukcinát DH, sukcinát dehydrogenáza; IDH, isocitrát dehydrogenáza; AAC, ADP/ATP přenašeč; OAA, oxaloacetát; PEP, fosfoenolpyruvát; PK, pyruvát kináza; ACDH, acetaldehyd dehydrogenáza; STK, sukcinát thiokináza. Konečné produkty jsou etanol, formát, acetát, laktát, sukcinát. 15

16 4.2 Vliv fruktózy na podíl konečných produktů Obrázek 6 ukazuje schéma metabolismu anaerobních chytridiomycetních hub při různých koncentracích fruktózy. Metabolismus sacharidů probíhá přes meziprodukt fosfoenolpyruvát (PEP), který je v cytoplasmě přeměněn buď na pyruvát, který může být dále rozštěpen pomocí PFL na formát a acetyl-coa či je transportován do hydrogenosomů, nebo je přeměněn na oxaloacetát a dále na malát, který je transportován do organely a dekarboxylován jablečným enzymem na pyruvát, což poskytuje elektrony na redukci dvou H + za vzniku molekulárního vodíku. Vysoká koncentrace fruktózy (B) nepřispívá ke tvorbě vodíku pomocí [FeFe] hydrogenázy (Davidson et al. 2002), jelikož se z fosfoenolpyruvátu netvoří (nebo jen ve velmi malém množství) oxaloacetát a následně ani malát, který by byl transportován do hydrogenosomů, přičemž tvorba vodíku je na tomto kroku závislá. Následující reakce probíhající v hydrogenosomech jsou již jen podružné cesty anaerobního energetického metabolismu a ukazují na kontrolu a správné ladění intra-hydrogenosomálního prostředí. Při nižší koncentraci (0,1%) fruktózy skoro 50% glykolytického toku vede k tvorbě malátu a jeho téměř kompletnímu transportu do hydrogenosomů, kde se následně formuje vodík. V porovnání vzniká o více než 20% více vodíku než při vyšší koncentraci fruktózy (Boxma et al 2004). 16

17 Obr. 6: Změny v toku metabolitů Piromyces indukované různými koncentracemi fruktózy v médiu (Boxma et al 2004). Tloušťka šipek odpovídá proporcionálně spočítanému toku v přítomnosti 0,1% fruktózy (A) a 0,5% fruktózy (B). Zkratky jsou stejné jako na obrázku 5. 17

18 5. Hydrogenosomy trichomonád Hydrogenosomy byly poprvé objeveny v anaerobních parabasalidních bičíkovcích trichomonádách - Tritrichomonas foetus (Lindmark and Müller 1973). Dále byly hydrogenosomy objeveny v lidském parazitu T. vaginalis a v parazitech plazů Monocercomonas sp. Hydrogenosomy T. vaginalis jsou pravděpodobně nejvíce prostudované organely svého druhu. Byla velmi dobře určena jejich role v energetickém metabolismu a nedávno u nich byla objevena i schopnost skládat Fe-S centra, důležité kofaktory mnohých proteinů. V této kapitole se zaměřím hlavně na T. vaginalis, protože je medicínsky velmi důležitá, její genom byl nedávno kompletně osekvenován a poskytuje nám mnoho důležitých, často i nečekaných informací o metabolismu hydrogenosomů trichomonád (obrázek 7). 5.1 Metabolismus hydrogenosomů trichomonád Substráty, které jsou nezbytné pro katabolický metabolismus hydrogenosomů, pocházejí z glykolýzy probíhající v cytosolu. Hlavní substrát je pyruvát získaný z PEP pomocí pyruvát kinázy, přičemž je pyruvát dále transportován do hydrogenosomu. Pyruvát lze též získat v procesu reverzibilní oxidativní dekarboxylace malátu pomocí NAD-specifického malic enzymu (též malát dehydrogenáza dekarboxylující) uvnitř hydrogenosomu, přičemž tento enzym využívá NAD + jako akceptor elektronů přednostně před NADP + za jeho současné redukce na NAD(P)H (Drmota et al. 1996; Doležal et al. 2003). Pyruvát podléhá v hydrogenosomech oxidativní dekarboxylaci pomocí pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy (PFO), přičemž vzniká ekvimolární množství acetyl-coa, CO 2 a dva elektrony. Tyto elektrony jsou předány na nízkomolekulární [2Fe-2S] přenašeč ferredoxin, který je předá enzymu [FeFe] hydrogenáze (neboli hydrogen:ferredoxin oxidoreduktáze), která redukuje protony za vzniku molekulárního vodíku, přičemž dochází k reoxidaci ferredoxinu. Acetyl-CoA je dále přeměněn na další konečný produkt metabolismu - acetát a vedlejší produkt CoA, a to díky enzymu acetát:sukcinát-coa transferáze (ASCT). CoA je přenesen na sukcinát za vzniku sukcinyl-coa, který následně štěpí sukcinát thiokináza (STK, též sukcinyl-coa syntetáza) na CoA-SH a sukcinát. V tomto kroku ztrácí sukcinyl-coa vysoce energetickou thioesterovou vazbu a dochází k substrátové fosforylaci ADP na ATP. Ráda bych se zmínila, že bylo v genomu T. vaginalis identifikováno devět homologních [Fe] hydrogenáz, které obsahují tzv. H centrum, které katalyzuje aktivaci vodíku 18

19 a tvoří ho [4Fe4S] skupina spojená přes cysteinový můstek s [2Fe] skupinou (Pütz et al. 2006). Správná činnost hydrogenáz však vyžaduje aktivitu specializovaných proteinů maturáz neboli Hyd proteinů, mezi něž patří proteiny HydE, HydF a HydG, a které byly v nedávné době identifikovány i u T. vaginalis (Pütz et al. 2006; Meyer 2007). Dlouho se předpokládalo, že hydrogenosomy trichomonád neobsahují žádné komponenty mitochondriálního dýchacího řetězce. Nedávno však bylo objeveno, že jsou v hydrogenosomech T. vaginalis přítomny 2 podjednotky NADH dehydrogenázy (též NADH: ubichinon oxidoreduktáza, komplex I) (Hrdý et al. 2004). Tento komplex I v mitochondriích či bakteriích katalyzuje oxidaci NADH spojenou s redukcí membránově vázaného ubichinonu (koenzym Q). Přenos elektronů přes redoxní centra (FMN, Fe-S skupiny) komplexu I je navíc spojen s přesunem protonů, který tak vytváří elektrochemický gradient na vnitřní mitochondriální či bakteriální membráně, jenž je hnací silou pro tvorbu ATP pomocí F 1 F 0 ATP syntázy. Analýzy hydrogenosomální NADH dehydrogenázy odhalily, že je tento enzym heterodimer. Jedna podjednotka obsahuje FMN kofaktor a [4Fe-4S] skupinu, druhá [2Fe-2S] skupinu (Hrdý et al. 2004). Tento enzym přenáší v hydrogenosomech elektrony z NADH na ferredoxin, a propojuje oxidaci NADH s produkcí vodíku přes enzym hydrogenázu. Zahrnutí komplexu I do tvorby vodíku poskytuje další důkaz, že by mitochondrie a hydrogenosomy mohly být aerobní a anaerobní homology jedné prapůvodní organely (Hrdý et al. 2004). 5.2 Metabolismus polyaminů V hydrogenosomech trichomonád se odehrává dihydrolázová dráha argininu, prekursoru biosyntézy polyaminů, což jsou dusíkaté sloučeniny, které se ve fyziologických podmínkách vážou k fosfolipidům, nukleovým kyselinám a proteinům a ovlivňují stabilitu nukleových kyselin, konformaci molekul, genovou expresi, diferenciaci buňky a chrání buňku před oxidativním stresem (Feuerstein et al. 1990). V této dráze je arginin nejprve přeměněn na citrulín pomocí arginin deiminázy. Ten je poté přetvořen na ornitin a karbamoylfostát prostřednictvím enzymu ornitin karbamoyltransferázy. Z ornitinu dále vzniká produkt putrescín díky ornitin dekarboxyláze, který je dále konvertován na spermidin a nakonec na spermin (Linstead et al. 1983; Pegg 1986). Karbamoylfosfát je makroergní molekula, která je rozštěpena na bikarbonát a amoniak díky karbamát kináze, která zároveň fosforyluje jednu molekulu ADP na ATP. Tato dráha je pravděpodobně důležitý zdroj ATP pro trichomonády in situ, trichomonády kultivované in vitro využívají jako hlavní zdroj energie glukózu a dihydrolázová dráha dodává asi jen 1% ATP (Yarlett et al. 1996). 19

20 5.3 Metabolismus aminokyselin Analýza genomu T. vaginalis (Carlton et al. 2007) přinesla řadu nečekaných výsledků. Některé se týkají hydrogenosomálního metabolismu aminokyselin. Předpokládalo se totiž, že metabolismus aminokyselin hydrogensosomů zahrnuje pouze dekarboxylaci argininu a transaminace. Byly však objeveny geny kódující proteiny pro konverzi glycinu a serinu, glycin dekarboxylázový komplex (GDC) a serin hydroxymethyltransferázu (SHMT) Glycin dekarboxylázový komplex a serin hydroxymethyltransferáza GDC je multienzymový komplex nacházející se ve všech organismech, složený ze čtyř volně asociovaných komponent P proteinu (homodimer obsahují pyridoxal fosfát, štěpí glycin), H proteinu (monomerní protein obsahující lipoamid, dekarboxyluje glycin), T proteinu (monomerní protein vyžadující tetrahydrofolát jako kofaktor) a L proteinu (dihydrolipoamid dehydrogenáza, homodimer s FAD) (Mukherjee et al. 2006). GDC eukaryot je výlučně mitochondriální enzym katalyzující oxidativní dekarboxylaci a deaminaci glycinu, čímž vzniká CO 2, NH 3 a NADH. Zbylý methylenový uhlík je přenesen na tetrahydrofolát (THF) za vzniku N 5, N 10 -methylen tetrahydrofolátu, který přenáší jednu uhlíkatou jednotku do reakce s glycinem katalyzované SHMT, vedoucí ke vzniku serinu. SHMT trichomonád je dimerní, pyridoxal fosfát-dependentní enzym katalyzující reverzibilní přeměnu serinu a THF na glycin a N 5, N 10 -methylen THF, což je základní metabolická cesta inkorporace jedné uhlíkaté jednotky do mnoha buněčných metabolitů (Schirch and Szebenyi 2005). V genomu T. vaginalis byly objeveny pouze geny kódující proteiny H a L, geny pro proteiny T a P zatím nebyly v hydrogenosomech detekovány (Mukherjee et al. 2006). Tyto geny jsou pravděpodobně odlišné od známých homologů, proto zatím nebyly identifikovány, ale pokud nejsou opravdu přítomné, pak jsou předpokládané funkce celého komplexu jen těžko představitelné. Navíc dihydrofolát reduktáza, enzym nutný k přeměně folátu na THF, také zatím nebyl detekován v genomu T. vaginalis, což činí záhadné funkční spojení SHMT a GDC přes THF a také samotnou aktivitu SHMT. Budoucnost snad přinese jednoznačné odpovědi. 20

21 5.4 Mechanismus tvorby Fe-S skupin Fe-S skupiny jsou anorganické kofaktory považované za prvotní katalyzátory v evoluci biomolekul (Lill R a Mühlenhoff 2008), které jsou zcela nepostradatelné pro řadu proteinů k jejich správné biologické činnosti. Proces, který zajišťuje správné umístění těchto kofaktorů na proteiny, probíhá jak v mitochondriích, tak v hydrogenosomech trichomonád (Tachezy et al. 2001; Sutak et al. 2004), je to tedy jejich společný znak. Fe-S skupiny mohou být na apoproteinech poskládány i bez přispění chemických katalyzátorů, zpravidla je však tento proces v buňce zprostředkováván pomocí speciálního procesu syntézy Fe-S komplexů (ISC assembly). V zásadě jsou Fe-S skupiny nejprve skládány na proteinovém lešení, načež jsou přeneseny na akceptorový apoprotein. První krok vyžaduje aktivitu komplexu IscS/Isd11 (též cystein desulfuráza). Tento enzym poskytuje cystein jako donor síry pro proteinový skelet IscU. Další komponenta, IscA, může také působit jako alternativní proteinové lešení pro maturaci Fe-S komplexů (Johnson and Dean 2005). Nedávné analýzy ukázaly účast hydrogenosomálního frataxinu na metabolismu železa. Exprese tohoto proteinu v kmenu S. cerevisiae postrádající frataxin uspěšně komplentovala růstový defekt mutanta. Hydrogenosomální frataxin byl schopen zastoupit mitochondriální homolog při syntéze hemu a FeS center (Doležal et al. 2007). Ke správnému skládání Fe-S skupin jsou rovněž potřebné redukční ekvivalenty, které poskytuje [2Fe2S] ferredoxin. Systém chaperonů zahrnující Hsp 70, J-typ kochaperon a ADP/ATP nukleotid exchange faktor, se pravděpodobně následně účastní druhého kroku, kdy jsou Fe-S skupiny přeneseny na apoprotein a proběhne maturace celého komplexu (Sutak et al. 2004). 21

22 5.5 Import proteinů do hydrogenosomů Doposud nebyla v hydrogenosomech trichomonád objevena DNA, což poukazuje na to, že jsou hydrogenosomální proteiny kódovány v jádře, syntetizovány na polysomech a následně importovány do cílové organely. Bylo provedeno mnoho studií, které měly za úkol odhalit, jak funguje tento import a které komponenty jsou do tohoto procesu zapojeny. Laboratorní testy ukázaly, že je pro import proteinů do hydrogenosomů nezbytná neporušená organela ochotná udržet elektrochemický potenciál, cytosolické faktory, a že je tato reakce závislá na teplotě (optimum je 37 C) a ATP (Bradley et al. 1997). Vazba a translokace proteinů do hydrogenosomů vyžaduje také u většiny proteinů přítomnost cílové N-terminální presekvence aminokyselin, které nejsou přítomny u maturovaných proteinů, jelikož je odštěpí hydrogenosomální procesovací peptidáza. Porovnání presekvencí několika hydrogenosomálních proteinů odhalilo konzervované složení často se objevovaly hydrofobní či hydroxylované aminokyseliny, velmi významný je leucin na druhé pozici za methioninem, arginin společně s asparaginem či fenylalaninem se pak vyskytovaly velmi blízko místa odštěpení presekvence (Bradley et al. 1997). Zajímavé výsledky ohledně presekvencí přinesly nedávné pokusy prováděné na enzymu thioredoxin reduktáze, která vystupuje v obraně proti peroxidům. Bylo objeveno, že jedna její isoforma nevyžaduje k transportu do hydrogenosomu N-terminální presekvenci, ale stačí jí vnitřní cílový signál na molekule proteinu, jehož přesná povaha však zatím není známa (Mentel et al. 2008). Ve vnější membráně hydrogenosomů byly identifikovány homologní komponenty importního komplexu vnitřní membrány (TIM), konkrétně Tim23, Tim17, Hsp 70 a Pam 18 (Mentel et al. 2008). V hydrogenosomech se zřejmě vyskytují i homologní komponenty mitochondriálního importního komplexu vnější membrány (TOM) konkrétně Tom 40 a Sam 50. V mezimembránovém prostoru se nacházejí tzv. malé Tim proteiny fungující jako heterohexamerní transportery prekurzorů v rámci tohoto prostoru (Pavel Doležal, osobní sdělení). 22

23 5.6 Antioxidační mechanismy trichomonád T. vaginalis je anaerobní organismus obývající lidský urogenitální trakt, kde je poměrně vysoká koncentrace kyslíku do 60 µm. Tento organismus používá v metabolismu glukózy dva charakteristické hydrogenosomální enzymy, které jsou velmi senzitivní ke kyslíku - PFO a [Fe] hydrogenázu. Bylo však dokázáno, že trichomonády nejlépe rostou při nízké koncentraci tohoto plynu (Pütz et al. 2005). Vyšší koncentrace je však pro ně smrtelná (Ellis et al. 1994), proto musí trichomonády vlastnit speciální obranné mechanismy proti kyslíku a jeho metabolitům, aby ochránily všechny důležité enzymy. Trichomonády nevlastní ani antioxidant glutation či jiný obdobný thiol, proto se předpokládá, že hlavní nízkomolekulární antioxidant kyslíku je cystein (Coombs et al. 2004). Trichomonády dále obsahují cytosolické NADH a NADPH oxidázy, které zabraňují pronikání kyslíku do hydrogenosomů (Coombs et al. 2004; Smutná et al. 2009), přičemž první enzym redukuje kyslík na vodu a druhý na peroxid vodíku. Jak v cytosolu, tak v hydrogenosomech je přítomná superoxid dismutáza (SOD), která přeměňuje dvě molekuly superoxidového radikálu na peroxid vodíku a kyslík (Ellis et al. 1994; Mentel et al. 2008). Nicméně kataláza, která by odstraňovala peroxid vodíku, byla detekována pouze v Tritrichomonas foetus, nikoli v T. vaginalis (Page-Sharp et al. 1996; Mentel et al. 2008). Nedávno však byly v hydrogenosomech objeveny dva enzymy, které mají peroxidázovou aktivitu homodimerní rubrerytrin a peroxiredoxin (Pütz et al. 2005; Mentel et al. 2008). Oba jsou funkčně příbuzné s antioxidačním systémem detekovaným v cytosolu T. vaginalis, který se skládá z thioredoxin reduktázy, thioredoxinu a thioredoxin peroxidázy, které společně vystupují v ochraně proti kyslíku a pravděpodobně také redukují cystein a udržují tak jeho hladinu v buňce (Coombs et al. 2004; Mentel et al. 2008). Další protein, který byl detekován v T. vaginalis a který se pravděpodobně účastní ochrany před kyslíkovými radikály, je flavodiiron protein (FDP) patřící do superrodiny flavodiiron proteinů třídy A (Smutná et al. 2009). Tento hydrogenosomální enzym je dimer složený ze dvou identických podjednotek, které nekovalentně váží FMN. FDP zajišťuje redukci kyslíku na vodu a je též schopný přijmout elektrony od ferredoxinu, což by mohlo také hrát roli v ochraně před kyslíkem (Smutná et al. 2009). 23

24 Obr. 7: Mapa metabolismu hydrogenosomů T. vaginalis. Oranžová barva reprezentuje enzymy energetického metabolismu. Ferredoxin (žlutá barva) dodává elektrony hydrogenáze, která syntetizuje molekulární vodík. Předpokládaná aktivita proteinů, které byly odhaleny sekvenací genomu: růžová tvorba Fe-S center a maturace hydrogenázy; modrá systém zbavující organelu nebezpečných produktů kyslíku; žlutá metabolismus aminokyselin; zelená translokace proteinů a jejich maturace; Zkratky Fdx; SOD, superoxid dismutáza; Trx, thioredoxin; TrxP, thioredoxin peroxidáza; TrxR, thioredoxin reduktáza; HydG, HydF, HydE, pomocné maturázy Fe hydrogenázy; Jac1 a Mdj1, chaperony obsahující J doménu; Mge, nukleotid exchange faktor; HPP, hydrogenosomální peptidáza (Carlton et al. 2007). 24

25 6. Porovnání metabolismu hydrogenosomů chytridiomycetních hub, trichomonád a nálevníků Z biochemických a fylogenetických analýz je jasně patrné, že metabolismus hydrogenosomů těchto tří skupin organismů, stejně jako kompartmentalizace mnoha jejich enzymů, metabolity a konečné produkty jsou v mnohých směrech specifické a odlišné. Největší rozdíly v metabolismu hydrogenozomů těchto organismů najdeme pravděpodobně ve zpracování pyruvátu, které se liší v klíčovém enzymu konvertujícím pyruvát na acetyl-coa. Hydrogenosomy trichomonád a nálevníka Dasytricha používají k tomuto ději PFO, přičemž se tvoří acetyl-coa a CO 2 a elektrony, které jsou přeneseny na ferredoxin a dále na hydrogenázu za vzniku molekulárního vodíku. Anaerobní nálevníci (N. ovalis) používají k dekarboxylaci pyruvátu PDH, přičemž elektrony putují na NAD + vzniku NADH, které je oxidováno hydrogenázou zpět na NAD + za vzniku molekulárního vodíku či jsou elektrony předány rhodochinonu a protony přepumpovány přes komplex I do mezimembránového prostoru. Anaerobní houby (Piromyces a Neocallmastix) stejně jako nálevník Trimyema pak používají enzym PFL, přičemž vzniká acetyl-coa a formát. Enzym PFL je u Piromyces a Neocallimastix lokalizován též v cytosolu, kde zprostředkovává tentýž děj jako v hydrogenosomech. Podobný osud najdeme ve zpracování cytoplasmatického fosfoenolpyruvátu (PEP) u všech těchto organismů, kdy je PEP konvertován na oxaloacetát a dále na malát pomocí enzymů fosfoenolpyruvát karboxykinázy a malát dehydrogenázy, přičemž výsledný malát je transportován do hydrogenosomu. U trichomonád a Neocallimastix je dále přeměněn na pyruvát pomocí malic enzymu (Hackstein 1999). U N. ovalis je malát transportovaný do hydrogenosomů konvertován na fumarát (Boxma et al. 2005). Rozdíl najdeme v produkci redukčních ekvivalentů. PFL chytridiomycetých hub nevytváří žádné redukční ekvivalenty, a to jak v hydrogenosomech, tak v cytoplasmě, oproti PFO trichomonád, která redukuje ferredoxin, a PDH nálevníků, který vytváří NADH. Stojí také za povšimnutí, že syntézu ATP v trichomonadách i chytridiomycetech katalyzují dva stejné enzymy STK (sukcinát thiokináza) a ASCT (sukcinyl-coa:acetát CoA transferáza). Při této reakci dává acetyl-coa vzniknout acetátu pomocí enzymu ASCT, který zárověň konvertuje sukcinát na sukcinyl-coa. STK pak využije této sloučeniny na trvorbu ATP. U nálevníků pravděpodobně vzniká ATP přeměnou acetyl-coa či butyryl-coa na acetát nebo butyrát pomocí enzymů acetyl-coa syntázy a butyryl-coa syntázy. za 25

26 7. Hydrogenosomy a mitochondrie V podstatě od chvíle, kdy došlo k objevení hydrogenosomů, spekulují vědci o jejich původu a příbuznosti s mitochondriemi. Studie těchto organel na rozličných mikroorganismech přinesly dvě možné teorie. První výklad se opírá o metabolismus hydrogenosomů a jejich dva základní enzymy PFO a hydrogenázu, které nalezneme u fermentujících a metanogenních bakterií, a předpokládá, že tato organela vznikla nezávisle z endosymbiotické buňky, kterou pohltila prokaryotní buňka (Bradley et al. 1997). V poslední době se však vychází z předpokladu, že hydrogenosomy a mitochondrie jsou homologní organely mající společného fakultativně anaerobního předka, který se spojil s prapůvodní prokaryotní buňkou, ze které následně vznikli první eukaryotní organismy (Bradley et al. 1997; Hackstein et al. 2006). Postupně se tyto organismy i se svými endosymbionty začaly přizpůsobovat odlišným podmínkám prostředí, přičemž ztratily či naopak získaly nové vlastnosti a enzymy, a daly vzniknout dvěma rozdílným organelám. Pokusím se teď shrnout jejich společné a odlišné znaky. Základní podobnost najdeme již v morfologii, jelikož obě organely obklopuje dvojitá membrána a vnitří membrána některých hydrogenosomů (N. ovalis) tvoří kristy a obsahuje kardiolipin, což je nepostradatelný lipid vnitřní mitochondriální membrány, který by mohl v hydrogenosomech vystupovat v mnoha rolích jako je import proteinů, apoptóza a další (de Rosa et al. 2006). V hydrogenosomální membráně T. vaginalis a T. fotetus nebyl detekován (Guschina et al. 2009). Co se týče biochemických znaků, obě tyto organely umí vyrábět ATP jako zdroj energie. Liší se však v množství získaného ATP a v konečných akceptorech elektronů. Typické mitochondrie používají jako akceptor kyslík a hydrogenosomy redukují protony na molekulární vodík (Hackstein 1999). Obě organely také produkují ATP v kroku substrátové fosforylace katalyzované STK, ačkoli je před tím sukcinyl-coa, hlavní substrát této reakce, tvořen různými mechanismy (Müller 1973). Podobnost najdeme také ve zpracování malátu, který obě organely dekarboxylují na pyruvát, jenž je následně přeměněn na acetyl-coa, ze kterého však v hydrogenosomech vzniká acetát, zatímco v mitochondriích vstupuje do cyklu trikarboxylových kyselin (Müller 1973, Dyall 2000). S mitochondriemi mají hydrogenosomy dále společné kódovaní proteinů v jádře, což znamená jejich syntézu na volných ribosomech a obdobný mechanismus translokace do cílových organel. Ve většině případů je potřebná signální presekvence, která je lokalizována na proteinech obou organel na N-konci, odstraněna z maturujícího proteinu a má podobné složení aminokyselin (met leu ser). Nejnápadnější rozdíl je v délkách presekvencí, 26

27 hydrogenosomální mají 5 14 aminokyselin, zatímco savčí a kvasinkové mitochondriální presekvence jsou dlouhé aminokyselin, byť i sekvence dlouhé pouhých 7 12 aminokyselin jsou schopné translokace do této organely. Hydrogenosomy trichomonád jsou místem syntézy Fe-S center (Tachezy et al. 2001), což je nepostradatelná činnost eukaryotických mitochondrií, a mají také podobné některé antioxidační mechanismy. Hydrogenosomy naopak postrádají řadu podstatných mitochondrálních charakteristik, což může být způsobeno sekundárními ztrátami v rámci adaptace na anaerobní podmínky. Mezi odlišné znaky patří (s výjimkou N. ovalis) absence DNA, Krebsova cyklu (N. frontalis má pouze nekompletní) a též nemají aerobní energetický systém, tj. cytochrom dependentní elektron transportní řetězec, oxidativní fosforylaci (Müller 1973; Dyall 2000) ani F 0 F 1 ATPázu. Velký rozdíl je i v konečných metabolitech - hydrogenosomy produkují H 2 a CO 2, kdežto aerobní mitochondrie vždy CO 2 a H 2 O. Hydrogenosomy však mají také enzymy a proteiny, které nejsou u aerobních mitochondrií přítomny. Jendá se zejména o PFO a PFL a hydrogenázu, které vystupují v metabolismu pyruvátu a následné tvorbě vodíku. Zajímavé výsledky ohledně podobnosti hydrogenosomů s mitochondriemi vyšly z experimentů prováděných na N. ovalis. V hydrogenosomech N. ovalis byly identifikovány typicky mitochondriální proteiny kódované v jádře, jako je pyruvát dehydrogenáza a komplex II (Boxma 2005). Hydrogenosomy N. ovalis jsou též senzitivní k inhibitorům mitochondriálního komplexu I a produkují sukcinát jako hlavní metabolický produkt, což je biochemický znak typický pro anaerobní mitochondrie (Boxma 2005). V kontrastu s klasickými mitochondriemi není u hydrogenosomů N. ovalis kyslík konečný akceptor elektronů, vzniklých při oxidaci glukózy, nýbrž N. ovalis předává tyto elektrony na endogenní komponenty jako je pyruvát či fumarát (Boxma 2005; Martin 2005). Zbylá dávka elektronů je předána protonům za vzniku molekulárního vodíku jako dalšího konečného metabolického produktu (Martin 2005). K redukci fumarátu není vyžadována v hydrogenosomech N. ovalis přítomnost ubichinonu, jako je tomu u aerobních mitochondrií, nýbrž je nutný rhodochinon, který má nižší redoxní potenciál. Hydrogenosomy N. ovalis jsou často shledávány jako chybějící článek mezi mitochondriemi a hydrogenosomy, a to díky přítomnosti genů kódujících komponenty mitochondriálního dýchacího řetězce (komplex I a II) a schopnosti tvorby vodíku (Boxma 2005). 27

28 8. Obrázková příloha Obrázek A : Pohled na různé buňky obsahující hydrogenosomy (H). a) anaerobní houba Neocallimastix; b) bachorový nálevník; c, d) Tritrichomonas foetus v transmisním elektronovém mikroskopu. (Ax) axostyl, (C) kosta, (ER) endoplasmatické retikulum, (GL) granula glykogenu, (F) přední bičík, (N) jádro, (P) pelta, (V) vakuoly, (RF) zpětný bičík. (Obrázek a od Benchimol et al. 1997; Obrázek b - d od Benchimol, nepublikováno). 28

29 Obrázek B: Cytochemie T. foetus na vápník (šipky) (Benchimol et al 2001). Obrázek C: Hydrogenosom (H) v procesu autofágie. Pozorování dvojité membrány (šipky) autofágní vakuoly obklopující neporušený hydrogenosom. (Benchimol 1999) 29

30 9. Seznam použité literatury Akhmanova A, Voncken F, van Alen T, van Hoek A, Boxma B, Vogels G, Veenhuis M, Hackstein JH. A hydrogenosome with a genome. Nature. 1998, Akhmanova A, Voncken FG, Harhangi H, Hosea KM, Vogels GD, Hackstein JH. Cytosolic enzymes with a mitochondrial ancestry from the anaerobic chytrid Piromyces sp. E2. Mol Microbiol Dec;30(5): Akhmanova A, Voncken FG, Hosea KM, Harhangi H, Keltjens JT, op den Camp HJ, Vogels GD, Hackstein JH. A hydrogenosome with pyruvate formate-lyase: anaerobic chytrid fungi use an alternative route for pyruvate catabolism. Mol Microbiol. 1999;32(5): Benchimol M, Johnson PJ, de Souza W. Morphogenesis of the hydrogenosome: an ultrastructural study. Biol Cell. 1996;87(3): Benchimol M. Hydrogenosome autophagy: An ultrastructural and cytochemical study. Biol Cell Jun;91(3): Benchimol M. The hydrogenosome peripheral vesicle: similarities with the endoplasmic reticulum. Tissue Cell Feb;40(1): Epub 2007 Nov 26. Boxma B., Voncken F, Jannink S, van Alen T, Akhmanova A, van Weelden SW, van Hellemond JJ, Ricard G, Huynen M, Tielens AG, Hackstein JH. The anaerobic chytridiomycete fungus Piromyces sp. E2 produces ethanol via pyruvate:formate lyase and an alcohol dehydrogenase E. Mol Microbiol. 2004;51(5): Boxma B., Rob M. de Graaf, Georg W. M. van der Staay, Theo A. van Alen, Guenola Ricard, Toni Gabaldón, Angela H. A. M. van Hoek (2005) An anaerobic mitochondrion that produce hydrogen. Nature Mar 3;434(7029):74-9. Bradley PJ, Lahti CJ, Plümper E, Johnson PJ. Targeting and translocation of proteins into the hydrogenosome of the protist Trichomonas: similarities with mitochondrial protein import. EMBO J Jun 16;16(12): Bullerwell CE, Lang BF. Fungal evolution: the case of the vanishing mitochondrion. Curr Opin Microbiol. 2005;8(4): Carlton JM, Hirt RP, Silva JC, Delcher AL, Schatz M, Zhao Q, Wortman JR, Bidwell SL, Alsmark UC, Besteiro S, Sicheritz-Ponten T, Noel CJ, Dacks JB, Foster PG, Simillion C, Van de Peer Y, Miranda-Saavedra D, Barton GJ, Westrop GD, Müller S, Dessi D, Fiori PL, Ren Q, Paulsen I, Zhang H, Bastida-Corcuera FD, Simoes-Barbosa A, Brown MT, Hayes RD, Mukherjee M, Okumura CY, Schneider R, Smith AJ, Vanacova S, Villalvazo M, Haas BJ, Pertea M, Feldblyum TV, Utterback TR, Shu CL, Osoegawa K, de Jong PJ, Hrdy I, Horvathova L, Zubacova Z, Dolezal P, Malik SB, Logsdon JM Jr, Henze K, Gupta A, Wang CC, Dunne RL, Upcroft JA, Upcroft P, White O, Salzberg SL, Tang P, Chiu CH, Lee YS, Embley TM, Coombs GH, Mottram JC, Tachezy J, Fraser-Liggett CM, Johnson PJ. Draft genome sequence of the sexually transmitted pathogen Trichomonas vaginalis. Science. 2007;315(5809):

31 Chen H, Li XL, Ljungdahl LG. Biomass degrading enzymes from anaerobic rumen fungi. SAAS Bull Biochem Biotechnol. 1995;8:1-6. Contamine V, Picard M. Maintenance and integrity of the mitochondrial genome: a plethora of nuclear genes in the budding yeast. Microbiol Mol Biol Rev Jun;64(2): Coombs GH, Westrop GD, Suchan P, Puzova G, Hirt RP, Embley TM, Mottram JC, Müller S. The amitochondriate eukaryote Trichomonas vaginalis contains a divergent thioredoxinlinked peroxiredoxin antioxidant system. J Biol Chem Feb 13;279(7): Epub 2003 Nov 20. Davidson EA, van der Giezen M, Horner DS, Embley TM, Howe CJ. An [Fe] hydrogenase from the anaerobic hydrogenosome-containing fungus Neocallimastix frontalis L2. Gene. 2002;296(1-2): Doležal P, Dancis A, Lesuisse E, Sutak R, Hrdý I, Embley TM, Tachezy J. Frataxin, a conserved mitochondrial protein, in the hydrogenosome of Trichomonas vaginalis. Eukaryot Cell Aug;6(8): Epub Doležal P, Vanácová S, Tachezy J, Hrdý I. Malic enzymes of Trichomonas vaginalis: two enzyme families, two distinct origins. Gene. 2004;329: Drmota T, Proost P, Van Ranst M, Weyda F, Kulda J, Tachezy J. Iron-ascorbate cleavable malic enzyme from hydrogenosomes of Trichomonas vaginalis: purification and characterization. Mol Biochem Parasitol. 1996; 83(2): Dyall SD, Johnson PJ. Origins of hydrogenosomes and mitochondria: evolution and organelle biogenesis. Curr Opin Microbiol. 2000;3(4): Ellis JE, McIntyre PS, Saleh M, Williams AG, Lloyd D. Influence of CO2 and low concentrations of O2 on fermentative metabolism of the rumen ciliate Dasytricha ruminantium. J Gen Microbiol Jun;137(6): Ellis JE, Yarlett N, Cole D, Humphreys MJ, Lloyd D. Antioxidant defences in the microaerophilic protozoan Trichomonas vaginalis: comparison of metronidazole-resistant and sensitive strains. Microbiology Sep;140 ( Pt 9): Embley TM, van der Giezen M, Horner DS, Dyal PL, Foster P. Mitochondria and hydrogenosomes are two forms of the same fundamental organelle. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2003;358(1429): ; discussion Feuerstein BG, Pattabiraman N, Marton LJ. Molecular mechanics of the interactions of spermine with DNA: DNA bending as a result of ligand binding. Nucleic Acids Res. 1990;18(5): van der Giezen M, Sjollema KA, Artz RR, Alkema W, Prins RA. Hydrogenosomes in the anaerobic fungus Neocallimastix frontalis have a double membrane but lack an associated organelle genome. FEBS Lett. 1997;408(2):