Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze Katedra biochemie

Transkript

1 Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze Katedra biochemie PŘÍPRAVA REKOMBINANTNÍHO LIDSKÉHO CYTOCHROMU b 5 PREPARATION OF RECOMBINANT HUMAN CYTOCHROME b 5 Diplomová práce Školitel: RNDr. Václav Martínek, Ph.D. Praha 2010 Bc. Tereza Hálková

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením školitele RNDr. Václava Martínka, Ph.D. a všechny použité zdroje jsem řádně citovala. V Praze dne Tereza Hálková

3 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli, RNDr. Václavu Martínkovi, Ph.D., za zadání zajímavého tématu diplomové práce a za kvalitní vedení. Především děkuji za cenné rady, postřehy a informace, které mi k danému tématu poskytl, a za trpělivost, se kterou se mi po dobu řešení práce věnoval. Dále bych chtěla poděkovat RNDr. Věře Kotrbové, PhD. zejména za ochotu, se kterou mě zasvětila do problematiky exprese a purifikace rekombinantních proteinů a genové syntézy. Dále pak za četné rady a pomoc při řešení problémů, s nimiž jsem se v průběhu práce setkala. Tato diplomová práce vznikla za podpory grantu Grantové agentury České republiky 203/09/0812.

4 Diplomová práce 2010 Abstrakt Cytochrom b 5 je malý hemový protein. V lidském organismu se vyskytuje ve třech formách, a to vázaný v membráně endoplasmatického retikula (mikrosomální cyt b 5 ) nebo ve vnější mitochondriální membráně, ale také jako solubilní forma v cytoplasmě maturovaných erytrocytů. Cytochrom b 5 slouží zejména jako jednoelektronový přenašeč při různých reakcích, včetně reakcí katalyzovaných cytochromy P450. Jedním z cílů předkládané diplomové práce bylo připravit a izolovat solubilní králičí cytochrom b 5, a to metodou heterologní exprese v Escherichia coli BL 21 Gold. Pro expresi byl použit expresní vektor založený na plasmidu pet22b, který nesl syntetický gen kódující králičí mikrosomální cytochrom b 5, u něhož byla odstraněna část kódující C-terminální membránovou kotvu. Dále byly syntetizovány geny kódující lidský erytrocytární a mikrosomální cytochrom b 5. Geny pro lidské cytochromy b 5 byly vloženy do klonovacího vektoru puc19, amplifikovány v kompetentních buňkách E. coli DH5α a verifikovány DNA sekvenací. Následně byly zkonstruovány a ověřeny expresní vektory pet22b obsahující geny kódující lidský mikrosomální a erytrocytární cytochrom b 5. Klíčová slova: Heterologní exprese, genová syntéza, lidský cytochrom b 5, izolace - i -

5 Diplomová práce 2010 Abstract Cytochrome b 5 is a small heme protein. There are three isoforms present in human organism, one is located in the membrane of endoplasmic reticulum (microsomal cyt b5), second in the outer mitochondrial membrane and the third (soluble form) was found in cytoplasm of matured erythrocytes. The main role of cytochrome b 5 is to transport single electron in various reactions including cytochrome P450-dependent reactions. First aim of the thesis was to prepare and to isolate the soluble form of rabbit microsomal cytochrome b 5, using heterologous expression in Escherichia coli strain BL-21 Gold. The plasmid pet22b containing synthetic gene for rabbit microsomal cytochrome b 5, lacking the sequence encoding the membrane associated C-terminal domain, was used as an expression vector. The second aim was to synthesize the expression vectors carrying genes for human microsomal and erythrocytic cytochromes b 5. These genes were prepared by gene synthesis, ligated to cloning vector puc19, amplified in E. coli DH5α competent cells and their sequences were verified by DNA sequencing. Consequently the pet22b expression vectors containing genes for human microsomal and erythrocytic cytochrome b 5 were constructed and finally their suitability for heterologous expression was evaluated. Keywords: Heterologous expression, gen synthesis, human cytochrome b 5, isolation (In Czech) - ii -

6 Diplomová práce 2010 Obsah 1 Úvod Biotransformace xenobiotik MFO systém Cytochrom b Isoformy cytochromu b 5 a jejich vlastnosti Mechanismus účinku cytochromu b 5 v reakčním cyklu cytochromu P Vliv cytochromu b 5 na katalytickou aktivitu cytochromu P Heterologní exprese rekombinantního cytochromu b Escherichia coli jako nástroj v molekulární genetice Klonovací plasmid puc Expresní plasmid pet22b Cíle diplomové práce Materiál a metody Použité přístroje Použitý materiál a chemikálie Metody: Exprese a purifikace solubilního králičího cytochromu b Příprava agarových ploten Transformace buněk E. coli BL-21 Gold konstruktem založeným na expresním vektoru pet22b Kultivace transformovaných buněk E. coli BL-21 Gold metoda multi-cell colony Indukce exprese cytochromu b Dezintegrace buněk E. coli BL-21 Gold Iontově výměnná chromatografie (DEAE Sepharosa CL-6B, ph 8) Gradientová eluce cytochromu b Gelová filtrace (Sephadex G-75, ph 8) Elektroforéza SDS-PAGE Stanovení koncentrace proteinů pomocí BCA Metody: Příprava expresních vektorů nesoucích syntetické geny pro lidské cytochromy b Oligonukleotidy použité pro genové syntézy Polymerasová řetězová reakce-pcr iii -

7 Diplomová práce Horizontální agarosová elektroforéza Izolace DNA z gelu-jetquick Gel Extraction Spin Kit Štěpení DNA pomocí endonukleas EcoRI a HindIII Štěpení DNA pomocí endonukleas XhoI a NdeI Ligace Transformace buněk E. coli DH5α vektorem, amplifikace vektoru Kultivace buněk E. coli DH5α metoda single-cell colony Izolace plasmidové DNA-minipreparace (JETquick-Plasmid miniprep Spin Kit) Izolace plasmidové DNA-maxipreparace (JETSTAR-Plasmid Maxiprep Kit) Příprava kompetentních buněk E. coli DH5α pomocí CaCl Určení koncentrace a čistoty DNA Příprava vzorků na sekvenaci Výsledky a diskuse Heterologní exprese a purifikace solubilního králičího cytochromu b Nanesení vzorku a promytí kolony Gradientová eluce a purifikace cytochromu b Celkový průběh exprese a purifikace králičího solubilního cytochromu b Příprava expresních vektorů obsahujících syntetické geny pro lidský mikrosomální a erytrocytární cytochrom b Syntéza inzertů obsahujících geny pro lidské cytochromy b Amplifikace inzertů obsahujících geny pro lidské cytochromy b Restrikce pomocí endonukleas EcoRI a HindIII Ověření připravených konstruktů pomocí DNA sekvenace Maxipreparace klonovacích vektorů puc19 obsahujících geny pro lidské cytochromy b Příprava expresních vektorů nesoucích geny pro lidské cytochromy b Maxipreparace expresních vektorů pet22b obsahujících geny pro lidské cytochromy b Kontrolní restrikce připravených expresních vektorů Kontrolní exprese lidského erytrocytárního a mikrosomálního cyt b Závěr Seznam použité literatury iv -

8 Diplomová práce 2010 Seznam obrázků Obr. 1 Struktura cytochromu b 5 v interakci s biologickou membránou... 3 Obr. 2 Ukotvení cytochromu b 5 v membráně endoplasmatického retikula... 4 Obr. 3 Přenos elektronů v rámci MFO systému... 6 Obr. 4 Kolonie E. coli... 8 Obr. 5 Klonovací vektor puc Obr. 6 Expresní vektor pet22b Obr. 7 Schéma provedení gradientové eluce cytochromu b Obr. 8 Aminokyselinová sekvence králičích cytochromů b Obr. 9 Eluční profil proteinů z kolony DEAE Sepharosy CL-6B Obr. 10 Výřez SDS-PAGE frakcí z kolony DEAE Sepharosy CL-6B Obr. 11 Průběh gradientové eluce cytochromu b 5 z kolony DEAE Sepharosy CL-6B Obr. 12 Gradientová eluce cyt b 5 z kolony DEAE Sepharosy CL-6B Obr. 13 Průběh gelové filtrace cytochromu b Obr. 14 Gelová filtrace cyt b 5 z kolony Sephadexu G Obr. 15 Průběh exprese a purifikace cytochromu b Obr. 16 Nukleotidová sekvence syntetizovaných inzertů Obr. 17 Schéma překryvu oligonukleotidů při syntéze genů pro lidské cytochromy b Obr. 18 Nukleotidová sekvence syntetizovaných oligonukleotidů Obr. 19 Amplifikace inzertů s geny pro mikrosomální a erytrocytární cyt b Obr. 20 Amplifikace inzertů s geny pro mikrosomální a erytrocytární cyt b 5 (3. PCR) Obr. 21 Amplifikace inzertu s genem pro erytrocytární cytochrom b Obr. 22 Restrikce inzertů endonukleasami EcoRI a HindIII Obr. 23 Restrikce puc19 endonukleasami EcoRI a HindIII Obr. 24 Nukleotidové sekvence genu pro erytrocytární cyt b 5 vloženého v plasmidu puc Obr. 25 Nukleotidové sekvence genu pro mikrosomální cyt b 5 vloženého v plasmidu puc Obr. 26 Optimalizovaná sekvenační data nukleotidové sekvence genu pro mikrosomální cyt b 5 vloženého v plasmidu puc Obr. 27 Restrikce pet22b endonukleasami XhoI a NdeI Obr. 28 Restrikce puc19 nesoucího syntetické inzerty pomocí XhoI a NdeI v -

9 Diplomová práce 2010 Obr. 29 Restrikce připravených expresních vektorů endonukleasami XhoI a NdeI Obr. 30 Kontrolní exprese lidských cytochromů b Seznam tabulek Tab. 1 Oligonukleotidy pro syntézu inzertů Tab. 2 Koncentrace proteinů Tab. 3 Koncentrace a čistota vzorků určených k sekvenaci Tab. 4 Koncentrace a čistota klonovacích vektorů získaných maxipreparací Tab. 5 Koncentrace a čistota expresních vektorů získaných maxipreparací vi -

10 Diplomová práce 2010 Seznam použitých zkratek a symbolů A A X BCA BIS bp BSA C adenin absorbance při vlnové délce x nm 4,4 -dikarboxy-2,2 -bicinchoninová kyselina N,N-methylen-bis-akrylamid párů bazí ( Base Pairs ) hovězí sérový albumin cytosin cyt b5 cytochrom b5 Da Dalton, jednotka molekulové hmotnosti DEAE diethylaminoethyl DNA deoxyribonukleová kyselina E. coli Escherichia coli EDTA ethylendiamintetraoctová kyselina G guanin IPTG isopropyl β-d-1-thiogalaktopyranosid LB médium Luria-Broth médium, komplexní růstové médium MFO-systém systém oxidas se smíšenou funkcí ( Mixed Function Oxidases ) mrna mediátorová ribonukleová kyselina NADH nikotinamidadenindinukleotid, redukovaná forma NADPH nikotinamidadenindinukleotidfosfát, redukovaná forma OD 600 ori PCR PřF RPM SDS SDS-PAGE T TBE TEMED optická denzita při vlnové délce 600 nm počátek replikace ( origin of replication ) polymerasová řetězová reakce ( Polymerase Chain Reaction ) Přírodovědecká fakulta otáčky za minutu ( Revolutions Per Minute ) dodecylsulfát sodný elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného thymin TRIS-borát-EDTA N,N,N,N -tetramethylethylendiamin - vii -

11 Diplomová práce 2010 TRIS UK v/v w/v X-gal 2-amino-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol Univerzita Karlova volume/volume, objem látky v mililitrech ve 100 ml weight/volume, počet gramů látky ve 100 ml roztoku 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galaktopyranosid - viii -

12 Úvod 1 Úvod 1.1 Biotransformace xenobiotik Xenobiotika (cizorodé látky) se na základě hydrofobicity rozdělují na polární a nepolární. Polární xenobiotika jsou poměrně rychle vylučována z organismu, na rozdíl od xenobiotik nepolárních, která díky své lipofilní povaze mohou procházet membránami a kumulovat se. Aby mohla být nepolární xenobiotika vyloučena z organismu, musí být biotransformována v polárnější metabolity (detoxikována) [1,2]. U živočichů probíhá biotransformace xenobiotik ve dvou fázích - derivatizační a konjugační. V derivatizační fázi dochází k zavádění polárních skupin do molekuly xenobiotika, nebo k demaskování stávajících funkčních skupin. Tyto děje jsou realizovány: 1. Oxidačními reakcemi (C-hydroxylace, N-hydroxylace, N-oxidace, S-oxidace, oxidační deaminace, dealkylace, oxidace dvojné vazby mezi atomy uhlíku, oxidace primárních a sekundárních alkoholů a aldehydů apod.) 2. Redukčními reakcemi (přeměna aromatických nitrosloučenin a azosloučenin na primární aminy, redukce ketonů na sekundární alkoholy) 3. Hydrolytickým demaskováním funkčních skupin (hydrolýza esterů a amidů za vzniku fenolů a karboxylových kyselin, respektive aminů a hydroxylových kyselin) [3]. V konjugační fázi pak dochází k reakcím derivatizované molekuly xenobiotika s endogenními hydrofilními sloučeninami (např. kyselina glukuronová, acethylkoenzym A, glutathion) za tvorby konjugátů, které jsou snadno vyloučeny z organismu, nejčastěji močí a žlučí [1,3]. 1.2 MFO systém Nejdůležitější skupinou enzymů, které se účastní derivatizační fáze biotransformace xenobiotik, jsou oxygenasy. Jsou to enzymy zajišťující inkorporaci kyslíku do molekuly cizorodé látky, a to ve formě hydroxylové skupiny, oxo-skupiny nebo dvou oxo-skupin. Na základě toho se oxygenasy rozdělují na monooxygenasy a dioxygenasy [2]. Klíčovým enzymovým systémem derivatizační fáze biotransformace je mikrosomální systém monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO systém). MFO systém je 1

13 Úvod soubor enzymů katalyzujících inkorporaci jednoho atomu kyslíku do molekuly hydrofobního substrátu, přičemž druhý atom kyslíku je redukován na vodu [2,4]. MFO systém je v živočišném organismu lokalizován především v játrech, v menší míře též v plicích, ledvinách, nadledvinkách, tenkém střevě a kůži. V buňce se MFO systém vyskytuje v membráně hladkého endoplasmatického retikula a mitochondrií [1,2]. MFO systém obsahuje tři základní složky: flavoproteinový enzym NADPH:cytochrom P450 reduktasu, která slouží jako dělič elektronového páru a donor jednotlivých elektronů, hemthiolátový enzym cytochrom P450, který je terminální oxidasou MFO systému, a biologickou membránu, ve které jsou oba enzymy zakotveny (membránové lipidy způsobují např. konformační změny cytochromu P450 a tím zvyšují jeho afinitu k substrátu) [1,2]. Dalšími složkami, které mohou být součástí MFO systému, jsou cytochrom b 5 a NADH:cytochrom b 5 reduktasa [2]. 1.3 Cytochrom b 5 První zmínky o cytochromu b 5 pocházejí z období kolem roku 1950, kdy byl tento protein nalezen v savčích jaterních mikrosomech [5]. Jedná se o hemoprotein kyselého charakteru s relativně malou molekulovou hmotností cca Da [5,6,7], který je stabilní v neutrálním, bazickém a mírně kyselém prostředí (ph 6,5-10) [5]. Oxidovaná forma cytochromu b 5 má typické absorpční maximum při 413 nm, redukovaná forma při 423, 526 a 557 nm [5]. Struktura cytochromu b 5 je tvořena šesti α helixy a pěti β skládanými listy [8]. Protein se skládá ze dvou domén: hydrofilní (cytoplasmatické) ezymaticky aktivní N-koncové domény a menší hydrofobní C-koncové domény, kterou je ukotven v membráně [6,7,8,9,10,11]. N-koncová katalytická doména je tvořena přibližně 100 aminokyselinami [9,10] a obsahuje 2 hydrofobní jádra [10]. V prvním hydrofobním jádře tvořeném 4 α helixy je lokalizována prosthetická skupina - protoporfyrin IX (hem typu b) [10]. Železo hemu je koordinováno prostřednictvím dvou imidazolových zbytků histidinu [8,10,12,13]. Tyto histidiny (His 68 a His 44) jsou ve všech známých savčích, rostlinných i bakteriálních cytochromech b 5 plně konzervované [8]. Druhé hydrofobní jádro N-koncové domény je složeno z β skládaných listů [10]. 2

14 Úvod C-koncová doména cytochromu b 5 je tvořena přibližně 20 aminokyselinami a zajišťuje ukotvení proteinu v membráně endoplasmatického retikula nebo, v případě mitochondriální isoformy, ve vnější mitochondriální membráně (viz dále) [7,9]. Obě domény cytochromu b 5 jsou spojeny úsekem cca 15 aminokyselinových zbytků [7,11]. Struktura cytochromu b 5 ukotveného v biologické membráně je uvedena na obrázku 1. Obr. 1 Struktura cytochromu b 5 v interakci s biologickou membránou Zeleně je zvýrazněn hem přítomný v N-koncové doméně proteinu, C-koncová doména interaguje s membránou. Převzato z [7] Isoformy cytochromu b 5 a jejich vlastnosti V současné době jsou známy 3 isoformy savčího cytochromu b 5 [14]. Jedná se především o cytochrom b 5 přítomný v membráně endoplasmatického retikula (mikrosomální cytochrom b 5 ) a cytochrom b 5 lokalizovaný ve vnější mitochondriální membráně. Další isoformou je pak erytrocytární cytochrom b 5. Mikrosomální a mitochondriální cytochrom b 5 vznikají pravděpodobně expresí dvou různých genů [11,15,16]. Oba tyto proteiny mají podobnou strukturu a vykazují 3

15 Úvod 84-97% identitu v sekvenci aminokyselin. Liší se však fyzikálními vlastnostmi. Mitochondriální cytochrom b 5 má více negativní redukční potenciál, pevněji vázaný hem a vykazuje vyšší odolnost vůči termální a chemické denaturaci. Mitochondriální i mikrosomální apoformy cytochromu b 5 jsou přitom podobně stabilní, z čehož lze usuzovat, že vyšší odolnost mikrosomálního cytochromu b 5 vůči denaturaci souvisí s pevnější vazbou hemu [9,10]. Informace o tom, zdali bude cytochrom b 5 ukotven v membráně endoplasmatického retikula nebo ve vnější mitochondriální membráně, je pravděpodobně obsažena v posledních cca 10 aminokyselinách C-konce proteinu [9,17]. Existují dva modely možného zanoření C-koncové domény cytochromu b 5 v membráně [14]. Na obrázku 2 jsou tyto modely vytvořené pro mikrosomální cytochrom b 5. Obr. 2 Ukotvení cytochromu b 5 v membráně endoplasmatického retikula Znázorněny jsou dva modely možného ukotvení mikrosomálního cytochromu b 5. Dle transmembránového modelu prochází C-koncová doména cytochromu b 5 membránou do lumen endoplasmatického retikula. Druhý model (čárkovaně) predikuje přítomnost konce C-terminální domény v cytosolu. Převzato z [14]. 4

16 Úvod V současné době je preferován tzv. transmembránový model. Ten předpokládá průchod C-terminální domény mikrosomálního a mitochondriálního cytochromu b 5 membránou a přítomnost posledních cca 7-10 aminokyselin v lumen endoplasmatického retikula, respektive v mezimembránovém prostoru mitochondrií [9,10]. Méně pravděpodobný je model, který předpokládá přítomnost konce C-terminální domény v cytosolu. Další isoformou je solubilní erytrocytární cytochrom b 5, který se vyskytuje v cytoplasmě maturovaných erytrocytů [18]. Na základě dřívější hypotézy se předpokládalo, že tato forma vzniká proteolýzou z mikrosomálního cytochromu b 5 během maturace erytrocytů [18,19]. Tato hypotéza však přestala platit poté, co se podařilo určit celou aminokyselinovu sekvenci erytrocytární formy cytochromu b 5 [20]. Ukázalo se, že sekvence 1. až 97. aminokyseliny erytrocytární i mikrosomální formy cytochromu b 5 jsou shodné, na pozici 98 v sekvenci erytrocytární formy je však přítomen prolin, který se v mikrosomální formě na této pozici nevyskytuje. Vznik erytrocytární formy proteolýzou z mikrosomální tedy není možný. Erytrocytární cytochrom b 5 vzniká pravděpodobně alternativním sestřihem genu pro mikrosomální cytochrom b 5 [20]. Hlavní funkcí cytochromu b 5 je přenos jednoho elektronu v různých reakčních cyklech. V mitochondriích se cytochrom b 5 účastní metabolismu endogenních substrátů, například biosyntézy androgenů [21], zatímco funkcí erytrocytárního cytochromu b 5 ve spolupráci s NADH:cytochrom b 5 reduktasou je redukce methemoglobinu zpět na funkční hemoglobin [22]. Mikrosomální cytochrom b 5 se účastní poměrně široké škály reakcí zahrnující desaturaci mastných kyselin, biosyntézu steroidů a plasmalogenů [14,23,24,25] a v neposlední řadě také metabolismus xenobiotik za účasti mikrosomálního MFO systému [26]. Právě role cytochromu b 5 v reakčním cyklu cytochromu P450 je v současnosti předmětem studia mnoha pracovišť Mechanismus účinku cytochromu b 5 v reakčním cyklu cytochromu P450 Jak již bylo řečeno v oddíle 1.2, cytochrom P450 katalyzuje inkorporaci kyslíku do molekuly substrátu. K tomu vyžaduje příjem dvou elektronů, které mu nejčastěji 5

17 Úvod poskytuje NADPH:cytochrom P450 reduktasa. Kromě ní je ovšem donace elektronů schopen také cytochrom b 5. První hypotézy o tom, že je cytochrom b 5 zapojen do reakčního cyklu cytochromu P450 se objevují v 70. letech minulého století [26,27,28]. Již v této době bylo známo, že NADH:cytochrom b 5 reduktasa je schopna přenášet elektron z NADH (donor dvou elektronů) na jednoelektronové akceptory jako je cytochrom b 5 [27] a že redukci cytochromu b 5 je schopna katalyzovat také NADPH:cytochrom P450 reduktasa [28]. V současné době jsou navrženy tři hypotézy, kterými cytochrom b 5 ovlivňuje reakční cyklus cytochromu P450: 1. Přenos obou potřebných elektronů do katalytického cyklu cytochromu P Přenos druhého elektronu do cyklu cytochromu P Allosterická stimulace bez elektronového transportu [8,29] Možnosti transportu elektronů uvnitř MFO systému shrnuje následující schéma (Obr. 3): NADH NADPH e - NADH:cytochrom b 5 reduktasa e - e - e - e - NADPH:cytochrom P450 reduktasa Cytochrom b 5 e - e - Cytochrom P450 Obr. 3 Přenos elektronů v rámci MFO systému Znázorněny jsou různé cesty, kterými může cytochrom P450 akceptovat elektrony. Vytvořeno podle [29]. V případě přenosu obou elektronů pomocí cytochromu b 5 jsou elektrony přenášeny postupně z NADH na NADH:cytochrom b 5 reduktasu, dále na cytochrom b 5 a cytochrom P450 [27,29]. Tato cesta je tedy zcela nezávislá na přítomnosti NADPH:cytochrom P450 reduktasy. Přenos pouze druhého elektronu na cytochrom P450 pomocí cytochromu b 5 může probíhat ve dvou alternativách. Buď systémem NADH NADH:cytochrom b 5 reduktasa cytochrom b 5, nebo systémem NAD(P)H NADPH:cytochrom P450 reduktasa cytochrom b 5. První elektron je poskytován NADPH:cytochrom P450 reduktasou [29]. 6

18 Úvod Vliv cytochromu b 5 na katalytickou aktivitu cytochromu P450 Přítomnost cytochromu b 5 v MFO systému se může projevit aktivací nebo inhibicí katalyzované reakce, případně nemusí mít žádný vliv. Záleží přitom na typu konkrétního cytochromu P450 a na povaze substrátu [30,31]. Příkladem vlivu substrátu je skutečnost, že cytochrom P450 2B4 vyžaduje přítomnost cytochromu b 5 pro metabolismus methoxifluranu, zatímco metabolismus benzheptaminu katalyzovaný tímtéž cytochromem P450 je v přítomnosti cytochromu b 5 ovlivněn minimálně [31]. Vliv konkrétního typu cytochromu P450 dobře demonstruje příklad metabolismu azobarviva Sudanu I. V přítomnosti cytochromu b 5 je Sudan I významně metabolizován pomocí cytochromu P450 1A1, zatímco cytochromy P450 2D6 a 2C19 biotransformují Sudan I za stejných experimentálních podmínek s mnohem nižší účinností [32]. V poslední době je také intenzivně studována otázka allosterické stimulace pomocí cytochromu b 5. Ukazuje se totiž, že i apoforma cytochromu b 5, která neobsahuje hem a tudíž ztrácí schopnost přenášet elektrony, může v některých případech stimulovat reakční cyklus cytochromu P450. Bylo například dokázáno, že holoforma i apoforma cytochromu b 5 stimulují katalytickou aktivitu cytochromů P450 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 3A4 a 3A5 [30,33]. 1.4 Heterologní exprese rekombinantního cytochromu b 5 Heterologní exprese, tedy exprese požadovaného genu v buňce, kde se tento gen přirozeně nevyskytuje, má oproti klasické izolaci proteinu z biologického materiálu mnoho výhod. Hlavní výhodou je skutečnost, že je tímto způsobem možné připravit proteiny z organismů, u nichž by se biologický materiál získával velmi obtížně (lidské cytochromy b 5 ). Kromě toho jsou výtěžky proteinu v tomto systému obvykle mnohem vyšší, než v původním organismu. Nevýhodou pak u některých proteinů může být absence posttranslačních modifikací. Metody molekulární biologie používané k expresi rekombinantních proteinů jsou založené hlavně na práci s rekombinantní DNA. Pojmem rekombinantní DNA je označován vektor nesoucí gen, který má být klonován [34]. Konstrukce rekombinantní DNA za účelem klonování genů je nezbytná z toho důvodu, že udržení samostatného genu (nebo jiného náhodného fragmentu DNA) v buňce je velmi nepravděpodobné. Klonovaný 7

19 Úvod gen může tedy v buňce existovat pouze jako součást vektoru, který je schopen autonomní replikace [35]. Pro amplifikaci rekombinantní DNA se používají bakteriální buňky, které lze relativně snadno kultivovat a které díky značné rychlosti proliferace zajišťují vysoké výtěžky požadované DNA. Nejčastěji se k tomuto účelu využívá Escherichia coli (E. coli) [34,35,36]. Běžně používanými vektory pro přípravu rekombinantní DNA jsou uměle zkonstruované bakteriální plasmidy odvozené od přirozených bakteriálních plasmidů. Tyto plasmidy obsahují sekvenci DNA, která funguje jako počátek replikace ( origin of replication, neboli místo ori) a zajišťuje množení rekombinantní DNA v hostitelské buňce nezávisle na bakteiálním chromosomu [34,35,36]. Hostitelská buňka je obvykle transformována pouze jednou molekulou rekombinantní DNA, která se v buňce replikuje a je předávána dceřiným buňkám [34] Escherichia coli jako nástroj v molekulární genetice E. coli je tyčinkovitá gramnegativní bakterie (viz Obr. 4) o průměru asi 10 µm [37]. Pro účel molekulární biologie a genetiky byla připravena celá řada mutantních kmenů E. coli, které jsou např. zbaveny schopnosti syntetizovat restrikční endonukleasy a enzymy degradující cizorodou DNA. Tím je zajištěna stabilita rekombinantní DNA [36]. Při výběru vhodného kmene je nejdůležitější účel, k němuž má být použit, např. pro amplifikaci DNA (E. coli DH5α), nebo expresi genů (E. coli BL-21). Obr. 4 Kolonie E. coli Díky vysoké rychlosti proliferace je E. coli oblíbeným nástrojem pro amplifikaci rekombinantní DNA i expresi proteinů. Převzato z [38]. 8

20 Úvod E. coli má vzhledem k svému objemu relativně velký povrch. Ten ji umožňuje rychlý přísun živin a tím i rychlý metabolismus a růst [37]. V LB médiu (Luria-Broth médium, komplexní médium), při zajištění dostatečné aerace (minimálně 5x větší objem vzduchu než je objem média), teploty 37 C a za intenzivního míchání má E. coli v exponenciální fázi růstu generační dobu cca 20 min. Ve stacionární fázi růstu bývá obvykle dosaženo koncentrace cca 2x10 9 buněk/ml [34,37]. Pro odhad koncentrace buněk se nejčastěji využívá spektrofotometrické měření zákalu zpravidla při vlnové délce 600 nm. Koncentrace buněk bývá tedy uváděna jako optická denzita při vlnové délce 600 nm (OD 600 ). V hrubém přiblížení platí, že kultura E. coli s hodnotou OD 600 ~ 0,1 obsahuje cca 10 8 buněk/ml [36] Klonovací plasmid puc19 Při rekombinantní expresi cytochromu b 5 byl jako klonovací vektor využíván plasmid puc19 (viz Obr. 5). Obr. 5 Klonovací vektor puc19 Schéma plasmidu s vyznačením všech pozic štěpících míst restrikčních endonukleas, počátku replikace (ori) a genů pro selekční markery. Převzato z [39]. 9

21 Úvod Hlavní výhodou vektoru puc19 je skutečnost, že se jedná o plasmid, který má při 37 C cca 75 kopií v jedné buňce [39]. Tím je zajištěn poměrně vysoký výtěžek klonované DNA. Plasmid puc19 má velikost 2686 bp [39], takže může být použit ke klonování dlouhého úseku DNA (teoreticky až cca 7000 bp) [34]. Tento plasmid obsahuje dva geny pro selekční markery. Gen kódující enzym β-laktamasu, která mění ampicilin na netoxickou formu [34] a gen lacz, který kóduje α-peptid enzymu β-galaktosidasy. Enzym β-galaktosidasa vzniká běžně v E. coli expresí genu lacz a zajišťuje štěpení laktosy na glukosu a galaktosu. Některé kmeny E. coli nesou však gen lacz zkrácený o segment lacz. Tyto mutanty mohou syntetizovat enzym pouze tehdy, když obsahují plasmid nesoucí chybějící úsek lacz. Transkripce genu lacz i genu lacz je řízena promotorem lac a je indukovatelná galaktosidy, např. isopropyl β-d-1-thiogalaktopyranosid (IPTG) [34,35]. Na začátku sekvence genu lacz je přítomno polyklonovací místo, tzv. polylinker, což je úsek obsahující sérii restrikčních míst pro vložení klonovaného genu [36]. Při konstrukci rekombinantní DNA (inzerci klonovaného genu) dochází k inaktivaci genu lacz a hostitelská buňka se zkráceným genem lacz tedy není schopna syntetizovat β-galaktosidasu. Této skutečnosti se využívá při selekci rekombinantů. Enzym β-galaktosidasa štěpí totiž také analog laktosy, chromogenní substrát, tzv. X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl- β-d-galaktopyranosid), za vzniku tmavě modrého produktu. Rekombinanty je možné identifikovat na selektivním médiu obsahujícím ampicilin, X-gal a IPTG, jelikož v důsledku absence β-galaktosidasy zůstanou bílé, zatímco nerekombinantní kolonie se zbarví modře [34,35]. Při expresi rekombinantního cytochromu b 5 byl využit pouze selekční marker kódující β-laktamasu, která zajišťuje rezistenci k ampicilinu. Exprese tohoto genu trvá několik minut, proto je nezbytné transformované buňky nejprve kultivovat v médiu bez ampicilinu a inokulaci selektivního média (s ampicilinem) provést až po vytvoření dostatečného množství β-laktamasy [34]. 10

22 Úvod Expresní plasmid pet22b Expresní plasmid slouží nejen ke klonování požadovaného genu, ale zároveň k produkci proteinu kódovaného klonovaným genem. K úspěšné expresi heterologního genu v buňkách E. coli je nezbytné, aby plasmid obsahoval promotor, terminátor a vazebné místo pro ribosom, které je E. coli schopna rozeznat [34]. Promotor je místo, kde začíná transkripce genu a běžně je v E. coli rozeznáváno σ-podjednotkou RNA polymerasy. Terminátor je naopak místo na konci genu, kde se transkripce zastaví. Vazebné místo pro ribosom je krátká nukleotidová sekvence, která je po transkripci do mrna (mediátorová RNA) rozeznávána ribosomem. Několik nukleotidů za tímto místem se pak nachází iniciační kodon [34]. Pro heterologní expresi cytochromu b 5 byl využit expresní vektor pet22b, který je uveden na obrázku 6 na následující straně. Vektor pet22b má velikost 5493 bp a obsahuje selekční marker zajišťující rezistenci k ampicilinu [40]. Hlavní výhodou tohoto plasmidu je přítomnost T7 promotoru (v místě odpovídajícímu bp), který je specifický pouze pro RNA polymerasu kódovanou bakteriofágem T7 [35]. Tato RNA polymerasa je mnohem aktivnější než RNA polymerasa E. coli [34], takže gen umístěný za T7 promotorem (gen pro cytochrom b 5 ) je exprimován ve vysokém výtěžku. Jelikož se gen pro T7 RNA polymerasu normálně v E. coli nevyskytuje, je potřeba pro expresi použít kmen E. coli, který má v chromosomu integrovaný T7 fágový genom. Fágová DNA je v těchto kmenech navíc pozměněna tak, aby byl lac promotor (viz předchozí oddíl 1.4.2) umístěn před gen pro T7 polymerasu. Přidáním IPTG do růstového média proto dochází ke spuštění exprese T7 RNA polymerasy, která zahájí transkripci genu za T7 promotorem (cytochromu b 5 ) [34]. 11

23 Úvod Obr. 6 Expresní vektor pet22b Schéma plasmidu s vyznačením všech pozic štěpících míst restrikčních endonukleas, počátku replikace (ori) a genů pro selekční markery. T7 promotor je umístěn v místě označeném černou šipkou v pozici bp. Převzato z [40]. 12

24 Cíle diplomové práce 2 Cíle diplomové práce Jedním z cílů diplomové práce bylo připravit solubilní formu cytochromu b 5 vhodnou pro přípravu polyklonálních protilátek a také pro studium interakcí cytochromu b 5 s proteiny MFO systému, především cytochromy P450. Konkrétně se jednalo o heterologní expresi a následnou purifikaci solubilní formy králičího mikrosomálního cytochromu b 5. Dalším cílem bylo syntetizovat a verifikovat gen pro lidskou solubilní (erytrocytární) formu cytochromu b 5 a následně připravit konstrukty založené na vektorech puc19 (klonovací) a pet22b (expresní) obsahujících tento syntetický gen. Stejným způsobem pak připravit také konstrukty založené na totožných vektorech obsahující syntetický gen kódující membránově vázanou lidskou mikrosomální formu cytochromu b 5. Připravené konstrukty založené na vektoru pet22b poslouží k následné expresi a izolaci těchto proteinů dosud nestudovaných v naší laboratoři. 13

25 Materiál a metody 3 Materiál a metody 3.1 Použité přístroje Analytické váhy: 40 SM-200A, Pesa HM-200, A&D Instruments LTD. Předvážky: N, Kern EW 600-2M, Kern EK-600H, A&D Instruments LTD. Vodní lázeň: Julabo TW2, Biotech Julabo TW8, Biotech Ohřívač bloků: LS1, VLM GmbH Centrifuga: 5415 D/R, Eppendorf Janetzki K70D, MLW Allegro X-22R, Beckman Coulter Stolní minicentrifuga, Labnet Stolní minicentrifuga Gilson, GmC Lab Vortex: MS2 Minishaker, IKA MS 1 Minishaker Schiller Pharma Spektrofotometr: Spectromom 195D, MOM Budapest Spekol 11, CARLZEISS, Jena Diod Array 8453, Hewllet-Packard ph metr: model 370, ATI Orion Magnetická míchačka: HM 2A, Laboratorní přístroje Praha KMO2 basic, IKA Variomag Monotherm, H+P Laborator technik Sběrač frakcí: BioLogic BioFrac, BIO RAD Peristaltická pumpa: PP 05, Laboratorní přístroje Praha Ultrafiltrační cela: 8200, Amicon Vakuová odparka: DNA Speed Vac, DNA 110, Savant Elektroforetická aparatura: MSMINI 10-Multi Sub Mini, Uvitec (agarosová elektroforéza) minive Vertical, Amersham Biosciences (SDS-PAGE) 14

26 Materiál a metody Zdroj pro elektroforézu: Transluminátor: Drtič ledu: Termocycler: Ultrazvuková sonda: Bezdotykový kahan: Inkubátor: Laminární box: Autokláv : Fotoaparát: EPS 301, Electrophoresis Power Supply, Amerham Pharmacia Biotech Dark Reader, Clare Chemical Research Solid Tech gene, TECHNE Sonopuls HD 3100, Bandelin Gasprofi2 SCS, VLD-TEC IR 1500 Automatic CO 2 Incubator, Flow Laboratories ORBI-SAFE TS Net Wise, Gallenkamp BIO 126, Labox Varioklav 400E, H+P Labortechnik DMC-LS65, Panasonic 3.2 Použitý materiál a chemikálie SIGMA, USA Isopropyl β-d-1-thiogalaktopyranosid (IPTG), standard molekulových hmotností pro SDS-PAGE (wide range), 4,4 -dikarboxy-2,2 -bicinchoninová kyselina (BCA), médium Luria Broth, Luria Agar LACHEMA BRNO, Česká republika Dihydrogenfosforečnan draselný, ethanol, octan sodný, EDTA, isopropanol, persíran amonný Serva, Německo Ampicilin Lach-Ner, s.r.o., Česká republika Chlorid draselný PENTA, Česká republika Glycerin, hydroxid sodný SEVAPHARMA, Česká republika BSA Pharmacia, Švédsko Sephadex G-75, Agarosa NA 15

27 Materiál a metody Top-Bio, Česká republika DNA marker ( bp) East Port, Česká republika Oligonukleotidy, dinukleotidtrifosfáty Fermentas, Kanada Lambda DNA/EcoRI +HindIII marker 3 ( bp), Pfu DNA polymerasa (c = 2,5 u/µl) + pufr (10x koncentrovaný), vzorkový pufr pro DNA markery (6x koncentrovaný) NEW ENGLAND Biolabs, USA HindIII (c = u/ml), EcoRI (c = u/ml) + pufr (10x koncentrovaný), T4 DNA ligasa (c = u/ml) + pufr (10x koncentrovaný), NdeI (c = u/ml) + pufr 4 (10x koncentrovaný), XhoI (c = u/ml) + BSA ( 100x koncentrovaný), puc19, pet22b GENOMED, Německo JETquick-Plasmid Miniprep Spin Kit, JETquick-Gel Extraction Spin Kit, JETSTAR-Plasmid Maxiprep Kit INVITROGEN, USA SYBR Safe TM DNA gel Stain (10000x koncentrované) Stratagene, USA Bakteriální kmen E. coli BL-21 Gold Kompetentní buňky E. coli DH5α poskytl RNDr. Marek Ingr, Ph.D. 16

28 Materiál a metody 3.3 Metody: Exprese a purifikace solubilního králičího cytochromu b Příprava agarových ploten Sterilní agar připravený do 500 ml skleněné lahve (4 g agaru na 100 ml destilované vody) byl rozehřán v mikrovlnné troubě. Potřebné množství rozehřátého agaru bylo odlito do sterilní zkumavky Falcon (50 ml) a po zchladnutí, těsně před nalitím agarových ploten, byl přidán ampicilin (100 µg/ml). Agar s antibiotikem byl promíchán a nalit po cca 10 ml do sterilních Petriho misek a ponechán ztuhnout při laboratorní teplotě na vodorovném stole Transformace buněk E. coli BL-21 Gold konstruktem založeným na expresním vektoru pet22b Zásobní roztok konstruktu založeném na expresním vektoru pet22b a syntetickém genu pro solubilní králičí cytochrom b 5 (skladován v -20 C) a 200 µl buněk Escherichia coli BL-21 Gold (skladováno v -80 C) bylo vyjmuto z mrazáku a rozmraženo na ledu při laboratorní teplotě. Poté byly do mikrozkumavky s E. coli BL-21 Gold přidány 3 µl konstruktu, směs byla jemně promíchána pipetou a inkubována 30 minut na ledu při laboratorní teplotě. Dále byla suspenze vystavena teplotnímu šoku, který usnadňuje vstup DNA do buněk: mikrozkumavka byla umístěna na 1,5 min do vodní lázně (Julabo TW2, Biotech) předehřáté na 42 C a následně ponechána 2 min na ledu. K takto transformovaným buňkám bylo přidáno 600 µl tekutého LB média bez ampicilinu, suspenze byla inkubována 1 hod při teplotě 37 C (IR 1500 Automatic CO 2 Incubator, Flow Laboratories) a následně převedena z mikrozkumavky na agarovou plotnu obsahující ampicilin (100 µg/ml) a rozetřena sterilními kuličkami po celém povrchu agaru. Plotny byly inkubovány přes noc při teplotě 37 C (IR 1500 Automatic CO 2 Incubator, Flow Laboratories). 17

29 Materiál a metody Kultivace transformovaných buněk E. coli BL-21 Gold metoda multi-cell colony Nejprve bylo připraveno sterilní LB médium (2,5 g média na 100 ml destilované vody). 2 ml LB média s ampicilinem (100 µg/ml) byly naneseny na agarovou plotnu obsahující přes noc narostlé kolonie a rozetřeny sterilní hokejkou po celém povrchu agaru. Vzniklá suspenze byla pipetou přenesena do 500 ml tekutého LB média s ampicilinem (100 µg/ml). Buňkami inokulované médium bylo dále inkubováno v orbitálním shakeru při teplotě 37 C a 200 RPM (ORBI-SAFE TS Net Wise, Gallenkamp) Indukce exprese cytochromu b 5 Průběžně byla měřena optická denzita buněk E. coli BL-21 Gold v LB médiu při 600 nm (OD 600 ) proti roztoku LB média s ampicilinem (100 µg/ml). V momentě, kdy OD 600 dosáhla hodnoty 0,65, byla provedena indukce exprese cytochromu b 5 pomocí β-d-1-thiogalaktopyranosidu (IPTG). Koncentrace IPTG v roztoku byla 0,5 mm. Buňky byly poté kultivovány dalších 5 hodin při teplotě 37 C a 200 RPM (ORBI-SAFE TS Net Wise, Gallenkamp). Exprese cytochromu b 5 byla ukončena centrifugací: LB médium s namnoženými buňkami bylo rozděleno do dvou centrifugačních zkumavek a vyváženo. Centrifugace probíhala 20 min při 3000 RPM (centrifuga Janetzki K70D, MLW). Médium bylo odstraněno z centrifugačních zkumavek a pelety byly resuspendovány ve 3 ml resuspendačního pufru (10 mm KH 2 PO 4, 1mM EDTA, ph 7,7). Nakonec byly resuspendované pelety spojeny, přeneseny do zkumavky Falcon (50 ml) a ponechány v -20 C přes noc Dezintegrace buněk E. coli BL-21 Gold Spojené pelety skladované v -20 C byly rozmraženy a naředěny resuspendačním pufrem (10 mm KH 2 PO 4, 1mM EDTA, ph 7,7) na celkový objem 20 ml. Poté byla provedena dezintegrace buněk sonikací (utrazvuková sonda Sonopuls HD3100, Bandelin) 6 x 1 min, po každé minutě sonikace byly buňky chlazeny vždy 2 min na ledu. Nakonec byly dezintegrované buňky centrifugovány (centrifuga Allegro X-22R, Beckman Coulter, 18

30 Materiál a metody rotor 4250) 15 min při 4500 RPM a 4 C a ze získaného supernatantu (cca 17 ml) byl izolován cytochrom b Iontově výměnná chromatografie (DEAE Sepharosa CL-6B, ph 8) Pro iontově výměnnou (ionexovou) chromatografii byla jako nosič použita DEAE Sepharosa CL-6B, která slouží k zachycení a výměně anionů (anex). Příprava nosiče probíhala následujícím způsobem: přibližně 50 ml DEAE Sepharosy CL-6B uchovávané ve 20% ethanolu bylo 3x promyto destilovanou vodou a 2x cyklizačním pufrem (1 M KH 2 PO 4, ph 8), ve kterém byla nakonec Sepharosa ponechána přes noc. Takto připravený nosič byl nalit do chromatografické kolony, kde po usazení vytvořil sloupec přibližně 2,5 x 20 cm. Přes noc byla kolona promývána ekvilibračním pufrem (10 mm KH 2 PO 4, 1 mm EDTA, 20% glycerol (w/v), ph 8) o objemu 150 ml. Na kolonu DEAE Sepharosy CL-6B byl nanesen supernatant o objemu cca 17 ml získaný dezintegrací buněk E. coli BL-21 Gold. Při ph 8 je cytochrom b 5 záporně nabitý a je tudíž zachycován na koloně anexu spolu s ostatními záporně nabitými látkami. Ostatní látky zadržovány nejsou a jsou eluovány z kolony. Eluce pomocí ekvilibračního pufru probíhala při 4 C, rychlost průtoku byla nastavena na l ml/min a byly jímány frakce o objemu 3 ml (sběrač frakcí BioLogic BioFrac, BIO RAD). Průběžně byla sledována absorbance frakcí při vlnové délce 413 nm (odpovídá absorpčnímu maximu cytochromu b 5 ) a 280 nm (absorpce aromatických aminokyselin v proteinech) proti ekvilibračnímu pufru (spektrofotometr Spectromom 195D, MOM Budapest). Eluce byla ukončena v momentě, kdy A 280 dosáhla prakticky nulové hodnoty. Tomu odpovídala spotřeba cca 150 ml ekvilibračního pufru. U vybraných frakcí byla provedena kontrolní ektroforéza na polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) Gradientová eluce cytochromu b 5 Cytochrom b 5 byl eluován z kolony DEAE Sepharosy CL-6B pomocí lineárního gradientu KCl (0-400 mm) v ekvilibračním pufru (10 mm KH 2 PO 4, 1 mm EDTA, 20% glycerol (w/v), ph 8) za využití peristaltické pumpy (PP 05, Laboratorní přístroje Praha). 19

31 Materiál a metody Schéma uspořádání jednotlivých komponent při gradientové eluci je uvedeno na obrázku 7. Eluce probíhala při teplotě 4 C za stálého míchání obou pufrů (magnetická míchačka Variomag Monotherm, H+P Laborator technik). pumpa kolona sběrač frakcí 400 mm KCl 10 mm KH 2 PO 4 1 mm EDTA 20% glycerol (v/v) ph 8, V = 300ml 10 mm KH 2 PO 4 1 mm EDTA 20% glycerol (v/v) ph 8, V = 300ml Obr. 7 Schéma provedení gradientové eluce cytochromu b5 Cytochrom b 5 byl eluován z kolony DEAE Sepharosy CL-6B pomocí gradientu KCl (0-400 mm) v ekvilibračním pufru (10 mm KH 2 PO 4, 1 mm EDTA, 20% glycerol (w/v), ph 8) Na sběrači frakcí (BioLogic BioFrac, BIO RAD) byl nastaven průtok 0,6 ml/min a jímány byly frakce o objemu 6 ml. Na základě změřené absorbance frakcí proti ekvilibračnímu pufru při vlnové délce 413 nm a 280 nm (Spectromom 195D, MOM Budapest) byl sestaven eluční profil cytochromu b 5. U vybraných frakcí byla provedena kontrolní ektroforéza SDS-PAGE Gelová filtrace (Sephadex G-75, ph 8) Gelová filtrace je chromatografická metoda sloužící k separaci proteinů na základě rozdílných molekulových hmotností. Nejprve jsou z kolony eluovány proteiny s vysokou molekulovou hmotností, postupem času jsou eluovány stále menší proteiny. Tato metoda byla využita jako konečný krok při purifikaci solubilního králičího cytochromu b 5. Jako nosič byl použit Sephadex G-75 o objemu cca 80 ml, který po nalití do chromatografické kolony vytvořil sloupec o velikosti cca 2x40 cm. 20

32 Materiál a metody Frakce obsahující cytochrom b 5 získané gradientovou elucí byly spojeny, 10x zahuštěny z původního objemu cca 17 ml na konečný objem cca 1,7 ml (ultrafiltrační cela 8200, Amicon) a naneseny na kolonu Sephadexu G-75. Eluce proteinů z kolony pomocí ekvilibračního pufru (10 mm KH 2 PO 4, 1mM EDTA, 20% (w/v) glycerol, ph 8) probíhala při 4 C, nastavení rychlosti průtoku l ml/min a byly jímány frakce o objemu 4 ml (sběrač frakcí BioLogic BioFrac, BIO RAD). Eluční profil byl sestaven na základě absorbance jednotlivých frakcí proti ekvilibračnímu pufru při vlnové délce 413 a 280 nm (spektrofotometr Spectromom 195D, MOM Budapest). U vybraných frakcí byla provedena kontrolní elektroforéza SDS-PAGE. Frakce obsahující purifikovaný cytochrom b 5 byly spojeny (celkový objem cca 12 ml) a 6x zahuštěny (ultrafiltrační cela 8200, Amicon) na konečný objem cca 2 ml. 2 ml získaného solubilního králičího cytochromu b 5 byly po 200 µl alikvotech přeneseny do mikrozkumavek Eppendorf a uchovány v -80 C Elektroforéza SDS-PAGE Použité roztoky: Pufr A: 0,375 M Tris-HCl; 0,1% SDS (w/v); ph 8,8 Pufr B: 0,125 M Tris-HCl; 0,1% SDS (w/v); 0,0006% bromfenolová modř (w/v); ph 6,8 Polymerační roztok A: 30% akrylamid (w/v); 0,8% BIS (w/v) v pufru A Polymerační roztok B: 30% akrylamid (w/v); 0,8% BIS (w/v) v pufru B Elektrodový pufr: 0,025 M Tris-HCl; 0,192 M glycin; 0,1 % SDS (w/v); ph 8,3 Vzorkový pufr redukující (4x koncentrovaný): 0,25 M Tris-HCl; 8% SDS (w/v); 40% glycerol (v/v); 20% 2-merkaptoethanol (v/v); 0,012% bromfenolová modř (w/v); ph 6,8 Fixační roztok: 10% isopropanol (v/v); 10% kyselina octová (v/v) Barvící lázeň: 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v); 46% ethanol (v/v); 9,2% kyselina octová (v/v) Odbarvovací lázeň: 25% ethanol (v/v); 10% kyselina octová (v/v) Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) byla provedena postupem vycházejícím z Laemmliho práce [41]. Tato technika se používá k separaci proteinů na základě jejich molekulové hmotnosti. K separaci byl použit 4% (w/v) zaostřovací a 15% (w/v) separační gel. Oba gely vznikly kopolymerací 21

33 Materiál a metody akrylamidu a N,N-methylen-bis-akrylamidu (BIS). Dalšími složkami gelů byly persíran amonný a N,N,N,N -tetramethylethylendiamin (TEMED), které slouží k iniciaci polymerace. Persíran amonný se působením světla rozkládá za vzniku volných radikálů, které způsobují polymeraci akrylamidu a N,N-methylen-bis-akrylamidu. TEMED se používá jako stabilizátor volných radikálů [42]. 15% separační gel byl připraven smísením 3,5 ml pufru A, 3,5 ml polymeračního roztoku A, 7 µl TEMEDu a 70 µl persíranu amonného (100 mg/ml). Gel byl nalit do výšky cca 6 cm mezi dvě skla oddělená spacery, která byla umístěna vertikálně v elektroforetické aparatuře (minive Vertical, Amersham Biosciences). Poté byl gel převrstven destilovanou vodou, aby na jeho povrchu nevznikly nerovnosti. Po ztuhnutí (cca 45 minut) byla destilovaná voda vylita a povrch gelu osušen filtračním papírem. Poté byl připraven 4% zaostřovací gel smísením 2,6 ml pufru B, 400 µl polymeračního roztoku B, 3 µl TEMEDu a 60 µl persíranu amonného (100 mg/ml). Zaostřovací gel byl nalit na separační gel a ihned po nalití byl mezi dvě skla shora zasunut hřeben pro vytvoření jamek. Po ztuhnutí zaostřovacího gelu (cca 45 minut) byl hřeben vyjmut, dolní silikonové těsnění elektroforetické aparatury bylo uvolněno a aparatura byla umístěna do elektroforetické vany. Horní i dolní elektrodový prostor byl vyplněn elektrodovým pufrem. Vhodně zředěné vzorky byly smíchány s odpovídajícím množstvím 4x koncentrovaného vzorkového pufru. Výsledný roztok byl 5 min povařen (elektrický vařič, ETA), krátce odstředěn (stolní minicentrifuga, Labnet) a nanesen do jamek v gelu. Nanáška činila µl roztoku na jamku. Elektroforéza probíhala vertikálně za konstantního napětí 80 V při průchodu zaostřovacím gelem a po 45 min bylo napětí zesíleno na 150 V pro průchod separačním gelem. Celková doba průběhu elektroforézy byla nastavena na 2 hod. Po skončení elektroforézy byla skla vyjmuta z elektroforetické aparatury a opatrně oddělena od sebe. Zaostřovací gel byl odstraněn a separační gel byl vložen na 5 min do fixačního roztoku, následně do barvící lázně (na 20 min za horka, na 60 min za laboratorní teploty) a nakonec do odbarvovací lázně minimálně na 60 min. 22

34 Materiál a metody Stanovení koncentrace proteinů pomocí BCA Stanovení koncentrace proteinů bylo provedeno metodou dle Wiechelmana a kol. [43]. Ke stanovení koncentrace proteinů bylo využito BCA činidlo, což je sodná sůl kyseliny 4,4 -dikarboxy-2,2 - bicinchoninové (BCA). BCA činidlo se připravuje smísením roztoků sodné soli kyseliny bicinchoninové v alkalickém prostředí (49 dílů) a CuSO 4 (1 díl). (Složení roztoků je uvedeno níže.) Při interakci s proteinem dochází nejprve k alkalické redukci měďnatého iontu na měďný dle rovnice: Protein + Cu 2+ OH- Cu +, dále dochází k chelataci měďného iontu kyselinou bicinchoninovou za vzniku červeně zbarveného komplexu, dle rovnice: Cu BCA (BCA) 2 - Cu + komplex Absorbance vzniklého komplexu se měří při vlnové délce 562 nm, ke stanovení koncentrace se využívá kalibrace standardy - nejčastěji hovězím sérovým albuminem (BSA) [42]. Vzorky určené ke stanovení koncentrace byly nejprve vhodně naředěny destilovanou vodou (podle potřeby 5x - 100x). Každý vzorek byl připraven ve třech různých ředěních a kvůli eliminaci chyb byl každý typ ředění připraven třikrát. Zároveň byla připravena kalibrace: ke kalibraci byl použit BSA o koncentraci 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 mg/ml (ředěno dvojkovou řadou). Poté bylo připraveno BCA činidlo: BCA byla rozpuštěna ve 49 dílech roztoku A (0,4% NaOH (w/v); 0,95% NaHCO 3 (w/v); 2% Na 2 CO 3 (w/v); 0,16% vínan sodný (w/v); ph 11) tak, aby výsledná koncentrace byla 1 % BCA (w/v) v 50 dílech. Dále byl přidán 1 díl roztoku B (4% CuSO 4.5H 2 O (w/v) v destilované vodě). BCA činidlo bylo rozpipetováno po 980 µl do vyžíhaných zkumavek. Do každé zkumavky bylo následně přidáno 20 µl vzorku (nebo BSA), směs byla promíchána na vortexu a inkubována 1 hodinu ve vodní lázni (Julabo TW8, Biotech) při 60 C. Na závěr byla změřena absorbance vzorků a BSA při vlnové délce 562 nm (spektrofotometr Diod Array 8453, Hewllet-Packard) proti kontrole, kde bylo k BCA činidlu přidáno 20 µl destilované vody místo vzorku. 23

35 Materiál a metody 3.4 Metody: Příprava expresních vektorů nesoucích syntetické geny pro lidské cytochromy b 5 V průběhu diplomové práce byly připraveny dva expresní vektory expresní vektor obsahující syntetický gen pro lidský cytochrom b 5 vázaný v membráně endoplasmatického retikula (mikrosomální cytochrom b 5 ) a expresní vektor obsahující gen pro lidský erytrocytární (cytoplasmatický) cytochrom b 5. Veškeré metody použité k přípravě expresních vektorů byly prováděny zároveň pro oba zmíněné geny Oligonukleotidy použité pro genové syntézy Pro syntézu inzertů obsahujících geny kódující lidský mikrosomální a erytrocytární cytochrom b 5 byly navrženy oligonukleotidy uvedené v následující tabulce 1. Tab. 1 Oligonukleotidy pro syntézu inzertů a. 6b Sekvence oligonukleotidu 5 -GACGAATTCATATGGCGGAACAGTCTGACGAAGCGGTTAAA TACTACACCCTGGAAGAAATC-3 5 -ATACTACACCCTGGAAGAAATCCAGAAACACAACCACTCTA AATCTACCTGGCTGATCCTGCACCACAAA-3 5 -TTCACGCAGAACTTCTTCACCACCCGGGTGTTCTTCCAGGA ATTTGGTCAGGTCGTAAACTTTGTGGTGCAGGATCAG-3 5 -TGAAGAAGTTCTGCGTGAACAGGCGGGTGGTGACGCGACCG AAAACTTCGAAGACGTTGGTCACTCTACCGACGCGC-3 5 -CGTCCGGGTGCAGTTCACCGATGATGAAGGTTTTAGACATT TCACGCGCGTCGGTAGAGTG-3 5 -AACTGCACCCGGACGACCGTCCGAAACTGAACAAACCGCCG GAAACCCTGATCACCACCATC-3 5 -GTAAAGCTTCTCGAGTTACGGTTCCGGCGGTTTGTTCAGTTT CGGACGGTCGTCCGGGTGCAGTT-3 5 -CAACCGCAGAGATCGCCGGGATAACCCAGTTGGTCCACCAA GAAGAAGAAGAGTCGATGGTGGTGATCAGGGT-3 5 -GTAAAGCTTCTCGAGTTAGTCTTCCGCCATGTACAGACGGT ACATCAGCGCAACCGCAACCGCAGAGATCGC-3 24

36 Materiál a metody Inzert obsahující gen pro lidský mikrosomální cytochrom b 5 byl syntetizován pomocí oligonukleotidů 1, 2, 3, 4, 5, 6a, 7 a 8. Inzert obsahující gen pro lidský erytrocytární (cytoplasmatický) cytochrom b 5 byl syntetizován pomocí oligonukleotidů 1, 2, 3, 4, 5 a 6b. Oligonukleotidy byly dodány v lyofilizované formě firmou East Port Praha Polymerasová řetězová reakce-pcr Lyofilizované oligonukleotidy, které při syntéze genu slouží zároveň jako primery, byly rozpuštěny ve µl sterilní vody (dle dodaného množství) na 100 µm koncentaci. 10 µl těchto 100 µm roztoků bylo následně použito k přípravě 20 µm roztoků sloužících jako zásobní pro PCR. Byly provedeny dvě následné PCR. V 1. kroku PCR byly do reakční směsi přidány oligonukleotidy 2, 3, 4, 5, 6a, 7 v případě syntézy genu pro lidský mikrosomální cytochrom b 5 a oligonukleotidy 2, 3, 4, 5 v případě syntézy genu pro lidský erytrocytární cytochrom b 5. Touto reakcí byla připravena směs oligonukleotidů obsahující také úseky DNA odpovídající celé vnitřní části syntetizovaných genů. Produkt této 1. PCR byl použit jako templát pro 2. PCR. Jako primery sloužily oligonukleotidy 1 a 8 v případě mikrosomální formy cytochromu b 5 a oligonukleotidy 1 a 6b v případě erytrocytární formy. Díky těmto oligonukleotidům byl ze směsi různě dlouhých oligonukleotidů amplifikován požadovaný úsek odpovídající celému syntetickému inzertu obsahujícímu gen pro příslušný lidský cytochrom b 5. Úseky odpovídající celým syntetickým inzertům byly následně izolovány horizontální elektroforézou na agarose. Reakční směs pro 1. PCR obsahovala: 1 µl oligonukleotidu 2, 3, 4, 5, 6a, 7 (20 µm) pro mikrosomální formu cyt b 5 nebo 1 µl oligonukleotidu 2, 3, 4, 5 (20 µm) pro erytrocytární formu cyt b 5 1 µl směsi dinukleotidtrifosfátů (10 mm) 5 µl pufru pro Pfu polymerasu (10x koncentrovaný) 0,5 µl Pfu polymerasy Sterilní vodu do celkového objemu 50 µl 25

37 Materiál a metody Reakční směs pro 2. PCR obsahovala: 1 µl oligonukleotidu 1 a 8 (20 µm) pro mikrosomální formu cyt b 5 nebo 1 µl oligonukleotidu 1 a 6b (20 µm) pro erytrocytární formu cyt b 5 1 µl produktu 1. PCR sloužícího jako templát 1 µl směsi dinukleotidtrifosfátů (10 mm) 5 µl pufru pro Pfu polymerasu (10x koncentrovaný) 0,5 µl Pfu polymerasy Sterilní vodu do celkového objemu 50 µl Obě reakce probíhaly v termocycleru (Techgene, Techne), kde byly nastaveny následující podmínky: 30 cyklů 94 C 30 s : rozvolnění DNA 50 C 30s : nasednutí oligonukleotidů (primerů) 73 C 2 min : polymerace 1 cyklus 73 C 5 min : dosyntetizování segmentů DNA 6 C do té doby, než se z cycleru odebraly vzorky Horizontální agarosová elektroforéza Horizontální elektroforéza na agarosovém gelu byla prováděna za účelem přečištění DNA, nebo jako kontrolní metoda po provedení dvojí restrikce DNA. Nejprve byla připravena 1,5 % agarosa ve 40 ml 1x koncentrovaného TAE pufru ph 8,2 (zásobní roztok 50x koncentrovaný: 2 M Tris, 1 M kyselina octová, 50 mm EDTA). Agarosa byla rozpuštěna ohřevem v mikrovlnné troubě za občasného promíchání. Po ochlazení na cca 40 C byly do roztoku agarosy přidány 4 µl barviva SYBR Safe TM DNA gel Stain (10000x koncentrované), roztok byl promíchán a nalit do elektroforetické nádobky s hřebenem k vytvoření jamek pro nanášení vzorků. Po ztuhnutí gelu byl vyjmut hřeben, nádobka byla umístěna do elektroforetické aparatury 26

38 Materiál a metody (MSMINI 10-Multi Sub Mini, Uvitec) tak, aby záporně nabitá DNA mohla putovat v elektrickém poli ke kladně nabitému pólu, a zalita 1x koncentrovaným TAE pufrem. Do jamek byly nanášeny vzorky smíchané s 5x koncentrovaným vzorkovým pufrem (40% sacharosa (w/v), 0,1% bromfenolová modř (w/v)) v maximálním množství 25 µl na jamku. Vzorky byly porovnávány s DNA standardy (DNA marker bp nebo λ marker bp), které byly po ředění vzorkovým pufrem pro DNA markery nanášeny v množství 3 µl na jamku. Elektroforéza probíhala minut za použití zdroje EPS 301 při napětí 110 V. Gel byl analyzován v temné komoře na transluminátoru (Dark Reader, Clare Chemical Research). Pro účel archivace byly gely vyfotografovány fotoaparátem (DMC-LS65, Panasonic) Izolace DNA z gelu-jetquick Gel Extraction Spin Kit Požadovaná DNA byla opatrně vyříznuta z gelu, přičemž byl kladen důraz na to, aby nedošlo k její kontaminaci, přenesena do mikrozkumavky Eppendorf a zvážena na analytických vahách (HM-200, A&D Instruments LTD). Dále bylo postupováno dle návodu výrobce JETquick Gel Extraction Spin Kitu [44]. Do mikrozkumavky byl přidán solubilizační roztok L1 obsahující chaotropní soli a TBE-solubilizátor (300 µl L1 na každých 100 mg gelu) a gel se nechal rozpustit při 50 C (ohřívač bloků LS1, VLM GmbH) 15 minut za občasného promíchání poklepáním na stěnu mikrozkumavky. Po rozpuštění gelu byly vzorky aplikovány na kolonky JETquick v maximálním objemu 600 µl, kolonky byly vloženy do mikrozkumavek Eppendorf a centrifugovány 1 min při RPM (centrifuga 5415, Eppendorf). Eluovaný roztok byl odstraněn. Kolonky byly poté promyty 500 µl roztoku L1 a opět centrifugovány 1 min při RPM. Eluovaný roztok byl odstraněn. Následně byl na kolonky aplikován roztok L2 obsahující NaCl, EDTA, Tris-HCl a ethanol, který byl odstřeďován 1 min při RPM a pak odstraněn. Dále bylo provedeno odstranění případných zbytků roztoku L2 centrifugací při nejvyšších otáčkách (13200 RPM) 1 min. Po tomto kroku byly kolonky vyjmuty a přeneseny do čistých 1,5 ml mikrozkumavek Eppendorf, doprostřed kolonek bylo aplikováno 50 µl sterilní vody předehřáté na 65 C a 1 min se kolonky nechlay stát při laboratorní teplotě. Nakonec byla provedena eluce DNA odstředěním při RPM 2 min. 27

39 Materiál a metody Štěpení DNA pomocí endonukleas EcoRI a HindIII Pro účel ligace produktů 2. PCR (nasyntetizovaných inzertů) do klonovacího vektoru puc19, bylo nutné nejprve provést dvojí restrikci jak plasmidu, tak inzertů, pomocí endonukleas EcoRI a HindIII. Podmínky, za kterých jsou obě endonukleasy aktivní, byly nalezeny na webových stránkách firmy New England Biolabs v aplikaci Double Digest Finder [45]. Metoda byla dále ještě optimalizována použitím různé koncentrace enzymů a různé doby štěpení, až byly nalezeny ideální podmínky, za kterých byla naštěpena téměř všechna použitá DNA (ověřeno elektroforézou na agarose.) K restrikci inzertu bylo použito: 15 µl produktu 2. PCR (vyizolovaný z agarosového gelu) 1 µl EcoRI 2 µl HindIII 2 µl pufru pro Eco RI (10x koncentrovaný) K restrikci vektoru PUC19 bylo použito: 6 µl plasmidu puc19 1 µl EcoRI 2 µl HindIII 2 µl pufru pro Eco RI (10x koncentrovaný) Sterilní voda do celkového objemu 20 µl Restrikce endonukleasami EcoRI a HindIII probíhala 2 hod při teplotě 37 C (IR 1500 Automatic CO 2 Incubator, Flow Laboratories) Štěpení DNA pomocí endonukleas XhoI a NdeI Před provedením ligace inzertů obsahujících gen pro příslušný lidský cytochrom b 5 do expresního vektoru pet22b byla provedena restrikce pet22b a restrikce inzertů z klonovacího vektoru puc19 pomocí endonukleas XhoI a NdeI. Podmínky restrikce byly opět nalezeny na webových stránkách firmy New England Biolabs [45] (viz předchozí oddíl 3.4.5). 28

40 Materiál a metody K restrikci inzertu z puc19 bylo použito: µl puc19 s inzertem (dle koncentrace plasmidové DNA) 1 µl XhoI 1 µl NdeI 2 µl pufru NEB 4 (10x koncentrovaný) 0,2 µl BSA (100x koncentrovaný) Sterilní voda do celkového objemu 20 µl Restrikce probíhala přes noc při 37 C (IR 1500 Automatic CO 2 Incubator, Flow Laboratories). Restrikce plasmidu pet22b byla provedena analogicky s tím rozdílem, že k restrikci bylo použito pouze 10 µl pet22b. Mimo výše zmíněných případů byla provedena také kontrolní restrikce pomocí EcoRI a HindIII po ligaci inzertu do klonovacího vektoru puc19 a následné amplifikaci tohoto konstruktu. Dále byla provedena kontrolní restrikce pomocí XhoI a NdeI po ligaci inzertu (vyštěpeného z puc19) do expresního vektoru pet22b a následné amplifikaci tohoto konstruktu. Ke kontrolní restrikci, která sloužila k ověření správného průběhu ligace, bylo použito 5-15 µl plasmidové DNA (dle koncentrace), množství ostatních složek restrikční směsi a podmínky restrikce zůstaly zachovány Ligace Ligační reakce byla využita při vkládání inzertu do klonovacího vektoru puc19 a do expresního vektoru pet22b. V obou případech byla ligace prováděna mezi fragmenty DNA s kohezivními (přečnívajícími, komplementárními) konci. K ligaci byla využita DNA ligasa z bakteriofága T4. Ligační směs obsahovala: 15 µl naštěpeného inzertu 2 µl naštěpeného vektoru (pcu19 nebo pet22b) 1 µl T4 DNA ligasy 2 µl pufru pro T4 DNA ligasu 29

41 Materiál a metody Nejprve byla smíchána vektorová DNA s inzertem, vložena na 5 min do ohřívače bloků (LS1, VLM GmbH) nastaveného na teplotu 45 C a následně ponechána 3 min na ledu. Tato inkubace sloužila k rozrušení nežádoucích vazeb mezi komplementárními konci [36]. Poté byly přidány ostatní složky ligační směsi. Ligace probíhala přes noc v termocycleru (Techgene, Techne) nastaveném na udržování teploty 16 C Transformace buněk E. coli DH5α vektorem, amplifikace vektoru Tento postup byl využit pro amplifikaci vektorů pet22b a puc19 obsahujících syntetické geny pro cytochromy b 5. Zásobní roztok buněk Escherichia coli DH5α (skladováno v -80 C) byl vyjmut z mrazáku a rozmražen na ledu při laboratorní teplotě. 100 µl buněk bylo přidáno do 1,5 ml mikrozkumavky Eppendorf k 20 µl klonovacího nebo expresního vektoru obsahujícího příslušný gen a směs byla ponechána 30 min na ledu. Poté byla mikrozkumavka vystavena teplotnímu šoku 1,5 min v ohřívači bloků (LS1, VLM GmbH) nastaveném na teplotu 42 C a následně ponechána 2 min na ledu při laboratorní teplotě. Do mikrozkumavky bylo přidáno 300 µl LB média bez ampicilinu a následovala hodinová kultivace buněk při 37 C (IR 1500 Automatic CO 2 Incubator, Flow Laboratories). Po vyjmutí z inkubátoru byla suspenze v mikrozkumavce krátce odstředěna při nízkých otáčkách (0,5 min, 5000 RPM, centrifuga 5415, Eppendorf), horních 100 µl supernatantu bylo odebráno a odstraněno a ve zbylém objemu supernatantu byla opatrně resuspendována peleta. (Provedeno z důvodu redukce objemu LB média, menší objem se lépe vsákne do agaru.) Poté byla suspenze pipetou nanesena na předem připravenou agarovou plotnu s ampicilinem (100 µg/ml) (viz oddíl 3.3.1) a vyžíhanou hokejkou rozetřena po celém povrchu agaru. Agarové plotny s buňkami byly ponechány přes noc při teplotě 37 C (IR 1500 Automatic CO 2 Incubator, Flow Laboratories). Stejný postup byl proveden i v případě amplifikace samotného vektoru puc19. V tomto případě byl k transformaci 100 µl buněk E. coli DH5α použit 1 µl puc19. 30

42 Materiál a metody Kultivace buněk E. coli DH5α metoda single-cell colony Druhý den byly přes noc narostlé kolonie (vždy několik z každé agarové plotny) přeočkovány v laminárním boxu (Bio 126, Labox). Přeočkování bylo provedeno sterilním párátkem následujícím způsobem: do vyžíhané pinzety bylo uchopeno párátko, špičkou párátka byla opatrně nabrána 1 kolonie z agarové plotny a párátko bylo vhozeno do zkumavky Falcon s 5-ti ml LB média obsahujícího ampicilin (100µg/ml). Agarové plotny byly obaleny parafilmem a uloženy do lednice k případnému dalšímu použití. Přeočkované kolonie umístěné ve zkumavkách Falcon s ne zcela utaženými víčky (z důvodu zajištění dostatečné aerace) byly inkubovány při 37 C a 200 RPM přes noc (ORBI-SAFE TS Net Wise, Gallenkamp). Následující den bylo odebráno 200 µl přes noc narostlé buněčné kultury z každé zkumavky Falcon a uchováno v 15 % roztoku glycerolu (v/v) v -80 C k případnému dalšímu použití Izolace plasmidové DNA-minipreparace (JETquick-Plasmid miniprep Spin Kit) Ze zkumavek Falcon obsahujících narostlé buněčné kultury bylo nejprve vyžíhanou pinzetou odstraněno párátko. Dále byla suspenze centrifugována při 4500 RPM 5 min (centrifuga Allegro X-22R, Beckman Coulter, rotor 4250), supernatant byl odstraněn a zkumavky Falcon s peletami byly ponechány 2 minuty v převrácené poloze, aby se odstranily zbytky LB média. Dále bylo postupováno dle návodu dodáného výrobcem JETquick-Plasmid miniprep Spin Kitu [44]. K peletám bylo přidáno 250 µl roztoku G1 (50 mm Tris-HCl ph 8, 10 mm EDTA, 100 µg/ml RNasa A), pelety byly resuspendovány a přeneseny do sterilních mikrozkumavek Eppendorf. Pak bylo do mikrozkumavek přidáno 250 µl lyzačního roztoku G2 (200 mm NaOH, 1% SDS (w/v)), promícháno převracením a ponecháno při laboratorní teplotě 5 min. Dále bylo do mikrozkumavek přidáno 350 µl neutralizačního roztoku G3 obsahujícího acetát a guanidin hydrochlorid, směs byla promíchána převracením a centrifugována při maximálních otáčkách (13200 RPM) po dobu 10 min (centrifuga 5415, Eppendorf). 31

43 Materiál a metody Supernatant byl pomocí pipety přemístěn na kolonku JETquick umístěnou v nové sterilní mikrozkumavce Eppendorf a odstřeďován 1 min při RPM. Eluovaný roztok byl odstraněn a kolonka byla promyta 500 µl roztoku G4 (obsahujícího NaCl, EDTA, Tris-HCl a ethanol). Následovala centrifugace 1 min při RPM (centrifuga 5415, Eppendorf), eluovaný roztok byl opět odstraněn a kolonka byla umístěna zpět do mikrozkumavky. Poté byla provedena další centrifugace 1 min při RPM (centrifuga 5415, Eppendorf) kvůli odstranění zbytků roztoku G4. Nakonec byla provedena eluce plasmidové DNA: kolonky byly přeneseny do nových sterilních 1,5 ml mikrozkumavek Eppendorf a bylo na ně aplikováno 75 µl sterilní vody předehřáté na 65 C. Po 1 minutě stání při laboratorní teplotě byla DNA eluována odstředěním při RPM 2 min (centrifuga 5415, Eppendorf) a dále uchována v mrazáku při -20 C Izolace plasmidové DNA-maxipreparace (JETSTAR-Plasmid Maxiprep Kit) Koloniemi E. coli DH5α transformovanými plasmidovou DNA, které byly kultivovány přes noc při 37 C na agarové plotně, bylo metodou single-cell colony inokulováno 250 ml tekutého LB média obsahujícího ampicilin (100 µg/ml). Přeočkované kolonie byly inkubovány při 37 C a 140 RPM přes noc (ORBI-SAFE TS Net Wise, Gallenkamp). Druhý den bylo postupováno dle návodu dodaného výrobcem JETSTAR-Plasmid Maxiprep Kitu [46]. Nejprve byla provedena ekvilibrace JETSTAR kolonky pomocí 30 ml roztoku E4 (600 mm NaCl, 100 mm octan sodný, 0,15% Triton X-100 (w/v), ph 5 pomocí kyseliny octové) z JETSTAR-Plasmid Maxiprep Kitu. Poté bylo 250 ml LB média s narostlými kulturami rozděleno do 2 centrifugačních zkumavek, vyváženo a centrifugováno při 3000 RPM a teplotě 4 C 10 min (centrifuga Janetzki K70D, MLW). Médium bylo odlito, pelety byly resuspendovány v 5 ml roztoku E1 (50 mm Tris-HCl, 10 mm EDTA, ph 8 pomocí HCl, 100 µg/ml RNasa A), spojeny a přeneseny do zkumavky Falcon (50 ml). Do zkumavky bylo přidáno 10 ml roztoku E2 (200 mm NaOH, 1% SDS (w/v)), suspenze byla promíchána převracením a inkubována 5 min při laboratorní teplotě. Pak bylo do zkumavky přidáno 10 ml roztoku E3 (3,1 M octan draselný, ph 5,5 pomocí kyseliny octové), suspenze byla opět promíchána 32

44 Materiál a metody převracením, rozdělena do 2 centrifugačních zkumavek (30 ml) a zkumavky byly vyváženy. Následovala centrifugace při RPM 10 min (centrifuga Allegro X-22R, Beckman Coulter, rotor 630). Supernatant byl aplikován na předem ekvilibrovanou kolonku JETSTAR, nechal se samovolně protéct a poté byl vylit. Pak byla kolonka promyta 60 ml roztoku E5 (800 mm NaCl, 100 mm octan sodný, ph 5 pomocí kyseliny octové), který se nechal samovolně protéct a následně byl vylit. Plasmidová DNA byla z kolonky eluována do centrifugační zkumavky (30 ml) pomocí 15 ml roztoku E6 (1250 mm NaCl, 100 mm Tris-HCl, ph 8,5 pomocí HCl), který se opět nechal samovolně protéct kolonkou. Dále byla provedena precipitace DNA přídavkem 10,5 ml isopropanolu vychlazeného na -20 C do centrifugační zkumavky. Směs byla centrifugována 30 min při RPM a 4 C. Isopropanol byl odlit, peleta byla promyta 10 ml 70% (v/v) ethanolu vychlazeného na -20 C a směs byla opět centrifugována 30 min při RPM a 4 C. Ethanol byl odlit a peleta byla sušena v otevřené centrifugační zkumavce 15 min při laboratorní teplotě. Nakonec byla peleta resuspendována v 500 µl sterilní vody a přenesena do sterilní 1,5 ml mikrozkumavky Eppendorf Příprava kompetentních buněk E. coli DH5α pomocí CaCl 2 Pojmem kompetentní buňky se rozumí buňky schopné přijmout plasmidovou DNA. Poměrně jednoduchou metodou pro přípravu kompetentních buněk je jejich inkubace s CaCl 2 za snížené teploty. Při této metodě je důležité zajistit buňkám dostatečnou aeraci a odebrat buňky na počátku exponenciální fáze růstu (hodnota optické denzity při 600 nm přibližně 0,4), kdy jsou v optimálním fyziologickém stavu [36]. Do mikrozkumavky Eppendorf se zásobním roztokem buněk E. coli DH5α (skladováno v -80 C) byla zanořena špička sterilního párátka a párátko bylo vhozeno do Erlenmeyerovy baňky (500 ml) s 50 ml LB média obsahujícího ampicilin (100µg/ml). Kultivace buněk probíhala paralelně ve 2 Erlenmeyerových baňkách při 37 C a 120 RPM (inkubátor Orbi-Safe TS Net Wise, Gallenkamp). Průběžně byla měřena optická denzita buněk E. coli DH5α v LB médiu při 600 nm (OD 600 ) proti roztoku LB média s ampicilinem (100µg/ml). Kultivace byla ukončena v momentě, kdy OD 600 dosáhla hodnoty 0,36 v jedné a 0,40 v druhé Erlenmeyerově baňce. 33

45 Materiál a metody Poté byly buňky přeneseny do 2 zkumavek Falcon (50 ml) a ponechány 10 min na ledu. Následovala centrifugace při 4000 RPM a 4 C 10 min (centrifuga Allegro X-22R, Beckman Coulter, rotor 4250). Supernatant byl odlit a zkumavky s peletami byly ponechány 2 min v obrácené poloze, aby se odstranily zbytky LB média. Ke každé peletě bylo přidáno 10 ml 100 mm CaCl 2 vychlazeného na 0 C, pelety byly resuspendovány vychlazenou špičkou a ponechány 10 min na ledu. Následovala opět centrifugace při 4000 RPM a 4 C 10 min, supernatant byl odlit a zkumavky s peletami byly ponechány 2 min v obrácené poloze, aby se odstranily zbytky roztoku CaCl 2. Ke každé peletě byly přidány 2 ml 100 mm CaCl 2 vychlazeného na 0 C, pelety byly resuspendovány vychlazenou špičkou a ponechány 2 hod na ledu při laboratorní teplotě. Nakonec byly do každé zkumavky přidány 2 ml sterilního 50% glycerolu a buňky byly po 200 µl alikvotech přeneseny do sterilních Mikrozkumavek Eppendorf a skladovány v -80 C Určení koncentrace a čistoty DNA Purinové a pyrimidinové báze v DNA mají aromatický charakter a díky nim mají roztoky DNA charakteristické absorpční spektrum s minimem při 236 nm a maximem při 260 nm [35]. Pro odhad koncentrace a čistoty vzorků DNA se využívá měření absorbance v ultrafialové oblasti ( nm). Koncentrace plasmidové DNA byla určena ze vztahu: Koncentrace DNA [µg/ml] = (A 260 -A 320 ) x ředění x 50 µg/ml Pro posouzení čistoty roztoků DNA byl využit poměr (A 260 -A 320 ) / (A 280 -A 320 ), protože nejčastějšími znečišťujícími látkami v roztocích DNA bývají proteiny, které mají absorpční maximum při vlnové délce 280 nm. Dalším poměrem určujícím čistotu roztoku DNA je poměr (A 260 -A 320 ) / (A 230 -A 320 ), který udává množství přítomných solí a organických látek. Absorbance při 320 nm pak především koriguje přítomnost případného zákalu v roztoku DNA. Kvalitní DNA má poměr (A 260 -A 320 ) / (A 280 -A 320 ) v rozmezí 1,7 2 a poměr (A 260 -A 320 ) / (A 230 -A 320 ) vyšší než 1,5 [47]. Pro účel sekvenace by oba poměry měly být vyšší než 1,8 [48]. Koncentrace a čistota DNA byla stanovována za využití spektrofotometru Diod Array 8453, Hewlett-Packard. Vzorky DNA byly naředěny 1: 260 sterilní vodou a bylo 34

46 Materiál a metody změřeno jejich absorpční spektrum od 200 do 330 nm proti sterilní vodě. Z hodnot absorbance při vlnových délkách 230, 260, 280 a 320 nm byla určena koncentrace a čistota DNA Příprava vzorků na sekvenaci Připravené klonovací vektory puc19 s vloženými syntetickými geny pro lidské cytochromy b 5 byly sekvenovány v Laboratoři sekvenace DNA Univerzity Karlovy v Praze, Viničná 7. K sekvenaci byl využit standardní primer M13R o nukleotidové sekvenci: 5 - AACAGCTATGACCATG -3. Na sekvenaci byly připraveny vzorky obsahující 600 ng DNA ve 13 µl sterilní vody. 35

47 Výsledky a diskuse 4 Výsledky a diskuse 4.1 Heterologní exprese a purifikace solubilního králičího cytochromu b 5 V první fázi zpracování tématu diplomové práce byla provedena izolace solubilního králičího cytochromu b 5. Pro tento účel byl již dříve v laboratoři připraven konstrukt založený na plasmidu pet22b nesoucí syntetický gen kódující solubilní králičí cytochrom b 5. Protein kódovaný tímto genem odpovídal uměle zkrácenému mikrosomálnímu králičímu cytochromu b 5. Aminokyselinové sekvence králičího mikrosomálního a uměle zkráceného solubilního cytochromu b 5 je uvedena na obrázku 8. Sekvence králičího mikrosomálního cytochromu b 5 byla nalezena v databázi Uniprot pod identifikačním číslem P00169 [49]. Membránový Solubilní 1 AAQSDKDVKYYTLEEIKKHNHSKSTWLILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLREQAGGDA 1 AAQSDKDVKYYTLEEIKKHNHSKSTWLILHHKVYDLTKFLEEHPGGEEVLREQAGGDA ********************************************************** Membránový 59 TENFEDVGHSTDARELSKTFIIGELHPDDRSKLSKPMETLITTVDSNSSWWTNWVIPA Solubilní 59 TENFEDVGHSTDARELSKTFIIGELHPDDRSK ******************************** Membránový 117 ISALIVALMYRLYMADD Obr. 8 Aminokyselinová sekvence králičích cytochromů b 5 Membránový = králičí mikrosomální cytochrom b 5 Solubilní = uměle zkrácený mikrosomální cytochrom b 5 (neobsahuje hydrofobní aminokyseliny na C-konci proteinu, kterými je protein vázán v membráně endoplasmatického retikula.) Hvězdičkou jsou označeny shodné aminokyseliny. Výše zmiňovaný konstrukt byl použit pro transformaci buněk E. coli BL-21 Gold. Kultivace buněk probíhala v tekutém LB médiu (0,5 l), které bylo inokulováno metodou multi-cell colony. Pět hodin po indukci byla exprese cytochromu b 5 ukončena, buňky sklizeny a desintegrovány sonikací. Pomocí frakční centrifugace byla získána cytosolární frakce, která byla dále purifikována iontově výměnnou chromatografií na DEAE Seoharose CL-6B 36

48 Výsledky a diskuse Nanesení vzorku a promytí kolony Na kolonu DEAE Sepharosy CL-6B bylo aplikováno cca 17 ml cytosolární frakce obsahující cytochrom b 5. Během promývání kolony byly jímány frakce o objemu 3 ml, ve kterých byla průběžně měřena absorbance při 280 nm (vlnová délka odpovídající absorpci aromatických aminokyselin v proteinech) a 413 nm (absorpční maximum cytochromu b 5 ). Izolace solubilní formy cytochromu b 5 byla v naší laboratoři prováděna poprvé, a to podle zavedeného postupu na izolaci membránové formy (ve variantě bez použití detergentů). Bylo tedy důležité zjistit, jestli i u zkrácené formy dochází k úplné vazbě na kolonu a zda-li nedochází ke ztrátám při promývání kolony. Výsledky ukázaly, že solubilní králičí cytochrom b 5 s ostatními záporně nabitými látkami zůstal zachycen na koloně anexu, zatímco neutrální a kladně nabité látky byly eluovány z kolony. Eluce byla ukončena při poklesu A 280 na prakticky nulovou hodnotu. Průběh chromatografie ilustruje následující graf (Obr. 9). 4,5 Nanesení vzorku a promytí kolony (DEAE Sepharosa CL-6B) Absorbance 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 280 nm 413 nm 0,0 0-0, Eluční objem [ml] Obr. 9 Eluční profil proteinů z kolony DEAE Sepharosy CL-6B (V=50 ml; 2,5x20 cm), eluční pufr: 10 mm KH 2 PO 4, 1 mm EDTA, 20% glycerol (w/v), ph nm absorbance frakcí při vlnové délce 280 nm (absorpční maximum aromatických aminokyselin) 413 nm - absorbance frakcí při vlnové délce 413 nm (absorpční maximum cyt b 5 ) U zeleně zvýrazněných frakcí byla provedena kontrolní elektroforéza SDS-PAGE. 37

49 Výsledky a diskuse Z chromatogramu na předešlé straně (Obr. 9) je patrné, že se na kolonu nevázalo velké množství aromatických látek. Frakce v oblasti odpovídající elučnímu objemu ml vykazovaly určitou absorbanci při 413 nm. V těchto frakcích byly pravděpodobně přítomny hemové proteiny nevázající se na kolonu (absorpční maximum hemoproteinů leží v oblasti nm) nebo vysokomolekulární agregáty obsahující bazické proteiny. U vybraných frakcí reprezentujících tři hlavní maxima na chromatogramu, které odpovídaly elučním objemům 21, 24, 27, 30, 54 a 108 ml (v grafu na obrázku 9 jsou tyto frakce zvýrazněny zeleně) byla provedena kontrolní elektroforéza SDS-PAGE (Obr. 10) σ Da Da Da Da Da Da Da Da Solubilní cyt b Da Da Da Obr. 10 Výřez SDS-PAGE frakcí z kolony DEAE Sepharosy CL-6B čísla odpovídající elučnímu objemu dané frakce. Vzorky ředěny 10x. σ sigma marker molekulových hmotností. Ze sledovaných frakcí pouze frakce odpovídající elučnímu objemu 21, 24, 27 a 30 obsahovaly podstatné množství proteinů, z nichž malou částí by mohl být také cytochrom b 5 (molekulová hmotnost cca Da). Mohlo by se jednat například o malé množství cytochromu b 5, který je součástí výše zmiňovaných agregátů, které se na kolonu nevážou. Ve frakcích odpovídajících elučním objemům 54 a 108 ml způsobila zvýšenou absorbanci 38

50 Výsledky a diskuse při 280 nm pravděpodobně přítomnost nečistot neproteinové povahy, neboť na SDS-ELFO nebyly v těchto frakcích detekovány žádné proteiny. Při poklesu absorbance při 280 nm na prakticky nulovou hodnotu bylo promývání kolony ukončeno a byla zahájena gradientová eluce cytochromu b 5 z kolony Gradientová eluce a purifikace cytochromu b 5 Gradientová eluce cytochromu b 5 z kolony DEAE Sepharosy CL-6B probíhala pomocí gradientu KCl (0-400 mm). Monitorovány byly opět vlnové délky 280 a 413 nm (viz Obr. 11). Eluční profil cytochromu b 5 z anexové kolony (DEAE Sepharosa CL-6B) gradientem KCl Absorbance 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0, nm 280 nm 0,0-0, Eluční objem [ml] Obr. 11 Průběh gradientové eluce cytochromu b 5 z kolony DEAE Sepharosy CL-6B (V=50 ml; 2,5x20 cm), eluční pufr: 10 mm KH 2 PO 4, 1 mm EDTA, 20% glycerol (w/v), ph nm - absorbance měřená při vlnové délce 280 nm 413 nm - absorbance měřená při vlnové délce 413 nm (absorpční maximum cyt b 5 ) Vrchol ležící v oblasti ml odpovídá eluci cytochromu b 5. U zeleně zvýrazněných frakcí byla provedena kontrolní elektroforéza SDS-PAGE. 39

51 Výsledky a diskuse Z chromatogramu je patrné, že došlo k dobrému oddělení cytochromu b 5 od ostatních proteinů, což ukazuje vysoký poměr A 413 / A 280 u frakcí odpovídajících elučnímu objemu 229, 235 a 241 ml. U těchto a ještě dalších frakcí odpovídajících ostatním maximům na chromatogramu byla provedena elektroforéza SDS-PAGE (Obr. 12). V grafu na obrázku 11 na předešlé straně jsou tyto frakce zvýrazněny zeleně Solubilní cytochrom b 5 Obr. 12 Gradientová eluce cyt b 5 z kolony DEAE Sepharosy CL-6B čísla odpovídající elučnímu objemu dané frakce. Vzorky ředěny 10x. Frakce odpovídající elučnímu objemu ml obsahovaly podstatné množství cytochromu b 5 a zároveň minimum ostatních proteinů. Přítomné znečišťující proteiny vykazovaly podstatně větší molekulou hmotnost než cytochrom b 5, bylo tedy přistoupeno k dodatečnému purifikačnímu kroku gelové filtraci. Frakce byly spojeny, zahuštěny a naneseny na kolonu Sephadexu G-75 (viz Obr. 13 na následující straně). Během gelové filtrace došlo k efektivnímu odstranění proteinů, které měly větší molekulovou hmotnost než cytochrom b 5. U vybraných frakcí reprezentujících maxima na chromatogramu byla opět provedena kontrolní elektroforéza SDS-PAGE (viz Obr. 14 na následující straně). 40

52 Výsledky a diskuse Eluční profil cytochromu b 5 - gelová filtrace (Sephadex G-75) Absorbance 2,0 1,6 1,2 0,8 0, nm 413 nm 0,0-0, Eluční objem [ml] Obr. 13 Průběh gelové filtrace cytochromu b 5 kolona Sephadexu G-75, ph 8 (V=80 ml; 2x40 cm), eluční pufr: 10 mm KH 2 PO 4, 1 mm EDTA, 20% (w/v) glycerol, ph8 280 nm - absorbance při vlnové délce 280 nm 413 nm - absorbance při vlnové délce 413 nm (absorpční maximum cyt b 5 ) Peak ležící v oblasti ml odpovídá eluci cytochromu b 5. Zeleně jsou zvýrazněny frakce, u kterých byla provedena kontrolní elektroforéza SDS- PAGE Solubilní cytochrom b 5 Obr. 14 Gelová filtrace cyt b 5 z kolony Sephadexu G čísla odpovídající elučnímu objemu dané frakce. Vzorky ředěny 10x. 41

53 Výsledky a diskuse Na základě porovnání výsledků elektroforézy (Obr. 14, předešlá strana) a chromatogramu (Obr. 13, předešlá strana) byly vybrány frakce odpovídající elučním objemům 44, 49 a 53 ml, které neobsahovaly žádné detekovatelné proteiny s výjimkou cytochromu b 5. Tyto frakce byly spojeny a zahuštěny a po 200 µl alikvotech přeneseny do mikrozkumavek Eppendorf, v nichž byly uchovány při -80 C k dalšímu použití Celkový průběh exprese a purifikace králičího solubilního cytochromu b 5 Celkový průběh exprese a purifikace králičího solubilního cytochromu b 5 reprezentuje následující obrázek 15. Ve vybraných vzorcích byla stanovena koncentrace proteinů pomocí BCA činidla s BSA (viz oddíl ). Tyto koncentrace jsou uvedeny v tabulce 2 na další straně σ Solubilní cytochrom b 5 Obr. 15 Průběh exprese a purifikace cytochromu b 5 1. Buňky E. coli BL-21 Gold před indukcí exprese cytochromu b 5 (ředěno 2x) 2. Buňky E. coli BL-21 Gold po indukci exprese cytochromu b 5 pomocí IPTG (ředěno 4x) 3. Desintegrované buňky E. coli BL-21 Gold (ředěno 13x) 5. Cytosolární frakce buněk E. coli BL-21 Gold po desintegraci (ředěno 2x) 7. Spojené frakce obsahující cytochrom b 5 před purifikací gelovou filtrací (ředěno 10x) 8. Purifikovaný cytochrom b 5 (ředěno 10x) 9. Purifikovaný cytochrom b 5 (ředěno 5x) σ - Standard molekulových hmotností, dráhy 4. a 6. obsahují jen destilovanou vodu 42

54 Výsledky a diskuse Tab. 2 Koncentrace proteinů Stanoveno pomocí BCA činidla s BSA. Vzorek C [mg/ml] Buňky E. coli BL-21 Gold po indukci exprese cyt b 5 15,1 ± 0,8 Cytosolární frakce desintegrovaných buněk E. coli BL-21 Gold 12,6 ± 0,9 Spojené frakce obsahující cyt b 5 před purifikací 4,3 ± 0,4 Cytochrom b 5 1,2 ± 0,1 Po desintegraci buněk E. coli BL-21 Gold, které byly transformovány expresním vektorem pet22b nesoucím syntetický gen pro králičí solubilní cytochrom b 5, bylo získáno cca 17 ml cytosolární frakce obsahující mimo jiné i cytochrom b 5. Z cytosolární frakce, která obsahovala 15,1 ± 0,8 mg/ml proteinů, byly získány 2 ml purifikovaného králičího solubilního cytochromu b 5 o koncentraci 1,2 ± 0,1 mg/ml. Množství získaného proteinu, vzhledem k počátečnímu objemu kultury (500 ml), je poněkud menší, než lze u poměrně malého proteinu jako je cytochrom b 5 očekávat. Hlavními důvody by mohla být jeho možná zvýšená afinita k bazickým proteinům přítomným v E. coli., nebo také nižší stabilita uměle zkrácené formy proteinu za podmínek exprese a izolace. Tomu by nasvědčovalo i nespecifické vysolování této uměle připravené solubilní formy cytochromu b 5, která při orientačním srážení pomocí (NH 4 ) 2 SO 4, precipitovala v širokém rozsahu koncentrací. Proto byl tento jinak běžný purifikační krok z izolace vyloučen a není v práci ani detailněji popisován. 43

55 Výsledky a diskuse 4.2 Příprava expresních vektorů obsahujících syntetické geny pro lidský mikrosomální a erytrocytární cytochrom b Syntéza inzertů obsahujících geny pro lidské cytochromy b 5 Za účelem přípravy expresních vektorů byly syntetizovány dva inzerty obsahující syntetické geny pro lidský cytochrom b 5 gen kódující protein identický s lidským cytochromem b 5 vázaným v membráně endoplasmatického retikula (lidský mikrosomální cytochrom b 5 ) a gen kódující protein identický s lidským solubilním erytrocytárním (cytoplasmatickým) cytochromem b 5. V případě syntézy genu kódujícího solubilní formu lidského cytochromu b 5 bylo kvůli podezření na sníženou stabilitu dříve navrženého solubilního (uměle zkráceného) králičího cytochromu b 5 přistoupeno k přípravě erytrocytárního cytochromu b 5. Tato forma cytochromu b 5 se přirozeně vyskytuje v lidském organismu a v prostředí maturovaného erytrocytu je velmi stabilní. Nukleotidové sekvence obou syntetizovaných inzertů jsou uvedeny na obrázku 16 na další straně. 44

56 Výsledky a diskuse a) EcoRI GACGAATTCATATGGCGGAACAGTCTGACGAAGCGGTTAAATACTACACCCTGGAAGAA ATCCAGAAACACAACCACTCTAAATCTACCTGGCTGATCCTGCACCACAAAGTTTACGA CCTGACCAAATTCCTGGAAGAACACCCGGGTGGTGAAGAAGTTCTGCGTGAACAGGCGG GTGGTGACGCGACCGAAAACTTCGAAGACGTTGGTCACTCTACCGACGCGCGTGAAATG TCTAAAACCTTCATCATCGGTGAACTGCACCCGGACGACCGTCCGAAACTGAACAAACC GCCGGAAACCCTGATCACCACCATCGACTCTTCTTCTTCTTGGTGGACCAACTGGGTTA TCCCGGCGATCTCTGCGGTTGCGGTTGCGCTGATGTACCGTCTGTACATGGCGGAAGAC TAACTCGAGAAGCTTTAC XhoI NdeI HindIII b) EcoRI NdeI GACGAATTCATATGGCGGAACAGTCTGACGAAGCGGTTAAATACTACACCCTGGAAGAA ATCCAGAAACACAACCACTCTAAATCTACCTGGCTGATCCTGCACCACAAAGTTTACGA CCTGACCAAATTCCTGGAAGAACACCCGGGTGGTGAAGAAGTTCTGCGTGAACAGGCGG GTGGTGACGCGACCGAAAACTTCGAAGACGTTGGTCACTCTACCGACGCGCGTGAAATG TCTAAAACCTTCATCATCGGTGAACTGCACCCGGACGACCGTCCGAAACTGAACAAACC GCCGGAACCGTAACTCGAGAAGCTTTAC XhoI HindIII Obr. 16 Nukleotidová sekvence syntetizovaných inzertů a) inzert obsahující gen pro mikrosomální cytochrom b 5, černě je označena sekvence kódující enzymaticky aktivní N-koncovou doménu proteinu, zeleně oblast kódující membránovou kotvu, modře úseky obsahující restrikční místa, iniciační kodon respektive terminační kodon (stop kodon) a tří bázový přesah. b) inzert obsahující gen pro erytrocytární cytochrom b 5, černě je označena sekvence genu (shodná s enzymaticky aktivní doménou mikrosomálního cyt b 5 ), červeně kodon kódující prolin (u mikrosomálního cyt b 5 tento kodon chybí), modře úseky obsahující restrikční místa, iniciační kodon respektive stop kodon a tří bázový přesah. 45

57 Výsledky a diskuse Pro přípravu inzertů bylo nutné navrhnout několik oligonukleotidů o délce přibližně 70 bp, které odpovídaly celému úseku syntetizovaného inzertu (viz schéma na Obr. 17). Tyto oligonukleotidy se vzájemně překrývaly úseky o délce bp, jejichž teplota tání se pohybovala okolo 60 C. a) b) Obr. 17 Schéma překryvu oligonukleotidů při syntéze genů pro lidské cytochromy b 5 a) membránově vázaná forma b) solubilní forma Zvláštní pozornost byla věnována zejména krajním oligonukleotidům, které obsahují navíc restrikční místa pro inzerci do klonovacího vektoru (puc19) a do expresního vektoru (pet22b), iniciační kodon respektive stop kodon a tří bázový přesah. Tyto oligonukleotidy navíc slouží při amplifikaci inzertu jako primery ve druhém kroku dvoustupňové PCR (viz oddíl 3.4.2). První oligonukleotidy slouží jako forward primery zajišťující amplifikaci DNA od začátku oligonukleotidové sekvence. Poslední oligonukleotidy plní funkci reverse primerů a zajišťují amplifikaci konce nukleotidové sekvence. Poslední oligonukleotidy musí být tedy komplementární k požadované nukleotidové sekvenci. U obou syntetizovaných inzertů byl na 5 -konci prvního oligonukleotidu přidán tří bázový přesah GAC a za ním restrikční místo pro endonukleasu EcoRI GAATTC zajišťující inzerci do klonovacího vektoru puc19. Cytosin na konci restrikčního místa pro EcoRI je zároveň první bazí v sekvenci restrikčního místa CATATG, které rozeznává endonukleasa NdeI zajišťující inzerci do expresního vektoru pet22b. Restrikční místo, které rozeznává Nde I, zároveň obsahuje iniciační kodon pro translaci proteinu ATG. Sekvence přidaná na 5 -konci prvních oligonukleotidů je na obrázku 16 a) a b) na předešlé straně umístěna na začátku nukleotidové sekvence a zvýrazněna modře. Na obrázku 18 a) a b) na následující straně je tato sekvence zvýrazněna podtržením na 5 -konci prvního oligonukleotidu. 46

58 Výsledky a diskuse Poslední oligonukleotid obou syntetizovaných inzertů byl navržen komplementárně k požadované sekvenci. Na jeho 5 -konec byla přidána komplementární sekvence ke stop kodonu TAA, tedy ATT. Následovala sekvence GAGCTC komplementární k restrikčnímu místu CTCGAG, které rozeznává endonukleasa XhoI umožňující inzerci do expresního vektoru pet22b. Dále byla přidána sekvence TTCGAA komplementární k sekvenci AAGCTT, kterou rozeznává endonukleasa HindIII. Ta umožňuje vložení inzertu do klonovacího vektoru puc19. Nakonec byl přidán tří bázový přesah ATG komplementární k TAC. Sekvence přidaná na 5 -konce posledních oligonukleotidů je na obrázku 18 a) a b) zvýrazněna podtržením. Tato sekvence je komplementární k modře vyznačenému úseku na konci nukleotidové sekvence na obrázku 16 a) a b) na straně 45. a) 5 -GACGAATTCATATGGCGGAACAGTCTGACGAAGCGGTTAAATACTACACCCTGGAAGAAATC-3 5 -ATACTACACCCTGGAAGAAATCCAGAAACACAACCACTCTAAATCTAC CTGGCTGATCCTGCACCACAAA-3 5 -TGAAGAAGTTCTGCGTGAACAGGCGGGT 3 -GACTAGGACGTGGTGTTTCAAATGCTGGACTGGTTTAAGGACCTTCTTGTGGGCCCACCACTTCTTCAAGACGCACTT-5 GGTGACGCGACCGAAAACTTCGAAGACGTTGGTCACTCTACCGACGCGC-3 5 -AACTGCACCCGG 3 -GTGAGATGGCTGCGCGCACTTTACAGATTTTGGAAGTAGTAGCCACTTGACGTGGGCC ACGACCGTCCGAAACTGAACAAACCGCCGGAAACCCTGATCACCACCATC-3 TGC-5 3 -TGGGACTAGTGGTGGTAGCTGAGAAGAAGAAGAACCACCTGGTTGACCCAATAGGGCCG 3 -CG CTAGAGACGCCAAC-5 CTAGAGACGCCAACGCCAACGCGACTACATGGCAGACATGTACCGCCTTCTGATTGAGCTCTTCGAAATG-5 b) 5 -GACGAATTCATATGGCGGAACAGTCTGACGAAGCGGTTAAATACTACACCCTGGAAGAAATC-3 5 -ATACTACACCCTGGAAGAAATCCAGAAACACAACCACTCTAAATCTAC CTGGCTGATCCTGCACCACAAA-3 5 -TGAAGAAGTTCTGCGTGAACAGGCGGGT 3 -GACTAGGACGTGGTGTTTCAAATGCTGGACTGGTTTAAGGACCTTCTTGTGGGCCCACCACTTCTTCAAGACGCACTT-5 GGTGACGCGACCGAAAACTTCGAAGACGTTGGTCACTCTACCGACGCGC-3 3 -GTGAGATGGCTGCGCGCACTTTACAGATTTTGGAAGTAGTAGCCACTTGACGTGGGCC 3 -TTGACGTGGGCC TGC-5 TGCTGGCAGGCTTTGACTTGTTTGGCGGCCTTGGCATTGAGCTCTTCGAAATG-5 Obr. 18 Nukleotidová sekvence syntetizovaných oligonukleotidů a) inzert obsahující gen pro mikrosomální cytochrom b 5 b) inzert obsahující gen pro erytrocytární cytochrom b 5 47

59 Výsledky a diskuse Nukleotidové sekvence genů pro lidské cytochromy b 5 byly navrženy na základě aminokyselinových sekvencí lidského mikrosomálního a erytrocytárního cytochromu b 5 uvedených v databázi Uniprot pod identifikačním číslem P respektive P [50]. Nukleotidové sekvence byly navrženy a optimalizovány pomocí webové aplikace Optimizer [51] tak, aby vyhovovaly používaným kmenům E. coli příbuzným s kmenem K12. Kontrola správné translace DNA na protein byla provedena za pomoci webové aplikace Emboss Transeq [52]. Nakonec byly optimalizovány teploty tání překrývajících se úseků oliginukleotidů a predikována tvorba případných nežádoucích sekundárních struktur (vlásenek, dimerů apod.) ve webové aplikaci IDT Oligo Analyzer 3.1 [53] Amplifikace inzertů obsahujících geny pro lidské cytochromy b 5 Amplifikace inzertů obsahujících geny pro mikrosomální a erytrocytární formu lidského cytochromu b 5 byla provedena ve dvou následných PCR (viz oddíl 3.4.2). Na obrázku 19 jsou ukázány výsledky prvního i druhého kroku PCR Erytrocytární cyt b 5 (323 bp),mikrosomální cyt b 5 (431 bp) Obr. 19 Amplifikace inzertů s geny pro mikrosomální a erytrocytární cyt b 5 1: Amplifikované oligonukleotidy po 1. PCR - inzert s genem pro erytrocytární cyt b 5 2: Amplifikované oligonukleotidy po 2. PCR, šipkou je označen bend odpovídající požadovanému inzertu s genem pro erytrocytární cyt b 5 (323 bp) 3: DNA marker bp 4: Amplifikované oligonukleotidy po 1. PCR - inzert s genem pro mikrosomální cyt b 5 5: Amplifikované oligonukleotidy po 2. PCR, šipkou je označen bend odpovídající požadovanému inzertu s genem pro mikrosomální cyt b 5 (431 bp) 48

60 Výsledky a diskuse Jak je patrné z fotografie agarosového gelu na obrázku 19 na předešlé straně, v průběhu 2. PCR nedošlo k amplifikaci pouze požadovaného inzertu, ale bylo přítomno i mnoho kratších oligonukleotidových fragmentů (dráhy 2 a 5). Proto byly proužky odpovídající oběma inzertům izolovány z agarosového gelu a použity (0,05 µl) jako templát pro další (třetí) PCR. Výsledky této amplifikace ukazuje následující obrázek Erytrocytární cyt b 5 Mikrosomální cyt b 5 (431 bp) Obr. 20 Amplifikace inzertů s geny pro mikrosomální a erytrocytární cyt b 5 (3. PCR) Jako templát sloužily již aplifikované inzerty (0,05 µl), které byly izolovány z agarosového gelu. 1-4: Amplifikace inzertu s genem pro mikrosomální cyt b 5 (431 bp) 5: DNA marker bp 6-8: Amplifikace inzertu s genem pro erytrocytární cyt b 5 (323 bp) Amplifiace obou inzertů byla provedena paralelně ve dvou PCR mikrozkumavkách obsahujících identické reakční směsi. Každá reakční směs byla při nanášení na agarosový gel rozdělena do dvou jamek, z toho důvodu je amplifikovaný inzert s genem pro mikrosomální cytochrom b 5 přítomen ve čtyřech drahách. Na obrázku 20 je vidět, že amplifikace inzertu s genem pro mikrosomální cytochrom b 5 proběhla bez komplikací. Tento inzert byl tedy vyříznut z drah 1 4 a izolován z agarosového gelu. V případě inzertu s genem pro erytrocytární cytochrom b 5 však k amplifikaci nedošlo. Z toho důvodu byla amplifikace tohoto inzertu provedena znovu ve dvou následných PCR (kroky 1 a 2). Výsledky amplifikace ilustruje obrázek 21 na další straně. 49

61 Výsledky a diskuse Obr. 21 Amplifikace inzertu s genem pro erytrocytární cytochrom b 5 1: DNA marker bp 2: Amplifikované oligonukleotidy po 1. PCR 3-5: Amplifikovaný inzert obsahující gen pro erytrocytární cytochrom b 5 (323 bp) po 2. PCR. Velká intenzita bendu v dráze č. 5 je způsobena zhruba dvojnásobnou koncentrací DNA v tomto vzorku oproti vzorkům v drahách 3 a 4. Jak je vidět z obrázku 21, amplifikace inzertu obsahujícího gen pro erytrocytární cytochrom b 5 proběhla tentokrát již úspěšně. Bendy odpovídající amplifikovanému inzertu jsou viditelné v drahách 3-5. Amplifikace probíhala opět paralelně ve dvou PCR mikrozkumavkách obsahujících identické reakční směsi. První reakční směs byla při nanášení na agarosový gel rozdělena do dvou jamek (dráhy 3 a 4). Druhá reakční směs rozdělena nebyla a byla zahuštěna na cca polovinu původního objemu. Z toho důvodu je proužek příslušející amplifikovanému inzertu v dráze 5 intenzivnější než proužky v drahách 3 a 4. Amplifikované inzerty s genem pro erytrocytární cytochrom b 5 byly vyříznuty z drah 3, 4 a 5 a izolovány z agarosového gelu. Tímto způsobem byly připraveny syntetické geny pro mikrosomální a erytrocytární formu lidského cytochromu b 5 s příslušnými restrikčními místy na koncích tak, aby mohly být vloženy do klonovacího plasmidu puc Restrikce pomocí endonukleas EcoRI a HindIII Byla provedena dvojí restrikce pomocí endonukleas EcoRI a HindIII, a to jak s inzertem obsahujícím gen pro erytrocytární formu lidského cytochromu b 5, tak s inzertem 50

62 Výsledky a diskuse obsahujícím gen pro mikrosomální formu lidského cytochromu b 5 a s vlastním klonovacím vektorem, plasmidem puc19. Po provedení dvojí restrikce byly vzorky přečištěny elektroforézou na agarose a následně izolovány z agarosového gelu. Výsledky štěpení ukazují následující fotografie agarosových gelů (Obr. 22 a) a b), Obr. 23) Inzert s genem pro erytrocytární cyt b 5 (315 bp) Inzert s genem pro mikrosomální cyt b 5 (423 bp) a) b) Obr. 22 Restrikce inzertů endonukleasami EcoRI a HindIII a) 1, 2: inzert s genem pro erytrocytární cyt b 5 po restrikci, 3:DNA marker bp b) 1, 2: inzert s genem pro mikrosomální cyt b 5 po restrikci, 3:DNA marker bp Fotografie byly převedeny do černobílé podoby kvůli zvýšení kontrastu barev a tedy lepší viditelnosti proužků po tisku. Úprava byla provedena v programu gimp i686 [54] puc19: restrikce EcoRI a HindIII 3530 bp 2027 bp Obr. 23 Restrikce puc19 endonukleasami EcoRI a HindIII 1: puc19, 2: puc19 po restrikci pomocí EcoRI, 3: puc19 po restrikci pomocí HindIII, 4: puc19 po dvojí restrikci pomocí EcoRI a HindIII, 5: DNA marker bp 51

63 Výsledky a diskuse Z výsledků na obrázku 23 na předešlé straně je patrné, že v porovnání s neštěpeným plasmidem, došlo po restrikci ke zvětšení jeho zdánlivé molekulové hmotnosti, což je obvykle vyvoláno jeho linearizací a tudíž zvětšeným odporem při průchodu gelem. Restrikce plasmidu puc19 byla provedena také pouze pomocí endonukleasy EcoRI (Obr. 23, dráha 2) a nebo pomocí samotné endonukleasy HindIII (Obr. 23, dráha 3). Tato štěpení sloužila k ověření, zda jsou obě endonukleasy aktivní. Po dvojí restrikci byla provedena ligace obou inzertů do plasmidu puc19. Po ligaci byl tento vektor amplifikován v buňkách E. coli DH5α, ze kterých byl následně izolován minipreparací. Byly získány 4 vzorky obsahující amplifikovaný vektor puc19 s vloženým genem pro erytrocytární cytochrom b 5 pocházející ze 4 různých kolonií E. coli DH5α. Dále bylo získáno 6 vzorků obsahujících amplifikovaný vektor puc19 s vloženým genem pro mikrosomální cytochrom b 5 pocházející ze 6 různých kolonií E. coli DH5α. Na základě určené koncentrace a čistoty plasmidové DNA v těchto vzorcích byly vybrány 2 vzorky vhodné k sekvenaci (viz tabulka 3). Tab. 3 Koncentrace a čistota vzorků určených k sekvenaci Konstrukt s genem pro erytrocytární cyt b 5 Konstrukt s genem pro mikrosomální cyt b 5 c [µg/ ml] (A 260 -A 320 ) / (A 280 -A 320 ) (A 260 -A 320 ) / (A 230 -A 320 ) 406 2,00 1, ,04 1, Ověření připravených konstruktů pomocí DNA sekvenace K sekvenaci byl využit primer M13R o nukleotidové sekvenci: 5 - AAC AGCTATGACCATG -3, který při sekvenaci nasedal reverzně a komplementárně na úsek nukleotidové sekvence, který je na obrázcích 24 (str. 53), 25 (str. 54) a 26 (str. 55) podbarven růžově. Výsledky sekvenace byly tedy dodány v reverzní a komplementární formě k původní sekvenci inzertů. Proto byly nejprve převedeny pomocí webové aplikace Reverse Complement na serveru bioinformatics.org [55] a následně porovnány na webovém serveru BLAST pomocí aplikace nucleotide blast s původní sekvencí [56]. 52

64 Výsledky a diskuse Na obrázcích 24, 25 (str. 54), 26 (str. 55) je uvedena nukleotidová sekvence syntetického genu pro erytrocytární respektive mikrosomální cytochrom b 5 vloženého v plasmidu puc19. Na těchto obrázcích je šedě podbarvena sekvence, kterou se podařilo sekvenací potvrdit. Modrým písmem (šedě podbarveným) je uveden úsek sekvence, která byla potvrzena manuálně na základě vyhodnocení elektroforeogramu, který byl obdržen spolu s výsledky sekvenace. Žlutě jsou podbarveny úseky, které nebyly sekvenací potvrzeny. EcoRI NdeI Iniciační kodon GGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT GAATTCATATGGCGGAACAGTCTGACGAAGCGGTTAAATACTACACCCTGGAA GAAATCCAGAAACACAACCACTCTAAATCTACCTGGCTGATCCTGCACCACAA AGTTTACGACCTGACCAAATTCCTGGAAGAACACCCGGGTGGTGAAGAAGTTC TGCGTGAACAGGCGGGTGGTGACGCGACCGAAAACTTCGAAGACGTTGGTCAC TCTACCGACGCGCGTGAAATGTCTAAAACCTTCATCATCGGTGAACTGCACCCG GACGACCGTCCGAAACTGAACAAACCGCCGGAACCGTAACTCGAGAAGCTTGG CGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC CACACA...-3 Stop kodon XhoI HindIII Obr. 24 Nukleotidové sekvence genu pro erytrocytární cyt b 5 vloženého v plasmidu puc19 Šedě je podbarvena sekvence potvrzená sekvenací, modrým písmem (šedě podbarveným) je uveden úsek sekvence potvrzené na základě elektroforeogramu. Žlutě je podbarven guanin, který nebyl sekvenací potvrzen. Růžově je podbarvena sekvence, na kterou nasedal primer M13R. Sekvenací se podařilo ověřit správnost syntézy prakticky celé sekvence erytrocytární formy lidského cytochromu b 5 (Obr. 24), až k poslednímu nukleotidu v kodonu pro prolin 98 (poslední C-koncová aminokyselina). Tento kodon je však naštěstí zcela degenerovaný, takže by i v případě, že by během přípravy konstruktu došlo k mutaci, vznikl vždy tentýž protein. 53

65 Výsledky a diskuse EcoRI NdeI Iniciační kodon GGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT GAATTCATATGGCGGAACAGTCTGACGAAGCGGTTAAATACTACACCCTGGAA GAAATCCAGAAACACAACCACTCTAAATCTACCTGGCTGATCCTGCACCACAA AGTTTACGACCTGACCAAATTCCTGGAAGAACACCCGGGTGGTGAAGAAGTTC TGCGTGAACAGGCGGGTGGTGACGCGACCGAAAACTTCGAAGACGTTGGTCAC TCTACCGACGCGCGTGAAATGTCTAAAACCTTCATCATCGGTGAACTGCACCCG GACGACCGTCCGAAACTGAACAAACCGCCGGAAACCCTGATCACCACCATCGA CTCTTCTTCTTCTTGGTGGACCAACTGGGTTATCCCGGCGATCTCTGCGGTTGCG GTTGCGCTGATGTACCGTCTGTACATGGCGGAAGACTAACTCGAGAAGCTTGG CGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC CACACA...-3 Stop kodon XhoI HindIII Obr. 25 Nukleotidové sekvence genu pro mikrosomální cyt b 5 vloženého v plasmidu puc19 Šedě je podbarvena sekvence potvrzená sekvenací, modrým písmem (šedě podbarveným) je uveden úsek sekvence potvrzené na základě elektroforeogramu. Žlutě je podbarven kodon odpovídající C-koncové aminokyselině (Asp 133), který nebyl sekvenací potvrzen. Růžově je podbarvena sekvence, na kterou nasedal primer M13R. Také v tomto případě se sekvenací podařilo ověřit správnost téměř celé sekvence lidského mikrosomálního cytochromu b 5 (Obr. 25). Sekvenací nebyl identifikován pouze poslední nukleotidový triplet, který kóduje C-koncovou kyselinu asparagovou (Asp 133). Vzhledem k tomu, že v sekvenci erytrocytární formy, ani v ověřeném úseku sekvence mikrosomální formy cytochromu b 5, nebyla zjištěna žádná mutace, je ale pravděpodobné, že k mutaci nedošlo ani u posledních tří nukleotidů. Aby bylo možné skutečně vyloučit mutaci v syntetizovaném genu pro lidský mikrosomální cytochrom b 5, byla kvalita sekvenačních dat vylepšena pomocí specializovaného programu LongTrace Online. Tento program je volně dostupný jako limitovaná webová služba [57]. Takto upravená hrubá data byla vizualizována a znovu zanalyzována v programu Sequence Scanner v1.0 [58]. Tímto způsobem byla zlepšena 54

66 Výsledky a diskuse čitelnost sekvence na obou koncích a jednoznačně potvrzena identita nejen C-koncové aminokyseliny (Asp 133), ale také přítomnost terminačního kodonu TAA za touto aminokyselinou (Obr. 26). EcoRI NdeI Iniciační kodon GGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT GAATTCATATGGCGGAACAGTCTGACGAAGCGGTTAAATACTACACCCTGGAA GAAATCCAGAAACACAACCACTCTAAATCTACCTGGCTGATCCTGCACCACAA AGTTTACGACCTGACCAAATTCCTGGAAGAACACCCGGGTGGTGAAGAAGTTC TGCGTGAACAGGCGGGTGGTGACGCGACCGAAAACTTCGAAGACGTTGGTCAC TCTACCGACGCGCGTGAAATGTCTAAAACCTTCATCATCGGTGAACTGCACCCG GACGACCGTCCGAAACTGAACAAACCGCCGGAAACCCTGATCACCACCATCGA CTCTTCTTCTTCTTGGTGGACCAACTGGGTTATCCCGGCGATCTCTGCGGTTGCG GTTGCGCTGATGTACCGTCTGTACATGGCGGAAGACTAACTCGAGAAGCTTGG CGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTC CACACA...-3 Stop kodon XhoI HindIII Obr. 26 Optimalizovaná sekvenační data nukleotidové sekvence genu pro mikrosomální cyt b 5 vloženého v plasmidu puc19 Šedě je podbarvena sekvence potvrzená sekvenací, modrým písmem (šedě podbarveným) je uveden úsek sekvence potvrzené na základě softwarového vylepšeného elektroforeogramu. Růžově je podbarvena sekvence, na kterou nasedal primer M13R. Stejným postupem byla také optimalizována a reevaluována sekvenční data sekvence erytrocytární formy lidského cytochromu b 5. Opět se podařilo prodloužit čitelnost sekvence na obou koncích a tak potvrdit přítomnost CCG kodonu příslušejícího prolinu

67 Výsledky a diskuse Maxipreparace klonovacích vektorů puc19 obsahujících geny pro lidské cytochromy b 5 Koloniemi E. coli DH5α, které obsahovaly konstrukty prověřené sekvenací, bylo inokulováno 250 ml LB média. Buňky byly kultivovány přes noc a následně byla provedena maxipreparace plasmidové DNA. Touto metodou se podařilo získat 500 µl vektoru puc19 s vloženým genem pro mikrosomální cytochrom b 5 a 500 µl vektoru puc19 s vloženým genem pro erytrocytární cytochrom b 5. Koncentrace a čistota vektorů je uvedena v následující tabulce 4. Část těchto konstruktů byla následně použita pro přípravu expresních vektorů, ale většina byla uchována pro další použití v mrazáku při -20 C. Tab. 4 Koncentrace a čistota klonovacích vektorů získaných maxipreparací Konstrukt s genem pro erytrocytární cyt b 5 Konstrukt s genem pro mikrosomální cyt b 5 c [µg/ ml] (A 260 -A 320 ) / (A 280 -A 320 ) (A 260 -A 320 ) / (A 230 -A 320 ) 521 1,87 2, ,87 2, Příprava expresních vektorů nesoucích geny pro lidské cytochromy b 5 Aby mohly být oba geny zaligovány do expresního vektoru pet22b, bylo je nejprve nutné vyštěpit z klonovacího vektoru puc19. Toto štěpení bylo provedeno pomocí endonukleas XhoI a NdeI. Stejnými enzymy byl rozštěpen také expresní vektor pet22b. Ve všech případech byla mimo dvojí restrikce provedena také restrikce samotnou endonukleasou XhoI a samotnou endonukleasou NdeI. Výsledky štěpení ukazují obrázky 27 na straně 57 a 28 na straně

68 Výsledky a diskuse Obr. 27 Restrikce pet22b endonukleasami XhoI a NdeI 1: DNA marker bp 2: pet22b 3: pet22b po restrikci pomocí XhoI, 4: pet22b po restrikci pomocí NdeI 5: pet22b po dvojí restrikci pomocí XhoI a NdeI Fotografie byla převedena do černobílé podoby kvůli zvýšení kontrastu barev a tedy lepší viditelnosti proužků po tisku. Úprava byla provedena v programu gimp i686 [54]. Z obrázku 27 je patrné, že po provedení dvojí restrikce plasmidu pet22b, stejně tak jako po restrikci každou endonukleasou samostatně, došlo k linearizaci plasmidu. Proti původnímu očekávání však neštěpený plasmid vykazoval při elektroforéze nižší mobilitu, než plasmid linearizovaný. Příčinou by mohla být absence supersekundárních struktur (např. supercoil ) u tomto preparátu plasmidu a přítomnost pouze kruhové molekuly plasmidu. 57

69 Výsledky a diskuse Gen pro erytrocytární cyt b 5 (303 bp) 239 bp Gen pro mikrosomální cyt b 5 (411 bp) Fragmenty o velikosti cca 220 bp Obr. 28 Restrikce puc19 nesoucího syntetické inzerty pomocí XhoI a NdeI 1: restrikce puc19 obsahujícího gen pro erytrocytární cyt b 5 pomocí XhoI 2: restrikce puc19 obsahujícího gen pro erytrocytní cyt b 5 pomocí NdeI 3: dvojí restrikce puc19 obsahujícího gen pro erytrocytní cyt b 5 4: DNA marker bp 5: dvojí restrikce puc19 obsahujícího gen pro mikrosomální cyt b 5 6: restrikce puc19 obsahujícího gen pro mikrosomální cyt b 5 pomocí NdeI 7: restrikce puc19 obsahujícího gen pro mikrosomální cyt b 5 pomocí XhoI Fotografie byla převedena do černobílé podoby kvůli zvýšení kontrastu barev a tedy lepší viditelnosti proužků po tisku. Úprava byla provedena v programu gimp i686 [54]. Jak je vidět na obrázku 28, z obou plasmidů se podařilo úspěšně vyštěpit inzert nesoucí gen pro erytrocytární cytochrom b 5 (dráha 3) i inzert obsahující gen pro mikrosomální cytochrom b 5 (dráha 5). Ve všech drahách, kde byla DNA vystavena endonuklease NdeI (dráhy 2, 3, 5 a 6), je patrný slabý proužek o velikosti cca 220 bp. Plasmid puc19 totiž obsahuje další restrikční místo rozeznávané endonukleasou NdeI, které je vzdálené 218 bp od restrikčního místa pro NdeI vloženého před oběma syntetickými geny. Inzerty obsahující geny pro lidský erytrocytární a mikrosomální cytochrom b 5 byly izolovány z drah 3 a 5, zaligovány do expresního vektoru pet22b pomocí T4 DNA ligasy a použity k transformaci buněk E. coli DH5α. 58

70 Výsledky a diskuse Maxipreparace expresních vektorů pet22b obsahujících geny pro lidské cytochromy b 5 Expresními vektory pet22b s vloženými syntetickými geny byly transformovány buňky E. coli DH5α. Transformované buňky byly kultivovány na agarových plotnách a následně byla provedena inokulace 250 ml LB média metodou single cell colony. Kultivace buněk v LB médiu probíhala přes noc, poté byly buňky sklizeny a amplifikované konstrukty byly získány maxipreparací plasmidové DNA. Takto bylo získáno 2 x 500 µl expresního vektoru pet22b s vloženým genem pro mikrosomální cytochrom b 5 (od 2 různých kolonií E. coli DH5α) a 2 x 500 µl expresního vektoru pet22b s vloženým genem pro erytrocytární cytochrom b 5 (od 2 různých kolonií E. coli DH5α). Koncentrace a čistota vektorů je uvedena v následující tabulce (Tab. 5). Tab. 5 Koncentrace a čistota expresních vektorů získaných maxipreparací Konstrukt s genem pro erytrocytární cyt b 5 č. 1 Konstrukt s genem pro erytrocytární cyt b 5 č. 2 Konstrukt s genem pro mikrosomální cyt b 5 č. 1 Konstrukt s genem pro mikrosomální cyt b 5 č. 2 c [µg/ ml] (A 260 -A 320 ) / (A 280 -A 320 ) (A 260 -A 320 ) / (A 230 -A 320 ) 311 2,12 3, ,17 3, ,92 2, ,24 3, Kontrolní restrikce připravených expresních vektorů S expresními vektory získanými maxipreparací byla provedena kontrolní restrikce endonukleasami XhoI a NdeI. Výsledky restrikce ilustruje obrázek 29 na následující straně. 59

71 Výsledky a diskuse Gen pro erytrocytární cyt b 5 Gen pro mikrosomální cyt b 5 Obr. 29 Restrikce připravených expresních vektorů endonukleasami XhoI a NdeI 1: DNA marker bp 2: Expresní vektor s genem pro erytrocytární cyt b 5 č. 1 po restrikci (303 bp) 3: Expresní vektor s genem pro erytrocytární cyt b 5 č. 2 po restrikci (303 bp) 4: DNA marker bp 5: Expresní vektor s genem pro mikrosomální cyt b 5 č. 1 po restrikci (411 bp) 6: Expresní vektor s genem pro mikrosomální cyt b 5 č. 2 po restrikci (411 bp) Fotografie byla převedena do černobílé podoby kvůli zvýšení kontrastu barev a tedy lepší viditelnosti proužků po tisku. Úprava byla provedena v programu gimp i686 [54]. Přítomnost vyštěpených genů v drahách 2, 3, 5 a 6 na obrázku 29 svědčí o správném průběhu ligace, tedy o tom, že připravené expresní vektory pet22b skutečně obsahují zaligované syntetické geny pro lidský erytrocytární a mikrosomální cytochrom b Kontrolní exprese lidského erytrocytárního a mikrosomálního cytochromu b 5 Aby bylo ověřeno, že jsou buňky E. coli transformované připravenými expresními vektory schopné produkovat požadované lidské cytochromy b 5, byla provedena kontrolní exprese těchto proteinů. K tomuto účelu byl využit kmen E. coli BL-21 Gold. Kultivace transformovaných buněk probíhala nejprve na agarové plotně přes noc, poté byla provedena inokulace 7 ml LB média metodou multi cell colony. Buňky byly v LB médiu kultivovány do OD 600 cca 1 a poté byla přes noc provedena indukce exprese cytochromů b 5. Průběh kontrolní exprese byl monitorován pomocí elektroforézy SDS-PAGE (viz Obr. 30 na další straně). 60

72 Výsledky a diskuse σ Lidský mikrosomální cyt b 5 Lidský erytrocytární cyt b 5 Obr. 30 Kontrolní exprese lidských cytochromů b 5 ředěno tak, aby OD 600 buněk E. coli BL-21 Gold byla ve všech vzorcích ~ 1. 1: E. coli BL-21 Gold před indukcí, pet22b s genem pro erytrocytární cyt b 5 č. 1 2: E. coli BL-21 Gold před indukcí, pet22b s genem pro erytrocytární cyt b 5 č. 2 3: E. coli BL-21 Gold před indukcí, pet22b s genem pro mikrosomální cyt b 5 č. 1 4: E. coli BL-21 Gold před indukcí, pet22b s genem pro mikrosomální cyt b 5 č. 2 5: E. coli BL-21 Gold po indukci, pet22b s genem pro erytrocytární cyt b 5 č. 1 6: E. coli BL-21 Gold po indukci, pet22b s genem pro erytrocytární cyt b 5 č. 2 7: E. coli BL-21 Gold po indukci, pet22b s genem pro mikrosomální cyt b 5 č. 1 8: E. coli BL-21 Gold po indukci, pet22b s genem pro mikrosomální cyt b 5 č. 2 9: Králičí mikrosomální cytochrom b 5, σ: Sigma marker molekulových hmotností. Jak je z obrázku 30 patrné, buňky E. coli BL-21 Gold transformované připravenými expresními vektory, jsou po indukci schopné velice efektivně produkovat lidské cytochromy b 5 (viz dráhy 5, 6, 7 a 8.) Produkce těchto proteinů je natolik silná, že i dva kontrolní vzorky (před indukcí) obsahovaly detekovatelné množství cytochromu b 5. V těchto vzorcích (dráhy 1 a 3) došlo pravděpodobně k indukci stopovým množstvím IPTG, které mohlo ulpět např. na stěnách autoklávovaných zkumavek Falcon (ty se v laboratoři používají opakovaně). Oba expresní vektory obsahující gen pro erytrocytární cytochrom b 5, stejně tak jako oba expresní vektory obsahující gen pro mikrosomální cytochrom b 5, mohou být tedy v budoucnu použity k expresi lidských cytochromů b 5. 61