MIKROSKOP. Historie Jeden z prvních jednoduchých mikroskopů sestavil v roce 1676 holandský obchodník a vědec Anton van Leeuwenhoek.

Transkript

1 MIKROSKOPIE E- mailový zpravodaj MIKROSKOP firmy Olympus Journal of Scanning Probe Microscopy ( Materials Today, 2008, New Microscopy Special Issue

2 MIKROSKOP Historie Jeden z prvních jednoduchých mikroskopů sestavil v roce 1676 holandský obchodník a vědec Anton van Leeuwenhoek. Popis mikroskopu Základem mikroskopu jsou čočky, které tvoří objektiv a okulár. Okuláry a objektivy jsou často výměnné. Zvětšení: asi 50 až Maximální teoretické zvětšení je asi 2000 a to již naráží na fyzikální bariéry kvůli omezení délky světelných vln.

3 MIKROSKOP Obyčejný optický mikroskop se skládá z objektivu, který vytváří převrácený obraz objektu a okuláru, kterým tento obraz pozorujeme jako lupou. Součástí mikroskopu je i zdroj světla s kondenzorem, který zabezpečující optimální osvětlení objektu. Kvalita zobrazení buněk závisí na třech hlavních faktorech: na dostatečném zvětšení obrazu, rozlišovací schopnost mikroskopu a na kontrastu obrazu. Rozlišovací schopnost mikroskopu závisí na numerické apertuře objektivu a kondenzoru a na kvalitě osvětlení preparátu t.j. na optimálním nastavení Koehlerova osvětlení.

4 MIKROSKOP Zvětšení mikroskopu Zvětšení obrazu mikroskopem je dáno zvětšením okulárů a zvětšením objektivu. Okuláry mikroskopu během pokusu neobměňujeme, nejčastěji používáme okuláry zvětšující 20x - 25x. Maximální užitečné zvětšení mikroskopu je však určeno i rozlišovací schopností objektivu. Za podmínek, kdy je minimální vzdálenost dvou rozlišitelných bodů srovnatelná s rozlišovací schopností lidského oka, obraz se nezlepší ani při použití silně zvětšujících okulárů, kdy dostaneme jen rozměrnější obraz bez nových detailů.

5 MIKROSKOP Numerická apertura objektivu Odhad minimální vzdáleností dvou rozlišitelných bodů (Ymin) je dán vztahem: Ymin = konst. ( l /n. sin n) kde l je vlnová délka světla ve vakuu, n je index lomu prostředí před objektivem, a n je polovina vrcholového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu. Veličina (n. sin n ) je tzv. numerická apertura objektivu, NA. U nejkvalitnějších imerzních objektivů bývá NA ~ 1.3 až 1.4. Pro nejkratší vlnové délky viditelného záření ( ~ 400 nm) se pak rozlišovací schopnost těchto objektivů blíží hodnotě 0,17 µm.

6 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP Konfokální mikroskop je druhem optického mikroskopu, jehož výhodou je vyšší rozlišovací schopnost daná detekcí světla pouze z ohniskové roviny mikroskopu. V obecné vědecké mluvě se též mluví o konfokálu. Zásadní rozvoj konec sedmdesátých let Confocal = mající společné ohnisko Známy jsou tyto typy mikroskopu: - rastrující konfokální mikroskop - skenující zařízení zařizuje posun ohniska excitujícího laserového paprsku - konfokální mikroskop s rotujícím diskem - místo skenujícího zařízení obsahuje rotující Nipkowovův kotouč, na kterém je mnoho navzájem oddělených clonek

7 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP ( Základním prvkem konfokálního skanovacího laserového mikroskopu je skanovací mechanismus který skanuje laserové záření po vzorku (skrz osvětlovací clonku). Fotodetektor detekuje buď odražené, nebo fluorescenční světlo. Malá apertura před detektorem separuje nefokuzované světlo od světla fokuzovaného. Tato apertura umožňuje rovněž separování jednotlivých vrstev snímaného vzorku a tím umožňuje objemovou analýzu.

8 Laserová rastrovací konfokální mikroskopie

9 Laserová rastrovací konfokální mikroskopie

10 Laserová rastrovací konfokální mikroskopie

11 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP Princip rastrovacího konfokálního mikroskopu: Laserový paprsek (intenzivní bodový zdroj světla) je fokusován na clonku, dále prochází objektivem až na vzorek, kde je obraz clonky fokusován do bodu, jehož průměr odpovídá difrakční mezi (rozlišovací mez). Přes stejný objektiv jde zpětně i světlo na vzorku odražené či rozptýlené, případně fluorescence. Sekundární světlo putující zpět prochází opět clonkou, jejiž bodový obraz je s pomocí děliče paprsků lokalizován před fotonásobič, kde.je umístěna druhá konfokální bodová clonka, která filtruje světlo pocházející z oblasti mimo ohniskovou rovinu mikroskopu. Obraz celé zaostřené roviny lze pak získat rastrováním bod po bodu některým z těchto postupů: - rozmítáním laserového paprsku - příčným posuvem vzorku před objektivem - posuvem objektivu nad vzorkem.

12 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP Světelným zdrojem je laserové záření. Konfokální mikroskop poskytuje mimořádně ostrý, kontrastní, vysoce informativní obraz s vysokým rozlišením. Struktury nacházející se nad a pod rovinou fokusace nemají téměř žádný vliv na kvalitu obrazu. Hloubka ostrosti je vždy minimální. Postup měření : buněčné struktury, které chceme pozorovat, obarvíme fluorochromem. Laserový paprsek je zaostřen do zvolené roviny, která buňkou prochází jako imaginární řez.v této zvolené rovině dojde k osvícení preparátu laserovým paprskem a fluorochrom emituje viditelné záření. Získaný obraz je zaznamenán počítačem. Postupnou změnou zaostření je možné získat obraz z více rovin (imaginárních řezů) od vršku až ke spodu buňky. Zde je nejlépe patrný rozdíl proti klasické fluorescenční mikroskopii, kde září fluorochrom ve všech optických rovinách najednou (nelze tedy určit, co je nahoře a co je dole, uprostřed, atd.).

13 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP Pokud následně chceme provést 3D rekonstrukci obrazu, vzdálenosti mezi jednotlivými rovinami snímání by měly být vždy menší než hloubka ostrosti jednotlivých snímků. Po pořízení snímků z více rovin (běžně cca 30-60) se jednotlivé snímky poskládají podle osy z (seřadí nad sebe podle pořadí snímání). Takto získáme pro každý bod pozorovaného objektu konkrétní hodnotu jasu (pro daný fluorochrom). Poté lze měnit libovolně směr/úhel pohledu a tím pádem je možné objekt zobrazit z libovolné strany (zorného úhlu) - dokonce lze objekt zobrazit i z boku nebo zespodu (všechna obrazová data ze všech virtuálních řezů jsou totiž uložena v PC). Vše je znovu vypočítáno pro nově zvolený směr/úhel pohledu (podle obrazových dat ze všech zobrazených vrstev) a následně je vygenerován pohled na objekt z námi zvoleného směru/úhlu. V současné době software již umožňuje také zobrazení 3D perspektivní - tj. takové, kdy bližší části objektu (buňky) se jeví jako větší než části vzdálenější.

14 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP První laserový konfokální rastrovací mikroskop byl vyroben r Pomocí konfokálního mikroskopu se lze zbavit neostrostí v důsledku překrývání se zaostřeného obrazu s rozmazanými obrazy struktur, které se nacházejí mimo zaostřenou rovinu, což je obzvlášť rušivý jev při fluorescenční mikroskopii. Při konfokální mikroskopii je pozorovaný objekt osvětlen bodovým zdrojem, nejčastěji k tomu slouží laserový paprsek fokusovaný na clonku, která je pak objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek do bodu o průměru rovnajícím se minimální vzdáleností dvou rozlišitelných bodů. Stejný objektiv pak sbírá světlo vzorkem odražené a rozptýlené, případně fluorescenci.

15 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP Při zpětném průchodu tohoto záření objektivem vznikne další obraz bodové clonky, který je pomocí děliče paprsků lokalizován před fotonásobič. V místě tohoto obrazu se nachází druhá konfokální bodová clonka, která blokuje detekci záření pocházejícího z míst vzorku mimo rovinu právě zaostřenou. Obraz celé této roviny získáme rastrováním bod po bodu. Existují tři různé způsoby rastrování, t.j. cestou rozmítání laserového paprsku nebo příčným posouváním vzorku před objektivem, případně posouváním objektivu před vzorkem. Při rastrování je signál z fotonásobiče registrován počítačem spolu s informací o souřadnicích analyzovaných bodů. Celý soubor těchto dat je pak převeden na obraz pozorovaného vzorku. Tento obraz již díky prostorové filtraci záření dopadajícího na detektor neobsahuje neostré pozadí mimofokálních oblastí vzorky. Konfokální obrazy jsou proto vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem.

16 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP Základním prvkem konfokálního skanovacího laserového mikroskopu je skanovací mechanismus který skanuje laserové záření po vzorku (skrz osvětlovací clonku). Fotodetektor detekuje buď odražené, nebo fluorescenční světlo. Malá apertura před detektorem separuje nefokuzované světlo od světla fokuzovaného. Tato apertura umožňuje rovněž separování jednotlivých vrstev snímaného vzorku a tím umožňuje objemovou analýzu.

17 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP

18 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP Leica TCS SPE - spektrální konfokální mikroskop s velkým rozlišením

19 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP

20 Přednosti konfokální mikroskopie Vysoké axiální rozlišení při vysoké ostrosti obrazu Možnost optických řezů a pozorování průhledných vzorků i pod povrchem Konstrukce trojrozměrných obrazců Bezkontaktní povrchová profilometrie (i málo odrazivých materiálů) Možnost snímání barevného obrazu ve skutečných barvách Možnost pozorování nevodivých materiálů Možnost pozorování porézních materiálů není potřeba vytvoření vakua Možnost použití obrazové analýzy Možnost využití klasických metod světelné mikroskopie (světlé a tmavé pole, nomarského diferenciální kontrast, fázový kontrast, polarizační a fluorescenčnímikroskopie atd.) Možnost pozorování živých exemplářů bez nutnosti jejich usmrcení. Nedochází k degradaci vzorku Jednoduchá výměna vzorků Jednoduchá obsluha Konfokální mikroskopie tvoří článek mezi optickou světelnou mikroskopií a elektronovou řádkovací mikroskopií

21 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP Konfokální obrazy optických řezů vznikají v číselné (digitální) formě a lze je proto dále upravovat všemi běžnými způsoby počítačového zpracování obrazů. Specialitou konfokální mikroskopie je možnost prostorové rekonstrukce mikroskopických objektů, opírající se o několik desítek až stovek optických řezů jedním objektem, postupně snímaných při plynule se měnící hloubce zaostření. Ze souboru optických řezů lze mimo jiné generovat stereoskopické páry zvětšené obrazy celého trojrozměrného objektu viděné pravým a levým okem. Stereoskopické páry skýtají velmi působivé plastické obrazy preparátů. Ze souboru horizontálních řezů lze také rekonstruovat vertikální optické řezy vzorkem. Vertikální řezy se ovšem dají získat i přímým způsobem, vhodnou volbou rastrovacího algoritmu mikroskopu. Další, poměrně nová metoda konfokální mikroskopie spočívá v současném snímání fluorescenčních obrazů pomocí tří fotonásobičů se spektrálními filtry pro modrou, zelenou a červenou barvu. Rekombinací dílčích obrazů v základních barvách získáme optický řez v reálných barvách emitované fluorescence.

22 Konfokální optická mikroskopie (Confocal Optical Microscopy) Materials Characterization, R.W. Cahn Frs, Elsevier, 2005 Optická metoda pro zaznamenávání 3D obrázků s rozlišením rovným nebo větším než mají konvenční optické mikroskopy. Obrázky s vysokým kontrastem jsou vytvářeny z celkového objemu zkoumaného vzorku mnohonásobně tlustšího než je hloubka ohniska čočky mikroskopu. Jsou zaznamenávány 2D obrázky při stejně vzdálených intervalech podél optické osy mikroskopu. Obraz 3 D je rekonstruován digitálně při použití série 2D obrázků. Dojde ke zlepšení kontrastu ve směru z (podél optické osy), ale změna je minimální ve směru x a y. Konfokální mikroskop je skenující zobrazovací systém. Ve většině případů je dopadající světlo fokusováno do bodu a je skenováno v rovině x-y. Vzorek je mechanicky skenován v 2D. Hlavní důvod pro použití konfokálního mikroskopu je v optickém z- segmentování a vytváření 3D.

23 Konfokální optická mikroskopie (Confocal OpticalMicroscopy) Materials Characterization, R.W. Cahn Frs, Elsevieer, 2005 Jsou tři principy skenování : - je použit laser a objekt je osvětlen a obrazy zaznamenány jako bod v čase. 2D skenování je docíleno buď pomocí galvanických zrcátek nebo kombinací akustooptického modulátoru pro rychlé skenování a - používá se rychle rotující disk s velkým počtem děr (konfokální apertury) - Nipkow geometrie. Je osvětlen velký počet bodů vzorku a stejně je detekován velký počet obrazových bodů. Obraz je zaznamenáván většinou CCD kamerou. - skenování podél optické osy (z) změnou pozice objektivu nebo vzorku pomocí krokového motorku

24 Konfokální optická mikroskopie (Confocal OpticalMicroscopy) Materials Characterization, R.W. Cahn Frs, Elsevieer, 2005 Zobrazování Existují dva nejpoužívanější zobrazovací módy : - Epi-iluminační reflexe - Fluorescence Oba módy jsou si podobné až na existenci vlnově selektivních filtrů v osvětlovací a zobrazovací části fluorescenčního módu.

25 Konfokální optická mikroskopie (Confocal OpticalMicroscopy) Materials Characterization, R.W. Cahn Frs, Elsevieer, 2005 Obr 1a. Osvětlující paprsek expanduje z otvoru a část světla je odkloněna na čočku objektivu buď děličem svazku (reflekční mód) nebo dichroickým zrcadlem (fluorescenční mód). Je důležité aby celá apertura objektivu byla světlem pokryta a je pak fokusována na vzorek do difrakčně limitované stopy.

26 Konfokální optická mikroskopie (Confocal OpticalMicroscopy) Materials Characterization, R.W. Cahn Frs, Elsevieer, 2005 Zobrazovací systém - obr. 1b. Světlo se buď odráží od struktury vzorku nebo excituje molekuly barviva dochází k fluorescenční emisi. Odražené nebo emitované světlo je kolektováno čočkou objektivu a je fokusováno v rovině konfokální zobrazovací apertury. Světlo v ohnisku prochází aperturou a je detekováno fotonásobičem. U fluorescenčního módu je za dichroickým zrcadlem umístěn bariérový filtr, který odráží iluminační světlo rozptýlené na zobrazovací dráze nebo světlo přenesené dichroicky (dvoubarevně). Světlo bude vždy generováno v oblasti vzorku mimo hloubku ohniska čočky objektivu. Obraz ohniskového bodu světla generovaného objemem vzorku blíž k objektivové čočce než je fokuzační oblast, tak toto světlo je zobrazeno za rovinou konfokální apertury. Umístěním apertury toto světlo eliminujeme. Na druhé straně, světlo ze vzorku za fokuzační oblastí je fokusováno před aperturou. Většina světla je tudíž eliminována a nedopadne na fotonásobič.

27 FLUOROSCENČNÍ MIKROSKOP V r pozoroval Kohler při mikroskopování s ultrafialovým světlem fluorescenci mnoha preparátů. Fluorescenční mikroskop je mikroskop v němž světlo vycházející z preparátu vzniká fluorescencí buď in situ přítomných přírodních látek (fluorescence primámí), nebo látek na preparát aplikovaných, často fluorochromů (fluorescence sekundární). Fluorescenční mikroskop se používá například ke studiu lokalizace přírodních látek v buňkách, k vitálnímu barvení a v imunocytochemii. První fluorescenční mikroskop s UV excitací vznikl r.1913.

28 FLUOROSCENČNÍ MIKROSKOP Jako zdrojů světla se používá převážně vysokotlakých výbojek plněných rtutí nebo xenonem. Tyto výbojky vydávají velké množství energie svého záření v ultrafialové oblasti. Jejich světlo je poměrně stabilní, výbojky vydrží zářit asi 500 pracovních hodin. Zažehávají se však vysokonapěťovými pulsy, je proto potřeba zapínat je dříve než ostatní elektronické přístroje v aparatuře. Fluorescenční mikroskop je používán k vizualizaci označených buněk, buněčných struktur či molekul a k měření koncentrací iontů uvnitř buněk. Typicky se měří změny koncentrace vápníku v cytoplazmě, které jsou v klidovém stavu udržovány v rozmezí 50 až 200 nm a po stimulaci vstupu vápníku do buňky nebo po jeho uvolnění z intracelulárních zásob stoupají až desetinásobně. Změny ve fluorescenčních vlastnostech sond po navázání iontu jsou registrovány a po porovnání s kalibrační křivkou přepočteny na koncentraci.

29 FLUOROSCENČNÍ MIKROSKOP Intermediární filamenta keratinového typu v buňkách linie BT 20 (karcinom prsu) kultivované in vitro. Nepřímá fluorescence (FITC), jádra (žlutě) dobarvena ethidium bromidem. Mikroskop ICM 405 C, ZEISS, NSR. Zvětšení 1540x. (J. Bártek)