Obsah přednášky Metody používané v cytologii Metody založené na barvení buněk

Transkript

1 Obsah přednášky Metody používané v cytologii Metody založené na barvení buněk Nejčastěji používané mikroskopické techniky Imunofluorescenční značení Příklady a využití Konfokální mikroskopie Princip metody Aplikace metody, využití GFP technologie Elektronová mikroskopie Princip metody a rozdělení technik Příprava vzorků pro elektronovou mikroskopii

2 Světelná mikroskopie První funkční mikroskop přelom šestnáctého a sedmnáctého století Z. Jansen 9x zvětšení Antonie van Leeuwenhoek polovina sedmnáctého století Primitivní mikroskop s přesně vybroušenými čočkami Až 275x zvětšení Jako první popsal lidské buňky, bakterie, vakuoly Robert Hooke 1665 složený mikroskop Optické prvky světelných mikroskopů dosáhly hranice technických možností asi ve 30. letech minulého století 2000x zvětšení, rozlišení 0,2 mm

3 Čím je dáno rozlišení světelného mikroskopu? Rozlišení objektivní a subjektivní Rozlišení oka v ideální zaostřovací vzdálenosti (25 cm) je asi 75 mm Rozlišení optického mikroskopu je 280 nm v bílém světle (160 nm v UV světle) Abbeho teorém: d = 0,61. l. (n. sin q) -1 Objektiv s nízkou NA Objektiv s vysokou NA Numerická apertura (NA) objektivu NA = n. sin q Objektivy suché vs. objektivy imerzní

4 Viditelná část elektromagnetického spektra

5 Jablonského diagram a fluorescence

6 Excitace a emise fluorescenčního vzorku λ em > λ exc

7 Světelná mikroskopie Mikroskopické metody v cytologii Studium živých buněk live cell imaging. Na zvýraznění buněčných kompartmentů možno použít vitální barviva (intravitální, supravitální a postvitální barvení) Studium usmrcených buněk po fixaci pozorování trvalých preparátů. Důležitá je zejména fixace (fyzikální, chemická), kdy dochází zakonzervování a stabilizaci buňky Fluorescenční mikroskopie Laserová konfokální mikroskopie Podobně jako fluorescenční mikroskopie je založena na pozorování fluorescenčních látek v živých či fixovaných preparátech Na rozdíl od fluorescenční mikroskopie nevyužívá jako zdroj lampy ale lasery Má malou hloubku ostrosti a dokáže odfiltrovat záření z vrstev nad a pod rovinou zaostření používá se na získání tzv. optických řezů Elektronová mikroskopie Místo fotonů využívá elektrony a namísto běžných čoček se používají elektromagnetické čočky Studium subcelulárních struktur Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) na ultratenkých řezech vs. rastrovací (scanning) elektronová mikroskopie (SEM) na povrchu struktur

8 Mikroskopické metody v cytologii Speciální techniky Stereoskopické mikroskopy Pro trojrozměrná pozorování, vhodné pro preparativní postupy Malé zvětšení (max. 200x) Ultramikroskop Založený na Tyndallově efektu Pozorování a kvantifikace zářících částic ve tmavém zorném poli Fázový kontrastní mikroskop a interferenční mikroskop (DIC) Umožňuje zkontrastnit nebarvené nativní buňky pouze na základě fázového posunu polarizovaných složek světla Takto se dají pozorovat buňky ve viditelném světle a je možné studovat jemné detaily buněčných struktur (změny v jádře, buněčné dělení ) Fluorescenční mikroskop Pozorování živých buněk i fixovaných mrtvých buněk, imunofluorescenční techniky Používá se ke studiu rychlých buněčných procesů, mitóza atd. Vhodné spíše ke studiu oddělených buněk v suspenzích, ne optické řezy

9 DIC differencial interference contrast microscopy Interference

10 Metody barvení v buněčné biologii Vitální barvení vs barvení fixovaných buněk Používají se barviva přirozená (karmín, šafrán, berberin) a umělá (kyselá, zásaditá a neutrální) Barvení možno provádět progresivně či regresivně Živé buňky od mrtvých možno odlišit pomocí methylenové modři Běžná barviva používaná v biologii: Krystalová violeť barví buněčnou stěnu, důležitá složka při Gramově barvení DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) fluorescenční barvička excitovaná v UV oblasti, barví jádro, lze použít in vivo i in vitro Eosin barvení cytoplasmy, kolagenu a svalových vláken Ethidium bromid/jodid fluorescenční barvička, interkaluje se do DNA, nebarví živé buňky ale možno použít ke studiu apoptózy Kyselý fuchsin barví kolagen, hladký sval či mitochondrie. Lze použít rovněž i k barvení jader Hoechst barvení DNA v živých buňkách, skupina barviv běžně používaných ve fluorescenční mikroskopii Rhodamin Rhodamin B se používá např. pro značení mitochondrií FM4-64 styrylová barvička, barvení PM a dalších buněčných struktur

11 Metody barvení v buněčné biologii grampozitivní gramnegativní

12 Epifluorescenční mikroskop

13 Epifluorescenční mikroskop

14 Epifluorescenční mikroskop

15 Konfokální laserový mikroskop

16 Fluorescenční značky pro fluorescenční/konfokální mikroskopii

17 Značení za použití více fluorescenčních látek

18 Imunofluorescenční značení Technika založena na použití značených protilátek fluorescenční značky Pro pozorování většinou postačuje standardní fluorescenční mikroskop ale možno použít i konfokální Pozorují se fixované preparáty Pozorování tkáňových řezů, histologické řezy atd. - mikrotomy Pozorování tkání nebo celých organismů (rostlin) roztlaky Rozlišujeme přímé a nepřímé značení Přímé značení: fluorescenční značka navázána na primární protilátku. Používá se zejména v diagnostice pro studium autoimunitních onemocnění Nepřímé značení: použití primární a sekundární protilátky. Je citlivější než přímá fluorescence a používá se standardně pro značení více protilátkami

19 Imunofluorescenční značení základní termíny Antigen Monoklonální protilátka Polyklonální protilátka Cross-reaktivita Primární protilátka Sekundární protilátka

20 Postup při imunofluorescenční detekci Fixace kritický krok, musí být rychlá a dostatečně účinná methanol, aceton či paraformaldehyd / Permeabilizace Blokování omezení nespecifických interakcí BSA apodob. Primární protilátka Jedna či více primárních protilátek Při použití více protilátek nutno použít rozdílné typy Promytí Sekundární protilátka Promytí Zalití do média

21 Přímé značení

22 Přímé značení

23 Nepřímé značení

24 Shrnutí - optimalizace podmínek pro imunoznačení Účinná fixace a blokování Volba protilátek (isotyp, cross-reaktivita) Správná koncentrace protilátek (koncentrace vs. sensitivita) Vhodná volba fluorochromu a optického systému Kontrolní inkubace (preimunní sérum) Opakovaná značení

25 Konfokální mikroskopie Princip a využití LASER SCANNING CONFOCAL MICROSCOPY KONFOKALITA Zdoj záření: laser Konfokality dosaženo pomocí pinhole, jsou zaostřeny pouze paprsky z roviny ostrosti Kontrolovaná hloubka ostrosti SCANNING záznam obrazu se děje většinou pomocí skenování-galvano-optická zrcadla, pro vyhodnocení a rekonstrukci obrazu nutný výkonný počítač Možnost optických řezů

26 Konfokální mikroskopie Set Up

27 Konfokální mikroskopie Beam Splitter vs AOBS Konvenční beam splitter zařízení kombinující dichroická zrcadla a soustavu emisních filtrů AOBS Acousto Optical Beam Splitter má několik výhod proti standardnímu BS Rychlejší a citlivější Nedochází k vysvícení vzorku Přesnější kontrola emisních profilů fluoroforů

28 Konfokální mikroskopie Skenovací zařízení Paprsek (single beam) je postupně naváděn celou plochou vzorku x-y skenování Rychlost skenování a průměrování ovlivňuje kvalitu obrazu (a vysvěcování vzorku) AOBS zvyšuje rychlost skenování Multiple beam scanning Nipkowův disk používá se ke studiu rychlých dějů

29 Konfokální mikroskopie Optické řezy Díky kontrole hloubky ostrosti možno zaostřit do jedné roviny Optické řezy po z ose obvykle kolem 1 mm a méně Při dostatečně tenkých optických řezech možno vytvořit rekonstrukci 3D obrazu snímaného objektu

30 Konfokální mikroskopie Optické řezy Jsou možné díky Laser Scanning Confocal Microscopy: Konfokální mikroskop umožňuje kontrolu hloubky ostrosti snímku konfokalita X-Y Skenování obrazu za pomoci laseru Skenování podél osy Z s možností 3D rekonstrukce získaných optických řezů

31 Konfokální mikroskopie Optické řezy Optical sections - root anatomy

32 Konfokální mikroskopie Optické řezy a 3D rekonstrukce 3D modely

33 Konfokální mikroskopie Optické řezy a časové snímání

34 Konfokální mikroskopie Studium dynamiky 20s32ms 20s32ms 40s474ms 1m0s711ms 1m20s948ms 1m41s185ms 2m1s422ms

35 Výhody a nevýhody konfokální mikroskopie vůči fluorescenční Základní výhodou je získání opticky čistého, zaostřeného obrazu (fluorescence z vrstev mimo rovinu zaostření je do značné míry potlačena) Získání optických řezů možnost rekonstrukce 3D obrazu, skenování sekcí může probíhat ve všech rovinách (x-y-z sectioning) Systémy pro konfokální mikroskopii umožňují použití několika fluoroforů současně a to jak díky svým optickým vlastnostem tak i počítačovému vyhodnocení obrazu (linear unmixing) Skenovací laserový mikroskop má i některá omezení: možnosti excitace dány počtem laserů, skenování je relativně pomalý proces, díky odfiltrování fluorescence z ne-fokálních vrstev může dojít k dramatickému poklesu signálu, laser má vysoký výkon může dojít k vysvícení vzorku a poškození buněk

36 GFP technologie

37 Wild type GFP GFP Green Fluorescent Protein tradičně se tak označuje protein izolovaný z medúzy Aequorea victoria Aequorin vs GFP fluorescence po ozáření modrým světlem Protein je složený z 238 aminokyselin (26.9 kda) Struktura GFP založena na b-barelu s chromoforem ukrytým uvnitř molekuly Neurony značené pomocí GFP

38 Wild type GFP GFP z A. victoria má hlavní excitační peak při 395 nm a vedlejší při 475 nm, emise při 509 nm v zelené části spektra Dnes se používají pouze mutanty wild type GFP 1995 první významná mutace zvýšena stabilita i fluorescence, změna excitace pouze na jednu hodnotu 488 nm Za výzkum GFP (a dalších fluorescenčních proteinů) udělena Nobelova cena v roce 2008

39 Chromofor v molekule GFP GFP má přirozenou schopnost fluorescence danou svojí vnitřní strukturou tripeptid (Ser65-Tyr66-Gly67) ukrytý uvnitř b-barelu cyklizuje a podléhá oxidaci (maturace) Není potřeba žádný kofaktor Tento proces je autokatalytický, vyžaduje pouze přítomnost kyslíku Cyklizace a oxidace za vzniku aktivního chromoforu Vzniklý chromofor obsahuje konjugované dvojné vazby, které umožňují uchování a přenos energie elektronů

40 Wild type GFP Modré záření vzniká v důsledku jiné chemické reakce (chemiluminiscence) Energie tohoto záření je absorbována konjugovanými dvojnými vazbami chromoforu Uvolněná energie je vyzářena v procesu fluorescence (508 nm)

41 Další fluorescenční proteiny odvozené od GFP Wild type GFP má řadu nevýhod pro běžné použití, např. neefektivní folding proteinu při 37 C, dnes se nejčastěji používá enhanced GFP, egfp (možno používat i v živočišných buňkách) Od GFP byly odvozeny další fluorescenční proteiny, jsou to jeho tzv. spektrální varianty Cyan Fluorescent Protein (CFP) Yellow fluorescnt Protein (YFP) Blue Fluorescent Protein (BFP) Paleta fluorescenčních proteinů rozšířena ještě o DsRed (Red Fluorescent Protein) z korálu Discosoma striata

42 Další fluorescenční proteiny odvozené od GFP Změny v oblasti fluoroforu či v downstream oblasti vedou ke změnám ve vlnové délce emitovaného záření

43 Další fluorescenční proteiny odvozené od GFP site-directed mutagenesis

44 Vlastnosti GFP a výhody jeho využití Relativně malý vysoce stabilní protein Univerzální možno klonovat a exprimovat téměř ve všech organismech Auto-fluorescence Možnost kvantifikace Použití: První použití GFP bylo jako reportérový gen Největší využití GFP je pro lokalizaci fúzních proteinů v živých systémech, fúze většinou neovlivňuje vlastnosti proteinu FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)

45 Aequorea GFP technologie GFP Promotor Fimbrin Arabidopsis Fúzní protein -N-terminální fúze -C-terminální fúze -Intramolekulární fúze

46 GFP technologie - Gateway

47 FRET FRET (Fluorescence/Förster Resonance Energy Transfer) neradioaktivní přenos energie mezi dvěma chromofory skrze interakci dipól-dipól excitovaný donor a akceptor ve vzdálenosti obvykle menší než 10 nm používá se k studiu proteinových interakcí BRET (Bioluminiscence Resonance Energy Transfer) na podobném principu ale využívá jevu bioluminiscence (použití např. luciferasy) odpadají některé problémy vzniklé s excitací CFP

48 FRAP Fluorescence recovery after photobleaching Tuto techniku možno využít v laserovém konfokálním mikroskopu Používá se ke studiu dynamických dějů Studium lipidové dvouvrstvy Studium dynamiky mikrotubulů apodob.

49 BiFC Bimolecular fluorescence complementation Zkoumání proteinových interakcí Subcelulární lokalizace vzniklých komplexů Transientní nebo stabilní exprese Nutno použít slabé promotory Studium dynamiky mikrotubulů apodob.

50 Transgenní organismy exprimující fluorescenční proteiny Fetální fibroblasty transformovány genem pro RFP metodou retrovirální vektorové infekce Proveden nukleární transfer ze somatických buněk do oocytů Vzniklá embrya implementovíny do vejcovodu náhradní matky

51 Transgenní organismy exprimující fluorescenční proteiny S.G.Hong et al., Generation of Red Fluorescent Protein Transgenic Dogs, genesis, 2008, vol. 47, pg

52 Elektronová mikroskopie Elektronová mikroskopie V optické mikroskopii je mezní rozlišení asi 200 nm, pro dosažení vyššího rozlišení nutno použít záření o nižší vlnové délce Jako zdroj záření využívá elektrony proč? -> korpuskulárně-vlnový charakter, lze je urychlit v elektromagnetickém poli Urychlující napětí se pohybuje od 40 kv do 120 kv (300 kv) Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) a rastrovací (skenovací) elektronová mikroskopie (SEM)

53 Rozdíl mezi světelnou a elektronovou mikroskopií

54 Základní fyzikální jevy v elektronové mikroskopii Vzorek propouští elektrony TEM ad. Vzorek odráží elektrony BSE (backscattered) Vzorek adsorbuje elektrony Vzorek emituje elektrony (sekundární elektrony) SEM Vzorek emituje elektromagnetické záření (g-záření) mikroanalýza Vzorek emituje ionty

55 Konstrukce TEM Elektronická část Vakuová část Vakuový systém je schopen dosáhnout hodnot až 10-6 torru Zobrazovací část Osvětlovací systém Zobrazovací systém Zvětšovací systém Záznamová část

56 Konstrukce SEM

57 Využití EM pro pozorování biologických preparátů TEM studium subcelulárních struktur v buňce nebo studium proteinových interakcí v buněčných lyzátech Zvětšení až x ( x), rozlišení až 50 pm Při studiu biopreparátů v TEM vzniká problém zejména s vakuem vzorek nutno upravit: Fixace Post-fixace Odvodnění Vzorky pro TEM nejsou dostatečně kontrastní možno provést barvení (negative staining) nebo značení protilátkami (immunogold) SEM používá se ke studium povrchů, má menší rozlišení než TEM, ale dokáže dobře rekonstruovat povrch vzorku ve 3D

58 Imunoznačení pro TEM Pomocí imunoznačení můžeme potvrdit lokalizaci proteinu v hledaném kompartmentu buňky Při použití protilátek s různým značením (zlaté kuličky o různém průměru) můžeme studovat navíc i kolokalizaci očekávaných interakčních partnerů

59 Postup imunoznačení Ultratenké řezy zařízení ultramikrotom Blokování Primární protilátka / Promytí Sekundární protilátka značená zlatem / Promytí Negativní barvení uranyl acetát, citronan olovnatý Pozorování