Středoškolská odborná činnost 2012/2014 Obor: 4 Biologie Vliv oplodnění samic klíštěte Ixodes ricinus na průběh sání a trávení hostitelské krve Gabriela Slípková Kraj: Jihočeský České Budějovice 2014 Středoškolská odborná činnost 2012/2014
Obor: 4 Biologie Vliv oplodnění samic klíštěte Ixodes ricinus na průběh sání a trávení hostitelské krve The effect of fertilization of tick Ixodes ricinus females on blood feeding and digestion of host blood. Autor: Gabriela Slípková Škola: Kraj: SZŠ a VOŠZ České Budějovice Husova 3, 371 60, České Budějovice Jihočeský Školitel: RNDr. Petr Kopáček, CSc. Parazitologický ústav AVČR, České Budějovice Školitel specialista: Bc. Jitka Konvičková Přírodovědecká fakulta, Jihočeská univerzita České Budějovice 2014
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji práci vypracovala samostatně pouze s použitím literatury uvedené v přiloženém seznamu literatury. Nemám žádný závažný důvod, který by bránil zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon) v platném znění. V Českých Budějovicích dne 18.3.2014 podpis:.
Poděkování: Děkuji svému školiteli Petru Kopáčkovi za zadání zajímavého tématu, za jeho trpělivost, čas, odborný přístup a nově nabyté zkušenosti. Veliké díky patří i Jitce Konvičkové, která mi byla nápomocná při experimentálních činnostech, za její vstřícnost a pochopení během celé práce. Dále bych chtěla poděkovat kolektivu laboratoře, své profesorce fyziky Heleně Jandové za prvotní podnět, který vyvolal zájem o tuto práci. V neposlední řadě děkuji své rodině za podporu a důvěru.
Anotace: Proteolýza proteinů hostitelské krve je pro klíště nezbytným fyziologickým procesem. Tato práce se zabývá studiem vlivu oplodnění dospělých samic klíštěte Ixodes ricinus na dynamické profily trávicích proteáz v průběhu sání na hostiteli. Pomocí specifických fluorescenčních substrátů bylo provedeno stanovení průběhu aktivit trávicích enzymů (cathepsinu B, L, C a legumainu) v homogenátech střev samic během sání. Tyto aktivity byly porovnány mezi panenskými a oplodněnými samicemi sajícími v přítomnosti samců. Bylo zjištěno, že aktivita trávicích enzymů v průběhu sání dospělých samic je daleko vyšší u oplodněných samic, než u samic panenských. Klíčová slova: Klíště; Ixodes ricinus; enzym, panenské samice; oplodněné samice; aktivita enzymů; cathepsin B; cathepsin C; cathepsin L; legumain. Annotation: Proteolysis of the ingested blood proteins is a crucial physiological process in ticks. This thesis is focused on the influence of fertilization of Ixodes ricinus female ticks and its impact on the dynamics of digestive enzymes during blood-feeding period. Specific fluorescent substrates were used to detect activity profiles of digestive enzymes (cathepsin B, L, C and legumain) in female gut tissue homogenates during feeding. Profiles of virgin female ticks were compared with those of fertilized females. The activity of all enzymes increased much higher in the fertilized females compared to virgin females. Key words: Tick, Ixodes ricinus, enzyme, virgin females, fertilized females, enzymatic activity, cathepsin B, cathepsin C, cathepsin L, legumain.
Obsah 1. Úvod... 10 1.1 Charakteristika klíšťat... 10 1.2 Ixodida morfologie těla... 10 1.3 Morfologie Ixodidae a Argasidae... 10 1.3.1 Ixodidae... 11 1.3.2 Argasidae... 12 1.4 Klíště obecné Ixodes ricinus... 12 1.5 Nemoci přenášené I. ricinus... 13 1.6 Fyziologie střeva I. ricinus, sání a trávení... 14 1.6.1 Morfologie střeva... 14 1.6.2 Sání dospělých samic... 15 1.6.3 Trávení hostitelské krve... 16 2. Metodika... 18 2.1 Testovací skupiny, sběr klíšťat... 18 2.2 Strojení morčat... 18 2.3 Pitva střevních tkání samic klíštěte I. ricinus... 18 2.4 Homogenizace tkání... 19 2.5 Měření aktivit trávicích proteáz... 20 2.6 Elektroforéza (SDS-PAGE) a Western blot... 21 3. Výsledky a diskuse... 23 3.1 Vliv oplodnění samic na aktivitu a množství trávicích proteáz... 24 3.1.1 Cathepsin L... 24 3.1.2 Cathepsin B... 27 3.1.3 Cathepsin C... 29 3.1.4 Legumain... 30 6
3.2 Shrnutí... 31 3.3 Sání samic I. ricinus z přírody... 31 4. Seznam literatury... 32 7
Cíle práce 1. Stanovení aktivit trávicích proteáz (cathepsin B, L, C a legumain) ve střevních homogenátech dospělých samic klíštěte Ixodes ricinus v definovaných časových intervalech v průběhu sání na hostiteli u skupin panenských samic a samic sajících v přítomnosti samců. 2. Detekce cathepsinu B a cathepsinu L metodou Western blot. 3. Srovnání sání samic I. ricinus nasbíraných v přírodě v / bez přítomnosti samců. 8
Použité zkratky CatB cathepsin B CatC cathepsin C CatL cathepsin L IrAE legumain CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate DTT dithiothreitol EDTA kyselina ethylendiamintetraoctová AMC aminomethylcoumarin Arg arginin Gly glycin Phe fenylalanin Ala - alanin UF (unfed) nenasáté samice FF (fully fed) plně nasáté samice (8. den) RFU relativní fluorescenční jednotky SDS dodecylsulfát sodný PBS fyziologický roztok PVDF polyvinylidenfluorid DAB 3,3'-diaminobenzidine 9
1. Úvod 1.1 Charakteristika klíšťat Taxonomické zařazení: Říše: Členovci (Arthropoda) Nadtřída: Klepítkatci (Chelicerata) Třída: Roztoči (Acarina) Řád: Klíšťatovci (Ixodida, Metastigmata) o Nuttalliellidae (monotypická skupina, 1 druh) (Nava et al., 2009) o Klíšťáci (Argasidae) o Klíšťata (Ixodidae) klíště obecné (Ixodes ricinus) Klíšťata jsou krevsající ektoparazité patřící do rozsáhlé říše členovců (Arthropoda). Dodnes bylo popsáno přes 870 druhů klíšťat. Klíšťata jsou přenašeči široké škály patogenů (např. virů, bakterií a protozoí), způsobující závažná onemocnění u zvířat a lidí (de la Fuente et al, 2008). 1.2 Ixodida morfologie těla Tělo roztočů se dělí na dvě hlavní části: 1) Gnathosoma Přední (hlavová) část 2) Idiosoma Zadní část 1.3 Morfologie Ixodidae a Argasidae Rozšíření druhů z řádu Ixodida je celosvětové od arktických až po tropické oblasti (de la Fuente et al., 2006). Nejhojnější výskyt klíšťat v přírodě v průběhu roku je v našich klimatických podmínkách na jaře (duben, květen) a následně na konci léta (srpen, září). 10
Obr. 1. Porovnání morfologie těla Ixodidae a Argasidae. A dorzální pohled na klíšťě z řádu Ixodidae: 1 samec, 2 samice. B Morfologie klíšťáka z řádu Argasidae: 3 dorzální pohled, 4 ventrální pohled. GN gnathosoma, SC scutum, ID idiosoma. (Převzato a upraveno z Volf et al., 2007). 1.3.1 Ixodidae Klíšťata (Ixodidae), v anglické literatuře označována jako hard ticks (tvrdá klíšťata), mají zřetelně oddělenou gnathosomu a idiosomu (Obr. 1). U klíšťat se nachází výrazné scutum, tvrdý chitinový štítek, který vykazuje výrazný pohlavní dimorfismus. Scutum kryje celou dorzální stranu těla samců. U larev, nymf a dospělých samic překrývá v nenasátém stavu přibližně 1/3 jejich těla. Zbytek idiosomy je kožovitý, přizpůsobený k několikanásobnému zvětšení objemu v průběhu sání na hostiteli. Nejnápadnějším orgánem na gnathosomě je ústní ústrojí s výrazným hypostomem, který je tvořen nepárovými válcovitými zpětnými zuby (Ryšavý et al., 1988). Hypostom společně s chelicery slouží klíštěti ke snadnému uchycení a setrvání v tkáni hostitele v průběhu celého sání. Na tarzálním článku prvního páru nohou je umístěn Hallerův orgán, tj. senzorická jamka se smyslovými brvami. Tento receptor vnímá rozdíly teplot, koncentrace CO 2 a jiných chemických sloučenin (Volf et al., 2007; Sonensine, 1991). Klíšťata skupiny Ixodidae sají během svého životního cyklu na jednom, nebo více hostitelích. U některých druhů například Rhipicephalus (Boophilus) microplus sají všechna životní stádia na stejném hostiteli (hovězím dobytku), pak mluvíme o jednohostitelském klíštěti. 11
1.3.2 Argasidae Klíšťáci (Argasidae), v anglosaské literatuře označováni jako soft ticks (měkká klíšťata), mají kožovitý tělní pokryv tzv. integument (Beaty et al., 1996). Gnathosoma je ložená na ventrální straně (Obr. 1). Scutum na dorzální straně idiosomy zcela chybí. Klíšťáci se od klíšťat liší schopností opakovaného sání, které probíhá po velmi krátkou dobu (řádově minuty až hodiny) na jednom hostiteli (Sonenshine, 1991). Výjimku tvoří larva, která saje krev hostitele v delších intervalech (několik hodin až dnů) (Volf et al., 2007). Po larválním stádiu následuje více nymfálních stádií, jejichž počet závisí na konkrétním druhu (Beaty et al., 1996). Některé druhy Argasidae dokáží hladovět při čekání na hostitele i několik let. Dospělci se vyznačují minimálním sexuálním dimorfismem. V České republice se vyskytuje např. klíšťák holubí (Argas reflexus), který v některých případech může sát i na člověku a způsobit mu tím silnou alergickou reakci s projevy intoxikace organismu (horečka, bolest hlavy) (Volf et al., 2007). 1.4 Klíště obecné Ixodes ricinus Ixodes ricinus se vyskytuje po celé Evropě. Je typickým zástupcem tříhostitelského klíštěte. Jeho vývoj (vajíčko larva nymfa dospělec) trvá 2 3 roky. Larvy sají na drobných hlodavcích, ptácích a ještěrkách, nymfy na větších obratlovcích. Dospělé samičky vyhledávají hlavně větší lesní zvěř, domácí kopytníky, psy, kočky. Člověk se může stát hostitelem všech vývojových stádií (Volf et al., 2007). Se samci I. ricinus se můžeme setkat na těle hostitele i přesto, že krev nesají. Vyskytují se zde za účelem páření, během něhož sameček nasaje hypostomem spermatofor ze svého pohlavního ústrojí a zavede jej samičce do pohlavního otvoru (Sonenshine, 1991). Samička klíštěte I. ricinus má červeno-hnědě zbarvený zadeček. Velikost samičky v nenasátém stavu se pohybuje okolo 3,5 mm. Sameček měří přibližně 2,5 mm (Ryšavý et al., 1988). I. ricinus se hojně vyskytuje v období od dubna do listopadu. Maxima výskytu pak dosahuje v květnu a září. Žije především v listnatých a smíšených lesích s křovinatým porostem v oblastech od nížin do pahorkatin. I. ricinus vyhledává místa s vyšší relativní vlhkostí, neboť je jeho tělo náchylné k vyschnutí (Ryšavý et al., 1988). Klíšťata na svého hostitele vyčkávají na rostlinné vegetaci v pátrací ( questing ) pozici s doširoka roztaženýma předníma nohama. 12
1.5 Nemoci přenášené I. ricinus Klíště obecné přenáší řadu onemocnění, která mohou končit i smrtí hostitele. Mezi nejvýznamnější z nich patří: Klíšťová encefalitida (tick born encephalitis): Jedná se o virové onemocnění způsobené flavivirem, který infikuje tkáň v místě přisátí klíštěte. Pak dochází k napadení imunitního systému hostitele a následně dochází k rozšíření virů do centrálního nervového systému. Díky tomu dochází k odumírání nervových buněk a následnému poškození celého organismu (např. ochrnutí, nervové dysfunkce, atd.). Před klíšťovou encefalitidou je možné se účinně bránit vakcinací, kterou je třeba každých 3 5 let přeočkovat (Kimmig et al., 2003). Lymeská borelióza: Je bakteriální onemocnění způsobené spirochétami z komplexu druhů Borrelia burgdorferi sensu lato. Po infikování krve hostitele se bakterie množí a pronikají do orgánů, lymfatických cest a mízních uzlin. Během 14 dní se u 60-70 % infikovaných jedinců objeví na kůži erythema migrans (zarudnutí), která je způsobena imunitní odpovědí hostitele. Proti tomuto patogenu zatím neexistuje účinná vakcinace. Babesióza: Původcem této nemoci je jednobuněčný intracelulární (malárii podobný) parazit (Babesia sp.) napadající především erytrocyty (Kimmig et al., 2003). Babesióza v současnosti nejvíce ohrožuje chov hospodářských zvířat na pastvinách, především skot. 13
1.6 Fyziologie střeva I. ricinus, sání a trávení 1.6.1 Morfologie střeva řeva Střevo I. ricinus zaujímá u plně pln nasáté samice většinu jejího těla. Je složeno z krátké střední části ásti tzv. žaludku a sedmi párů pár slepých výběžků (Obr. 2). Obr. 2. Střevo I. ricinus. A schématický nákres klíšťěcího střeva. S žaludek, DV diventriculae válcovité výběžky. výb B náhled do tělní lní dutiny polonasáté samice. (Převzato a upraveno z Konvičková, čková, 2013). Stěna střeva je tvořena řena vrstvou epiteliálních buněk (Obr. r. 3). Střevo se dále skládá ze svalových vláken, mezi nimiž se nachází bazální lamina (tj. tenká vláknitá extracelulární vrstva) (Raikhel et al., 1983). Buňky střevního řevního epitelu se dělí d na nediferencované buňky ňky (tj. buňky bu bez vyvinutých specializovaných vaných trávicích vakuol) vakuol a diferencované buňky (tj. buňky bu schopné trávit přijatou potravu). Obr. 3. Schéma střevního řevního epitelu polonasáté samice I. ricinus. NTB nediferencované trávicí buňky, bu DTB diferencované trávicí buňky, bu UTB uvolněné trávicí buňky, BL bazální lamina. lamina Zelené organely jádra. Modře ře a červeně č zvýrazněné organely (vakuoly) se přímo ímo podílej podílejí na trávení hostitelské krve. (Upraveno podle Franta et al., 2010) 14
Střevo reaguje na přísun krve změnou nediferencovaných buněk střevního epitelu na diferencované, aktivně trávící buňky. Přísun hemoglobinu do trávicích buněk je zajištěn pomocí modifikované plazmatické membrány s mikroklky. Zde se nachází vazebné jamky s receptory, které jsou schopné rozpoznat molekulu hemoglobinu. Tento proces se nazývá endocytóza zprostředkovaná receptory ( receptor-mediated-endocytosis ). Diferencované buňky přijímají potravu pomocí endocytózy a fagocytózy. Odpadní látky, zejména uvolněné krevní barvivo - hem, jsou vyloučeny ve formě agregátů ( residual bodies ) a postupně se hromadí v rektálním vaku. Když už buňka není schopná nadále plnit trávicí funkci, dochází k jejímu odpojení od střevního epitelu. V některých případech může dojít i k protržení jejich membrány a vyhřeznutí obsahu buněk do lumen střeva (Sonenshine, 1991). 1.6.2 Sání dospělých samic Dospělé samice I. ricinus sají hostitelovu krev přibližně 7-9 dní, během nichž postupně zvětšují svůj objem. Samice v průběhu sání prochází třemi fázemi (Obr. 4). 1) Přípravná fáze (24 36 hodin): Během této fáze vpravuje samička hypostom do hostitelovy pokožky a upevňuje se v ráně pomocí tzv. cementu (Coons et al., 1986). Dochází pouze k minimálnímu sání hostitelské krve. Během prvních hodin nedochází k trávení nasáté krve (Sonenshine, 1991). 2) Fáze pomalého sání ( slow feeding period ) (2. 6. den sání): Během 2. - 6. dne sání dochází k postupnému nasávání krve a kontinuálnímu nitrobuněčnému trávení. Hlavní část energie je během této fáze využita na syntézu zvětšující se kutikuly. 3) Fáze rychlého sání ( rapid engorgement ) (6. 8. den sání): Během poslední fáze sání samice nasaje až dvě třetiny z celkového množství krve, které až stonásobně převyšuje její původní váhu. Sonenshine ve své práci dále uvádí, že toto je možné pouze u oplodněných samic. Během posledních 2 dnů rychlého sání hostitelské krve je trávení mírně zpomaleno. Ve chvíli maximálního nasátí samice odpadá z hostitele a dochází k opětovnému nárůstu trávicí aktivity, zajišťující dostatečné množství živin pro tvorbu vajíček. 15
Obr. 4. Fáze sání krve u dospělých samic I. ricinus. PF přípravná fáze, PS fáze pomalého sání, RS fáze rychlého sání. UF nenasátá samice, 2d-6d dny v průběhu sání samic, FF plně nasátá samice, která odpadla z hostitele. Během sání na hostiteli vylučují klíšťata sliny, které se dostávají do rány slinným žlábkem na hypostomu. Sliny klíšťat obsahují širokou škálu bioaktivních proteinů a lipidů (Sauer et al., 2000). Slinné žlázy také zajišťují osmoregulaci, při níž je nadbytek vody z krve vrácen přes slinný kanálek zpět do hostitele (Bowman et al., 2004). Sliny dále zabraňují srážení krve (hemostázi), zužování cév (vazokonstrikci) a dochází k regulaci shlukování krevních destiček. Vazokonstrikci zabraňuje fibrinolýza (rozpouštění fibrinové sraženiny). V místě průniku do hostitele jsou vypouštěny proteázy a inhibitory, které fibrinolýzu urychlují. Shromažďování a přichycování krevních destiček v ráně brání enzym apyráza společně s dalšími proteiny. Tento komplex brání uzavření rány a zvyšují průtok krve (Mareš a Kopáček, 2008). 1.6.3 Trávení hostitelské krve Trávení krve hostitele je pro klíšťata nezbytným procesem. Živiny získané z hostitelské krve dodávají klíštěti energii nutnou pro přeměnu na vyšší vývojové stádium, nebo, v případě dospělých samic, je energie využita k tvorbě a výživě vajíček (Grandjean, 1984). Dospělá samice vytváří snůšku 1000 2000 vajíček. Trávení krve u klíšťat probíhá intracelulárně v buňkách střevního epitelu (Sonenshine, 1991) v kyselém ph (Grandjean, 1984). Tím se klíšťata liší od většiny krevsajících parazitů a hmyzu, kde je trávení extracelulární. Na trávení hlavní proteinové složky krve, hemoglobinu, se podílí řada proteáz, které se nacházejí v trávicích vakuolách střevních buněk. U klíštěte I. ricinus bylo popsáno 5 hlavních trávicích proteáz, které tvoří tzv. trávicí kaskádu (Obr. 5). Štěpení hemoglobinu zahajují 3 proteázy: aspartátová proteáza cathepsin D, cysteinová proteáza papainového typu cathepsin L a asparaginylová endopeptidáza legumain. Tyto proteázy štěpí hemoglobin na velké bílkovinné 16
fragmenty. Ty jsou dále štěpeny na menší fragmenty pomocí endopeptidázové aktivity cathepsinu B (cysteinová proteáza papainového typu) společně s cathepsinem L. Štěpení vzniklých peptidových fragmentů na dipeptidy a jednotlivé aminokyseliny zajištuje cysteinová exopeptidáza cathepsin C a endo- i exo-peptidázová aktivita cathepsinu B (Horn et al., 2009; Sojka et al., 2013). Obr. 5. Schéma degradace hemoglobinu ve střevě I. ricinus (upraveno podle Horn et al., 2009 a Sojka et al., 2013). 17
2. Metodika 2.1 Testovací skupiny, sběr klíšťat V této práci byly použity 3 sady samic klíštěte I. ricinus z laboratorních chovů Parazitologického ústavu Biologického centra AVČR. Pro jednotlivé sady bylo potřeba zajistit striktní oddělení samic od samců. Nymfální stádia I. ricinus sála na laboratorních morčatech. Nymfy byly po plném nasátí ponechány ve skleněných lahvičkách uzavřených buničinou a skladovány v boxech s relativní vlhkostí přibližně 95%, při konstantní teplotě vzduchu 26 C s fotoperiodou L:D (světlo:tma) 15:9. Těsně po metamorfóze na dospělce byly panenské samice odděleny od samců, aby nedošlo k jejich oplodnění. Pro další část práce byla nasbírána sada klíšťat z přírody metodou vlajkování (tj. sběr pomocí bílé vlněné vlajky). Lokalitou pro sběr byl les za sídlištěm Máj v Českých Budějovicích. Tyto samice byly použity pro pokus, který zjišťoval, zda dochází k oplození samic i mimo hostitele před samotným sáním. Každá sada klíšťat byla složena z testovací skupiny samic sajících bez samců a z kontrolní skupiny samic, které sály v přítomnosti samců. 2.2 Strojení morčat Z každé sady bylo odděleno 26 samic, které sály bez samců a dále kontrolní skupina 26 samic, které sály v přítomnosti samců. Dále bylo odděleno 8 samic, které nesály vůbec, v práci dále uváděno jako UF (nenasáté samice). Klíšťata sála na morčatech z laboratorních chovů PARÚ BC AVČR. Morčata byla před aplikací klíšťat intramuskulárně uspaná injekcí roztoku NARKETAN (Vetoquino) dávkou 0,2 ml/morče. Samice I. ricinus byly přenesené do gumového prstence tzv. kloboučku, který byl umístěn na hřbet morčete v místě s vyholenou srstí. Dále se klobouček zakryl ochrannou síťkou. Jednotlivé vzorky klíšťat byly z morčat odebírány ve stanovených časových intervalech v rozmezí 2. - 8. dne sání. 2.3 Pitva střevních tkání samic klíštěte I. ricinus Samice I. ricinus byly upevněny na voskovou podložku, která byla vložena pod binokulární stereomikroskop (Stemi DV4, Zeiss). Na idiosomu byla aplikována kapka 1x PBS (fyziologický roztok) pro usnadnění disekce střevní tkáně. Následně byla odstraněna horní část kutikuly. Střevní tkáň byla vyjmuta a přenesena do 1x PBS, kde 18
bylo střevo s opatrností propráno a zbaveno tak obsahu střevního lumen bez poškození střevního epitelu s trávicími buňkami. Vypitvaná tkáň byla skladována v 80 C do doby její homogenizace. 2.4 Homogenizace tkání Do vzorků střevní tkáně z jednotlivých intervalů bylo přidáno 200 l extrakčního pufru (0,1 M octan sodný, ph 5.0). Dále byly všechny vzorky homogenizovány plastovým pístem a následně ponořeny do kapalného dusíku. Poté byla provedena opětovná homogenizace. Tento postup byl opakován celkem třikrát. Nakonec byl plastový píst opláchnut 500 l extrakčního pufru. Výsledný přidaný objem v mikrozkumavce byl 700 l. Z tohoto objemu bylo odebráno 100 l vzorku na gelovou elektroforézu a western blot. Vzorky byly uskladněny v -80 C. Do zbylých 600 l vzorků byla přidána 1/10 (tzn. 60 l) objemu 10% roztoku detergentu CHAPS. Hotové vzorky byly inkubovány v předchlazené třepačce Eppendorf (1100 rpm, 4 C, 25 min) a stočeny v předchlazené centrifuze Hereaus Multifuge 3 (15000 rpm, 4 C, 10 min.). Stočený supernatant byl rozdělen do 100 l alikvovotů a vzorky byly uskladněny při -80 C do doby měření aktivit jednotlivých proteáz. 19
2.5 Měření aktivit trávicích proteáz Aktivita trávicích proteáz v jednotlivých vzorcích byla měřena pomocí specifických fluorescenčních substrátů na bázi aminomethylcoumarinu (AMC). Pro měření aktivit CatL a IrAE byl použit specifický inhibitor CA-074 pro odstínění aktivity CatB. Pro jednotlivé protézy byly připraveny reakční pufry (Tab. 1) o přesném ph (Horn et al., 2009, Franta et al., 2010). Tab. 1. Reakční pufry, substráty a inhibitory pro jednotlivé enzymy Enzym Reakční pufr (AB) ph Substrát (výsledná koncentrace) Inhibitor (výsledná koncentrace) CatB 0,2 M NaH 2 PO 4 + 2,5 mm DTT a + 1 M EDTA 5.5 Z-Arg-Arg-AMC (5 M) b - CatC CatL IrAE 0,1 M NaH 2 PO 4 + 0,025 M NaCl + 2,5 mm DTT 0,05 M kys. citronová + 0,1 M NaH 2 PO 4 + 0,1 M NaCl 0,05 M kys. citronová + 0,1 M NaH 2 PO 4 + 0,1 M NaCl 5.5 Gly-Arg-AMC (40 M) b - 4.0 Z-Phe-Arg-AMC (5 M) b CA-074 c 4.0 (2,5 M) Z-Ala-Ala-Asn-AMC CA-074 (10 M) b (2,5 M) a dithiothreitol (ThermoScientific), b AMC substráty (Bachem), c specifický inhibitor IrCB (Sigma- Aldrich) c Při přípravě reakce byly vzorky ponechány na ledu, aby nedocházelo k samovolnému rozkladu enzymů v extraktech. Měření probíhalo v mikrodestičkovém fluorimetru Infinite 200M (TECAN) s dvojitým monochromátorem. Reakce byly měřeny v černých mikrodestičkách (Nunc) s 96 jamkami. Pipetovací schéma pro jednotlivé proteázy je popsáno v (Tab. 2). Tab. 2. Pipetovací schéma a podmínky měření aktivit trávicích proteáz Pipetovací schéma Excitace/Emise [nm] CatB, CatL, IrAE 20 l vzorku + 80 l AB + 100 l S 360/465 CatC 20 l vzorku + 60 l AB + 20 l S 360/465 AB - reakční pufr, S- substrátový roztok 2x resp. 5 x koncentrovaný substrát v AB 20
Pro jednotlivé extrakty střevních homogenátů samic bylo provedeno orientační měření aktivit všech enzymů. Ředění, které odpovídalo přibližně 1500 relativním fluorescenčním jednotkám za minutu (RFU/min), byla použita jako výchozí ředění pro měření duplikátů (Tab. 3). Průměr těchto získaných hodnot byl u vzorků přepočten na RFU/1 min/střevo. Tab. 3. Typická výchozí ředění homogenátů střevních tkání samic 6. den saní CatB CatL CatC IrAE 6. den sání + 150x 20x 60x 8x 6. den sání 20x 2x 4x 2x 2.6 Elektroforéza (SDS-PAGE) a Western blot Elektroforéza probíhající v přítomnosti dodecylsulfátu sodného v polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) je metoda umožňující analytické rozdělení proteinů podle jejich velikosti. Proteiny po navázání SDS získávají záporný náboj a migrují ke kladné elektrodě (anodě). Metoda Western blot umožňuje detekci proteinů pomocí specifických protilátek, která je prováděna po elektroforetickém přenesení proteinů z polyakrylamidového gelu na speciální membránu (nitrocelulóza, teflon). Tkáně určené pro SDS-PAGE elektroforézu a Western bloty byly 10 min povařeny ve vzorkovém redukujícím pufru (Tab. 4) při 100 C. Na jamku bylo standardně naneseno 20 µl vzorku obsahující 0,1 střeva. LMW markeru (Tab. 4) bylo naneseno 15 µl Elektroforéza probíhala v gradientovém (5-17,5%) polyakrylamidovém gelu v elektroforetickém pufru (Tab. 4) při počátečním napětí 100 V (10 min) a následně 200 V po dobu separace. Poté byly gely obarveny barvícím roztokem a následně promyty v odbarvovacím roztoku (Tab. 4) nebo byly použity pro elektroforetický přesun proteinů na PVDF (polyvinylidenfluorid) membránu. Při přípravě Western blotu byla PVDF membrána aktivována ponořením do methanolu. Gel byl spolu s filtračnímy papíry namočen do blotovacího pufru (Tab. 4). Následně byl vytvořen blotovací sendvič (Obr. 6). Přenos na membránu probíhal v konstantním elektrickém poli při proudu 150 ma. Po přeblotování proteinů na membránu byla část membrány s markerem obarvena v barvícím roztoku a poté odbarvena odbarvovacím roztokem. Membrány pro imunodetekci byly vloženy na 1 hodinu do blokovacího pufru (Tab 4). Poté byla membrána inkubována přes noc v 5 C v primární králičí protilátce ředěné 1:100 v blokovacím pufru. Membrána byla druhý den pětkrát po pěti minutách promyta v PBS-Tweenu pro odmytí nenavázaných a nespecificky navázaných 21
primárních protilátek. Následně byla inkubována 1 hodinu v sekundární protilátce ředěné 1:2000 v PBS Tweenu (SwAR/Px, Sevac, Praha) konjugované s křenovou peroxidázou. Poté byla membrána opětovně pětkrát promyta v PBS Tweenu po 5 minutách. Proteiny s navázanými specifickými protilátkami byly detekovány v substrátovém roztoku (Tab. 4), který reagoval s navázanou peroxidázou za tvorby hnědě zbarveného produktu. K zastavení reakce byla membrána promyta destilovanou vodou. Obr. 6. Blotovací sendvič. - směr elektrického proudu je označen červenou šipkou Tab. 4. Roztoky pro SDS-PAGE a Western blot Složení 0,75 M Tris/HCl, ph 6.0, 8,5 % SDS, 50 % (v/v) glycerol, Vzorkový redukující pufr 32 mm DTT, 0,25 % (w/v) bromfenolová modř Elektroforetický pufr 25 mm Tris, 192 mm glycin, 0,1 % SDS 0,05 % Coomassie Briliant Blue R-250, 50 % (v/v) methanol, Barvící roztok 10 % (v/v) kys. octová Odbarvovací roztok 25 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) kys. octová Blotovací pufr 0,125 M Tris, 0,96 M glycin, 20 % methanol, 0,1 % (w/v) SDS Proteinový marker (LMW) LMW Electrophoresis Calibration Kit (GE Healthcare) PBS Tween 1x PBS, 0,05 % (v/v) Tween 20 Blokovací roztok 5 % (w/v) sušené mléko, 1x PBS, 0,05 % (v/v) Tween 100 mmtris-hcl ph 7.5 Substrátový roztok s přidaným H 2 O 2 (100 l/100 ml) a DAB (50 g/100 ml) 22
3. Výsledky a diskuse Rozdíl velikostí mezi samičkami, které sály v přítomnosti samců a bez samců je vidět na (Obr. 7). Nejpatrnější byl rozdíl u samic v 6. den sání před zahájení fáze rychlého sání a 8. den u plně nasátých (odpadlých) samic. Samice sající se samci část A (6. den sání) a část C (8. den sání) jsou několikanásobně větší, než samice sající bez samců v části B (6. den sání) a části D (8. den sání). Velikostní rozdíl se dá rovněž určit rozdílem ve vahách u jednotlivých skupin klíšťat (Obr. 8). Obr. 7. Velikost oplodněných a panenských samic po sání na morčeti. A oplozené samice 6. den sání, B panenské samice 6. den sání, C oplozené (plně dosáté) samice 8. den sání, D panenské samice 8. den sání. (Fotografie laskavě poskytnul Jan Erhart, Parazitologický ústav BC AVČR) Graf znázorňuje průměrné váhy samic z druhé sady klíšťat. U jednotlivých intervalů je znázorněna statistická odchylka hodnot (směrodatná odchylka). Na grafu je viditelný váhový rozdíl mezi skupinou samic sající bez samců a skupinou sajících se samci až od 4. dne sání. Samice sající se samci mají téměř dvojnásobnou váhu oproti panenským samicím. V 6. dni sání je nárůst váhy samic v přítomnosti samců přibližně trojnásobný a u 8. dne sání převyšuje rozdíl vah mezi skupinami desetinásobné hodnoty. 23
Obr. 8. Průměrná váha samic z 2. sady klíšťat v jednotlivých intervalech odebíraných pro následnou pitvu střevních tkání. Každá skupina čítá 8 samic. Tyto výsledky potvrzují dlouho známé literární údaje (např. Sonenshine, 1991), že pro přechod samic do fáze rychlého sání a pro jejich plné dosátí je nutné jejich oplodnění. Dosud však nebylo prozkoumáno, zda má oplodnění samic vliv i na aktivitu trávicích proteáz ve střevě. 3.1 Vliv oplodnění samic na aktivitu a množství trávicích proteáz Aktivitu a množství trávicích proteáz ve střevě panenských a oplodněných samic jsme sledovali u trávicích proteáz IrAE, CatL, CatB a exopeptidázy CatC. Z multienzymatického trávicího aparátu (Obr. 5) jsme nezkoumali pouze aspartátovou proteázu CatD, kvůli nedostupnosti specifického substrátu. Množství trávicích enzymů ve střevech bylo určeno pomocí Western blot pro CatL a CatB, proti kterým jsou k dispozici specifické protilátky. 3.1.1 Cathepsin L Samice před sáním mají nulovou hodnotu aktivity CatL (Obr. 9). Ve 2. dni sání se aktivita CatL u panenských samic i samic sajících se samci mírně 24
zvyšuje. Ve 4. dni sání je viditelný znatelný rozdíl mezi skupinami. Aktivita CatL je u samic sajících 4. den v přítomnosti samců více než dvojnásobná oproti panenským samicím. V šestém dni dosahuje aktivita CatL u samic sajících se samci svého maxima. V plně nasátém stádiu oplozených samic dochází k rapidnímu úbytku aktivity na téměř nulovou hodnotu v případě 1. sady. U 2. i 3. sady je viditelný úbytek o téměř 50 % oproti těmto hodnotám. Samice sající bez samců si udržují v průběhu sání pouze bazální hladinu aktivity a není zde viditelný žádný výrazný nárůst aktivity. Všechny tři pozorované sady mají podobný průběh zvyšování a snižování aktivity během trávení. Obr. 9. Profil aktivit CatL ve střevních extraktech samic I. ricinus v průběhu sání u tří sad samic. 25
Hladina proteinu IrCL (Obr. 10) je u nenasátých samic nulová. Ve 2. dni sání u obou skupin samic je viditelná zvýšená koncentrace neaktivního proenzymu CatL o velikosti ~ 50 kda. Ve 4. dni sání u obou skupin samic a v 6. dni sání neoplodněných samic je pozorovatelný nárůst koncentrace proteinu ve formě 2 bendů: aktivní enzym s velikostí ~ 27 kda a neaktivní proenzym o velikosti ~ 50 kda. U 6. dne sání oplodněných samic je viditelný nejvyšší nárůst koncentrace proteinů o podobné velikosti enzymů jako v předchozích dnech sání. V 8. dni sání u panenských klíšťat je viditelný pokles koncentrace proteinu oproti 6. dni sání. Toto ředění neposkytuje viditelné rozpoznání hladiny IrCL u 8. dne oplodněných samic díky příliš vysoké koncentraci hostitelských proteinů. Obr. 10. Western blot CatL v průběhu sání 2. sady samic. Pro-IrCL proenzym cathepsinu L, IrCB cathepsin L 26
3.1.2 Cathepsin B Aktivita CatB (Obr. 11) je u všech skupin v nenasátém stavu a ve 2. dni sání téměř nulová. Ve 4. dni sání oplodněných samic je viditelná zvýšená aktivita CatB. V 6. dni sání dosahuje jejich aktivita svého maxima. V případě všech 3. sad samic se samci klesá aktivita CatB v plně nasátém stavu téměř o polovinu. Hodnoty aktivit u panenských samic zůstávají na nízké hladině až do 4. dne sání. V 6. dni sání se aktivita mírně zvyšuje u 1. a 3. sady na nejvyšší hodnotu a poté zvolna klesá v 8. dni sání. V případě 2. sady je aktivita v 6. dni sání mírně zvýšená, ale až v 8. dni sání dosahuje svého maxima. Tato odchylka je pravděpodobně způsobena rozdílným časem přisátí k hostiteli. Obr. 11. Profil aktivit CatB ve střevních extraktech samic I. ricinus v průběhu sání u tří sad samic. 27
Hladina proteinu CatB (Obr. 12) je u nenasátých samic nulová, podobně jako ve druhé dni sání panenských samic i samic sajících se samci. Ve 4. dni u obou skupin samic a v 6. dni u panenských samic je již viditelná zvýšená koncentrace proteinu: aktivní enzym s velikostí ~ 32 kda a neaktivní proenzym o velikosti přibližně 46 kda. V 6. dni u oplozených samic je pozorována vysoká koncentrace CatB, převážněně aktivní formy CatB. U 8. dne sání panenských samic je viditelný vzestup hladiny proteinu. Toto ředění neposkytuje dobré rozpoznání hladiny CatB u 8. dne oplodněných samic díky vysoké koncentraci hostitelských proteinů. Obr. 12. Western blot CatB v průběhu sání 2. sady samic. Pro-ICB proenzym cathepsinu B, IrCB cathepsin B 28
3.1.3 Cathepsin C CatC vykazuje nulovou aktivitu u samic v nenasátém stavu (Obr. 13). Aktivita CatC se mírně zvyšuje u samic sajících bez samců i se samci ve 2. a 4. dni sání. V 6. dni sání u 2. a 3. sady oplozených samic dosahuje aktivita CatC svého maxima. V 8. dni sání tato hodnota mírně klesá. V případě 1. sady oplozených samic dosahuje aktivita svého maxima v 7. dni sání a poté mírně klesá. Tento rozdíl může být způsoben rozdílným časem přisátí k hostiteli. U panenských samic se aktivita v 6. dni sání kontinuálně mírně zvyšuje a svého maxima dosahuje v 8. dni sání v případě 2. a 3. sady. U 1. sady dosahuje aktivita svého maxima v 5. dni sání a poté zvolna klesá. Obr. 13. Profil aktivit CatC ve střevních extraktech samic I. ricinus v průběhu sání u tří sad samic. 29
3.1.4 Legumain Aktivita IrAE (Obr. 14) u obou sledovaných skupin je v nenasátém stavu a ve 2. dni sání téměř nulová. U oplozených samic je patrná zvýšená aktivita IrAE až ve 4. dni sání. V 6. dni sání dosahuje aktivita IrAE nejvyšších hodnot. U 1. sady se samci dochází v 7. dni sání k poklesu aktivity více jak o polovinu a poté aktivita mírně klesá. V případě 2. a 3. sady se samci je pokles hladiny aktivity IrAE v 8. dni sání třetinový oproti 6. dni sání. Aktivita IrAE u panenských samic je v 6. dni sání mírně zvýšená oproti 2. dni sání, jinak nepozorujeme žádný viditelný nárůst aktivity. Neoplodněné samice si udržují základní hladinu aktivity během celého sání. Všechny tři pozorované sady mají podobný průběh zvyšování a snižování aktivity během trávení. Odchylka viditelná ve 4. dni sání u 2. sady oplodněných samic je nejspíš způsobená rozdílným časem přisátí k hostiteli. Obr. 14. Profil aktivit IrAE ve střevních extraktech samic I. ricinus v průběhu sání u tří sad samic. 30
3.2 Shrnutí Ze získaných výsledků je patrné, že aktivita trávicích enzymů v průběhu sání dospělých samic je daleko vyšší u oplodněných samic. Výsledky Western blotu navíc ukazují, že větší aktivita enzymů je daná větším množstvím trávicích enzymů a nikoli zvýšenou aktivací již existujících neaktivních proenzymů. Regulace tvorby (proteosyntézy) trávicích enzymů je u dospělých samic zřejmě řízena hormonálně. Nezodpovězenou otázkou zůstává, jakým mechanismem je řízeno zvýšení proteolytické aktivity v průběhu sání nedospělých nymf (Konvičková, 2013). 3.3 Sání samic I. ricinus z přírody V literatuře i v praxi používané v mnoha laboratořích je zažitá představa, že k oplodnění samic I. ricinus dochází až během sání na hostiteli. Z tohoto důvodu se při experimentálních pokusech nasazují samci a samice na hostitele v poměru 1:1. Na druhou stranu se pravděpodobnost, že v přírodě hostitel (srna, pes, člověk) chytne najednou samce i samici se zdá poměrně malá. Proto jsme provedli jednoduchý experiment, který tuto domněnku měl potvrdit nebo vyvrátit. Pro tuto část práce byly použity dvě sady samic (Tab. 5) z přírody, nasbírané metodou vlajkování. Ze sady 25 samic sajících bez přítomnosti samců se plně dosálo 22 samic. V kontrolní skupině sající v přítomnosti samců byl počet plně dosátých samic 24. Samice, které se plně nedosály odpadnuly z hostitele v době mezi 6. - 8. dnem sání. Tímto pokusem bylo na základě předešlých výsledků této práce prokázáno, že samice z přírody jsou ve většině případů oplozeny ještě před sáním na hostiteli. Tento výsledek je víceméně v souladu s publikovanými pracemi o příbuzném klíštěti Ixodes scapularis, kdy u většiny samic pochytaných v přírodě byly nalezeny spermie ve spermatoforech (Kiszewski et al., 2002). Náš výsledek tedy ukazuje, že současné nasazování samic a samců z přírodních sběrů pro experimentální sání není v podstatě nutné. Tab. 5. Sání samice z přírody. Plně dosáté Nedosáté 25 bez samců 22 3 25 se samci (kontrola) 24 1 31
4. Seznam literatury Beaty B. J., Marquardt William C. The Biology of Disease Vectors. University Press of Colorado, 1996, 1: 170. Bowman A. S. and Sauer J. R. Tick salivary glands: function, physiology and future. Parasitology. 2004,129: 67 81. Coons L. B., Rosell-Davis R., Tarnowski B. I: Blood meal digestion in ticks. In Morphology, Physiology, and Behavioural Biology of Ticks. Edited by Sauer JR, Hair JA. New York: Ellis Horwood Ltd., John Wiley & Sons; 1986: 248-279. de la Fuente J. and Kocan K. M. Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species. Parasite Immunology. 2006, 28: 275 283. de la Fuente J. et al. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Front Biosci. 2008, 13: 6938 46. Franta Z., Frantova H., Konvickova J., Horn M., Sojka D., Mares M., Kopacek P. Dynamics of digestive proteolytic system during blood feeding of the hard tick Ixodes ricinus. Parasit Vectors. 2010, 3: 119. Horn M., Nussbaumerová M., Šanda M., Kovářová Z., Srba J., Franta Z., Sojka D., Bogyo M., Caffrey C. R., Kopáček P., Mareš M. Hemoglobin digestion in Blood- Feeding Ticks: Mapping a Multi-Peptidase Pathway by Functional Proteomics. Chem Biol. 2009, 16:1053-1063. Grandjean O. Blood digestion in ornithodorus moubata Murray Sensu stricto Walton (Ixodoidea: Argasidae) females. I: Biochemical changes in the midgut lumen and ultrastructure of the midgut cell, related to intracellular digestion. Acarologia. 1984. 25: 147-165. Kimmig P., Hassler D., Braun R. Nepatrné kousnutí s neblahými následky. 2003. PRAGMA. Praha. 114s. Kiszewski A.E., Spielman A. Preprandial Inhibition of Re-Mating in Ixodes Ticks (Acari:Ixodidae). Journal of Medical Entomology, 2002. 39(6):847-853. Konvičková J. Dynamika aktivit trávicích proteáz ve střevě klíšťat Ixodes ricinus během sání na hostiteli. Bakalářská práce, Přírodovědecká fakulta, Jihočeská univerzita, 2013: 14-35. Mareš M., Kopáček P. Molekulární pohled do světa klíšťat. Vesmír 2008, 87: 670-673. Nava S., Guglielmone A.A., Mangold A.J.. An overview of systematics and evolution of ticks. Front Biosci. 2009;14:2857-77. 32
Raikhel A.S. The excretory system. An Atlas of Ixodid tick Ultrastructure [English translation]. Entomological Society of America. 1983. 129-147. Ryšavý B., Zpěvák I., Zpěváková-Sokoltová H. Základy parazitologie. SPN. Praha. 1988, 215. Sauer J. R., Essenberg R. C. and Bowman A. S. Salivary glands in ixodid ticks: control and mechanism of secretion. Journal of Insect Physiology. 2000, 46: 1069 1078. Sojka D., Franta Z., Horn M., Caffrey C.R., Mareš M., Kopáček P. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends Parasitol. 2013 Jun;29(6):276-85. Sonenshine D.E. Biology of ticks. Oxford University Press, 1991, New York. Volf P., Horák P. a kol. Paraziti a jejich biologie. Triton. 2007, Praha. 318, 260-264. 33