4.3.1. Stanovení anorganických součástí Většina hmotnosti živých organismů je tvořena vodou, kterou jsou tyto organismy dokonale prostoupeny. Voda je i reaktivní chemickou sloučeninou, která se účastní řady enzymatických reakcí, je podstatou všech tělních tekutin, které zajišťují transport živin, metabolitů a plynů a udržují stálé osmotické poměry, ph, teplotu a další biologicky důležité hodnoty v celém organismu. Při vyšetřování vnitřního prostředí se zajímáme jednak o koncentrace složek, jednak o objemy ve kterých jsou tyto složky obsaženy. Koncentrace složek hodnotíme individuálně (např. koncentrace iontů v krvi), nebo souhrnně jako fyzikální veličinu (např. osmotický tlak). Dále hodnotíme i látkové množství jednotlivých substancí, jejich zásoby a jejich případný nedostatek nebo nadbytek. Stanovení nejvýznamnějších anorganických kationtů Sodné (Na + ) a draselné (K + ) ionty Sodné kationty jsou důležité pro udržování osmotického tlaku plasmy. Denní příjem člověka je mezi 90 250 mmol, nadbytek je z 95 % vylučován močí. Draselné kationty jsou typické pro intracelulární tekutinu, ve které mají koncentraci 150 mmol/l. Denní příjem je asi 100 mmol, z toho se 30 mmol adsorbuje. Stanovení Na + a K + se provádí v séru, heparinizované plazmě, plné krvi i v moči. Krevní vzorky po odstranění krvinek se mohou uchovávat při 2 4 C až 2 týdny, při -20 C jsou stabilní 6 měsíců; moč je asi desetkrát méně stabilní. Měření koncentrace Na + a K + se v současnosti provádí čtyřmi standardními metodikami a to: Iontově selektivními elektrodami, které mají pro měření Na + i K + kapalnou, iontoměničovou membránu. Před měřením je nutno elektrody kalibrovat roztoky o známé koncentraci. Podle metodiky měření rozeznáváme přímou metodu, kde měříme koncentraci iontů ve vzorku bez ředění a metodu nepřímou, kde vzorek ředíme (nutno používat vždy při měření moče) podobně jako u plamenové fotometrie, takže výsledky jsou obdobné. Plamenovou fotometrií na základních spektrálních čarách Na + 589 nm a K + 767 nm s použitím vnitřního standardu, kterým je Li + o koncentraci obvykle 15 mmol/l, emitující základní čáru při 671 nm. Zředěný vzorek (50 až 200-krát) se spaluje v propanovém hořáku. Intenzity signálů se po průchodu interferenčním filtrem měří fotodiodou a vyhodnocují počítačem.
Atomovou absorpční spektrometrií, která je založena na specifické absorpci monochromatického záření volnými atomy Na + nebo K + při 589 resp. 767 nm. Zdrojem záření je výbojka s dutou katodou, která je zhotovená z kovu, který se má stanovit. Moderní výbojky již mají multialkalickou dutou katodu. Záření prochází absorpčním prostředím, které je realizováno acetylenovým plamenem, do kterého je přiveden aerosol vzorku. Prošlé záření je zachycováno v monochromátoru, který izoluje vhodnou spektrální čáru a pomocí fotonásobiče je vyhodnocována absorbance, přímo úměrná koncentraci Na + nebo K + v klinických laboratořích se tento postup nepoužívá. Spektrofotometrickými metodami, které dělíme do dvou skupin. Metody prvé skupiny využívají aktivaci enzymů příslušným iontem a aktivované enzymy následně štěpí vhodný substrát. Na + aktivuje β-galaktosidasu, která štěpí 2-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid na D- galaktosu a 2-nitrofenol měřitelný při 420 nm. K + aktivuje tryptofanasu, která štěpí S-2- nitrofenyl-l-cystein a jeho úbytek se měří při 370 nm. Metody druhé skupiny měří spektrální posun při vzniku vazby mezi iontem a makrocyklickým chromoforem (trinitroanilinkryptohemispherand selektivně váže Na +, valinomycin je specifický pro K + ). Fyziologické hodnoty při 37 C u dětí do 15 let pro Na + jsou 134-146 mmol/l, pro K + jsou 3,2 5,9 mmol/l; u dospělých pro Na + jsou 132-142 mmol/l, pro K + jsou 3,8 5,3 mmol/l. Vápník (Ca 2+ ) Vápník je kation nejvíce zastoupený v lidském těle. Asi 99 % jeho množství je vázáno s fosforem v kostech, dentinu a zubní sklovině jako hydroxyapatit. Denní příjem je asi 25 mmol, z toho se adsorbuje 6,2 mmol, zbytek se vylučuje ledvinami a kůží. V séru je asi 50 % jeho celkového množství ionizováno, 40 45 % je vázáno na bílkoviny a 5 10 % je vázáno v komplexech s fosfáty, citráty nebo hydrogenkarbonáty. Stanovení Ca 2+ se provádí v nehemolytickém séru nebo heparinizované plazmě. Jiné druhy plasmy nelze použít. Stanovení se provádí i v moči. Vzorky séra a plasmy se mohou uchovávat při 20 C týden, při 2 8 C až 3 týdny, při -20 C jsou stabilní 6 měsíců. Moč je méně stabilní: při 20 C 2 dny, při 2 8 C 4 dny a při -20 C 3 týdny. Měření koncentrace Ca 2+ se provádí rovněž čtyřmi standardními metodikami a to: Atomovou absorpční spektrometrií při 422 nm. Ke vzorku se přidávají soli lanthanu, (nebo stroncia) k odstranění interference fosfátů a sulfátů. Tato metoda je referenční a někdy i rutinní. Podrobnosti viz měření koncentrace Na + a K +.
Plamenovou fotometrií na základní spektrální čáře Ca 2+ 423 nm s použitím kompenzačního roztoku o koncentraci Na + 140 mmol/l. Sérum resp. plazma se ředí 20-krát. Spektrofotometrickými metodami s různými komplexotvornými činidly (okresolftaleinkomplexon, arsenazo III), které jsou poměrně rozšířené. Metoda s o- kresolftaleinkomplexonem používá CAPS (3-(cyklohexylamino)-1-propansulfonová kyselina) / NaOH pufr o ph 10,7, ve kterém je dále 8-hydroxychinolin (k potlačení interference Mg 2+ a Fe 3+ ). Po přídavku vzorku se při 552 nm měří po 5 min prodlevě absorbance vzorku, standardu a blanku proti vodě. Koncentrace vápníku v mmol/l se vypočítá z níže uvedené rovnice. Nebo se měření celkové koncentrace vápníku provádí při 37 C ve fosfátovém pufru o ph 7,5, který obsahuje metalochromogen arsenaso III, 8-hydroxychinolin-5-sulfonovou kyselinu (k potlačení interference Mg 2+ ) a azid sodný. Po přídavku vzorku se při 650 nm měří po 2 min prodlevy absorbance vzorku, standardu a blanku proti vodě. Koncentrace vápníku v mmol/l se vypočítá z rovnice: Koncentrace vápníku = ( A vz /min - A bl /min) / ( A st /min - A bl /min). c st kde A vz je absorbance vzorku, A st je absorbance standardu, A bl je absorbance blanku a c st je koncentrace Ca 2+ ve standardu v mmol/l. Iontově selektivní elektroda se používá pouze pro měření ionisovaného Ca 2+. Elektroda má membránu z PVC na které jsou naneseny organofosfáty. Fyziologické hodnoty při 37 C pro celkový vápník jsou u dětí do 15 let 2,2-2,6 mmol/l a u dospělých 2,2-2,5 mmol/l. Zdravé děti za den močí vyloučí < 0,15 mmol/kg, dospělí 2,5 8,0 mmol Ca 2+. Fyziologické hodnoty ionisovaného Ca 2+ v plné krvi jsou u dětí do 10 let 1,15-1,45 mmol/l a u dospělých 1,15-1,30 mmol/l. Hořčík (Mg 2+ ) Hořčík je v pořadí čtvrtým nejvíce se vyskytujícím kationtem v lidském těle. Asi 50 % jeho celkového množství je přítomno ve vázané formě v kostech, většina zbylého množství se nalézá v intracelulárních tekutinách, v extracelulárních tekutinách je pouze malé množství (v krvi je jen 0,3 % celkového množství v těle). Stanovení Mg 2+ se provádí v nehemolytickém séru nebo plazmě (mimo EDTA plazmy), v moči a mozkomíšním moku. Vzorky séra a plazmy se mohou uchovávat při 4-20 C týden, při -20 C jsou stabilní 1 rok, v moči při 4 20 C 3 dny, při -20 C 1 rok. Měření koncentrace hořčíku se provádí dvěmi standardními metodikami a to: Atomovou absorpční spektrometrií při 285 nm. Vzorek se ředí roztokem chelatonu III k odstranění interference kovových iontů a solemi lanthanu k odstranění interference fosfátů a
sulfátů v poměru 1 : 50. Tato metoda je referenční. Podrobnosti viz měření koncentrace Na + a K +. Rutinně se většinou používají spektrofotometrické metody s různými komplexotvornými činidly (xylidylová modř magon, chlorofosfonazo III, kalmagit, arsenazo), které jsou sice levné, ale dávají pochybné výsledky. Proto se upřednostňuje enzymatická metoda, kdy se zprostředkovaně sleduje rychlost vzniku glukosa-6-fosfátu z glukosy a ATP působením HK, která závisí na koncentraci Mg 2+. Glukosa-6-fosfát se pak oxiduje glukosa-6-fosfátdehydrogenasou na 6-fosfoglukonát a současně se redukce NAD + na NADH měří při 340 nm. Koncentrace hořčíku v mmol/l se vypočítá z rozdílu absorbancí pomocí podobné rovnice jako pro výpočet koncentrace vápníku. Fyziologické hodnoty při 37 C pro celkový hořčík jsou u dětí do 15 let 0,60-0,95 mmol/l a u dospělých 0,73-1,06 mmol/l. Zdravé děti a dospělí denně močí vyloučí 2,5 8,5 mmol Mg 2+. Železo (Fe 2+, Fe 3+ ) Železo je dalším životně důležitým kationtem lidského těla, které ho obsahuje celkem 3 5 g. V těle se železo vyskytuje výhradně vázané na různé bílkoviny. Železo se vstřebává v objemu 3 6 % požitého množství, které denně činí asi 15 20 mg. Tvorba hemoglobinu spotřebuje denně asi 20 25 mg železa, které je do kostní dřeně dodáváno krví ze zásob v játrech a slezině vzniklých z odbouraných erytrocytů, ztráty jsou kryty z adsorbovaného železa. Krev prochází kostní dření 7 8 krát za 24 h, protože koncentrace železa v krvi je jen asi 20 µmol/l. Stanovení Fe 2+ se provádí v nehemolytickém séru nebo heparinisované plazmě. Jiné druhy plasmy nelze použít. Vzorky séra a plasmy se mohou uchovávat při 20 C týden, při 2 8 C až 3 týdny, při -20 C jsou stabilní několik let. Měření koncentrace Fe 2+ se provádí dvěmi standardními metodikami a to: Atomovou absorpční spektrometrií při 248 nm v supernatantu po deproteinaci kyselinou trichloroctovou používá se málo, protože záření zdroje je v tomto případě slabé a nestabilní. Spektrofotometrickými metodami s různými komplexotvornými činidly (batofenantrolin, ferrozin), které jsou poměrně rozšířené. Měření celkové koncentrace jako Fe 2+ se provádí při 37 C v acetátovém pufru o ph 4,5, který obsahuje hydroxylamin (redukovadlo Fe 3+ ), nebo v glycinovém pufru o ph 3,6, který obsahuje thiomočovinu a kyselinu askorbovou (redukovadlo Fe 3+ ). Po smíchání se vzorkem se reakční směs inkubuje 2 min při 560 nm a odečte se absorbance vzorku, standardu
a blanku a přidá se roztok chromogenu (ferrozinu s neokuproinem, nebo samotný ferrozin). Po přibližně 5 min inkubace se opět odečte absorbance a z rozdílů absorbancí vzorku a standardu se vypočte koncentrace Fe 2+ v µmol/l z rovnice: Koncentrace Fe 2+ = A vz / A st. c st kde A vz je absorbance vzorku, A st je absorbance standardu a c st je koncentrace Fe 2+ ve standardu v µmol/l. Tato metoda se používá i pro zjištění vazebné kapacity železa v séru. Při ph 8,1 (pufr TRIS) se k séru přidá známý nadbytek síranu železnatého, který úplně saturuje transferin. Obvykle po 10 min inkubaci se nenavázaný nadbytek Fe 2+ stanoví a vypočte pomocí výše uvedeného postupu. Rozdíl mezi množstvím přidaného a nenavázaného nadbytku Fe 2+ vyjadřuje nenasycenou vazebnou kapacitu (UIBC) železa v séru v µmol/l. Celková vazebná kapacita (TIBC) se vypočte součtem koncentrace Fe 2+ v séru a UIBC. Imunochemicky je možno stanovit koncentraci transferinu turbidimetricky přímo ve zředěném séru (1 : 10) reakcí se specifickou kozí protilátkou ve fosfátovém pufru. Měření se provádí při 340 nm, jako standard se používá defibrilovaná lidská plasma. Po přídavku vzorku nebo standardu k protilátce v pufru inkubujeme 15 30 min při 37 C, pak odečteme absorbanci vzorku a standardů. Koncentraci transferinu v g/l zjistíme z kalibrační křivky. Přepočet na TIBC v µmol/l se provede vynásobením koncentrace transferinu v g/l faktorem 25,2. Fyziologické hodnoty při 37 C pro celkové železo jsou u dětí od 1 roku do 15 let 4,0-24,6 µmol/l, u mužů 25 60 let 6,3-30,1 µmol/l, u žen 25 60 let 4,1-29,5 µmol/l; po porodu hodnoty klesají na 2,9 26,9 µmol/l. Fyziologické hodnoty UICB jsou u dětí 1 15 roků 20 44 µmol/l a u dospělých 15 60 let 32 45 µmol/l. Měď (Cu 2+ ) Meď je esenciálním biogenním prvkem lidského těla, které jí obsahuje celkem 80 120 mg. V těle je měď z 96 % vázaná na specifické bílkoviny (v séru na ceruloplasmin a albumin, v játrech na hepatokuprein), zbytek je volná měď, obsažená hlavně v séru. Měď se vstřebává v horní části tenkého střeva a v duodenu, denní potřeba jsou asi 2 mg, z potravy se vstřebává 30 60 % přítomné mědi. Stanovení Cu 2+ se provádí v nehemolytickém séru nebo heparinisované plazmě. Jiné druhy plazmy nelze použít. Vzorky séra a plazmy se mohou uchovávat při 20 C 2 dny, při 2 8 C 1 týden, při -20 C jsou stabilní 3 měsíce. Měření koncentrace Cu 2+ se provádí třemi standardními metodikami a to:
Atomovou absorpční spektrometrií při 325 nm v supernatantu po deproteinaci kyselinou trichloroctovou. Spektrofotometrickými metodami s různými komplexotvornými činidly reagujícími s ionty mědi: batokuproin, 5-Br-PSAA tj. 2-(5-brom-2-pyridylazo)-5-[N-propyl-N-(3- sulfopropyl)amino]anilin, nebo reakcí ceruloplasminu s p-fenylendiaminem v acetátovém pufru o ph 5,5, kdy se změna absorbance sleduje při 540 nm po 10 min inkubaci při 37 C a koncentrace ceruloplasminu se odečte z kalibrační přímky. Měření celkové koncentrace Cu 2+ se provádí při 37 C v acetátovém pufru o ph 4,2, který obsahuje guanidin hydrochlorid a 5-Br-PSAA. Po smíchání se vzorkem se reakční směs inkubuje 5 min a při 580 nm se odečte absorbance vzorku a standardu proti EDTA blanku. Koncentrace Cu 2+ v µmol/l se vypočte z rovnice použité pro výpočet koncentrace Fe 2+, kde c st je koncentrace Cu 2+ ve standardu v µmol/l. Imunochemicky je možno stanovit koncentraci ceruloplasminu turbidimetricky přímo ve zředěném séru (1 : 10) reakcí s polyklonální protilátkou ve fosfátovém pufru. Měření se provádí stejným postupem jako u měření koncentrace transferinu. Koncentraci ceruloplasminu v g/l zjistíme z kalibrační křivky. Přepočet na obsah mědi v µmol/l se provede vynásobením koncentrace ceruloplasminu v g/l faktorem 47,2. Fyziologické hodnoty při 37 C pro celkovou měď v µmol/l jsou u dětí od 1 roku do 15 let 10,3-21,4; u mužů do 60 let 11,0-22,0; u žen do 60 let 12,6-24,4 a u dospělých nad 60 let 13,5 29,7. Zinek (Zn 2+ ) Zinek je intracelulárním stopovým prvkem. Lidské tělo obsahuje celkem 1,4 2,3 g zinku, v séru je zinek z 88 % vázán na albumin, 11 % je vázáno na transferin a 1 % na aminokyseliny. Zinek se vstřebává v duodenu a jejunu a váže se na metalothionein. Denní potřeba je asi 5 22 mg, z potravy se vstřebává 10 20 % přítomného zinku. Stanovení Zn 2+ se provádí v nehemolytickém séru nebo heparinisované plazmě. Jiné druhy plasmy nelze použít. Ke stanovení se používá i moč, nebo sperma. Vzorky séra i plasmy se mohou uchovávat při 4 20 C 3 dny, při -20 C jsou stabilní 6 měsíců. Měření koncentrace Zn 2+ se provádí dvěmi standardními metodikami a to: Atomovou absorpční spektrometrií při 214 nm v supernatantu po deproteinaci kyselinou trichloroctovou.
Spektrofotometrickou metodou s 5-Br-PAPS (2-(5-brom-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N- (3-sulfopropyl)amino)fenol). Tento postup je ale pro biologickou koncentraci zinku málo citlivý a proto se v klinických laboratořích nepoužívá. Fyziologické hodnoty při 37 C pro Zn 2+ jsou v µmol/l u dětí od 2 měsíců do 12 let 14,8-21,7; u dospělých do 60 let 9,0 16,0 a nad 60 let 9,6 16,4. Selen (Se 4+ ) Selen je intracelulárním stopovým prvkem ovlivňujícím funkci srdečního a kosterního svalstva, nezbytným pro správnou funkci štítné žlázy, má antioxidační účinky a inhibuje virové nákazy včetně viru HIV. Vyskytuje se asi v 15 selenoproteinech z nichž nejdůležitější jsou cytosolární glutathion peroxidasa, thioredoxin reduktasa a jodothyronin-dejodidasa. Lidské tělo obsahuje celkem 4 14 mg selenu, v séru je selen z 66 % vázán na selenoprotein P a v selenocysteinu. Selen se vstřebává v tenkém střevu, denní potřeba je asi 0,6 2,5 µmol. Z potravy se vstřebává asi 40 % přítomného selenu, nadbytek je vylučován ledvinami. Stanovení selenu se provádí po odběru venosní srážlivé krve atomovou absorpční spektrometrií při 196 nm v upraveném supernatantu po předchozí centrifugaci při 1500 g. Supernatant se upravuje zředěním (1 : 2) roztokem 0,1 % HNO 3 v 0,1 % Tritonu X-100. Spektrofotometrická fluorescenční metoda používá jako komplexotvorné činidlo 2,3- diaminonaftalen (DAN), který je přidáván k upravenému vzorku séra. Postup je však pro stanovení biologických koncentrací málo citlivý a pro klinické laboratoře příliš komplikovaný. Fyziologické hodnoty při 37 C pro selen v séru v µmol/l jsou u dětí od 1 roku do 15 let 0,74-1,54 a u dospělých do 60 let 0,94 1,77. Stanovení nejvýznamnějších anorganických kationtů Chloridy (Cl - ), Chloridové anionty jsou hlavními ionty extracelulární tekutiny, v plasmě spolu se sodíkovými kationty udržují její osmotický tlak. V eytrocytech je koncentrace Cl - asi poloviční proti plasmě a činí 45 54 mmol/l, v intersticiální tekutině je koncentrace jen asi 1 mmol/l. Denní příjem člověka je okolo 130 260 mmol Cl - (7,6 15,2 g NaCl), nadbytek je vylučován potem a močí. V trávicím traktu je denně asi 200 mmol Cl - převedeno na HCl, která je opět resorbována v tenkém střevě. Stanovení Cl - se provádí v plné krvi (přímé měření pomocí iontově selektivní elektrody), v nehemolytickém séru, v plazmě, moči, potu i v jiných
tělních tekutinách. Vzorky jsou při 15 20 C stabilní 1 den, při 2-4 C 1 týden, při -20 C více než 1 rok. Měření koncentrace Cl - se provádí třemi standardními metodikami a to: Coulometricky pomocí přístroje chloridometru pracujícího s dvojicí stříbrných elektrod. Procházející konstantní proud uvolňuje z anody Ag +, který reaguje s Cl - v roztoku na nedisociovaný AgCl. Po vymizení Cl - nadbytek Ag + změní vodivost roztoku a mikroprocesor ukončí průchod proudu. Odečtený čas je přímo úměrný koncentraci Cl -. Přístroje jsou továrně kalibrovány a pracují s přesností ± 1,0 %. Tato metoda je referenční. Iontově selektivními elektrodami, které mají polymerní membránu s iontoměničem (např. tri-n-oktylpropylamonium chlorid) a umožňují přímé, nebo nepřímé měření koncentrace Cl - (viz měření koncentrace Na +, K + ). Tento postup dnes v klinických laboratořích převažuje. Chemickými metodami, které se dělí na titrační a spektrofotometrické. Merkurimetrická titrace je založena na reakci Cl - s Hg(NO 3 ) 2, produkující nedisociovaný chlorid rtuťnatý. Nadbytek Hg 2+ je detekován reakcí s difenylkarbazonem za vzniku fialového zbarvení. Fotometrická stanovení měří koncentraci Cl - pomocí jedno-, nebo několikastupňové reakce Cl - s různými činidly, které je možno fotometricky stanovit. Chloranilan rtuťnatý je v kyselém prostředí Cl - štěpen na kyselinu chloranilovou a její množství se po 10 min měří při 510 550 nm. Koncentrace Cl - se vypočte z kalibrační křivky. Měření koncentrace Cl - se provádí při laboratorní teplotě reakcí s roztokem Hg(SCN) 2 ve vodném methanolu, který dále obsahuje Fe(NO 3 ) 3 a Hg(NO 3 ) 2. Uvolněné thiokyanátové ionty reagují s Fe(NO 3 ) 3 za vzniku červeně zabarveného roztoku Fe(SCN) 3, jehož intenzita je přímo úměrná koncentraci Cl - a měří se při 460 500 nm spolu se standardem. K výpočtu koncentrace Cl - se používá rovnice uvedená pro výpočet koncentrace Fe 2+. Modernější metody používají jako činidlo rtuťnatou sůl 2,4,6-tri(2-pyridyl)-1,3,5- triazinu (TPTZ), které snižuje spotřebu jedovatých rtuťnatých solí na polovinu. TPTZ reaguje s Cl - ve zředěném séru za vzniku modrého barviva měřitelného při 560 600 nm. Reakce Cl - s chloristanem železitým ve zředěné HClO 4 poskytuje barevný komplex s maximy při 344 a 562 nm bez použití jedovatých rtuťnatých solí. Fyziologické hodnoty Cl - v mmol/l u dětí od 1 roku do 15 let jsou 96 108, u dospělých 15 60 let jsou 94-108, nad 60 let 98 114. Hydrogenkarbonáty (hydrouhličitany, HCO 3 - )
Hydrogenkarbonáty jsou druhými nejpočetněji zastoupenými anionty v plasmě. Při ph krve 7,4 ± 0,05 je 70 % celkového CO 2 transportováno ve formě HCO - 3 a jeho koncentrace v krvi je 24,2 mmol/l. Výpočet koncentrace HCO - 3 se zpravidla provádí na základě změření ph a pco 2 z Henderson- Hasselbachovy rovnice při sledování poruch acidobazické rovnováhy metabolického, nebo respiračního původu. Stanovení se provádí v heparinisované krvi z kapilár nebo stříkaček. Vzorky je třeba dopravovat na ledu a stanovení provést co nejrychleji. Současné analyzátory používají k měření množství uvolněného CO 2 nepřímou potenciometrickou metodu, založenou na měření změny ph pufru v indikační elektrodě. Titračně se určí alkalická rezerva zpětnou titrací NaOH po přidání známého množství HCl na neutrální indikátor (neutrální červeň, fenolová červeň, difenylkarbazon). Metoda se používá pro vyšetření duodenální šťávy. Měření koncentrace HCO - 3 enzymaticky se provádí v pufru o ph 8, který obsahuje fosfoenolpyruvátkarboxylasu (PEPC), malátdehydrogenasu (MD) a NADH. PEPC vytvoří z HCO - 3 a fosfoenolpyruvátu oxalacetát, který je MD pomocí NADH redukován na malát. Změna absorbance se měří při 340 nm. Postup se v klinických laboratořích nepoužívá. Fyziologické hodnoty HCO - 3 v mmol/l u mužů jsou 23,6 27,6 a u žen 21,8 27,2. Anorganické fosfáty (HPO 2-4, H 2 PO - 4, někdy nesprávně anorganický fosfor, P) Fosfor je v anorganické, nebo organické formě přítomen v celém lidském organismu v množství asi 600 g (19,4 molu P), z toho je 85 % vázáno v kostech jako hydroxyapatit. Plasma obsahuje 2,5 4,5 mg/l (0,81 1,45 mmol/l) anorganických fosfátů. Asi 10 % krevního fosfátu je vázáno na bílkoviny, 35 % je v Na +, Ca 2+ a Mg 2+ fosfátech, zbytek je v ionizované formě jako H 2 PO - 4 a HPO 2-4 (v poměru 1 : 4 při ph 7,4). Fosfáty se vstřebávají v tenkém střevě a v duodenu hlavně pasivní difusí, přijaté množství je závislé na obsahu v potravě. Stanovení fosforu se provádí v nehemolytickém séru nebo heparinisované plazmě. Jiné druhy plasmy nelze použít. Dále se fosfor stanovuje v ranní, nebo ve sbírané moči (okyseluje se např. 25 ml 6 mol/l HCl do 24 h sběru). Vzorky séra a plasmy se mohou uchovávat při 20 C 1 2 dny, při 4 8 C 1 týden, při -20 C jsou stabilní 1 rok. Okyselená moč (ph < 5) je stálá při 15 25 C 2 dny, při 4 8 C 6 měsíců. Měření koncentrace fosforu se provádí spektrofotometrickými metodami založenými na reakci fosfátových iontů s molybdenanem amonným v H 2 SO 4. Vzniklý fosfomolybdenanový komplex je možno fotometricky stanovit při 340 nm, nebo redukovat vhodnými redukovadly (SnCl 2, (NH 4 ) 2 Fe(SO 4 ) 2, aminonaftalensulfonová kyselina, resp. methyl-4-aminofenylsulfát) na molybdenovou modř s maximem při 600 700 nm. Další analytické modifikace využívají
reakci fosfátu s molybdenanem amonným a vanadičnanem amonným produkující žlutou kyselinu molybdátovanadátofosforečnou s maximem při 380 410 nm. Ve všech případech se reakce provádí při 37 C a po smíchání všech komponent se po 5 6 min odečítá absorbance vzorku, standardu a blanku při vhodné vlnové délce. Zbarvení je stálé až 1 h. Moč se před stanovením ředí 20-krát destilovanou vodou. Kromě uvedených metod s redukcí nebo bez redukce jsou také známé enzymatické metody (glykogenfosforylasa + fosfoglukomutasa + glukosa-6-fosfátdehydrogenasa; purinnukleosidfosforylasa + xanthinoxidasa; sacharosafosforylasa + fosfoglukomutasa + glukosa-6-fosfátdehydrogenasa), ale tyto se v klinických laboratořích nepoužívají. Koncentrace fosfátů v mmol/l se vypočte z rovnice použité pro výpočet koncentrace Fe 2+, kde c st je koncentrace fosfátů ve standardu v mmol/l. Výsledky stanovení v moči se přepočítají na látkové množství za den (du) v mmol/d podle rovnice: du (anorg. fosfáty) = c moč. ředění moče. V moč kde c moč je koncentrace anorganických fosfátů v moči v mmol/l a V moč je objem moče za 24 h v litrech. Fyziologické hodnoty při 37 C pro anorganické fosfáty v mmol/l jsou u dětí od 1 roku do 12 let 1,15-1,9; od 13 do 18 let 0,85-1,65; u dospělých do 60 let 0,70-1,60 a u dospělých nad 60 let 0,74 1,30. Literatura: 1. Kopáč, J. Lékařská laboratorní diagnostika. Turnov : Tiskárna Polygraf, s.r.o., 2004, 815 s., ISBN není uvedeno. 2. Masopust, J. Klinická Biochemie - požadování a hodnocení biochemických vyšetření část I. Praha : Karolinum, 1998, 429 s., ISBN 80-7184-648-1. 3. Masopust, J. Klinická Biochemie - požadování a hodnocení biochemických vyšetření část II. Praha : Karolinum, 1998, 395 s., ISBN 80-7184-649-X. 4. Burtis, C. A., Ashwood, E. R. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3 rd Edition. Philadelphia: W. B. Saunders Co., 1999, 1917 p., ISBN 0-7216-5610-2. 5. Greiling, H., Gressner, A. M. Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie, Dritte, neubearbeitete Auflage. Stuttgart: F. K. Schattauer Verlagsgesellschaft mbh, 1995, 1464 p., ISBN 3-7945-1548-X.