Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv STUDIUM VZTAHŮ MEZI STRUKTURU A AFIITU K ACETYLCHLIESTERÁZE U VYBRAÝCH PYRIDIIVÝCH DERIVÁTŮ Diplomová práce Hradec Králové 2006 Martin Paar 1
V úvodu své diplomové práce bych rád poděkoval paní Martině Hrabinové za její trpělivost při řešení syntetické části, Ing. Kamilu Kučovi Ph.D za odborné vedení laboratorní práce, Mgr. Danielovi Junovi Ph.D za spolupráci při řešení biochemických otázek a v neposlední řadě paní RDr. Veronice pletalové, Ph.D. za její obětavost, všestrannou pomoc a odborné připomínky ke zpracování výsledků. Tato práce vznikla za podpory projektu Grantové agentury Univerzity Karlovy, Grant č. 126/2005/B-Bio/FaF a projektu Ministerstva obrany České republiky, Grant č. FVZ0000501. 2
bsah 1. Úvod 5 2. Cíl práce 6 3. Teoretická část 7 3.1 Acetylcholinesteráza 7 3.1.1 Stavba enzymu 7 3.1.2 Lokalizace enzymu v těle a jeho funkce 8 3.2 rganofosforové sloučeniny a nervově paralytické látky 9 3.3 Symptomy otravy nervově paralytickými látkami 11 3.4 Reaktivátory acetylcholinesterázy 13 3.4.1 Tipy reaktivace AChE 13 3.4.2 Přehled pouţívaných reaktivátorů 14 3.4.3 Srukturní prvky reaktivátorů ovlivňující biologickou aktivitu AChE 15 4. Experimentální část 17 4.1 Chemická část 17 4.1.1 Syntéza monokvarterních pyridiniových derivátů 17 4.1.2 Syntéza biskvarterních pyridiniových derivátů 30 4.2 Biochemická část 37 4.2.1 Princip hodnocení reaktivace AChE 37 4.2.2 Princip hodnocení afinit heteroareniových solí 38 4.2.3 Vlastní postup měření aktivit enzymů 38 4.2.3.1 Měření aktivity intaktní AChE 40 4.2.3.2 Měření afinity reaktivátoru k intaktní AChE 40 4.2.3.3 Měření aktivity AChE inhibované organofosforovým inhibitorem 40 4.2.3.4 Měření aktivity reaktivované AChE 40 4.2.3.5 Výpočet reaktivační schopnosti testovaných reaktivátorů AChE 41 4.2.3.6 Výpočet afinit testovaných pyridiniových solí k intaktní AChE 41 5. Výsledky 42 3
6. Diskuse, Závěr 45 7. Seznam zkratek 47 8. Literatura 48 4
1. Úvod: Reaktivátory acetylcholinesterázy (AChE; EC 3.1.1.7) jsou součástí antidotních přípravků zavedených v Armádě ČR (AČR) pro léčbu intoxikací nervově paralytickými látkami (PL) typu sarin, soman, tabun nebo cyklosarin. Mezi jejich nejznámější zástupce patří obidoxim 1,3-bis(4- hydroxyiminomethylpyridinium)-2-oxapropan-dichlorid, methoxim 1,1-bis(4- hydroxyiminomethylpyridinium)-methan-dibromid a látka HI-6 1-(2- hydroxyiminomethylpyridinium)-3-(4-karbamoylpyridinium)-2-oxapropandichlorid). Jejich úkolem je štěpit vazbu vzniklou při ireverzibilní inhibici enzymu AChE fosfátem nebo fosfonátem. Ţádný z dosud syntetizovaných reaktivátorů AChE nedokáţe reaktivovat enzym inhibovaný všemi druhy PL. Proto se vědci zabývající se touto oblastí výzkumu snaţí predikovat a následně syntetizovat struktury ideálního širokospektrálního reaktivátoru AChE, který by dokázal reaktivovat enzym inhibovaný všemi typy PL. 5
2. Cíl práce: V roce 2003 byly poprvé na pracovišti katedry toxikologie fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany (KTX FVZ U) syntetizovány dva nové reaktivátory AChE. Tyto látky byly označeny kódem K027 (1-(4- hydroxyiminomethylpyridinium)-3-(4-karbamoylpyridinium)-propan-dibromid) a K048 (1-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-4-(4-karbamoylpyridinium)-butandibromid) (br.1). bě sloučeniny se liší pouze délkou spojovacího řetězce mezi dvěma kvarterními dusíky obsaţenými v jejich chemické struktuře [1,2]. a základě in vitro reaktivačních výsledků je jejich schopnost reaktivovat tabunem a pesticidy inhibovanou AChE velmi slibná [3,4]. Také jejich schopnost in vivo léčit tabunem a pesticidy intoxikované hlodavce (myš, potkan) je velmi nadějná [5,6]. Cílem mé diplomové práce je připravit různé strukturní fragmenty uvedených reaktivátorů, otestovat jejich biologické aktivity (afinitu k AChE a schopnost těchto látek reaktivovat tabunem a chlorpyrifosem inhibované AChE) a na základě získaných údajů zjistit, které strukturní fragmenty jsou zodpovědné za reaktivační schopnost předlohových látek K027 a K048. br. 1 Reaktivátory K027 a K048 H H 2 H H 2 + + CH 2 CH 2 CH 2 oxim K027 2Br - + + CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 oxim K048 2Br - 6
3. Teoretická část: 3.1 Acetylcholinesteráza 3.1.1 Stavba enzymu AChE je serinovou hydrolázou patřící do skupiny esteráz (br.2). Její význam spočívá ve štěpení neuromediátoru acetylcholinu (ACh). Má molekulovou hmotnost okolo 60 000 daltonů, její molekula má elipsoidní tvar, o velikosti přibliţně 45 60 65 angströmu, je sloţená z 12 skládaných centrálně smíchaných beta listů ohraničených 14 alfa spirálami. Kaţdý monomer má jedno katalytické centrum sloţené ze dvou částí: esteratické podjednotky obsahující katalytickou triádu a anionické podjednotky, která slouţí k navázání kvarterního dusíku ACh. Esteratická podjednotka obsahuje katalytický aparát enzymu tzv. katalytickou triádu aminokyselin Ser 200, His 440 a Glu 327. Anionická podjednotka je sloţena z aminokyselin Ser 84, Phe 330 a Phe 331. Její funkcí je přitáhnout nabitou část neuromediátoru (kvarterní dusík) jeţ vstupuje do aktivního centra enzymu. Tuto roli plní zejména zbytek aminokyseliny tryptofan. Současné krystalografické studie AChE umísťují aktivní katalytickou část, oproti dřívějším předpokladům, hlouběji dovnitř struktury enzymu [7]. br. 2 Acetylcholinesteráza 7
3.1.2 Lokalizace enzymu v těle a jeho funkce AChE je lokalizovaná v oblasti nervových synapsí a nervosvalových zakončení (nervosvalových plotének), kde hraje klíčovou roli při přenosu nervového vzruchu [8]. ACh je syntetizován z exogenně dodávaného cholinu (potravou), který je acetylován pomocí acetylkoenzymu A. Při přenosu nervového vzruchu se neuromediátor naváţe na bílkovinu synaptické membrány acetylcholinový receptor. avázáním se změní konfigurace (prostorové uspořádání) receptoru a membrána se stane propustná pro ionty, které začnou proudit do buňky a z buňky a vzniklý elektrický potenciál se dál šíří po nervovém vlákně jako elektrický impulz k další synapsi. Aby neuromediátor působil jen nezbytně nutnou dobu pro přenos vzruchu, musí být ihned po provedeném navázání a přenosu vzruchu rozloţen, coţ se děje katalytickým působením enzymu acetylcholinesterázy. Po rozloţení acetylcholinu se receptor vrací do původního stavu [8]. 8
3.2 rganofosforové sloučeniny a nervově paralytické látky rganofosforové sloučeniny se pouţívají v průmyslu jako látky povahy změkčovadel, hydraulické kapaliny, látky pro nehořlavé úpravy, ve veterinární či humánní medicíně jako léčiva nebo jako sloučeniny k výzkumu nervových funkcí. ejširšího pouţití dosáhly tyto látky v zemědělství jako insekticidy (látky k hubení hmyzu), které jsou běţně dostupné např. Metathion, Malathion, Actellic, In-stop aj. Mezi organické sloučeniny fosforu rovněţ patří nervově paralytické látky (PL), vyznačující se vysokou toxicitou vůči savcům. Jsou nejvýznamnější a nejnebezpečnější skupinou bojových chemických látek. Vyznačují se vedle vysoké toxicity rychlým nástupem účinku a průnikem do organizmu všemi branami vstupu. Jejich syntéza je poměrně snadná i levná, proto jsou vojensky i teroristicky snadno zneuţitelné. Dělí se na dvě skupiny, které jsou obecně označovány jako látky G a V [9,10]. 3.2.1 G-látky Mezi tyto látky patří: tabun (GA -ethyldimethylamidokyanofosfát) sarin (GB -isopropylmethylfluorofosfonát) cyklosarin (GF -cyklohexylmethylfluorofosfonát) soman (GD -pinakolylmethylfluorofosfonát) Jsou to bezbarvé, pohyblivé kapaliny podobné vodě bez výrazného zápachu, relativně dobře rozpustné ve vodě a dobře v organických rozpouštědlech. Je pro ně charakteristická vysoká těkavost, takţe nejpravděpodobnější branou vstupu jsou dýchací cesty. Tyto látky při pouţití v terénu vydrţí bez ztráty účinku (toxicity) 12-24 hodin. 3.2.2 V-látky ejvětšího vojenského významu dosáhla látka VX -ethyl-s-(2- diisopropylaminoethyl)methylthiofosfonát. V chemicky čistém stavu je to bezbarvá látka, méně pohyblivá, bez výraznějšího zápachu. Je pro ni 9
charakteristická nízká těkavost, takţe vydrţí ve vodě a volném terénu dlouhou dobu (týdny aţ měsíce). Ve vodě je špatně rozpustná, zato v organických rozpouštědlech a tucích je rozpustná dobře. br. 3 Chemické struktury nejznámějších nervově paralytických látek P P F F P sarin cyklosarin tabun P F P S soman VX 10
3.3 Symptomy otravy nervově paralytickými látkami PL ovlivňují cholinergní přenos nervového vzruchu, který je na synapsi zprostředkován chemickou látkou (neuromediátorem) acetylcholinem (ACh). Prakticky ireverzibilně inhibují AChE. K inhibici dochází následkem vzniku kovalentní vazby mezi organofosforovou sloučeninou a serinovým hydroxylem v aktivním místě enzymu [11]. br. 4 Inhibice acetylcholinesterázy sarinem F P AChE H + H 3 C AChE P CH 3 Intaktní enzym sarin Inhibovaný enzym Jestliţe je tento enzym inhibován, nemůţe plnit svou fyziologickou úlohu, tedy hydrolyzovat a tím inaktivovat acetylcholin uvolňovaný na synapsích a nervosvalových zakončeních. Jeho hromaděním v těchto místech dochází k trvalému dráţdění cholinergních receptorů a narušení cholinergního přenosu, coţ se projeví řadou příznaků jako je mióza, zvýšená sekrece ţláz s vnější sekrecí, bronchospasmus, křeče a ochrnutí dýchacího svalstva [10]. Těmto klinickým příznakům intoxikace PL v důsledku nadměrného dráţdění cholinergních receptorů se také říká akutní cholinergní krize [8]. V případě těţší intoxikace dochází k následnému selhání ţivotních funkcí zasaţeného organismu [12]. Ke smrti dochází v důsledku zástavy dýchání a selhání kardiovaskulárního systému.[7] U všech organických sloučenin fosforu včetně PL byly pozorovány i účinky nesouvisející přímo se zásahem do cholinergního přenosu nervového vzruchu, označované jako nespecifické nebo necholinergní účinky PL. a rozdíl od cholinergních účinků PL, které se klinicky projeví bezprostředně po zasaţení, nespecifické účinky PL se obvykle manifestují později. Mezi nejvýznamnější patří účinek charakterizovaný obecnou stresogenní reakcí, zásah do metabolismu nukleových kyselin a bílkovin vedoucí aţ k mutagennímu efektu, ovlivnění imunity a hepatotoxický efekt. Významný je i podíl nespecifických účinků PL 11
vedoucích k morfologickému poškození nervové tkáně, které patří mezi velmi závaţné důsledky akutní intoxikace PL. Bezprostřední příčinou poškození neuronů se podle posledních výzkumů jeví nadměrné vyplavení glutamátu v důsledku stimulace glutamátergních neuronů obsahujících jiný typ receptorů (MDA). Aktivace MDA receptorů vede k nadměrné akumulaci vápníku uvnitř neuronů a následné neuronální smrti [8]. 12
3.4 Reaktivátory acetylcholinesterázy 3.4.1 Typy reaktivace AChE Aktivita AChE můţe být obnovena třemi způsoby syntézou nového enzymu, spontánní reaktivací a indukovanou reaktivací [14]. Prvním výše zmíněným způsobem je syntéza enzymu de novo. Tento proces je velmi pomalý (100% restituce nastává během 50 100 dnů) [15]. Dalším způsobem obnovy funkce enzymu je proces spontánní reaktivace. Dochází při ní k reakci inhibovaného enzymu s vodou za uvolnění volného enzymu. Avšak i tento proces je velmi pomalý (př. VX 0,5 aţ 1 % za hodinu) [16]. br. 6 Schéma spontánní reaktivace sarinem inhibované acetylcholinesterázy AChE P CH 3 + H 2 H P H 3 C + AChE H inhibovaný enzym sarin volný enzym Třetím způsobem, jak obnovení aktivity inhibované AChE dosáhnout, je působení nukleofilu silnějšího neţ voda, schopného odštěpit kovalentně vázaný inhibitor. Tuto reaktivaci označujeme jako indukovanou a látky s touto schopností označujeme jako reaktivátory AChE [17]. br. 7 Schéma reaktivace sarinem inhibované acetylcholinesterázy pomocí nukleofilu (u - ) AChE P CH 3 u P + u - H 3 C + AChE H inhibovaný enzym volný enzym Dalším procesem, který ovlivňuje znovuobnovení aktivity cholinesteráz je proces stárnutí (tzv. aging). Dochází při něm k dealkylaci esterové skupiny inhibitoru AChE za vzniku nereaktivovatelného enzymu [8]. 13
br 8 Schéma stárnutí sarinem inhibované acetylcholinesterázy AChE P CH 3 H AChE P + H 2 CH 3 + inhibovaný enzym zestárlý enzym odštěpený alkohol Rychlost tohoto procesu je závislá zejména na substituentech na uhlíku C1 esterové skupiny inhibitoru AChE [16]. Tab. 1 Poločasy stárnutí nejznámějších PL Inhibitor AChE T 1/2 soman 2-10 min sarin 3-10 h tabun 13 h cyklosarin 40 h 3.4.2 Přehled používaných reaktivátorů Pro převedení neaktivní inhibované formy enzymu do původního stavu se uţívá reaktivátorů AChE, zjednodušeně označovaných jako oximy. Toto obecné označení vzešlo z faktu, ţe tyto látky mají v molekule oximovou skupinu, jeţ je za ph lidské krve částečně disociována a vzniklý oximátový anion je pak vlastním nukleofilem štěpícím vazbu mezi inhibitorem a enzymem [13]. br. 5 Reaktivace sarinem-inhibované acetylcholinesterázy - AChE P CH + 3 + Reaktivace AChE H + + P CH 3 inhibovaný reaktivátor reaktivovaný reaktivátor- enzym AChE enzym inhibitor 14
ejběţnějšími dosud pouţívanými reaktivátory ve světě jsou pralidoxim (2-PAM, 1-methyl-2-hydroxyiminomethylpyridinium-jodid) podává se v dávce 500 1000 mg i.m., obidoxim (Toxogonin, 1,3-bis(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-2-oxapropan-dichlorid), podává se v dávce 200 250 mg i.m., trimedoxim (TMB-4, 1,3-bis(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-propandibromid), podává se v dávce 1000 mg i.m., a látka HI-6 (1-(2- hydroxyiminomethylpyridinium)-3-(4-karbamoylpyridinium)-2-oxapropandichlorid), podává se v dávce 800 mg i.m. [18]. br. 9 ejznámější zástupci reaktivátorů AChE H H + CH 3 Cl - H + + CH 2 CH 2Cl - 2 pralidoxim obidoxim H H H 2 + + 2Br - CH 2 CH 2 CH 2 Trimedoxim H + + CH 2 CH 2Cl - 2 HI-6 3.4.3 Strukturní prvky reaktivátorů AChE ovlivňující jejich biologickou aktivitu Struktura reaktivátorů AChE zahrnuje několik základních znaků, které ovlivňují rychlost a účinnost reaktivačního procesu. Prvním základním znakem je přítomnost kvarterního dusíku v molekule reaktivátoru. becně se látky obsahující ve své molekule kvarterní dusík vyznačují zvýšenou afinitou jak k intaktnímu, tak inhibovanému enzymu. Látky, jeţ obsahují dva kvarterní dusíky (obidoxim, HI-6) se vyznačují vyšší afinitou k AChE v porovnání s monokvarterními (pralidoxim). Další strukturní vlastností reaktivátorů AChE je přítomnost oximové (převáţně aldoximové) skupiny, která je v prostředí lidského 15
organizmu disociována za vzniku oximátového aniontu, který je vlastním nukleofilním činidlem štěpícím ireverzibilní vazbu mezi organofosforovým inhibitorem a enzymem. Pro biskvarterní reaktivátory AChE je rovněţ důleţitým faktorem ovlivňujícím jejich reaktivační schopnost tvar a délka spojovacího řetězce mezi oběma kvarterními dusíky. Ukázalo se, ţe nejvhodnější délkou je tří- nebo čtyřčlenný řetězec. 16
4. Experimentální část: 4.1 Chemická část Teploty tání syntetizovaných sloučenin jsem měřil na bloku Boetius a nebyly korigovány. Spektra MR byla změřena na přístroji Varian Gemini 300 (pracovní frekvence 300,08 MHz pro 1 H). Chemické posuny jsou uvedeny v jednotkách ppm a jsou vztaţeny k tetramethylsilanu. Interakční konstanty J jsou vyjádřeny v Hz. Elementární analýzy (C, H,, ) pro nově syntetizované látky byly změřeny na přístroji Perkin-Elmer 2400. TLC analýzy jsem dělal na deskách DC-Alufolien Cellulose F (mobilní fáze - n-butanol: kyselina octová: voda - 5 : 1 : 2; detekce - Dragendorfovo činidlo). Pouţité chemikálie v kvalitě čistý byly zakoupeny od firmy Fluka (methyljodid, ethyljodid, propylbromid, butylbromid, 1,3-dibrompropan, 1,4- dibrombutan, isonikotinamid), od firmy Sigma-Aldrich (chlorpyrifos), od firmy Jan Kulich (ethanol bezvodý, aceton, chloroform, dimethylformamid, kyselina octová, acetonitril, diethylether). 4.1.1 Syntéza monokvarterních pyridiniových derivátů Monokvarterní deriváty jsem syntetizoval dle obecného schématu znázorněného na obr. 10. br. 10 Schéma přípravy monokvarterních derivátů pyridinu Z Z R - X R X R : CH 3, CH 2 CH 3, CH 2 CH 2 Br(I), CH 2 CH 2 CH 3, CH 2 CH 2 CH 2 Br, CH 2 CH 2 CH 2 CH 3, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br X : I, Br Z : CH=H, CH 2 17
1-methyl-4-hydroxyiminomethylpyridinium-jodid (K024) H CH 3 I Aceton reflux I H C 8 H 11 I 2 Mol. Wt.: 278,09 1,00 g (8,19 10-3 mol) 4-pyridinaldoximu jsem rozpustil v 50 ml acetonu. Poté jsem přidal 1,16 g (9,64 10-3 mol) methyljodidu a nechal reagovat za stálého míchaní za refluxu. Krystaly začaly vznikat po 1 hodině. Po 4 hodinách jsem odfiltroval první podíl předpokládané výsledné látky, který jsem promyl 100 ml etheru. V odsávací baňce tak vznikl i podíl druhý. Výsledný výtěţek reakce byl 0,97 g, coţ činilo 45 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil u prvního podílu na 177-180 C a u druhého podílu na 179-180 C. 1 H MR spektra odpovídají spektrům publikovaným v literatuře [20]. 18
1-methyl-4-karbamoylpyridinium-jodid (K025) H 2 CH 3 I Aceton reflux I C 8 H 11 I 2 Mol. Wt.: 278,09 H 2 1,01 g (8,28 10-3 mol) isonikotinamidu jsem rozpustil v 50 ml acetonu. Poté jsem přidal 1,16 g (9,64 10-3 mol) methyljodidu a nechal reagovat za stálého míchaní za refluxu. Krystaly začaly vznikat po 1 hodině. Po přerušení zahřívání a míchání, které trvalo asi 20 hodin jsem všechny vytvořené krystaly odfiltroval a promyl 100 ml etheru.výsledný výtěţek reakce byl 1,49 g, coţ činilo 68 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 269-270 C (lit. 21 : 268-269 C). 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,15 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,65 (bs, 1H, H 2 ), 8,39 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,26 (bs, 1H, H 2 ), 4,39 (s, 3H, CH 3 ) ppm. 19
1-ethyl-4-hydroxyiminomethylpyridinium-jodid (K076) H CH 3 CH 2 I Aceton reflux I H C 8 H 11 I 2 Mol. Wt.: 278,09 1,02 g (8,36 10-3 mol) 4-pyridinaldoximu jsem rozpustil v 50 ml acetonu. Poté jsem přidal 1,28 g (9,84 10-3 mol) ethyljodidu a nechal reagovat za stálého míchaní za refluxu. Vznik poţadovaného produktu jsem v průběhu reakce sledoval pomocí tenkovrstvé chromatografie. Po 6 hodinách a 40 minutách jsem reakci ukončil. Do roztoku s výslednou látkou jsem přidal 50 ml etheru. Vzniklé krystaly jsem odsál a vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 1,15 g, coţ činilo 50 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření výsledného produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 129-132 C. Pro C 8 H 11 I 2 (278,09) spočítané poměry elementů činí: 34,55 % C, 3,99 % H, 10,07 % a nalezené: 34,81 % C, 4,08 % H, 10,15 %. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,07 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,43 (s, 1H, CH=H), 8,23 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 4,65-4,55 (m, 2H, CH 2 ), 1,53 (t, 3H, CH 3 ) ppm. 20
1-ethyl-4-karbamoylpyridinium-jodid (K080) H 2 CH 3 CH 2 I Aceton reflux I C 8 H 11 I 2 Mol. Wt.: 278,09 H 2 1,02 g (8,36 10-3 mol) 4-pyridinaldoximu jsem rozpustil v 50 ml acetonu. Poté jsem přidal 1,28 g (9,84 10-3 mol) ethyljodidu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 60 C pod zpětným chladičem. Po 2 hodinách začaly vznikat první krystaly. Po 8 hodinách reagování jsem reakci ukončil a krystaly odsál, promyl pomocí 50 ml etheru a vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 0,42 g, coţ činilo 18 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření výsledného produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 219-221 C. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,28 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,65 (bs, 1H, H 2 ), 8,42 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,27 (bs, 1H, H 2 ), 4,76-4,62 (m, 2H, CH 2 ), 1,56 (t, 3H, CH 3 ) ppm. 21
1-propyl-4-karbamoylpyridinium-bromid (K081) H 2 Acetonitril CH 3 CH 2 CH 2 I 70 C Br C 9 H 13 Br 2 Mol. Wt.: 245,12 H 2 2,00 g (8,2 10-2 mol) isonikotinamidu jsem rozpustil v 50 ml acetonitrilu. Poté jsem přidal 2,21 g (1,8 10-2 mol) propylbromidu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 70 C pod zpětným chladičem. Po 12 hodinách začaly vznikat první krystaly. Po 20 hodinách jsem reakci ukončil a krystaly vysušil. Dále jsem provedl rekrystalizaci z bezvodého ethanolu. Promyl získané krystaly acetonem a vysušil (první podíl). Druhý podíl vznikl po přilití 50 ml etheru k roztoku zbylému po rekrystalizaci. Souhrnná hmotnost obou podílů byla 1,39 g, coţ činilo 35 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření výsledného produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil u prvního podílu na 140-145 C a u druhého podílu na 145-147 C. Pro C 9 H 13 Br 2 (245,12) spočítané poměry elementů činí: 44,10 % C, 5,35 % H, 11,43 % a naměřené 41,60 % C, 6,07 % H, 10,80 %. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,30 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,72 (bs, 1H, H 2 ), 8,46 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,29 (bs, 1H, H 2 ), 4,64 (t, 2H, CH 2 ), 2,03-1,87 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 3 ), 0,88 (t, 3H, CH 3 ) ppm. 22
1-propyl-4-hydroxyiminomethylpyridinium-jodid (K077) H CH 3 CH 2 CH 2 I Acetonitril 70 C I H C 9 H 13 I 2 Mol. Wt.: 292,12 3,00 g (2,46 10-2 mol) 4-pyridinaldoximu jsem rozpustil v 50 ml acetonitrilu. Poté jsem přidal 4,18 g (2,46 10-2 mol) propyljodidu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 70 C pod zpětným chladičem. Po 10 hodinách reakce se objevily krystaly, které jsem odsál (první podíl). Zbylý roztok jsem zahustil na vakuové odparce. Po ochlazení na teplotu 5 C vznikly krystaly druhého podílu. Hmotnost prvního podílu byla 3,43 g a druhého 0,49 g, coţ činilo 55 % z celkového moţného výtěţku reakce. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil u prvního podílu na 134-138 C a u druhého podílu na 132-136 C. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,04 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,44 (s, 1H, CH=H), 8,24 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 4,54 (t, 2H, CH 2 ), 2,00-1,85 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 3 ), 0,88 (t, 3H, CH 3 ) ppm. 23
1-butyl-4-hydroxyiminomethylpyridinium-bromid (K078) H CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 Br Acetonitril 70 C Br H C 10 H 15 Br 2 Mol. Wt.: 259,14 2,0 g (8,2 10-2 mol) 4-pyridinaldoximu jsem rozpustil v 60 ml acetonitrilu. Poté jsem přidal 2,25 g (1,8 10-2 mol) butylbromidu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 70 C pod zpětným chladičem. Po 7,5 hodinách jsem do roztoku přidal 100 ml etheru. Vytvořila se olejovitá fáze. Po 7 dnech stání vznikly z olejovité fáze krystaly, které jsem odfiltroval a následně rekrystaloval v ethanolu. Rekrystalizovaný produkt jsem promyl 50 ml acetonu a vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 1,22 g, coţ činilo 29 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 141-144 C (lit. 21 : 138-139 C). Pro C 10 H 15 Br 2 (259,14) spočítané poměry elementů činí: 46,35 % C, 5,83 % H, 10,81 % a nalezené 46,50 % C, 6,19 % H, 10,92 %. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,09 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,44 (s, 1H, CH=H), 8,24 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 4,59 (t, 2H, CH 2 ), 1,95-1,82 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 1,36-1,22 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 0,91 (t, 3H, CH 3 ) ppm. 24
1-butyl-4-karbamoylpyridinium-bromid (K082) H 2 CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 Br Ethanol reflux Br C 10 H 15 Br 2 Mol. Wt.: 259,14 H 2 2,0 g (8,2 10-2 mol) isonikotinamidu jsem rozpustil v 40 ml ethanolu. Poté jsem přidal 4,5 g (3,3 10-2 mol) butylbromidu a nechal reagovat za stálého míchání za refluxu. Po 36 hodinách jsem odfiltroval produkt, který jsem rekrystaloval z ethanolu a vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 0,48 g, coţ činilo 11 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 179-185 C. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,31 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,71 (bs, 1H, H 2 ), 8,45 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,28 (bs, 1H, H 2 ), 4,67 (t, 2H, CH 2 ), 1,98-1,83 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 1,36-1,21 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ), 0,90 (t, 3H, CH 3 ) ppm. 25
1-brom-3-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)propan-bromid (K006) H BrCH 2 CH 2 CH 2 Br Acetonitril reflux Br Br C 9 H 12 Br 2 2 Mol. Wt.: 324,01 H 3,00 g (2,46 10-2 mol) 4-pyridinaldoximu jsem rozpustil v 100 ml acetonitrilu. Poté jsem přidal 4,95 g (2,46 10-2 mol) 1,3-dibrompropanu a nechal reagovat za stálého míchaní za refluxu. Po 34 hodinách jsem odfiltroval vzniklé krystaly, které jsem rekrystaloval z acetonitrilu. Tenkovrstvá chromatografie ukázala, ţe poţadovaný produkt byl znečištěn, a proto jsem rekrystaloval ještě 4 z butanolu. ásledně jsem produkty vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 1,0 g, coţ činilo 13 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 182-185 C. Pro C 9 H 12 Br 2 2 (324,01) spočítané poměry elementů činí: 33,36 % C, 3,73 % H, 8,65 % a nalezeno: 33,42 % C, 3,72 % H, 8,43 %. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS-d 6 ): 2,48 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 Br); 3,57 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 Br, J = 6,6 Hz); 4,68 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 Br, J = 7,15 Hz); 8,23 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,87 Hz); 8,43 (s, 1H, CH=H); 9,06 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,0 Hz) ppm. 26
1-brom-3-(4-karbamoylpyridinium)propan-bromid (K083) H 2 Br H 2 Acetonitril BrCH 2 CH 2 CH 2 Br Br 75 C C 9 H 12 Br 2 2 Mol. Wt.: 324,01 14,8 g (1,2 10-1 mol) isonikotinamidu jsem rozpustil v 520 ml acetonitrilu. Poté jsem přidal 121,0 g (6 10-1 mol) 1,3-dibrompropanu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 75 C pod zpětným chladičem. Po 8 hodinách jsem odfiltroval krystaly a promyl acetonem. Filtrát jsem nechal dále reagovat. Po 19,5 hodinách jsem odfiltroval druhý podíl. Poté jsem produkty vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 33,9 g, coţ činilo 86 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření výsledného produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil u prvního podílu na 176-180 C a u druhého podílu na 178-181 C. Pro C 9 H 12 Br 2 2 (324,01) spočítané poměry elementů činí: 33,36 % C, 3,73 % H, 8,65 % nalezeno: 33,53 % C, 3,76 % H, 8,53 %. 1 H MR spektrum ( 300MHz, DMS-d 6 ): 2,49 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 Br); 3,57 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 Br, J = 6,6 Hz); 4,73 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 Br, J = 7,15 Hz); 8,27 (s, 1H, CH 2 ); 8,42 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,6 Hz); 8,66 (s, 1H, CH 2 ); 9,22 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,88 Hz) ppm. 27
1-brom-4-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)butan-bromid (K079) BrCH 2 CH 2 CH 2 CH 3 Br H Acetonitril Br 75 C Br C 10 H 14 Br 2 2 Mol. Wt.: 338,04 H 5,0 g (4,1 10-2 mol) 4-pyridinaldoximu jsem rozpustil v 250 ml acetonitrilu. Poté jsem přidal 17,7 g (8,2 10-2 mol) 1,4-dibrombutanu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 75 C pod zpětným chladičem. Po 47 hodinách jsem odfiltroval krystaly. Tenkovrstvá chromatografie potvrdila, ţe monokvarterní látka převaţuje nad biskvarterní. Tyto krystaly jsem za horka vyčistil v acetonitrilu, zfiltroval a promyl etherem. Za 1 hodinu po ochlazení roztoku na 5 C vznikly čisté krystaly. Výsledný výtěţek reakce byl 9,67 g, coţ činilo 70 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření výsledného produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil u prvního podílu na 147-154 C a u druhého podílu na 145-150 C. Pro C 10 H 14 Br 2 2 (338,04) spočítané poměry elementů činí: 35,53 % C, 4,17 % H, 8,29 % a nalezené: 36,82 % C, 4,46 % H, 9,07 %. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,07 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 8,44 (s, 1H, CH=H), 8,25 (d, 2H, J = 6,0, PyrH), 4,63 (t, 2H, CH 2 Br), 3,57 (t, 2H, CH 2 ), 2,09-1,97 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br), 1,88-1,76 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br) ppm. 28
1-brom-4-(4-karbamoylpyridinium)butan-bromid (K049) H 2 Br H 2 Acetonitril BrCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br Br 75 C C 10 H 14 Br 2 2 Mol. Wt.: 338,04 14,8 g (1,2 10-1 mol) isonikotinamidu jsem rozpustil v 520 ml acetonitrilu. Poté jsem přidal 100,0 g (8,2 10-1 mol) 1,4-dibrombutanu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 75 C pod zpětným chladičem. Po 11 hodinách jsem odfiltroval vzniklé krystaly. Ty jsem za horka vyčistil v acetonitrilu a zfiltrované krystaly promyl etherem. Ve filtrátu vznikl druhý podíl, který jsem opět odfiltroval. Provedl jsem rekrystalizaci z acetonitrilu a produkty vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 6,86 g, coţ činilo 17 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření výsledného produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil u prvního podílu na 154-157 C a u druhého podílu na 156-159 C. Pro C 10 H 14 Br 2 2 (338,04) spočítané poměry elementů činí: 35,53 % C, 4,17 % H, 8,29 % a nalezené: 35,34 % C, 4,12 % H, 8,10 %. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS-d 6 ): 1,80 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br); 2,03 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br); 3,53 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br, J = 6,6 Hz); 4,71 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br, J = 7,15 Hz); 8,26 (s, 1H, CH 2 ); 8,45 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,6 Hz); 8,70 (s, 1H, CH 2 ); 9,30 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,88 Hz) ppm. 29
4.1.2 Syntéza biskvarterních pyridiniových derivátů Biskvarterní symetrické pyridiniové sole jsem syntetizoval postupem naznačeným na obr. 11. br. 11 Schéma syntézy biskvarterních symetrických reaktivátorů AChE Z Z Z Br(CH 2 ) n Br CH 2 (CH 2 )nch 2 2Br Z : CH=H, CH 2 n : 1-2 Asymetrické biskvarterní deriváty pyridinu jsem připravil postupnou kvarternizací přes monokvarterní meziprodukty (br. 12). br. 12 Schéma syntézy biskvarterních asymetrických reaktivátorů AChE Z Z : CH=H Y : CH 2 n : 1-2 Br(CH 2 ) n Br Z Br CH 2 (CH 2 ) n CH 2 Br Y Z Y 2Br CH 2 (CH 2 ) n CH 2 30
1,4-bis(4- hydroxyiminomethylpyridinium)butan-dibromid (K074) H H H BrCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br DMFA 80 C 2Br CH 2 - CH 2 - CH 2 - CH 2 C 16 H 20 Br 2 4 2 Mol. Wt.: 460,16 10,0 g (8,2 10-2 mol) 4-pyridinaldoximu jsem rozpustil v 60 ml dimethylformamidu. Poté jsem přidal 6,9 g (3,19 10-2 mol) 1,4-dibrombutanu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 80 C pod zpětným chladičem. Po 1,5 hodině začaly vznikat první krystaly. Po dalších 3 hodinách jsem vzniklé krystaly odfiltroval a promyl etherem. Poté jsem produkt vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 12,4 g, coţ činilo 84 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 235-238 C (lit. 21 : 239-241 C). 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,09 (d, 4H, J = 6,0, PyrH), 8,45 (s, 2H, CH=H), 8,25 (d, 4H, J = 6,0, PyrH), 4,66 (t, 4H, CH 2 ), 2,04-1,89 (m, 4H, CH 2 CH 2 ) ppm. 31
1,4-bis(4-karbamoylpyridinium)butan-dibromid (K085) H 2 H 2 H 2 BrCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Br DMFA 75 C 2Br CH 2 - CH 2 - CH 2 - CH 2 C 16 H 20 Br 2 4 2 Mol. Wt.: 460,16 10,00 g (8,2 10-2 mol) isonikotinamidu jsem rozpustil v 60 ml dimethylformamidu. Poté jsem přidal 6,90 g (3,19 10-2 mol) 1,4-dibrombutanu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 75 C pod zpětným chladičem. Po 1 hodině začaly vznikat první krystaly. Po dalších 5,5 hodinách jsem vzniklé krystaly odfiltroval a promyl etherem. Poté jsem produkt vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 9,8 g, coţ činilo 66 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 295-298 C. Pro C 16 H 20 Br 2 4 2 (460,16) spočítané poměry elementů činí: 41,76 % C, 4,38 % H, 12,18 % a nalezené: 41,42 % C, 4,76 % H, 12,06 %. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,31 (d, 4H, J = 6,0, PyrH), 8,72 (bs, 2H, H 2 ), 8,47 (d, 4H, J = 6,0, PyrH), 8,31 (bs, 2H, H 2 ), 4,74 (t, 4H, CH 2 ), 2,08-1,91 (m, 4H, CH 2 CH 2 ) ppm. 32
1,3-bis(4-hydroxyiminomethylpyridinium)propan-dibromid (K018) H H H BrCH 2 CH 2 CH 2 Br DMFA 75 C 2Br CH 2 - CH 2 - CH 2 C 15 H 18 Br 2 4 2 Mol. Wt.: 446,14 5,00 g (4,09 10-2 mol) 4-pyridinaldoximu jsem rozpustil v 30 ml dimethylformamidu. Poté jsem přidal 4,14 g (2,05 10-2 mol) 1,3-dibrompropanu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 75 C pod zpětným chladičem. Po 4 hodinách jsem odfiltroval vzniklé krystaly a promyl etherem. Tenkovrstvá chromatografie ukázala přítomnost monokvarterní látky, proto jsem nechal reakční směs dále reagovat ještě s 3,0 g 4-pyridinaldoximu. Po dalších 8 hodinách jsem reakci ukončil a odfiltroval krystaly, které jsem promyl 50 ml etheru. Poté jsem produkt vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 4,84 g, coţ činilo 53 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 232-235 C (lit. 21 : 238-241 C). 1 H MR spektra odpovídají spektrům publikovaným v literatuře: [22] 33
1,3-bis(4-karbamoylpyridinium)propan-dibromid (K084) H 2 H 2 H 2 BrCH 2 CH 2 CH 2 Br DMFA 75 C 2Br CH 2 - CH 2 - CH 2 C 15 H 18 Br 2 4 2 Mol. Wt.: 446,14 5,00 g (4,09 10-2 mol) isonikotinamidu jsem rozpustil v 30 ml dimethylformamidu. Poté jsem přidal 4,14 g (2,05 10-2 mol) 1,3-dibrompropanu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 75 C pod zpětným chladičem. Po 2 hodinách jsem odfiltroval vzniklé krystaly a promyl etherem. Tenkovrstvá chromatografie ukázala přítomnost monokvarterní látky, a proto jsem krystaly rekrystaloval z butanolu. Poté jsem produkt vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 2,75 g, coţ činilo 30 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 269-273 C (lit. 21 : 265 C). 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS d 6 ): δ (ppm) 9,35 (d, 4H, J = 6,0, PyrH), 8,75 (bs, 2H, H 2 ), 8,51 (d, 4H, J = 6,0, PyrH), 8,32 (bs, 2H, H 2 ), 4,83 (t, 4H, CH 2 ), 2,79-2,63 (m, 4H, CH 2 CH 2 ) ppm. 34
1-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-4-(4-karbamoylpyridinium)butandibromid (K048) H H 2 H 2 H Acetonitril Br 75 C 2Br CH 2 - CH 2 - CH 2 - CH 2 Br C 16 H 20 Br 2 4 2 Mol. Wt.: 460,16 2,00 g (5,9 10-3 mol) 1-brom-4-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)butanbromidu (K079) jsem rozpustil v 50 ml acetonitrilu. Poté jsem přidal 0,72 g (5,9 10-3 mol) isonikotinamidu a nechal reagovat za stálého míchaní při teplotě 75 C pod zpětným chladičem. Po 26 hodinách jsem odfiltroval vzniklé krystaly. Tenkovrstvá chromatografie ukázala nečistoty v podobě výchozích látek. Proto jsem látku rekrystaloval z acetonitrilu a následně vysušil. Výsledný výtěţek reakce byl 1,37 g, coţ činilo 50 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil na 248-250 C (lit. 21 : 252-256 C). Pro C 16 H 20 Br 2 4 2 (460,16) spočítané poměry elementů činí: 41,76 % C, 4,38 % H, 12,18 % a nalezené: 41,65 % C, 4,36 % H, 11,90 %. 1 H MR spektrum ( 300 MHz, DMS-d 6 ): 1,97 (m, 4H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ); 4,67 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2, J = 7,15 Hz); 4,76 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 CH 2, J = 7,15 Hz); 8,24 (m, 3H, 2 Ph-H, CH 2 ); 8,45 (m, 3H, 2 Ph-H, CH=H); 8,73 (s, 1H, CH 2 ); 9,12 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,6 Hz); 9,34 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,32 Hz) ppm. 35
1-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-3-(4-karbamoylpyridinium)propandibromid (K027) HH 2 H 2 H Ethanol Br reflux 2Br CH 2 - CH 2 - CH 2 Br C 15 H 18 Br 2 4 2 Mol. Wt.: 446,14 8,45 g (2,61 M 10-2 mol) 1-brom-3-(4-hydroxymethylpyridinium)propanbromidu (K006) jsem rozpustil v 200 ml ethanolu. Poté jsem přidal 4,75 g (3,89 10-2 mol) isonikotinamidu a nechal reagovat za stálého míchaní za refluxu. Po 18 hodinách jsem odfiltroval první vzniklé krystaly. Tenkovrstvá chromatografie ukázala znečištění výchozími látkami. Proto jsem produkt rekrystaloval z ethanolu (první podíl). dfiltrované monokvarterní látky a filtrát jsem nechal ještě reagovat 15 hodin a odfiltroval druhý podíl. Tenkovrstvá chromatografie druhého podílu ukázala znečištění monokvarterní látkou a proto jsem provedl rekrystalizaci z ethanolu. Poté jsem oba podíly vysušil. Souhrnná hmotnost produktů byla 5,4 g, coţ činilo 83 % z celkového moţného výtěţku. Pro ověření výsledného produktu jsem pouţil tenkovrstvou chromatografii a změřil jsem teplotu tání, kterou jsem stanovil u prvního podílu na 217-220 C a u druhého podílu na 227-229 C (lit. 21 : 214-217 C). Pro C 15 H 18 Br 2 4 2 (446,14) spočítané poměry elementů činí: 38,08% C, 4,47% H, 11,84% a nalezené: 38,16% C, 4,49% H, 11,61%. 1 H MR spektrum (300 MHz, DMS-d 6 ): 2,68 (m, 2H, CH 2 CH 2 CH 2 ); 4,74 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2, J = 7,15 Hz); 4,82 (t, 2H, CH 2 CH 2 CH 2, J = 7,15 Hz); 8,27 (m, 3H, 2 Ph-H, CH=H); 8,48 (m, 3H, 2 Ph-H, CH 2 ); 8,74 (s, 1H, CH 2 ); 9,12 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,61 Hz); 9,34 (d, 2H, 2 Ph-H, J = 6,32 Hz) ppm. 36
4.2 Biochemická část 4.2.1 Princip hodnocení reaktivace AChE AChE štěpí přidaný substrát acetylcholin-jodid (AChI) za vzniku cholinjodidu (ChI) a kyseliny octové (AA) (br. 13). br. 13 Schéma štěpení acetylcholin jodidu H 3 C CH 2 CH 2 CH 2 C CH 3 AChE H 3 C CH 2 CH 2 CH 2 H CH 3 CH CH 3 I CH 3 I AChI ChI AA Pomocí ph-statu je udrţováno ph = 8 dotitrováváním uvolněné kyseliny octové 10-2 M roztokem ah. Spotřeba ah se rovná mnoţství kyseliny octové, která vznikla rozkladem AChI enzymem. Při reakci AChE s nervově paralytickou látkou či pesticidem se sniţuje aktivita AChE (ireversibilní inhibice enzymu). Je-li aktivita AChE sníţena, sníţí se i mnoţství kyseliny octové vzniklé při rozkladu AChI. Při titraci se tak sníţí i spotřeba roztoku ah (br. 14). br. 14 Schéma inhibice AChE tabunem AChE H P C HC P AChE tabun inhibovaná AChE Za tohoto předpokladu je moţné provést zkoušku reaktivačních schopností syntetizovaných látek. Inhibovaná AChE reaguje s oximátovým aniontem reaktivátoru AChE. Touto reakcí dochází k reaktivaci fosforylovaného enzymu, který pak můţe dále rozkládat AChI na kyselinu octovou a cholin a plnit tak opět svou fyziologickou funkci v organismu (br. 15). 37
br. 15 Schéma reaktivace AChE inhibované tabunem P reaktivátor C H R AChE inhibovaná AChE AChE reaktivovaná AChE P C R H komlex (tabun-reaktivátor) 4.2.2 Princip hodnocení afinit heteroareniových solí k AChE Afinitu syntetizovaných látek k AChE jsem testoval standardním in vitro pokusem. Sledoval jsem vliv koncentrace testovaných látek v reakčním médiu na aktivitu AChE. Afinita heteroareniových solí k AChE je reprezentována disociační konstantou enzym-inhibitor komplexu (K DIS ). Vyšší hodnota K DIS odpovídá úbytku afinity heteroareniových solí k enzymu. Pomocí ph-statu je udrţováno ph 8 dotitrováváním uvolněné kyseliny octové 10-2 M roztokem ah. Spotřeba ah se rovná mnoţství kyseliny octové, která vznikla rozkladem AChI enzymem. Při reakci AChE s inhibitorem se sniţuje aktivita AChE. Je-li aktivita AChE sníţena, sníţí se i mnoţství kyseliny octové vzniklé při rozkladu AChI. Při titraci se tak sníţí i spotřeba roztoku ah 4.2.3 Vlastní postup měření aktivit enzymů Chemikálie: Hydroxid sodný Roztok ah jsem připravil naředěním 50% roztoku ah (M v = 39,99 g.mol -1 ) a) 10-2 M roztok ah na titraci kyseliny octové. b) 10-1 M roztok ah na dotitrování 10-2 M roztoku oximu. 38
Acetylcholin-jodid 10-2 M roztok AChI (M v = 273,1 g.mol -1 ) jsem připravil rozpuštěním 0,55 g AChI ve 100 ml H 2. Acetylcholinesteráza (AChE) Jako zdroj enzymu mi slouţil homogenát z mozků laboratorního potkana (kmen Wistar). Uspaná zvířata byla usmrcena vykrvením z karotidy, mozek byl vyjmut a opláchnut fyziologickým roztokem. Homogenizace byla provedena v destilované vodě pomocí Ultra-Turrax homogenizátoru při 20000 ot./min. po dobu 1 min. Homogenát byl rozplněn do zkumavek po 2 ml a uchován při -35 C. Homogenát byl před kaţdým pouţitím vytemperován na teplotu 20 C a důkladně protřepán. acl 3 M roztok acl (M v = 58,44 g.mol -1 ) = 100 ml H 2 + 17,532 g acl Inhibitory AChE Chlorpyrifos (Riedel de Haën, Sigma Aldrich), Tabun (VTU Brno). Testované látky Mono a biskvarterní látky syntetizované v rámci této práce. Dále jsem připravil jejich koncentrační řadu od koncentrace 10-1 M 10-7 M. aváţené mnoţství jsem rozpustil v 5 ml H 2 a dalším ředěním připravil zbylé koncentrace. Pro měření reaktivace jsem uţil koncentrace 10-2 M a 10-4 M. Pro měření afinit syntetizovaných látek k intaktní AChE jsem uţil celou koncentrační škálu. Laboratorní přístroje Titrační systém RTS 822 (Radiometer Copenhagen) je systém sloţený z ph metru, automatického titrátoru a zapisovače. 39
4.2.3.1 Měření aktivity intaktní AChE Do reakční kádinky s 20,0 ml H 2 a 2,5 ml 3 M roztoku acl jsem přidal 0,5 ml temperovaného homogenátu (20 C), dotitroval 10-2 M ah na ph 8. Po přidání 2,0 ml acetylcholin-jodidu jsem změřil aktivitu neinhibovaného enzymu. 4.2.3.2 Měření afinity reaktivátoru k intaktní AChE Do reakční kádinky jsem napipetoval 2,5 ml roztok acl, 0,5 ml homogenátu, 1,0 ml roztoku testované látky dané koncentrace a 19,0 ml H 2 a dotitroval 10-2 M ah na ph 8. Po přidání 2,0 ml acetylcholin-jodidu jsem změřil aktivitu enzymu. Ze získané závislosti aktivit AChE na koncentraci reaktivátoru jsem vypočítal K DIS charakterizující afinitu kvarterních sloučenin k intaktní AChE. 4.2.3.3 Měření aktivity fosfátem inhibovaného enzymu Do 2 ml zkumavky s víčkem jsem napipetoval 0,5 ml homogenátu, 20 µl chlorpyrifosu (tabunu) a 0,5 ml H 2. Protřepal a nechal 30 minut inkubovat. Po 30 minutách inkubace jsem přidal 1,0 ml H 2 a zkumavku jsem vypláchl do reakční kádinky s 18,5 ml H 2 a 2,5 ml 3 M roztoku acl. bsah kádinky jsem dotitroval (10-2 M) roztokem ah na ph 8. Poté jsem přidal substrát (2 ml) a změřil aktivitu inhibovaného enzymu. 4.2.3.4 Měření aktivity reaktivované AChE aváţený, mnou nasyntetizovaný reaktivátor, jsem rozpustil v 3 ml destilované vody a dotitroval 10-2 M ah pomocí pipety na ph 8 a doplnil vodou na objem 5ml. Pro přípravu koncentrační škály oximu jsem odebíral 200µl pipetou 10-1 M roztok oximu a dal do zkumavky, do níţ jsem přidal 1,8 ml vody. Tím jsem získal 2,0 ml roztoku oximu o koncentraci 10-2 M. Takto jsem postupoval aţ po koncentraci 10-4 M. 40
Do 2 ml zkumavky s víčkem jsem napipetoval 0,5 ml homogenátu, 20 µl chlorpyrifosu (tabunu) a 0,5 ml H 2. Protřepal a nechal 30 minut inkubovat. Poté jsem přidal 200 µl roztoku oximu a 0,8 ml H 2 a promíchal a nechal dále 10 minut inkubovat (reaktivovat). Po reaktivaci AChE jsem obsah přelil do reaktivační kádinky s 18,5 ml H 2, 2,5 ml 3 M roztoku acl, 2 ml substrátu a změřil reaktivační schopnosti oximu. 4.2.3.5 Výpočet reaktivační schopnosti testovaných reaktivátorů AChE Aktivity intaktního (a o ) a chlorpyrifosem, respektive tabuneminhibovaného (a i ) enzymu byly odečteny ze závislosti spotřeby roztoku hydroxidu sodného na čase, která je přímo úměrná titrované kyselině octové uvolněné hydrolýzou acetylcholinu. Aktivita reaktivované AChE (a r ) byla opět odečtena po přidání reaktivátorů AChE a následné desetiminutové inkubaci ze závislosti spotřeby roztoku hydroxidu sodného na čase. Z naměřených hodnot aktivit bylo vypočítáno mnoţství reaktivované AChE (%) podle vzorce: a0 ar x 1 100 % [vzorec 1] a0 ai 4.2.3.6 Výpočet afinit testovaných pyridiniových solí k intaktní AChE Aktivity intaktního (a o ) a kvartérní látkou modifikovaného (a i ) enzymu byly odečteny ze závislosti spotřeby roztoku hydroxidu sodného na čase, která je přímo úměrná kyselině octové uvolněné hydrolýzou acetylcholinu. Z naměřených hodnot aktivit bylo vypočítáno procento inhibice AChE podle vzorce: a0 ai x 1 a0 100 % [vzorec 2] ] Disociační konstanta (K DIS ) byla získána nelineární regresí ze závislosti enzymové aktivity na koncentraci heteroareniových solí. 41
reaktivace [%] 5. Výsledky: Všechny kvarterní látky s funkční oximovou skupinou (K024, K076, K077, K078, K006, K074, K079, K018, K027, K048) jsem testoval pro jejich schopnost reaktivovat chlorpyrifosem (pesticidem) a tabunem (PL) inhibovanou AChE. Jak vyplývá z br. 16 a 17 a Tab. 2 charakterizujících reaktivační schopnost testovaných látek, všechny byly schopné reaktivovat AChE inhibovanou chlorpyrifosem. V případě tabunem inhibované AChE reaktivovalo enzym pouze 5 látek. Avšak pouze 6 reaktivátorů dosáhlo reaktivační schopnosti nad 10 %, která je povaţována za dostatečnou k přeţití u zasaţených organismů [8]. V případě tabunem inhibované AChE této koncentrace dosáhly pouze 3 reaktivátory AChE K074, K048 a K018 (Trimedoxim). Téměř ve všech případech bylo dosaţeno vyšší reaktivační účinnosti při koncentraci 0,001 M. V případě koncentrace niţší 0,00001 M, fyziologicky dostupné, dosáhly slibné reaktivační schopnosti pouze K076, K074, K018, K048 a K027 pro chlorpyrifos a K074 pro tabun. br. 16 aměřené hodnoty reaktivace AChE inhibované chlopyrifosem 100 90 80 70 0,001 M 0,00001 M 60 50 40 30 20 10 0 K024 K076 K077 K078 K006 K074 K079 K018 K048 K027 reaktivátory AChE 42
reaktivace [%] br. 17 aměřené hodnoty reaktivace AChE inhibované tabunem 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,001 M 0,00001 M K024 K076 K077 K078 K006 K074 K079 K018 K048 K027 reaktivátory AChE Tab. 2 aměřené hodnoty reaktivace AChE inhibované chlorpyrifosem a tabunem Chlorpyrifos methyl Tabun Reaktivátor [%] reaktivace AChE [%] reaktivace AChE [%] reaktivace AChE [%] reaktivace AChE koncentrace 10-3 M koncentrace 10-5 M koncentrace 10-3 M koncentrace 10-5 M K024 32,4 4,0 0,6 1,2 K076 20,9 14,8 0 0 K077 10,3 4,0 0 0 K078 3,6 4,2 0 0 K006 0 11,3 0 0 K074 32,4 37,6 22,8 15,8 K079 4,0 0 0 0 K018 51,3 37,7 31,2 7,3 K048 42,0 23,9 18,5 5,5 K027 44,5 23,1 3,8 0 43
inhibice cholinesteráz [%] Další testovanou vlastností syntetizovaných látek byla jejich afinita k intaktní AChE. Jak vyplývá z Tab. 3 a br. 18 všechny testované mono či biskvarterní látky se projevily jako účinné inhibitory AChE. Hodnota K DIS charakterizující jejich afinitu k enzymu se pohybovala v rozmezí koncentrací od 2,2 µm aţ po 492,4 µm. a br. 18 jsou pro větší názornost vyznačeny jen látky s nejvyšší afinitou (K079) a nejniţší afinitou (K025). Tab.3 aměřené hodnoty afinit reaktivátorů k AChE xim K DIS [µm] xim K DIS [µm] K025 492,4 K027 44,9 K082 268,8 K048 43,9 K077 228,7 K018 42,1 K080 188,9 K076 41,5 K024 142,7 K006 28,9 K083 128,4 K078 21,1 K081 115,1 K049 12,1 K085 63,1 K074 7,6 K084 50,1 K079 2,2 br.18 Vybrané hodnoty afinity reaktivátorů k AChE 100 75 K079 K025 50 25 0-8.5-7.5-6.5-5.5-4.5-3.5-2.5 log koncentrace oximu [M] 44
6. Diskuse, Závěr: Chemická struktura reaktivátorů AChE zásadně ovlivňuje proces reaktivace AChE inhibované jak PL, tak organofosforovými pesticidy [22, 23]. Ţádný z reaktivátorů AChE zavedený v AČR není schopen reaktivovat AChE inhibovanou všemi typy inhibitorů. Bohuţel ani oxim HI-6, v současnosti preferovaný konsorciem šesti států Kanada, izozemí, ěmecko, Švédsko, Dánsko a Anglie [24], není schopen reaktivovat AChE inhibovanou tabunem či některými pesticidy [25, 26]. Proto nemůţe být ani tento oxim označen jako širokospektrý. Vzhledem k nedostatečné schopnosti současně uţívaných reaktivátorů AChE reaktivovat inhibovaný enzym bez ohledu na typ inhibitoru stále pokračuje vývoj nových účinnějších reaktivátorů, kterými by mohly být nahrazeny reaktivátory stávající. Aby nebyly zbytečně syntetizovány látky s nízkou reaktivační schopností, vychází se při jejich přípravě z obecně známých struktur nebo se vyuţívá znalosti esenciálních fragmentů obsaţených ve strukturách známých reaktivátorů [1]. Mezi nejdůleţitější strukturní části obsaţené v molekule reaktivátorů patří přítomnost a počet oximových skupin, přítomnost a počet kvarterních dusíků a délka a tvar spojovacího řetězce mezi jednotlivými pyridiniovými jádry [22]. V této práci jsem se zabýval syntézou fragmentů reaktivátorů AChE K027 a K048, u kterých bylo zjištěno v průběhu posledních třech let, ţe jejich schopnost reaktivovat AChE inhibovanou pesticidy či tabunem je slibná [1-6]. ásledným in vitro testováním výše zmíněných fragmentů (afinita a reaktivační schopnost) jsem zjistil, ţe jsou rozdíly v reaktivačních schopnostech testovaných látek vůči tabunem a chlorpyrifosem inhibované AChE. AChE inhibovanou chlorpyrifosem reaktivovaly monokvarterní i biskvarterní fragmenty. Tabunem inhibovaná AChE byla reaktivována pouze biskvarterními fragmenty a monokvarterní fragmenty ji nereaktivovaly. Jako 45
nejlepší reaktivátory AChE inhibované buď chlorpyrifosem, či tabunem byla látka K018 (Trimedoxim) a látky K048 a K074. Ze získaných výsledků z měření afinity fragmentů k intaktní AChE vyplynulo, ţe nejniţší afinitu měly monokvartení fragmenty (např. K025). ejvyšší afinitu vykazoval monokvarterní fragment K079. becně lze říci (ačkoliv K079 měla nejvyšší afinitu k AChE), ţe biskvarterní látky patřily k látkám, které měly vyšší afinitu neţ monokvarterní. Reaktivační aktivitu jsem hodnotil pouze u fragmentů s oximovou skupinou, která je podmínkou reaktivační schopnosti. Zjistil jsem, ţe kromě přítomnosti alespoň jedné oximové skupiny je důleţitá přítomnost biskvarterní molekuly jako celku. Charakter druhého fragmentu, ani délka spojovacího řetězce reaktivační schopnost výrazně neovlivňují. 46
7. Seznam zkratek AA ACh AChE AChI AČR GA GB GD GF His kyselina octová acetylcholin acetylcholinesteráza acetylcholin-jodid Armáda České republiky tabun sarin soman cyklosarin histidin K DIS konstanta udávající koncentraci inhibitoru, při níţ dochází k 50% inhibici enzymu KTX FVZ Katedra toxikologie Fakulty vojenského zdravotnictví U Univerzita obrany MDA receptor pro -methyl-d-aspartát PL nervově paralytické látky Phe fenylalanin Ser Trp serin tryptofan 47
8. Literatura 1 KUČA K., BIELAVSKÝ J., CABAL J., BIELAVSKÁ M.: Synthesis of a potential reactivator of acetylcholinesterase 1-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-3-(carbamoylpyridinium)- propane dibromide. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3123-3125. 2 KUČA K., BIELAVSKÝ J., CABAL J., KASSA J.: Synthesis of a new reactivator of tabun inhibited acetylcholinesterase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 3545-3547. 3 KUČA K., BARTŠVÁ L., JU D., PATČKA J., CABAL J., KASSA J., KUEŠVÁ G.: ew quaternary pyridine aldoximes as causal antidotes against nerve agents intoxications. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky lomouc Czech Repub. 2005, 149, 75-82. 4 PETRIAU G. A., ARAFAT K., KUČA K., KASSA J.: Five oximes (K-27, K-33, K-48, BI-6 and methoxime) in comparison with pralidoxime: in vitro reactivation of red blood cell acetylcholinesterase inhibitied by paraoxon. J. Appl. Toxicol. 2006, 26, 64-71. 5 CALIC M., LUCIC VRDLJAK A., RADIC B., JELIC D., JU D., KUČA K., KVAŘÍK Z.: In vitro and in vivo evaluation of pyridinium oximes: mode of interaction with acetylcholinesterase, effect on tabunand soman-poisoned mice and their cytotoxicity. Toxicology 2006, 219, 85-96. 6 KASSA J.: The influence of oxime and anticholinergic drug selection on the potency of antidotal treatment to counteract acute toxic effects of tabun in mice. eurotox. Res. 2006, 9, 59-62. 48