MALDI-TOF MS typizace rodu Aeromonas Andrea Teshim 1,4 Spoluautoři: RNDr. Ludmila Tvrzová, Ph.D. 1 RNDr. Ivo Sedláček, CSc. 4 Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. 2 RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. 2 Ing. Matej Lexa, Ph.D. 3 (1) Ústav experimentální biologie,, Přírodovědecká fakulta MU, Brno, ČR (2) Oddělení funkční genomiky a proteomiky,, Přírodovědecká fakulta MU, Brno, ČR (3) Oddělení informačních technologií,, Fakulta informatiky MU, Brno, ČR (4) Česká sbírka mikroorganismů,, Přírodovědecká fakulta MU, Brno, ČR
Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight MS Analytická technika Rychlá chemotaxonomie založená na detekci biomarkerů Výhoda MALDI MS : Rozlišení chemotaxonomicky a fenotypicky neodlišitelných druhů (Př. B. anthracis, B. cereus, druhy rodu Listeria) Rod Aeromonas: shoda v sekvencích 16S rrna: 97,8 100 % Převzato: Martinez-Murcia 1999
Rod Aeromonas Aeromonas hydrophila 1984 4 druhy (A. hydrophila, A. caviae, A. salmonicida, A. sobria) 2004 17 druhů (Stackebrandt, Donohue a kol. 2005) Nová čeleď Aeromonadaceae mnoho společných biochemických znaků (Abbott 2003) heterogenita a genetická proměnlivost v rámci rodu (bv. A. media, ssp. A. salmonicida) Metody genotypizační: DNA-DNA hybridizace; analýza 16S rrna MLST: 16S rdna, reca, chia, gyrb MALDI-MS chemotaxonomie: unikátní markery Významná je autentizace a identifikace kmenů
Častý izolát klinického a veterinárního materiálu, podmíněný patogen Maso, mléko, sýry, ryby, zelenina, plody moře, vodní prostředí» klinika: sekreční faktory: cytotoxiny, enterotoxiny, lipázy aerolyzin, proteázy, siderofory povrchové faktory: fimbrie, membr.proteiny, S vrstva, pouzdro, LPS A. caviae mírné průjmy, Lac+, nehemolitická A. hydrophila - dyzenterie A. jandaei, A. trota, A. schubertii, A. veronii (bv. veronii a bv.sobria) Infekce ran, septikémie, gastroenteritidy, endokarditidy, meningitidy, pneumonie, osteomyelitidy, konjunktivitidy Ecthyma Gangrenosum Celulitis Rezistence k ampicilinu, penicilinu (inducibilní β-laktamázy), chlor, desinf.l., biofilm, 4 C» Diagnostika: selektiv. půda s Amp, TCŽS, alkal.pepton.voda, KA - mukózní kolonie, ox+, kat+, lac (mimo A.caviae), Glu+, Gas+, stringβ hemol. 4/20 Myonecrosis
MALDI MS analýza Destička MALDI Spot na MALDI desce Vzorky:~ buňky: celobuněčné preparáty- prostředí, klinika, potraviny kokrystalizace matrice se vzorkem N 2 laser 337nm excitace UV, absorbce E laseru hluboké vakuum 10-6 Pa Ionizace molekul uvolnění protonovaných molekul [M+H] + analytu Schéma metody
Cíle Ověřit diferenciační schopnost MALDI-MS pro bakterie rodu Aeromonas na typových kulturách a izolátech z prostředí Snaha získat : reprodukovatelná spektra - odlišnosti mezi kmeny --> autentizace, identifikace a.i. 5 0 0 A. media 3653T signál = hodnota m/z 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 1 0 0 0 0 m /z
Metodika Kultivace 45ti kmenů Aeromonas (CCM) Optimalizace přípravy a analýzy vzorku suspenze voda : ACN matrice: sdhb (20 mg/ml v 20%ACN, 1%TFA) MALDI-TOF analýza Oddělení funkční genomiky a proteomiky Bohunice, Reflex IV (Bruker) Úprava a zpracování spekter (= zobrazení ionizovatelnýchčástic bakteriálního proteomu v přítomnosti matrice) Klastrová analýza Výsledný dendrogram
Optimalizace metody Test typu a okyselení matrice (sdhb v 20% ACN s 1% TFA) Medium, hustota suspenze vzorku (2 µl buněk + 500 µl voda : ACN 1:1) Test reprodukovatelnosti Vliv délky zamražení, kultiv. teplota a.i. 1600 1400 1200 1000 800 O bjem a hustota vzorku 7156 T _300 ul_1 ul 7156 T _500 ul_2 ul a.i. 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1000 800 600 400 200 0 P. putida CCM 7156 T sdhb FA SA CHCA 5000 7000 9000 11000 13000 m/z Test vlivu matrice A.encheleia prodloužená kultivace (8 dní) A.encheleia standardní kultivace 600 7156 T _1000 ul_2 ul 400 200 7156 T _1000 ul_1 ul 0 6000 8000 10000 12000 m/z Test optimální hustoty suspenze Testy reprodukovatelnosti
a.i. 4000 3500 Srovnání srovnání uvnitř rodu A. caviae A. trota A.allosaccharophila 4491 4368 4363 3000 A. schuberttii 4356 2500 A. eucrenophila 4354 2000 1500 1000 A. sobria A.encheleia A.encheleia A.popoffii 2807 1909 1769 667 500 0 A.popoffii A.popoffii 658 655 6000 8000 10000 m/z
a.i. 1600 1400 Srovnání mezi kmeny A. popoffii CCM 7330 1200 A. hydrophila CCM 2280 1000 800 A. popoffii CCM 666 600 A. popoffii 400 CCM 660 vz.i. 200 0 A. popoffii CCM 660 vz.ii. 5000 7000 9000 11000 m/z
Srovnání mezi rody a.i. 2000 A. hydrophila ssp.hydrophila CCM 7146 T 1500 1000 Pseudomonas aeruginosa CCM 1960 T 500 Stenotrophomonas 0 m/z
(Donohue et al., 2005)
Shrnutí Optimalizace metody na sbírkových kmenech pro identifikaci izolátů Zisk reprodukovatelných spekter z různých kultivací za stejných podmínek srovnatelné výstupy Vytvoření dendrogramu příbuznosti 46ti kmenů rodu Aeromonas pomocí klastrové analýzy Byl stanoven MS profil rodu Aeromonas (4 257 4 259 Da, 5 050 5051 Da, 6 086 Da, 6 306 6 307 Da, 7 196 Da, 7 333 7 335 Da, 8 343 8 344 Da, 9 183 9 186 Da, 9 400 9 402 Da, 10 311 10 313 Da)
Výhody Vysoká rychlost a jednoduchá příprava vzorku Malý objem vzorku; šetření chemikáliemi Vysoce reprodukovatelný výstup Rychle vyvíjející se metodika tvorby databází Možnost srovnání s informacemi sekvenování genomu, proteinů Možnost kombinace s dalšími metodami (off-line separace ELFO, HPLC)
Využití MALDI-MS v mikrobiologii Klinická diagnostika Bacillus (Warscheid a Fenselau 2004), Campylobacter (Mandrell a kol. 2005), Clostridium, Corynebacterium, Escherichia (Holland a kol. 1996). Haemophilus rychlý screening izolátů nemocničních kmenů (Haag a kol. 1998). Dále Helicobacter (Nilsson 1999, Demirev a kol. 2001), Legionella (Keys a kol. 2004), Mycobacterium (Pignone a kol. 2006). Salmonella (Leuschner a kol. 2003), Streptococcus (Kumar a kol. 2004, Keys a kol. 2004), Staphylococcus (Edwards-Jones a kol. 2000, Walker a kol. 2002) U rodu Staphylococcus byly dokonce rozlišeny methicilin-citlivé a methicilin-rezistentní kmeny (Walker a kol. 2002) Při využití referenčních spekter je možno identifikovat neznámý vzorek (Lynn a kol 1999) Taxonomie mikroorganismů, enviromentální studie, potravinářství Analýza specifických bakteriálních proteinů: rekombinantní proteiny, faktory virulence, enzymy, metabolity, proteiny sporových stěn (Hathout a kol. 1999, Ryzhov a kol. 2000) a S-vrstvy, významné je studium bakteriocinů (Hindre a kol. 2003), peptidové mapování Sekvenování bakteriálních nukleových kyselin (Marvin a kol. 2003, Lay 2001)
Poděkování RNDr. Ludmila Tvrzová, PhD. vedoucí práce RNDr. Ivo Sedláček, CSc. - odborná pomoc při práci Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. - analýza vzorků, hodnocení spekter tvorba výstupních dat RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. konzultant Ing. Matej Lexa, Ph.D. statistické zpracování výsledků