Optimalizace podmínek přípravy vzorků pro MALDI-MS profilování bakterií. Diplomová práce

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE Optimalizace podmínek přípravy vzorků pro MALDI-MS profilování bakterií Diplomová práce Magdaléna Kačalová Vedoucí diplomové práce: Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. Brno 211

2 Bibliografický záznam Autor: Bc. Magdaléna Kačalová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Optimalizace podmínek přípravy vzorků pro MALDI-MS profilování bakterií Studijní program: Biologie Studijní obor: Obecná biologie Vedoucí práce: Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. Rok obhajoby: 211 Klíčová slova: MALDI TOF MS; Lactobacillus; identifikace; hmotnostní spektrometrie ii

3 Bibliographic entry Author: Bc. Magdaléna Kačalová Faculty of Science, Masaryk University Institute of Experimental Biology Title of thesis: Optimization of sample preparation conditions for MALDI MS profiling of lactic acid bacteria Degree programme: Biology Field of study: General Biology Supervisor: Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. Year of defence: 211 Keywords: MALDI TOF MS; Lactobacillus; identification; mass spectrometry iii

4 Poděkování Ráda bych na tomto místě srdečně poděkovala vedoucímu mé diplomové práce Mgr. Ondreji Šedovi, Ph.D. za velkou ochotu, neocenitelnou pomoc při řešení problémů a odborné rady, které mi během práce poskytoval. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Andreji Teshim za připomínky, konzultace a za poskytnuté vzorky bakterií. Mgr. Martě Duškové z VFU za poskytnuté kmeny bakterií a Václavovi Juchelkovi za vytvoření softwaru pro vyhodnocení výstupních dat. RNDr. Zbyňku Zdráhalovi, Dr. a kolektivu z Oddělení funkční proteomiky a genomiky za přijetí a vytvoření příjemné atmosféry. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracovala samostatně a použila jen citovaných dokumentů, uvedených v seznamu použité literatury. V Brně 12. května jméno, příjmení iv

5 Abstrakt Po provedení standardního protokolu přípravy dokáže MALDI-TOF MS robustně poskytovat reprodukovatelná hmotnostní spektra, ale některé blízce příbuzné druhy nedokáže spolehlivě odlišit. V této diplomové práci jsme se zaměřili především na studium podmínek přípravy vzorku pro MALDI-TOF MS analýzu a nastavení parametrů pro vyhodnocení MALDI-TOF MS profilů, které vedly k vytvoření metody spolehlivě rozlišující vybrané skupiny bakterií na druhové úrovni. Byl studován vliv podmínek složení roztoku MALDI matrice či metody nanášení vzorku na desku spektrometru na kvalitu a reprodukovatelnost MALDI MS profilů a diskriminační schopnosti metody. Byly nalezeny nové druhově a rodově specifické signály některých zástupců rodu Lactobacillus. Abstract Following the standard protocol preparation, the MALDI-TOF MS is capable to provide reproducible mass spectra in a significant way, but is not able to reliably distinguish some closely related species. In this thesis we focused primarily on the study of specimen preparation conditions for MALDI-TOF MS analysis and the parameter settings for evaluation of MALDI-TOF MS profiles, which led to the creation of a method able to reliably distinguish chosen groups of bacteria on the species level. The influence of the conditions of solution composition of the MALDI matrix as well as methods of specimen application on the spectrometer plate on the quality and reproducibility of the MALDI MS profiles and the discrimination capability of the method have been studied. New specific and generic specific signals of different members of the Lactobacillus genus have been found. v

6 Obsah 1. Úvod MALDI TOF MS Historie hmotnostní spektrometrie Princip MALDI TOF MS Princip TOF Matrice MALDI-TOF MS při analýze mikroorganismů Příprava mikrobiálních vzorků Získaná hmotnostní spektra a jejich zpracování MALDI-TOF MS v klinické mikrobiologii Vliv metod přípravy vzorků na vzhled MALDI-TOF hmotnostních spekter s ohledem na detekci proteinů s vyšší molekulovou hmotností Rod Lactobacillus Morfologické a fyziologické vlastnosti Kultivace Identifikace bakterií rodu Lactobacillus Problematika v taxonomii laktobacilů Cíl diplomové práce Experimentální část Vyšetřovaná skupina bakteriálních kmenů Použitý materiál Kultivační médium MRS médiu s,5% cysteinem Chemikálie Přístroje a pomůcky Příprava vzorků kmenů pro analýzu a jejich uchovávání Kultivace kmenů Sterilizace etanolem Úprava vzorků před nanesením na MALDI destičku Analýza vzorků a kalibrace metod Metody provedených experimentů Použitá metoda pro test vlivu intenzity laseru a koncentrace extraktu na kvalitu spekter Vliv změny poměrů vody a organické složky v roztoku matrice Změna poměrů vody a acetonitrilu v extrakčním rozpouštědle Testování různých druhů matric pro získání kvalitních signálů s ohledem na detekci látek s vyšší molekulovou hmotností Ověření použitelnosti metod, které dle publikovaných studií vedly detekci látek vyššími molekulovými hmotnostmi vi

7 3.4.6 Modifikace metody dle Madonny a kol Analýza laktobacilů s použitím HCCA a FerA jako matrice Výsledky Vyhodnocení výsledků Výsledky kontroly stability zamražených vzorků Test vlivu intenzity laseru a koncentrace vzorku na získaná spektra Vliv změny poměrů vody a organické složky v roztoku matrice Test vlivu změny poměru vody a acetonitrilu v rozpouštědle pro extrakci proteinů Testování různých druhů matric pro získání kvalitních signálů s ohledem na detekci látek s vyšší molekulovou hmotností Ověření použitelnosti metod, které dle studií vedou detekci látek vyššími molekulovými hmotnostmi Modifikace metody dle Madonny a kol Analýza laktobacilů s použitím matrice HCCA dle společnosti Bruker a FerA dle Madonny Diskuse Závěr Použitá literatura: Seznam zkratek: vii

8 1. Úvod Tato diplomová práce je zaměřena na získávání znalostí směřujících k rozvinutí metody MALDI-TOF MS (hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight mass spectrometry) s cílem zvýšení spolehlivosti klasifikace bakteriálních kmenů. Byla zkoumána především možnost zvýšení diskriminačních schopností metody na základě detekce proteinů v oblasti vyšších molekulových hmotností. V oblastech jako je monitoring životního prostředí, zpracování potravin, ochrana veřejného zdraví či klinická diagnostika je velmi důležité zjistit přítomnost patogenních mikroorganismů a pak zejména jejich správná identifikace. Velká pozornost proto patří v posledních letech metodě MALDI-TOF MS jako k potenciální technice, která by tuto rychlou a spolehlivou identifikaci bakterií i jiných mikroorganismů umožnila. Dosavadní znalosti a výsledky pokusů provedených pomocí MALDI-TOF MS dokazují schopnost rozlišit bakterie či jiné mikroorganismy na rodové, druhové a často i kmenové úrovni. Zároveň mnohé studie naznačují, že pro určité geneticky příbuzné druhy metoda neposkytuje jednoznačné výsledky identifikace, a právě v těchto případech je zapotřebí zavedené analytické postupy vhodným způsobem upravovat. 1

9 1.1 MALDI TOF MS Historie hmotnostní spektrometrie Zrod myšlenky principu hmotnostní spektrofotometrie se připisuje J. J. Thomsonovi, který již před rokem 1913 přišel s myšlenkou analýzy látek pomocí jejich ionizace, zrychlení v elektrickém poli a následné separaci iontů dle molekulových hmotností v magnetickém poli. V roce 1919 E. W. Aston postavil prototyp magnetického hmotnostního analyzátoru. Postupem času se vylepšovaly části spektrometru např. iontové zdroje, analyzátory či technika detekce iontů. První hmotnostní spektrometr s TOF (Time of Flight) analyzátorem byl sestaven A. E. Cameronem a D. F. Eggersem v roce Toto zařízení mělo však velmi nízké rozlišení. První TOF spektrometr s lepším rozlišením pochází z roku První studie o využití hmotnostní spektrometrie pro identifikaci bakterií pocházejí z roku 1975 (Anhalt 1975). Ionizační metoda MALDI pak byla popsána koncem osmdesátých let. Význam metody potvrzuje udělení Nobelovy ceny za chemii v roce 22 K. Tanakovi za její objev (Karas 1987, Tanaka 1988) Princip MALDI TOF MS Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem je poměrně mladá separační technika využívající tzv. měkké ionizace. Rychle se rozvíjí jako cenný nástroj pro měření molekulové hmotnosti biopolymerů např. peptidů, bílkovin, oligosacharidů, nukleotidů, či k detekci posttranslačních změn bílkovin. Lze jí také stanovovat glykoproteiny, oligosacharidy, protilátky a jejich konjugáty s léky, nukleové kyseliny, produkty PCR a řadu dalších látek. Postupně se stává nepostradatelnou součástí laboratorní praxe v biotechnologii, molekulární biologii a mnoha dalších odvětvích. Mezi velké přednosti této metody patří rychlost a malé množství vzorku potřebné pro analýzu. Metoda je založena především na smíchání vzorku s nadbytkem matrice v poměru asi 1:1 4. Při použití UV laseru (trváni pulzu 4 ns o vlnové délce 337 nm při použití dusíkového laseru) se jako matric nejčastěji využívá derivátů kyseliny skořicové či benzoové. Tato směs je pak nanesena na kovový nosič, nejčastěji nerezovou nebo hliníkovou destičku (obrázek 1). Destička je inertní vůči matrici či rozpouštědlům, před 2

10 analýzou je vždy vyčištěna, zbavena nečistot a prachu. Na povrchu destičky jsou vyryty kruhové zářezy, tzv. terčíky, které pomáhají udržet roztok analytu a matrice na stanoveném místě a zabraňují rozlití a smíchání vzorků. Obrázek 1: Destička MALDI (Převzato: Oddělení funkční genomiky a proteomiky, PřF MU) Po zaschnutí je nosič vložen do hmotnostního spektrometru, kde je vystaven hlubokému vakuu. Laserový paprsek pak způsobí sublimaci matrice, která přednostně paprsek absorbuje, přechází do plynné fáze a strhává s sebou molekuly analytu. Přenos části energie mezi matricí a analytem není dosud zcela vyjasněný, ale tato energie umožní jeho ionizaci bez značné fragmentace a tím i snazší interpretaci výsledného hmotnostního spektra. Ionty postupují přes silné elektrické pole, ve kterém jsou urychleny a zaostřeny. Vstupují pak do hmotnostního analyzátoru doby letu TOF Princip TOF Jedná se o pulzní hmotnostní analyzátor. Ionty jsou zde separovány na základě různých poměrů hmotnosti a náboje m/z. Trubice vyplněná vakuem zde poskytuje prostor pro pohyb iontů různou rychlostí vzhledem k jejich hmotnosti a náboji. Částicím se stejným nábojem je urychlením v elektrickém poli dána stejná kinetická energie, proto se lehčí ionty pohybují rychleji než těžké. Měří se celková doba letu iontů od aplikace laseru po dopad iontů na detektor. Platí zde vztah: ev m t = l 2 z kde (t) je celková doba letu, (l) je délka trubice, (m/z) molekulová hmotnost / náboj daného iontu, (V) urychlovací napětí v iontovém zdroji a e elementární náboj. 3

11 Pro zvýšení rozlišení se často používá reflektoru, tzv. iontového zrcadla, který kompenzuje disperzi kinetické energie iontů, tedy různost kinetické energie iontů se stejným m/z. Ionty s vyšší kinetickou energií proniknou hlouběji do reflektoru, čímž se prodlouží doba letu vůči iontům s nižší kinetickou energií. Ke kompenzaci nevyrovnaných počátečních kinetických energií u iontů se stejným m/z se také využívá tzv. zpožděné extrakce. Spočívá v malém časovém posunu mezi aplikací laseru na vzorek a aplikací urychlovacího napětí. Vyrovnávají se tím rozdíly v rychlosti iontů způsobené při desorpci. Detektor je propojen s počítačem a pomocí softwaru je výsledek zpracován. Vzhledem k tomu, že je náboj iontů po procesu MALDI většinou roven 1, výsledná hodnota je vyhodnocena přímo jako spektrum molekulových hmotností daných iontů. Schéma MALDI-TOF hmotnostního spektrometru je uvedeno na obrázku 2. Obrázek 2: Schéma MALDI-TOF MS (převzato: Matrice Volba matrice je jedním z nejdůležitějších faktorů analýzy. Matricemi bývají většinou slabé organické kyseliny s aromatickým jádrem např. deriváty kyseliny benzoové či skořicové. Používají se většinou jako roztoky ve směsích obsahujících acetonitril (ACN), kyselinou trifluoroctovou (TFA), k. mravenčí (FA), vodu či aceton. TFA a FA se používají pro úpravu ph, protože okyselení matrice zlepšuje kvalitu signálu. Kouzlo matrice spočívá v její schopnosti ochránit analyt před přímou ionizací paprskem laseru, a jeho následné nežádoucí fragmentaci. Správný výběr druhu matrice 4

12 bývá zcela zásadní pro analýzu. Tyto sloučeniny by měly vykazovat vysokou fotostabilitu, měly by mít určitou afinitu ke vzorku a se vzorkem kokrystalovat za vzniku homogenního filmu, který umožňuje získávat kvalitní spektra. Ukázka krystalizace některých matric je uvedena na obrázku 4. Zároveň je nutná schopnost absorbovat vlnovou délku záření laseru a mísitelnost rozpouštědla matrice s rozpouštědlem analytu. Matrice by však neměly se vzorkem reagovat, aby nekomplikovaly interpretaci spekter. Analýza probíhá ve velkém nadbytku matrice nad molekulami analyzovaných látek (v molárním poměru řádově 1:1-4 ), které se tedy vlivem laseru méně fragmentují a poskytují jednoduchá hmotnostní spektra. Matrice přebírá energii laseru a předává ji na analyt, čímž způsobí jeho přechod z pevné do plynné fáze. Excitované molekuly matrice ionizují molekuly analytu přenosem protonu, jehož mechanismus není zcela znám (obrázek 3). Obrázek 3: Schéma ionizace MALDI (převzato z Všechny tyto požadavky a nejasnosti znesnadňují výběr správné matrice pro daný analyt. Výběr je tedy založen na empirických vlastnostech. Různé matrice odlišně ionizují analyty, jinak krystalizují a dávají i odlišná hmotnostní spektra. Správně zvolená matrice by měla schnout co nejvíce homogenně a tvořit na destičce co nejmenší směsné krystaly. 5

13 Strukturní vzorce nejpoužívanějších matric u MALDI-TOF MS analýzy bakterií: kyselina 2,5 dihydroxybenzoová DHB gentisic acid kyselina 3,5-dimetoxy-4-hydroxyskořicová SA sinapinic acid kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová HCCA 4-hydroxy-3-metoxyskořicová kyselina FerA-ferulic acid kyselina 5-metoxysalicylová 5-MS kyselina 2-(4 hydroxyfenylazo)benzoová HABA Obrázek 4: Krystalizace některých matric na MALDI desce A HCCA, B SA, C DHB (Převzato: 6

14 1.1.5 MALDI-TOF MS při analýze mikroorganismů Tradiční bakteriologické techniky, jako je kultivace na selektivní médium nebo testy na biochemickou aktivitu jsou často časově náročné a pracné. Proto metoda MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie představuje zajímavou alternativu pro bakteriální diferenciaci. MALDI-TOF MS nabízí možnost rychlé a detailní identifikace a diferenciace bakterií či kvasinek, hub a spor. Poskytuje hmotnostní spektra části látek obsažených v bakteriální buňce, které jsou charakteristické pro analyzovaný rod, druh či kmen. Pro identifikaci neznámých bakterií je třeba vytvořit rozsáhlou databázi spekter, kde je možno porovnat získané spektrum se spektrem popsaného kmene a na základě jejich podobnosti pak určit pravděpodobnost správné klasifikace vzorku. Samotný proces analýzy a získání výsledku je velmi rychlý a je uskutečnitelný během několika minut. Samozřejmě předchází kultivace bakterií, která proces značně zpomaluje, ale tento proces je nezbytný i u většiny ostatních taxonomických metod Příprava mikrobiálních vzorků Příprava vzorku (výběr, koncentrace matrice a organických rozpouštědel) je jedním z rozhodujících kroků pro optimalizaci citlivosti, reprodukovatelnosti a správnosti stanovení m/z MALDI-TOF MS (Fenselau 21). Analýze můžeme podrobit celé buňky i jejich extrakty, tedy izolované proteiny. Nejrychlejším postupem je přímé nanesení nakultivovaných bakterií z agaru i tekutých půd na MALDI destičku. Proces extrakce také nebývá příliš zdlouhavý, jako vhodné rozpouštědlo se často používá silná organická kyselina, aceton či acetonitril ve směsi s vodou. Pro vytvoření homogenního filmu krystalů na destičce jsou vhodná více těkavá rozpouštědla. Existuje několik studií, které zkoumaly vliv podmínek růstu kultury na výsledné spektrum. Byly nalezeny rozdíly mezi spektry, ale identifikace vzorku byla stále možná. Inkubační doba má také vliv na kvalitu spektra (Valentine 25). Existuje několik metod nanášení vzorků na MALDI destičku (obrázek 5). Dried-droplet metoda zahrnuje nanesení směsi vzorku a roztoku matrice, měla by umožňovat detekci vysokomolekulárních látek. Metoda two-layer zahrnuje nejdříve nanesení kapky matrice a po jejím zaschnutí převrstvení směsí vzorku a matrice. Signály nízkomolekulárních látek by měla poskytovat lépe tzv. metoda bottom-layer, kdy je v objemu od,5 2 µl nanesen nejprve rozpuštěný vzorek a po zaschnutí nanesena ve stejném objemu rozpuštěná matrice (Vaidyanathan 22). 7

15 Obrázek 5: Metody nanášení vzorku před analýzou (Upraveno podle: Williams a kol. 23) Rozdíl v přípravě gram-pozitivních (G+) a gram-negativních (G-) bakterií je dán jejich odlišnou stavbou buněčné stěny, a tedy rozdílem v uvolňování proteinů. U přípravy vzorků z G+ je pro získání kvalitního spektra většinou nutná extrakce proteinů. K narušení peptidoglykanové vrstvy v buněčné stěně, která nedovoluje MALDI ionizaci proteinů, se používá enzymů lysozymu, který rozrušuje β-1,4-glykosidické vazby mezi N-acetylglukosaminem a kyselinou N-acetylmuramovou v peptidoglykanu, chemických rozpouštědel či mechanického rozrušení sonikací či teplem. G- bakterie můžeme obvykle přímo nanést na MALDI destičku po proplachu vodou Získaná hmotnostní spektra a jejich zpracování Vstupní informací u identifikace bakterií pomocí MALDI TOF MS je peptidový/proteinový profil, který je zobrazen jako hmotnostní spektrum. Je zobrazením četnosti ionizovaných částic bakteriálního proteomu. Zpracování spektra zahrnuje identifikaci a kvalifikaci píků a následné určení podobnosti s referenčními spektry. Píky, které se opakují při měření jednoho kmene, jsou považovány za charakteristické markery. Za dodržení standardních podmínek kultivace a analýzy jsou některé z těchto signálů charakteristické pro určitý rod, druh či kmen. Správná interpretace získaných dat pro charakterizaci bakterií je velmi důležitá a ne vždy snadná, protože někdy se vyskytují jen nepatrné rozdíly ve spektrech příbuzných kmenů. Spektra použitá pro identifikaci musejí být vysoce reprodukovatelná. Studie zabývající se MALDI-TOF hmotnostními spekry bakterií ukázaly, že 9 % signálů pochází z oblasti 6-1 Da. Ionty s molekulovou hmotností pod 6Da jsou výsledkem ionizace vlastní matrice. Ionty s vysokou molekulovou hmotností jsou signály vhodnými k rozlišení bakterií díky minimálnímu pozadí přítomnému ve vysokomolekulární oblasti spekter (Lay 21). Identita signálu je dále posouzena na základě přesnosti stanovení molekulové hmotnosti na použitém typu hmotnostního spektrometru za daných podmínek analýzy. Intenzita signálu je projevem ionizovatelnosti molekuly během procesu MALDI a je 8

16 rovněž závislá na relativní koncentraci proteinu v místě ionizace. Proto není MALDI- TOF MS kvantitativní metodou. Vhodná spektra mohou být získána automatickým sběrem dat pomocí softwaru, pokud je vzorek dobře homogenizován a správný signál poskytuje většina míst na terčíku. V případě, že dojde ke krystalizaci po obvodu terčíku či ve shlucích, je nutné ručně vyhledávat vhodná místa pro aplikaci laseru, která po ionizaci poskytují nejlepší poměr signál/šum, a tedy kvalitní výsledné spektrum. Pro účinné zavedení MALDI-TOF, jako techniky pro identifikaci mikroorganismů, je nutné zamezit získávání rozdílných spekter u analýzy stejných vzorků v různých laboratořích. Důvodem je pravděpodobně rozdílnost přípravy vzorků, které pak dávají rozdílná spektra. Je tedy nutné zavést standardní protokoly přípravy vzorků. Mezi zkoumané vlivy patří např. typy použité matrice a její ředění, různá intenzita laseru, kultivační média či stáří kultury apod. U charakteristických MALDI-TOF hmotnostních spekter pozorujeme na ose x záznam molekulové hmotnosti části proteinů z bakteriální buňky, na ose y potom intenzitu jejich signálu. 1.2 MALDI-TOF MS v klinické mikrobiologii V posledních letech byla identifikace bakterií či kvasinek v klinické mikrobiologické laboratoři založena především na fenotypových vlastnostech, jako je růst na selektivních médiích, morfologie kolonií, Gramovo barvení či různých biochemických reakcích buď pomocí komerčních kitů, nebo automatizovaných systémů. Tyto techniky dohromady dokáží identifikovat většinu bakteriálních izolátů s velkou správností, ale jsou časově náročné a nákladné. Fenotypové markery mohou být navíc jako identifikační znaky nestabilní kvůli jisté variabilitě v důsledku změny kultivačních podmínek. Alternativní variantou rychlé identifikace bakterií je v molekulární biologii polymerázová řetězová reakce (PCR), která v případě real-time PCR výsledky poskytne ve velmi krátké době. Nevýhodou jsou ovšem velmi náročné postupy pro identifikaci bakterií na druhové úrovni, vyžadují vysokou úroveň odborných znalostí a obdobně jako u jiných molekulárně biologických identifikačních technik výška provozních nákladů znemožňuje využití pro rutinní identifikace (Carbonnelle 211). Rychlá a správná identifikace je nutná pro zlepšení péče o pacienty s infekčními chorobami. V současné době je v oblasti mikrobiologie velká tendence prohlubovat 9

17 dosavadní poznatky, upravovat zavedené metody a vyvíjet nové technologie pro rychlou diagnostiku. MALDI-TOF MS je jednou z technik, které mají velký potenciál pro zlepšení rutinní identifikace bakterií či kvasinek. Díky získaným specifickým referenčním spektrům a jejich zařazení do databází mohou být bakterie rychle identifikovány. MALDI-TOF MS profilování bakteriálních buněk je založeno na charakteristických pících pro rody a druhy. Jsou vytvářeny databáze a standardní protokoly analýzy, které jsou postaveny na reprodukovatelně detekovatelných proteinech. Tyto podléhají genetické regulaci a reakcím na podněty z prostředí. Proto je důležité stanovení postupů pro zpracování mikrobiálních vzorků a pro vytvoření MALDI-TOF MS profilů (Carbonnelle 211). Prvních úspěchů ve využití MALDI-TOF MS pro analýzu bakterií bylo dosaženo v roce 1994, kde bylo použito lyzátu buněk (Cain a kol. 1994) a v roce 1996, kdy byly analyzovány celé bakteriální buňky (Holland 1996). V tomtéž roce Krishnamurthy a kol. na základě biomarkerů rozlišili patogenní bakterie Bacillus anthracis, Yersinia pestis a Brucella meliteusis od nepatogenních druhů (Krishnamurthy 1996). V roce 29 byly publikovány práce, jejichž autoři posoudili použitelnost MALDI-TOF MS z hlediska identifikace bakteriálních kmenů izolovaných z klinických vzorků. Z 166 testovaných kmenů bylo 95,4 % správně identifikováno, studie prokázala správnost identifikace na úrovni druhu 84,1 % a 11,3 % na úrovni rodu. V případě 2,8 % izolátů nebylo identifikace dosaženo a nesprávná identifikace se objevila u 1,7 % izolátů. Tyto nedostatky byly připsány na vrub chybám v databázi. Hlavní obtíže byly pozorovány u identifikace Streptococcus pneumoniae a Streptococcus mitis, jelikož jsou to příbuzné druhy a dávají velmi podobná MALDI- TOF hmotnostní spektra. Zjištěná doba potřebná pro identifikaci jednoho izolátu byla 6 minut (Seng 29). Na základě MALDI-TOF MS analýzy 559 izolátů G- bakterií z pacientů s cystickou fibrózou bylo zařazeno do správného druhu 549, zbývajících 1 do správného rodu (Degand 28). Rozsáhlá studie zhodnocující úspěšnost MALDI-TOF MS identifikace bakteriálních druhů v klinické mikrobiologické laboratoři prokázala správnou identifikaci u 162 (95,2 %) z 1116 vzorků (Eigner 29). Bizzini v roce 21 porovnával MALDI-TOF MS s konvenčními fenotypovými metodami. Mezi 1371 izoláty identifikovanými konvečními metodami bylo pomocí 1

18 MALDI-TOF MS stejně zařazeno 1278 (93,2 %) zjištěných druhů a 73 (5,3 %) bylo identifikováno na úrovni rodu (Bizzini 21). Uváděná průměrná doba analýzy a identifikace vzorků bývá méně než 1 minut, nesmí být však opomenuta doba kultivace bakterií, která ovšem zpomaluje i většinu dalších identifikačních metod. MALDI-TOF MS je brána jako 3 až 5 krát levnější ve srovnání s konvenčními metodami identifikace. Tyto výsledky potvrzují význam MALDI-TOF MS pro použití v klinické mikrobiologii, ale také zdůrazňují význam aktualizace databází a metod analýzy, přípravy vzorků atd. pro další zlepšení správnosti identifikace. MALDI-TOF MS může být také využita pro diagnostiku infekcí krevního řečiště či moči přímo ze vzorku. Důležitým krokem je oddělení bakterií od buněčných komponent a jejich lýze. Z některých studií vyplývá, že by tato metoda mohla být použita pro real-time diagnostiku, která by umožnila identifikaci do 3 až 45 minut (Prod'hom a kol. 21). V současnosti se ukazuje i potenciální užití MALDI-TOF MS při detekci antibiotické rezistence bakterií. Pozornost získává především výzkum rozlišení meticilin-rezistentních a meticilin-senzitivních kmenů stafylokoků (Jackson 25). Přehled studií, které se zabývají využitím MALDI TOF MS v klinické mikrobiologii, je uveden v tabulce č

19 Tabulka 1: Shrnutí hlavních studií pro identifikaci bakterií pomocí MALDI TOF MS (převzato z Carbonnelle a kol. 211) Id: identifikace Původ a počet Id na druhové Id na rodové Problémově identifikovatelné Autor vzorků úrovni úrovni bakterie Seng a kol. rutinní vzorek 83,8% 95% Propionobacterium acnes (29) 166 Streptococcus pneumoniae Stenotrophomonas maltophilia Shigella sp. van Veen a kol. (21) Blondiaux a kol. (29) Prod'hom a kol. (21) La Scola a kol. (29) Stevenson a kol. (29) Ferroni a kol. (21) Christner a kol. (21) Ferreira a kol. (21a) Ferreira a kol. (21b) rutinní vzorek 98 rutinní vzorek 362 z krve 126 z krve 599 z krve 212 z krve 685 z krve 277 z krve 3 z moči 22 92% 98.8% Streptococcus pneumoniae anaerobní bakterie 72,9% 87% Streptococcus viridans Shigella sp. 77.8% 78.7% Streptococcus mitis Staphylococcus sp. 76% 76% Streptococcus sp. polymicrobial samples 8,2% 8,2% Streptococcus mitis Propionobacterium acnes 89% 98% Streptococcus pneumoniae Streptococcus mitis 94,2% 95% G+ koky 42.6% 71.6% Streptococcus mutans Staphylococcus sp. Staphylococcus aureus 91.8% 92.7% Streptococcus sp. Enterococcus sp. Raoultella sp. 1.3 Vliv metod přípravy vzorků na vzhled MALDI-TOF hmotnostních spekter s ohledem na detekci proteinů s vyšší molekulovou hmotností Mnoho studií předpokládá, že získání spekter z oblasti vysokomolekulárních iontů (4kDa), může být pro diferenciaci bakterií velmi důležité. Předpokládají, že tyto oblasti obsahují specifické píky s minimálním pozadím (Lay 21). Bylo zjištěno, že relativní intenzita signálů v bakteriálních MALDI-TOF MS profilech je ovlivňována složením rozpouštědla použitého pro suspenzi buněk (Ruelle 12

20 24) či extrakci buněčné bílkoviny (Elhanany 21). Pro detekci vysokomolekulárních proteinů je nejúčinnější zpracovat bakteriální buňky povrchově aktivní látkou před analýzou MALDI-TOF (Chong 1997, Nilsson 1999, Meetani 25), přítomnost povrchově aktivních látek přímo v matrici žádné zlepšení nepřinesla (Williams 23). Možnost zvýšit poměr signál-šum pro vysokomolekulární proteiny popsal Easterling 1998, který vystavil buňky ultrazvuku. Ukazuje se, že přítomnost či nepřítomnost vysokomolekulárních signálů je často spojena s volbou matrice. Použití ferulové kyseliny (FerA) jako matrice umožňuje detekovat bílkoviny s vysokou molekulovou hmotností až do 7kDa (Lay 21, Nilsson 1999, Madonna 2, Meetani 25, Dieckmann 28), určitý pozitivní vliv má i použití kyseliny sinapové (Ryzhov 21, Shaw a kol. 24, Moura 28). Schopnost detekce vysokomolekulárních bílkovin také ovlivňuje složení rozpouštědla matrice (Madonna 2, Vaidyanathan 22, Ruelle 24). Rovněž metoda nanesení vzorku má značný dopad na možnosti detekce vysokomolekulárních bílkovin (Vaidyanathan 22). Přesto, že byly mnoha autory popsány možnosti zlepšení detekce vysokomolekulárních proteinů, žádný z nich nedefinoval přesně vztah těchto změn k diskriminačním schopnostem metody. 1.4 Rod Lactobacillus Rod Lactobacillus je co do počtu zástupců nejbohatším rodem skupiny bakterií mléčného kvašení. Podle taxonomického přehledu Prokaryot se rod Lactobacillus fylogeneticky řadí do domény Bacteria, kmene Firmicutes, třídy Bacilli, řádu Lactobacillales, čeledi Lactobacillaceae. Taxonomie tohoto rodu prochází neustálými změnami. Kromě klasifikace rodu nejsou dořešeny otázky konkrétních druhů, což má vliv na identifikaci a názvosloví kmenů. Podle současných poznatků se tento rod rozděluje do sedmi fylogenetických skupin Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacilus reuteri, Lactobacillus sakei a Lactobacillus salivarius; klasifikace je založena zejména na sekvenování genů pro hsp 6 a 16S rdna, dále pak rpoa, phes a tuf. Momentálně je rozlišováno 171 kmenů a 27 podkmenů ( 13

21 Obrázek 6: Lb. casei, Lb. paracasei, Lb. rhamnosus (Převzato z Tento rod byl poprvé popsán v r. 191 Beijerinckem. Vyskytuje se velmi běžně v různých prostředích. Tvoří část přirozené mikroflóry dutiny ústní, gastrointestinálního traktu a vaginy dospělých žen, kde zkvašují cukry na kyselinu mléčnou a tím snižují ph (kolem 4,5) vagíny potřebné pro ochranu sliznice proti nepříznivým mikroorganismům. Dalším ochranným mechanismem je tvorba antibakteriálních či toxických látek (lakticinů). Většinou jsou nepatogenní, pokud dojde k infekci (zejména Lactobacillus jensenii a Lactobacillus rhamnosus, izolovány jako původci endokarditid, bakteriémií, peritonitid, abscesů a meningitid), laktobacily jsou rezistentní na vankomycin a k léčbě je třeba vysokých dávek penicilinu. Často se laktobacilů využívá v moderním potravinářství např. při konzervaci potravin, kde díky snižování ph potravin zastavují množení hnilobných bakterií. Bohaté využití nacházejí při výrobě krmiv, např. při silážování píce. V mlékárenském průmyslu se využívají jako startovací kultury, pro zlepšení chuti a organoleptických vlastností jogurtů, acidofilních mlék, sýrů. Z jiných potravinářských produktů, ve kterých se laktobacilů využívá, mohou být uvedeny např. fermentované salámy nebo kysané zelí. Laktobacily patří mezi bakterie mléčného kvašení. Některé kmeny tvoří přirozenou mikroflóru mléka. Jsou součástí probiotik, mají tedy významnou roli v lidské výživě a díky tomu je jim v poslední době věnována velká pozornost. Laktobacily jako probiotika kolonizují sliznici střeva a zabraňují přemnožení nežádoucích mikroorganismů (klostridií, enteropatogennů či enterotoxigenních kmenů). Obecně jsou považovány za bakterie bezpečné, ale při užívání probiotik by měl být brán zřetel na rizikové skupiny, jako jsou staří lidé nebo lidé s imunodeficiencí, u kterých mohou vzácně způsobit endokarditidu a různé formy sepsí u dětí. 14

22 1.4.1 Morfologické a fyziologické vlastnosti Na pevných kultivačních půdách se vyskytují ve tvaru pravidelných grampozitivních tyček, občas kokovitého tvaru. Někdy se mohou vyskytovat v palisádovém uspořádání či ve formě krátkých řetízků. Nevytvářejí spory a jsou nepohyblivé (obrázek č.4). Většinou jsou obligátní anaerobové či mikroaerofilové, někteří zástupci jsou kapnofilní. Jsou striktně fermentativní a jako hlavní konečný produkt jejich fermentace je kyselina mléčná, patří tedy mezi bakterie mléčného kvašení. Nevytvářejí katalázu, i když některé kmeny mají pseudokatalázovou aktivitu. Jsou schopny zkvašovat laktózu a jiné cukry. Na základě konečných produktů fermentace cukrů je možno laktobacily charakterizovat fenotypicky do tří skupin (Sedláček 27). obligátně homofermentativní Hexózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou. Pentózy ani glukonát fermentovány nejsou. Zástupci: Lb. delbrueckii ssp. delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. lactis, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Lb. acidophilus, Lb. helveticus, Lb. crispatus, Lb. gallinarum, Lb. gasseri, Lb. johnsonii, Lb. salivarius a další. fakultativně heterofermentativní Hexózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou nebo směs kyseliny mléčné, octové, mravenčí a ethanolu. Pentózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou a octovou. Zástupci: Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. sakei, Lb. paracasei, Lb. curvatus, Lb. acetotolerans, Lb. zeae, Lb. rhamnosus a další. obligátně heterofermentativní Hexózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou, octovou, ethanol a oxid uhličitý. Pentózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou a octovou. Zástupci: Lb. buchneri, Lb. fermentum, Lb. gastricus, Lb. parabuchneri, Lb. composti, Lb. brevis, Lb. mucosae a další Kultivace Rostou na bohatých komplexních médiích. Kultivační půda pevná či tekutá, nejběžněji používané je selektivní médium MRS (de Man, Rogosa a Sharp), která obsahuje pepton, masový extrakt, kvasničný extrakt, glukózu, tween 8, 15

23 hydrogenfosforečnan draselný, octan sodný, citran amonný, síran hořečnatý a síran manganatý. Optimální růstová teplota se pohybuje mezi 3 C až 4 C Identifikace bakterií rodu Lactobacillus Laktobacily můžeme charakterizovat na základě vlastností fenotypových, např. pomocí biochemické charakteristiky, proteinových profilů, fyziologické analýzy či morfologie buněk. Tyto metody jsou často používány a většinou nejsou příliš pracné. Bývají však nespolehlivé při identifikaci blízce příbuzných druhů. Genotypové metody (molekulárně biologické), např. PCR v různých podobách, které jsou schopny rozlišit laktobacily až na úroveň kmene (nutné je mít k dispozici druhově či rodově specifické primery), metody ribotypizace, sekvencování či analýza plazmidové DNA, se využívají spíše k taxonomickým účelům. Molekulárně-biologické techniky bývají založeny na 16S rdna sekvencích, na znalostech genomu či různých specifických sondách. Díky blízké příbuznosti některých druhů je taxonomie rodu Lactobacillus velmi složitá. Klasifikace a nomenklatura např. kmenů Lb. casei, Lb. paracasei a Lb. rhamnosus je velmi ztížena jejich blízkou příbuzností. Pomocí tradičních metod je lze rozeznávat obtížně. Mají podobné fyziologické vlastnosti a požadavky na podmínky kultivace. Klasifikační schémata, aplikovaná v posledních desetiletích pro tyto druhy se neustále mění. Změny jsou ovlivňovány novými poznatky založenými na znalostech sekvencí DNA a také rozmachem molekulárně-biologických metod. Neustálé změny v klasifikaci této skupiny laktobacilů působí obtíže v průmyslovém využití kmenů a ztěžují orientaci v literárních zdrojích (Desai a kol. 26) Problematika v taxonomii laktobacilů Taxonomie rodu Lactobacillus je velmi složitá z důvodu blízké příbuznosti některých druhů. Neustálé změny v taxonomii a zvyšující se počet popsaných druhů je toho důkazem. Zvláště pak nejsou dořešeny otázky některých druhů, např. u druhů Lb. casei, Lb. paracasei, Lb. rhamnosus a Lb. zeae. Tyto druhy jsou si velmi blízké, 16

24 mají podobné fyziologické vlastnosti, nutriční požadavky a rostou za podobných podmínek. Proto byly v minulosti velmi těžko odlišitelné pomocí tradičních metod. Pojmenování Lb. casei bylo uskutečněno v roce 1916 (Orla-Jensen, 1919). Na základě fenotypické identifikace byl jako typový kmen označen Lb. casei subsp. casei ATCC 393 T Hansenem a Lesslemem v roce 1971 a schválen v Approved Lists of Bacterial Names v roce 198. Studie využívající DNA-DNA hybridizační techniky označily kmen ATCC 393 T jako nevhodný typový kmen Lb. casei pro svou nízkou genetickou podobnost s kmeny patřící do druhu Lb. casei (Dellaglio a kol., 1975). Collins a kol. v roce 1989 našel vysokou hladinu DNA homologie mezi kmeny patřícími do druhu Lb. casei a Lb. casei NCDO 151 a překlasifikoval Lb. casei subsp. casei, Lb. casei subpsp. alactosus a Lb. casei subsp. pseudoplantarum na Lactobacillus paracasei (Collins a kol. 1989). Došlo tedy k reklasifikaci velkého množství kmenů Lb. casei na Lb. paracasei. Dellaglio podal první žádost o zamítnutí druhu Lb. paracasei a změnu typového kmene Lb. casei z kmene ATCC 393 na kmen ATCC 334 (Dellaglio, 1991). Tato žádost však byla odmítnuta (Wayene 1994). Další žádost o reklasifikaci typového kmene Lb. casei ze stávajícího ATCC 393 na ATCC 334 a odmítnutí jména Lb. paracasei byla přednesena v roce 1996 (Dicks a kol., 1996). Žádost byla opět zamítnuta, nicméně tento návrh byl podporován ve studiích (Mori a kol. 1997; Chen a kol. 2; Felis a kol. 21). Tito navrhují přeřazení kmene ATCC 393 T z druhu Lb. casei do druhu Lb. zeae. Judicial Commission of the International Committee on Systematics of Bacteria (28) uvádí, že typovým kmenem Lb. casei je stále Lb. casei ssp. casei ATCC 393 T. 17

25 2. Cíl diplomové práce Cílem práce bylo nalezení podmínek přípravy vzorku pro MALDI MS analýzu a nastavení parametrů pro vyhodnocení MALDI MS profilů, které by vedlo k vytvoření metody spolehlivě rozlišující vybrané skupiny bakterií na druhové úrovni. Byl studován vliv podmínek extrakce, frakcionačních kroků, složení roztoku MALDI matrice či metody nanášení vzorku na desku spektrometru na kvalitu a reprodukovatelnost MALDI MS profilů a diskriminační schopnosti metody. Základní taxonomickou skupinou pro práci byl rod Lactobacillus. Součástí práce bylo řešení následujících úkolů: Vliv ředění vzorků rozpouštědly na výslednou kvalitu MALDI-TOF MS profilů Vliv změny poměrů organické a vodné fáze v roztoku matrice na MALDI- TOF MS profily Vliv změn poměrů organické a vodné fáze v rozpouštědle pro extrakci bakteriálních proteinů na MALDI-TOF MS profily Testování různých druhů matric pro získání kvalitních signálů s ohledem na proteiny s vyšší molekulovou hmotností Optimalizace metody MALDI-TOF MS pro detekci signálů z oblasti vyšších molekulových hmotností Test vlivu intenzity laseru na získání spekter v oblasti s vyššími molekulovými hmotnostmi Srovnání standardní metody analýzy s nově vyvinutou metodou Možnost rozlišení Lb. paracasei a Lb. rhamnosus s použitím nově vyvinuté metody 18

26 3. Experimentální část 3.1 Vyšetřovaná skupina bakteriálních kmenů Kmeny analyzované v této diplomové práci byly získány z České sbírky mikroorganismů a Veterinární a farmaceutické univerzity v Brně. Celkově bylo využito 32 kmenů z rodu Lactobacillus. Z toho byly tyto typové kmeny: Lactobacillus casei ssp. casei CCM 788 T Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 T Lactobacillus paracasei ssp. paracasei CCM 1825 T Lactobacillus acidophilus CCM 4833 T Lactobacillus crispatus CCM 71 T Lactobacillus amylovorus CCM 438 T Lactobacillus gallinarum CCM 4383 T Lactobacillus gasseri CCM 79 T Lactobacillus johnsonii CCM 4384 T Pro kalibraci hmot metody bylo použito kmene Escherichia coli DH5 alpha. 3.2 Použitý materiál Kultivační médium MRS médiu s,5% cysteinem V 1 ml destilované vody bylo rozpuštěno 52g M.R.S. Broth (Oxoid) a médium bylo sterilizováno v autoklávu (121 C, 2 min), po zchladnutí média bylo sterilně přidáno 1 ml cysteinu (zásobní roztok 5 % byl 1 x zředěn na výslednou koncentraci,5 %) Chemikálie acetonitril (Merck, Darmstadt, Německo) destilovaná voda (Milli-Q plus 185) (Millipore, Bilerica, Massachusetts, USA) kyselina mravenčí (Riedel de Haën, Německo) kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (Bruker Daltonik, Německo) etanol (Merck, Darmstadt, Německo).5mM Tris (ph 7.4) 19

27 Triton X 1 (Sigma-Aldrich, Německo) guanidine hydrochlorid (Sigma-Aldrich, Německo) TFA (Sigma-Aldrich, Německo) kyselina ferulová (Riedel de Haën, Německo) 2-propanol (Sigma-Aldrich, Německo) kyselina dihydroxybenzoová (Sigma-Aldrich, Německo) kyselina sinapová (Bruker Daltonik, Německo) N,N-dimethyldodecylamine-N-oxide (Sigma-Aldrich, Německo) Přístroje a pomůcky sterilní pasteurky skleněné eppendorfky zn. Eppendorf kalibrované 1,5 ml špičky (BIOHIT, Finsko) pipety (BIOHIT, Finsko) analytické váhy (AB14-S, Mettler Toledo, USA) vortex (MS2 Minishaker, IKA Werke GmbH & Co. KG, Německo) centrifugy (Hettich, Německo), (MiniSpin, Eppendorf, Německo). ultrazvuková čistička (Ultrasonic compact cleaner PS3A, Powersonic, USA) MALDI TOF hmotnostní spektrometr Ultraflex III (Bruker, Německo) software: BioTyper I, BioTyper II, FlexControl, FlexAnalysis (Bruker, Německo) 3.3 Příprava vzorků kmenů pro analýzu a jejich uchovávání Kultivace kmenů Bakterie byly kultivovány pro MALDI-TOF MS analýzu v tekutém médiu MRS obohaceném cysteinem po 24h při 37 C. Následně byly přeočkovány opět do zkumavek s MRS bujónem (Oxoid), ze kterých byly po 2h kultivace při 37 C odebrány sterilní pipetou pro sterilizaci etanolem. 2

28 3.3.2 Sterilizace etanolem V laminárním boxu byly sterilní pipetou nakultivované buňky odebrány do sterilních zkumavek Eppendorf a centrifugovány při 45 ot. 2 minuty. Odstředěné médium bylo odebráno a zbylé buňky byly promyty dvakrát v 9 µl demineralizované vody (DDW), při čemž byl použit vortex po dobu 2s a centrifuga při 45ot. po dobu 2 min. Po druhém promytí bylo k buňkám přidáno 3 ml DDW, mícháno na vortexu a přidáno 9 µl 96% etanolu, znovu mícháno na vortexu 2s a poté proběhla konečná centrifugace 133ot. po 2 min. Vzniklý supernatant byl odpipetován a zbylý pelet byl do doby analýzy uchováván v lednici Úprava vzorků před nanesením na MALDI destičku Pro analýzy prováděné z celých buněk byly použity pelety upravené pouze etanolovou extrakcí, které byly naneseny přímo na terčík MALDI destičky. Pro potřeby analýz bakteriálních extraktů byl použit následující postup extrakce: Pelety byly krátkou centrifugací zbaveny mikropipetou zbytků etanolu. Poté bylo přidáno 25 µl 7% FA, které byly důkladně s peletem promíchány špičkou pipety. Následně bylo dodáno 25 µl ACN a promícháno na vortexu. Následovala dvouminutová centrifugace při maximálních otáčkách (133 ot./min.). Vzniklý supernatant byl odpipetován do nové zkumavky Eppendorf a uchován v mrazícím boxu při -2 C do doby analýzy. Pro kontrolu stability v mrazícím boxu uchovávaných extrahovaných vzorků byla srovnána hmotnostní spektra čerstvě a půl roku zmražených extrahovaných vzorků laktobacilů. Vzorky byly analyzovány standardní metodou s matricí HCCA dle popsaného protokolu Analýza vzorků a kalibrace metod Měření byla prováděna MALDI-TOF hmotnostním spektrometrem Ultraflex III TOF/TOF (Bruker Daltonik, Německo) v lineárním pozitivním módu (urychlovací napětí bylo 25kV). K ionizaci bylo využito laseru SmartBeam pracujícího na vlnové délce 335 nm. Automatický mód byl použit pro sbírání dat u vzorků s homogenní krystalizací matrice. Laser byl zaměřován podle definovaného rastru, z jednoho bodu bylo akumulováno maximálně 4 laserových pulzů. Každý vzorek byl nanesen na 5 pozic MALDI destičky a z každé pozice byly provedeny tři analýzy. Pro kalibraci hmot 21

29 bylo použito extraktu z Escherichia coli DH5 alpha připraveného a analyzovaného podle popsaného protokolu. Spektra v oblasti molekulových hmotností do 2 Da, kde většinou nacházíme ionty pocházející z matrice, nebyla použita k vyhodnocení. Pro vyhodnocení dat bylo použito softwarů FlexControl, FlexAnalysis a BioTyper. 3.4 Metody provedených experimentů Použitá metoda pro test vlivu intenzity laseru a koncentrace extraktu na kvalitu spekter Pro sledování vlivu intenzity laseru a koncentrace extraktu na výsledné spektrum byla vybrána typová kultura Lactobacillus casei ssp. casei 788 T, která byla sterilizována 1,2 ml 75% etanolu. Pelet byl resuspendován v rozpouštědle (7% FA a ACN v poměru 1:1). Použitá matrice: byla použita kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (HCCA) připravena dle doporučeného postupu společnosti Bruker (nasycený roztok ve směsi 5 µl H 2 O, 5 µl 1% TFA, 1 µl ACN). Extrakt vzorku byl nanesen v objemu,3 µl na MALDI destičku v pěti opakováních. Po zaschnutí při pokojové teplotě byl vzorek převrstven,3 µl roztoku matrice. Vzorky byly tedy naneseny metodou Bottom-layer a data byla sbírána automaticky (akumulace po 1 střelách z každého terčíku). Intenzita laseru byla použita v 38 %, 4 % a 43 % na arbitrární stupnici. První ředění bylo provedeno 5 µl extraktu + 2,5 µl směsi 7% FA + ACN (1:1), druhé 5 µl extraktu + 5 µl směsi 7% FA + ACN (1:1) Vliv změny poměrů vody a organické složky v roztoku matrice Použita byla opět typová kultura Lactobacillus casei ssp. casei 788 T, upravená etanolovou sterilizací a extrahovaná směsí 7% FA a ACN v poměru 1:1. Použitá matrice: příprava proběhla dle tabulky 2, kde množství 1% TFA zůstalo zachováno (5 µl) a měnil se použitý objem vody (aq) a acetonitrilu (organická složka, og). HCCA byla přidávána do nasycení roztoku. Pro nanesení vzorku byla použita metoda Bottom-layer po 5 terčících pro každý roztok matrice. 22

30 Tabulka 2: Složení použité matrice H 2 O (µl) ACN (µl) aq : og 15 1: : :1, : ,5: : : Změna poměrů vody a acetonitrilu v extrakčním rozpouštědle Sedm vzorků Lactobacillus casei ssp. casei 788 T bylo kultivováno a sterilizováno obvyklým způsobem. Rozpouštědlo pro extrakci vzorků bylo připraveno dle tabulky 3. Použitá matrice: byla použita HCCA připravena dle doporučeného postupu společnosti Bruker (nasycený roztok ve směsi 5 µl H 2 O, 5 µl 1% TFA, 1 µl ACN). pokus matrice. Pro nanesení vzorku byla použita metoda Bottom-layer po 5 terčících na každý Tabulka 3: Složení rozpouštědla pro extrakci vzorků Lb. casei CCM 788 Vz. č. H 2 O(µl) FA 1% (µl) ACN(µl) Testování různých druhů matric pro získání kvalitních signálů s ohledem na detekci látek s vyšší molekulovou hmotností Vzorek byl připraven podle obvyklého postupu a analyzován jako extrakt. Různé typy matric byly zředěny do požadované koncentrace roztokem připraveným z 2 µl destilované vody + 2 µl 1% TFA + 4 µl ACN. 23

31 Použité matrice: DHB k. 2,5 - dihydroxylbenzoová (2 mg/ml) FerA k.ferulová (1 mg/ml) SA k. sinapová (1 mg/ml) HCCA (nasycená) Nanesení vzorku: a) Bottom-layer, b) Dried-droplet 2,4 µl matrice +,6 µl vzorku pak,6 µl na 5 jamek Ověření použitelnosti metod, které dle publikovaných studií vedly detekci látek vyššími molekulovými hmotnostmi Metoda podle Nilssona 1999 K připraveným peletům bylo přidáno 2 µl,1% TFA. Byla provedena sonifikace po dobu 2 min. Vzniklý bakteriální lyzát byl odstředěn a supernatant byl odebrán. Zbývající pelet byl extrahován v 2 µl 5% ACN, zamíchán na votexu a odstředěn. Vzniklý extrakt byl odebrán pro analýzu. Pro nanášení vzorků a matrice na MALDI destičku byla použita technika Seed-layer. První vrstva (matrice č. 1) obsahovala FerA o koncentraci 1 mg/ml v ACN. Takto vzniklá matrice byla nanesena v objemu,5 µl na MALDI destičku a ponechána zaschnout při laboratorní teplotě. Následně byla převrstvena směsí bakteriálního extraktu a matrice č. 2 v poměru 1:1. Matrice č. 2 vznikla nasycením FerA v roztoku 2-propanol/H 2 O/FA (2:3:1). Metoda dle Reulle a kol. 24 Pelet byl smíchán s,5 µl,1% TFA přímo na MALDI destičce. Po zaschnutí byl převrstven,5 µl etanolu, který byl ponechán zaschnout při laboratorní teplotě. Jako třetí a poslední vrstva byla použita matrice z nasycené HCCA v roztoku ACN/isopropanol/.1% TFA (49:49:2). Po zaschnutí byla provedena analýza. Tato metoda byla testována i bez použití etanolu. Byl použit stejný postup, jen krok převrstvení vzorku etanolem byl vynechán a nanesený vzorek byl po zaschnutí převrstven připravenou matricí. 24

32 Metoda dle Madonny a kol. 2 Vzorek byl upraven sterilizací etanolem, pro analýzu byl použit vzorek extrahovaný dle obvyklého postupu v množství,3 µl na MALDI destičku a po zaschnutí při pokojové teplotě převrstven,3 µl matrice, která byla připravena z FerA o koncentraci 12,5 mg/ml v roztoku FA/ACN/H 2 O (17:33:5). Po zaschnutí byla provedena analýza. Metoda dle Meetaniho a kol. 25 K analýze byly použity celé bakterie sterilizované etanolem. Pro první pokus byla použita jako matrice HCCA, v druhém pokusu FerA. Matrice HCCA byla připravena dle postupu doporučeného společností Bruker. Druhá matrice byla FerA o koncentraci 12,5 mg/ml v roztoku FA/ACN/H 2 O (17:33:5). Pelet nanesený na destičku byl převrstven 1 µl povrchově aktivní látky N,N-dimethyldodecylamine-N-oxidu (DDA) o koncentraci 1mM. Směs byla ponechána zaschnout při pokojové teplotě a následně byla převrstvena,5 µl jednou z matric. Stejný postup byl uplatněn i při použití buněčného extraktu, který jsme nanesli v množství,5 µl na MALDI desku. Metoda dle Chonga et al Použitými matricemi byly opět HCCA připravená dle společnosti Bruker a FerA připravená stejným způsobem jako u metody dle Meetaniho. Prvním krokem byla lyze buněk v roztokou.5 mm Trispuferu (ph 7.4), 2 M gu-hcl a 2% Tritonu. Buňky s tímto roztokem byly zamíchány na votexu po dobu 3s a centrifugovány (2 min. 13,5 ot. /min.). Vzniklý supernatant byl použit k analýze. Se zbylým peletem byl postup opakován. Oba vzniklé supernatanty byly smíchány a v množství,3 µl naneseny na destičku. Po zaschnutí při pokojové teplotě byly vzorky převrstveny jednou z matric Modifikace metody dle Madonny a kol. 2 Protokol přípravy analýzy dle Madonny se ukázal pro naše potřeby nejvhodnějším, nízká homogenita vzorku po zaschnutí na desce však neumožnila automatický sběr dat. Proto byly studovány různé modifikace metody. K analýze bylo vždy použito extraktu ze sterilizovaného vzorku. Jako matrice bylo vždy použito kyseliny ferulové. 25

33 Na MALDI destičku jsme pokaždé nanesli extrakt i matrici v objemu,2 µl na 5 terčíků pro každou koncentraci metodou bottom-layer. Změna koncentrace FerA Základní roztok pro ředění matrice byl připraven: FA/ACN/H2O 17:33:5. Postup přípravy matric je zobrazen v tabulce 4. Tabulka 4: Příprava matric s různými koncentracemi FerA Vz. č. Koncentrace FerA (mg/ml) Navážka FerA (mg) Množství základního roztoku (µl) 1 5, ,5, ,5 1, ,5 1, (nasycený roztok) 2,2 11 Změna poměru ACN a H 2 O v základním roztoku pro Madonnu Koncentraci FerA v matrici jsme použili 12,5 mg/ml základního roztoku (ZR). Množství FA bylo neměnné. Postup přípravy ZR lze nalézt v tabulce 5. Tabulka 5: Příprava základních roztoků pro Madonnu Vz. č. FA:ACN:H 2 O Naváženo FerA (mg) Množství ZR (µl) 1 17:15:68 1,1 (FerA nerozpuštěn) :25:58, :33:5 1, :4:43 1, :5: Změna poměru FA a H 2 O v základním roztoku Madonny Koncentraci FerA v matrici jsme použili 12,5 mg/ml základního roztoku. Množství ACN bylo konstantní. Postup přípravy základního roztoku lze nalézt v tabulce 6. Tabulka 6: Postup přípravy základního roztoku při změně množství FA a H 2 O Vz. č. FA:ACN:H 2 O Naváženo FerA (mg) Množství ZR (µl) v ZR 1 1:33:66 1, :33:62, :33:55, :33:5 1, :33:42 1, 8 6 4:33:27 1,