MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2013 PAVLÍNA ZEDNÍČKOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Metody identifikace probiotických mikroorganismů Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Gabriela Zorníková, Ph.D. Vypracovala: Pavlína Zedníčková Brno 2013

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Metody identifikace probiotických mikroorganismů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis.

PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych chtěla poděkovat vedoucí mé bakalářské práce Ing. Gabriele Zorníkové Ph.D. za to, že si mě převzala již po ukončení zadávání témat a za odborné vedení.

ABSTRAKT Tato bakalářská práce pojednává o probiotických mikroorganismech a metodách jejich detekce. Probiotika jsou čím dál častěji využívána pro výrobu různých potravin, zejména díky jejich příznivému účinku na zdravotní stav konzumenta. V práci byly popsány některé probiotické rody a druhy a jejich účinky. Dále je zaměřena na různé metody stanovení těchto mikroorganismů. Koncentraci probiotik ve výrobku můžeme stanovit mikrobiologickými metodami, pro určení rodu nebo druhu se používají biochemické testy nebo častěji metody molekulární biologie jako je např. polymerázová řetězová reakce (PCR). PCR a její modifikace jsou moderní, rychlé, citlivé a účinné metody využívané v mnoha oblastech výzkumu. KLÍČOVÁ SLOVA probiotika, bakterie mléčného kysání (BMK), mikrobiologické metody, biochemické testy, polymerázová řetězová reakce (PCR) ABSTRACT This bachelor thesis deals with the probiotic microorganisms and methods for their detection. Probiotics are increasingly used for the production of various type of food, especially due to their beneficial effects on the health of the consumer. In this work is focused some probiotic genus and species and their effects. To determine the concentration of probiotics in the product we use microbiological methods. To determine the genus or species we use biochemical tests or methods of molecular biology, for example polymerase chain reaction (PCR). PCR and its modifications are modern, fast, sensitive and effective methods used in many research areas. KEY WORDS probiotics, lactic acid bacteria (LAB), microbiologic methods, biochemical tests, polymerase chain reaction (PCR)

OBSAH 1 ÚVOD... 10 2 CÍL PRÁCE... 11 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 12 3 PROBIOTIKA... 12 3.1 Definice probiotik... 12 3.2 Vlastnosti probiotik... 12 3.3 Probiotické rody a druhy... 13 3.3.1 Bakterie mléčného kysání (BMK)... 13 3.3.1.1 Rod Lactobacillus... 14 3.3.1.1.1 Rod Lactobacillus, skupina I... 15 3.3.1.1.2 Rod Lactobacillus, skupina II... 15 3.3.1.1.3 Rod Lactobacillus, skupina III... 16 3.3.1.2 Rod Bifidobacterium... 18 3.3.1.3 Rod Enterococcus... 19 3.3.1.4 Rod Streptococcus... 19 3.4 Zdravotní aspekty... 20 3.5 Mikroflóra zažívacího traktu člověka... 21 3.6 Vliv probiotik na některá onemocnění... 22 3.6.1 Průjmová onemocnění... 22 3.6.2 Zánětlivá onemocnění střev... 23 3.6.3 Nádorová onemocnění... 23

3.6.4 Atopický ekzém... 24 3.6.5 Onemocnění vyvolaná Helicobacter pylori... 24 3.7 Probiotikum jako funkční potravina... 24 3.7.1 Prebiotika... 25 3.7.2 Synbiotika... 25 3.8 Zdroje probiotik... 25 3.8.1 Kysané mléčné výrobky... 26 3.8.2 Sýry... 27 3.8.3 Zmrzlina a mražené krémy... 27 3.8.4 Sušené výrobky... 27 3.8.5 Fermentované masné výrobky... 27 4 METODY STANOVENÍ PROBIOTICKÝCH MIKROORGANISMŮ... 28 4.1 Mikrobiologické metody... 28 4.2 Biochemické metody... 28 4.2.1 Extracelulární enzymatická aktivita mikroorganismů... 28 4.2.2 Intracelulární enzymatická aktivita mikroorganismů... 29 4.2.3 Diagnostické testy... 29 4.2.4 Doplňkové testy... 29 4.3 Molekulárně - biologické metody... 30 4.3.1 Modifikace PCR využitelné pro stanovení probiotik... 30 4.3.1.1 Interrepetitivní PCR (REP-PCR)... 30 4.3.1.2 Kvantitativní PCR (qpcr)... 30

4.3.1.3 Reverzně transkripční PCR (RT PCR)... 32 4.3.1.4 Náhodná PCR (AP PCR)... 33 4.3.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR)... 33 4.3.2.1 Princip PCR... 33 4.3.2.2 Komponenty reakce... 34 4.3.2.3 DNA templát pro PCR... 35 4.3.2.4 Kroky PCR... 35 4.3.2.5 Detekce produktu PCR... 37 4.3.2.5.1 Agarová gelová elektroforéza... 38 5 ZÁVĚR... 39 6 POUŽITÁ LITERATURA... 40 7 SEZNAM OBRÁZKŮ... 45 8 SEZNAM ZKRATEK... 46

1 ÚVOD Probiotika a výrobky obohacené těmito mikroorganismy hrají důležitou roli ve výživě člověka. Mají příznivý účinek na zdraví konzumenta, zejména na gastrointestinální trakt, který osidlují a zabraňují tak rozvoji patogenních mikroorganismů. Mezi nejčastěji používaná probiotika patří bakterie mléčného kvašení, jejichž hlavním metabolitem je kyselina mléčná. Řadíme sem rody Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus a Bifidobacterium. Probiotika a jejich pozitivní účinky jsou stále předmětem mnoha studií. V poslední době se sleduje zejména prevence rakoviny, zánětlivých střevních onemocnění, atopických ekzémů, infekce vyvolaná H. pylori apod. Stanovit probiotické mikroorganismy ve výrobku můžeme různými metodami. Mikrobiologické metody umožňují poměrně rychle a s možností vyjádřit výsledek v běžných jednotkách určit přítomnost mikroorganismů. Biochemické testy jsou založeny na zjištění biologických vlastností, kdy se prokazuje enzymatická aktivita bakterií. Nejrychlejší, nejpřesnější a vysoce citlivou metodou je metoda molekulární biologie polymerázová řetězová reakce (PCR) a její modifikace. Princip PCR je založen na replikaci nukleových kyselin, kdy se cyklicky opakuje syntéza nových řetězců vybraných úseků DNA prostřednictvím enzymu DNA polymerázy. Výsledný produkt PCR se ověřuje na agarové gelové elektroforéze. 10

2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce bylo: prostudovat odbornou literaturu zabývající se probiotickými mikroorganismy zaměřit se na zdravotní aspekty probiotik a možnosti technologického využití prostudovat metody identifikace probiotických mikroorganismů, zejména mikrobiologické, biochemické a molekulárně-biologické metody podrobněji popsat metodu polymerázové řetězové reakce (PCR), příp. další modifikace PCR využitelné v tomto zaměření. 11

LITERÁRNÍ PŘEHLED 3 PROBIOTIKA Probiotika jsou živé nepatogenní mikroorganismy, které mají pozitivní vliv na organismus, zejména střevní mikroflóru (Tannock, 2002). Výrobky obohacené o probiotické mikroorganismy řadíme mezi funkční potraviny, tedy potraviny, které mají kromě výživové hodnoty příznivý účinek na zdraví konzumenta, jeho fyzický a duševní stav (Kalač, 2003). 3.1 Definice probiotik Název probiotikum pochází z řeckého,,probio = pro život a za jeho protiklad se považuje slovo,,antibiotikum, které se používá pro látky mikrobiálního původu, jež jsou antagonisty zejména choroboplodných bakterií (Görner, 2004). Poprvé bylo slovo probiotikum použito v roce 1965 a to pro látky vytvářené určitým mikroorganismem, které podporují růst jiného mikroorganismu. V současné době je nejpoužívanější Fullerova definice z roku 1989:,,Probiotika jsou živé mikroorganismy přidávané do potravin, které příznivě ovlivňují zdraví jejich konzumenta zlepšením rovnováhy jeho střevní mikroflóry. Definice, kterou doporučují evropští odborníci, je však poněkud širší: probiotika jsou živé mikrobiální přídavky do potravin, které mají příznivý vliv na lidské zdraví (Kalač, 2003). 3.2 Vlastnosti probiotik Probiotika jsou bakterie, které mají schopnost překonat nepříznivé prostředí v žaludku člověka, zejména nízké ph, přítomnost kyseliny chlorovodíkové, proteolytických enzymů hlavně lysozymu, který způsobuje rozklad i pravých jogurtových bakterií. Dále musí být odolné proti žlučovým kyselinám a nízkému povrchovému napětí v zažívacím traktu. Zvláště významným faktorem, který musí probiotické bakterie překonat, je peristaltika střev, respektive rychlost, kterou prochází potravina trávicím a zažívacím traktem (Görner, 2004). 12

Mezi základní vlastnosti probiotických mikroorganismů patří tedy hlavně tolerance k nízkému ph, lysozymu, povrchovému napětí typickému pro prostředí zažívacího traktu, nárokům na kyslík a metabolické aktivitě. Takovéto mikroorganismy mají probiotické účinky a splňují následující podmínky: jsou jednoznačně lidského původu jsou úplně neškodné pro lidský organismus (musí splňovat podmínku,,gras = Generally Regarded As Safe) mají prokazatelný pozitivní vliv na kvalitativní a kvantitativní složení normální střevní mikroflóry, na osídlení střevní sliznice příznivou mikroflórou potlačují choroboplodné střevní bakterie zlepšují frekvenci stolice přirozeně se vyskytují v zažívacím traktu savců přežívají v horních částech zažívacího traktu setrvávají a rostou ve střevech vykazují v zažívacím traktu pozitivní metabolickou aktivitu a zachovávají vitalitu a aktivitu v produktu až do doby konzumace (Gajdůšek, 2000). 3.3 Probiotické rody a druhy V současné době jsou mezi probiotika řazeny hlavně druhy rodů Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus a Saccharomyces (Nevoral, 2005). 3.3.1 Bakterie mléčného kysání (BMK) Mezi nejvýznamnější probiotické mikroorganismy patří bakterie mléčného kysání. Patří sem řada různých mikroorganismů, které jsou klasifikovány společně podle tvorby stejného produktu kyseliny mléčné. BMK tolerují ph kolem 4 po několik týdnů. Jsou grampozitivní, anaerobní, mikroaerofilní, popř. fakultativně anaerobní většinou ve tvaru koků, ovoidů nebo tyčinek. 13

BMK dělíme do dvou kategorií podle konečných produktů jejich metabolismu homofermentativní a heterofermentativní nebo optimální teploty růstu mesofilní a termofilní. Teplotní optimum pro mesofilní bakterie je v rozmezí 25 30 o C. Termofilní BMK preferují teploty v rozmezí 40 44 o C a rostou rychleji než mesofilní bakterie (Gajdůšek, 2000). 3.3.1.1 Rod Lactobacillus Rod Lactobacillus zahrnuje mikroaerofilní nebo fakultativně anaerobní bakterie, které jsou nepohyblivé, tyčinkovitého tvaru. Řadíme je mezi BMK (Görner, 2004). Jsou hojně rozšířeny v přírodě. Laktobacily jsou důležité jak z hlediska potravinářského, tak biotechnologického. Některé významné druhy jsou vyobrazeny na obrázku č. 1 a 2. V mléce některé druhy vyvolávají přirozené kysání, kdy dochází k fermentaci laktosy na kyselinu mléčnou a vznikají kysané neboli fermentované mléčné výrobky. Dále se přirozeně vyskytují v ústech, trávicím ústrojí savců, na travinách či obilí, ale i jiných rostlinách a půdě (Šilhánková, 1995). Podle zkvašování laktosy dělíme bakterie na homofermentativní a heterofermentativní. Homofermentativní druhy zkvašují laktosu primárně na kyselinu mléčnou (70-90 %), patří sem hlavně laktobacily I. skupiny a některé druhy II. skupiny. (viz tabulka č. 1 a č. 2). Heterofermentativní bakterie fermentují laktosu na kyselinu mléčnou (50 %), kyselinu octovou, ethanol a CO 2. Sem řadíme zejména druhy III. skupiny (viz tabulka č. 3). Obr. 1: Lactobacillus acidophilus Obr. 2: Lactobacillus bulgaricus (Kaláb, 2005) (Kaláb, 2006) 14

3.3.1.1.1 Rod Lactobacillus, skupina I Z více jak 90 % fermentují hexosy na kyselinu mléčnou, pentosy a glukonáty nefermentují. Řadíme sem všechny termobakterie, tedy bakterie, které rostou při vyšších teplotách okolo 45 o C. Tabulka 1: Zástupci obligátně homofermentativních laktobacilů (Görner, 2004) Druh Růst při 15 o C 45 o C Prostředí, ve kterém se převážně vyskytuje a jiná charakteristika L. delbrueckii ssp. delbrueckii - + rostlinný materiál fermentovaný při vyšších teplotách (40 50 C) L. delbrueckii ssp. bulgaricus - + jogurty a sýry L. delbrueckii ssp. lactis - + kyselé mléko, sýry, lisované kvasnice, obilné zápary L. casei ssp. helveticus - + kyselé mléko, tvrdé sýry, ementálská kultura, maximum při 50 52 C L. acidophilus - + trávicí trakt lidí a zvířat, ústní dutina L. salivarius - + ústní dutina a intestinální trakt lidí L. farciminis + - masové produkty (nevařené uzeniny), pekárenský kvas, snáší 10 12 % NaCl L. yamanashiensis + - jablečný mošt a víno, hroznový mošt 3.3.1.1.2 Rod Lactobacillus, skupina II Do této skupiny patří fakultativně heterofermentativní laktobacily, které fermentují hexosy na kyselinu mléčnou a při nedostatku glukosy některé druhy produkují kyselinu octovou, ethanol a kyselinu mravenčí. Pentosy fermentují pomocí indukovatelné fosfoketolasy, tedy enzymu, který odpovídá na indukci ve směru růstu, zvětšení apod. 15

Tabulka 2: Zástupci fakultativně heterofermentativních laktobacilů (Görner, 2004) Druh Růst při 15 o C 45 o C Prostředí, ve kterém se převážně vyskytuje a jiná charakteristika L. alimentarius + - marinované rybí produkty, masové produkty, pekárenský kvas, roste při 10 % NaCl, tvoří acetonin L. bavaricus (L. sake) + - kysané zelí, fermentované zelné listy, převážně L- kyselina mléčná, růst mezi 2 37 C L. casei ssp. casei + - mléko, sýry, mléčné produkty, pekárenský kvas, siláž, ústní dutina a zažívací trakt lidí L. casei ssp. pseudoplantarum + - jak výše L. casei ssp. rhamnosus + + jak výše, jediný laktobacil rostoucí při obou teplotách L. case ssp. tolerans + - jak výše, přežívá pasteraci (72 o C, 40s) L. curvatus + - mléko, siláž, kravský hnůj, masové produkty, pekárenský kvas L. maltaromaticus + - mléčné produkty, siláž, pekárenský kvas, lidský gastrointestinální trakt, ústní dutina L. plantarum + - mléčné produkty, siláž, pekárenský kvas L. sake (L. bavaricus) + - kysané zelí a jiné fermentované zeleninové potraviny, masové produkty, pekárenský kvas, růst při 2 4 C, původně izolovaný z kvasnic 3.3.1.1.3 Rod Lactobacillus, skupina III Třetí skupina rodu Lactobacillus zahrnuje obligátně heterofermentativní bakterie, které fermentují hexosy na kyselinu mléčnou, octovou (ethanol) a oxid uhličitý. Pentosy zkvašují na kyselinu mléčnou a octovou. 16

Tabulka 3: Zástupci obligátně heterotrofních bakterií rodu Lactobacillus (Görner, 2004) Druh Růst při Prostředí, ve kterém se převážně vyskytuje a 15 o C 45 o C jiná charakteristika L. bifermentas + - při 1 % koncentraci fermentuje hexosu, je heterofermentativní, izoluje se z holandských sýrů s malými trhlinami L. brevis + - mléko, sýry, kysané zelí, siláž, intestinální trakt a ústní dutina lidí L. buchneri + - mléko, sýry, lidská dutina ústní L. confusus (Weisella confusa) L. divergens (Carnobacterium divergens) + +/- cukrová třtina, mrkvová šťáva, příležitostně v surovém mléku a slinách + - vakuově balené chlazené maso L. fermentum - + kvasnice, mléčné produkty, pekárenský kvas, kravský hnůj L. fructivorans + - kazící se majonéza, salátové dresinky, kazící se dezertní vína a aperitivy, upřednostňují ph 5,0 5,5 L. halotolerans (Weisella halotolerans) + - masové produkty L. kandleri + - produkce slizu ze sacharózy L. kefir + - kefír L. reuteri - + masové produkty, lidské a zvířecí fekálie L. sanfrancisciscensis (syn. L. sanfrancisco) L. viridescens (Weisella viridescens) + - pekárenský kvas + - nepřirozeně zbarvené masové produkty, pasterizované mléko 17

3.3.1.2 Rod Bifidobacterium Bifidobacterium je anaerobní rod, pro který je charakteristická tvorba acetátu a laktátu ze sacharidů v poměru 3:2 za současné produkce malého množství ethanolu, sukcinátu a mravenčanu. Tvar buněk je velmi polymorfní a nepravidelný, mohou se vyskytovat v podobě koků, kyjovitých útvarů, ale i dlouhých větvených tyčinek. Nejčastěji se vyskytují v trávicím traktu kojenců krmených mateřským mlékem, ale i v traktu dospělých lidí a zvířat (Šilhánková, 1995). Jsou to nepohyblivé mikroorganismy a snáší i velmi kyselé prostředí. Některé druhy jsou tolerantní k přítomnosti určitého množství O 2, ale jen za přítomnosti CO 2 nebo bifidogenních faktorů. Bifidogenní faktory spolu s obsahovými látkami a vlastnostmi mateřského mléka podporují růst bifidobakterií v tlustém střevě a patří sem zejména laktulosa (β-galaktosidofruktosa), N-acetyl-D-glukosamin obsahující sacharidy (bifidus faktor 1), transgalaktosyl oligosacharidy a další. Optimální růst těchto bakterií je v rozmezí teplot 37 o C - 41 o C a optimální hodnota ph pro růst je 6,5 7,0. Mezi nejpoužívanější druhy pro probiotické účely se využívají Bifidobacterium ssp. BB12, Bifidobacterium breve (Obr. 3) a Bifidobacterium longum BB536 (Görner, 2004). Obr. 3: Bifidobacterium breve (Kaláb, 2006) 18

3.3.1.3 Rod Enterococcus Enterococcus je mikroaerofilní rod s anaerobním katabolickým metabolismem, tvoří pouze kyselinu mléčnou jako jediný metabolismus cukrů, podílí se na tvorbě aroma a chutnosti výrobků. Patří mezi homofermentativní bakterie mléčného kvašení. Některé druhy se přirozeně vyskytují v trávicím traktu člověka i jiných savců. Jsou odolnější než střevní tyčinky k nepříznivým podmínkám. Používají se také jako indikátory fekálního znečištění (Šilhánková, 1995). Jejich využití a význam je velmi široký. U některých mléčných a masných výrobku se podílejí na tvorbě aroma a chuti, ale u některých potravin mohou způsobit i jejich zkažení. Můžeme je využívat jako startovací kultury v masném či mléčném průmyslu i jako probiotika. Jako probiotika se využívají zejména E. faecalis a E. faecium (Obr. 4), jsou to však podmíněné patogeny, které jsou velmi častou příčinou fekálního znečištění vody nebo nozokominálních infekcí u lidí, kde způsobují různé druhy infekcí a onemocnění jako např. enteritidy, infekce močových cest aj. (Martincová, 2012). Např. E. faecium M 74 se využívá jako probiotikum i u nemléčných potravin (Görner, 2004). Obr. 4: Enterococcus faecium (www.profimedia.cz) 3.3.1.4 Rod Streptococcus Jsou to grampozitivní, fakultativně anaerobní, nesporulující mikroorganismy. Streptokoky mají okrouhlé nebo vejčité buňky. Tvoří řetízky uspořádané v párech a jsou nepohyblivé. Optimální teplota je 37 o C, s výjimkou termofilních druhů S. salivarus ssp. thermophilus (Obr. 5 a 6). Rostou na polotuhých médiích na krevním agaru, tvoří většinou bezbarvé kolonie. 19

Tvoří skupinu velmi rozmanitých druhů, od parazitických až po saprofytické. Saprofytické druhy se využívají v potravinářství a jsou zahrnuté především (dle novějšího zařazení) v rodech Lactococcus a Enterococcus, patří k nim i S. salivarus ssp. thermophilus (Görner, 2004). Obr. 5 a 6: Streptococcus salivarus ssp. thermophilus (Kaláb, 2007) 3.4 Zdravotní aspekty Mezi základní funkce probiotik a tedy i BMK patří dietetická a ochranná funkce. Z dietetického hlediska dochází při tvorbě kyseliny mléčné (i dalších kyselin) ke snižování ph ve střevním traktu a tím dochází ke zvyšování vstřebávání vápníku, fosforu a železa, stabilizuje se produkce vitamínů skupiny B a také se tlumí rozvoj škodlivé hnilobné mikroflóry. Mléčné bílkoviny jsou lépe stravitelné a mastné kyseliny, vzniklé lipolýzou, příznivě ovlivňují stravitelnost tuků. Ochranná funkce je uplatňována především inhibicí růstu nežádoucích mikroorganismů pomocí produkce antimikrobiálně aktivních metabolitů. Tuto funkci zajišťují především organické kyseliny, peroxid vodíku, biacetyl, oxid uhličitý nebo bakteriociny (Gajdůšek, 2000). Dochází ke snížení tvorby bakteriálních enzymů v tlustém střevě, které mají mutagenní účinky a mohou vyvolávat růst nádorů, a také ke snížení hladiny krevního LDL cholesterolu (Šustová, 2012). Pro dosažení příznivých účinků pro lidské zdraví je spotřebitelům doporučována denní konzumace alespoň 100 g mléčného výrobku s minimálním obsahem 10 miliónů (10 6 ) probiotických bakterií v 1 g nebo 1 ml výrobku (Burdychová, 2008). 20

3.5 Mikroflóra zažívacího traktu člověka Díky probiotikům a prebiotikům se začala podrobněji studovat i střevní mikroflóra. Lékaři jsou přesvědčeni, že díky poznatkům o roli těchto prospěšným bakterií jsou schopni omezit příčiny a mechanizmy vedoucí ke vzniku a rozvoji nemocí (Tannock, 2002). Mechanismus působení probiotik souvisí s jejich schopností soutěžit s patogenními mikroorganismy, znepřátelit si tyto patogeny nebo modulovat hostitelův imunitní systém (Singh et al., 2013). Lidský gastrointestinální trakt (GIT) se skládá z komplexu mikroorganismů, které kolonizují délku střeva. Po narození je GIT v podstatě bez mikrobů. K počátečnímu osídlování střeva mikroorganismy dochází během porodu nebo krátce poté. První mikroorganismy - enterobakterie a laktobacily jsou brzy vytlačeny silnějšími anaerobními druhy. U kojených dětí dominují ve střevní mikroflóře bifidobakterie (Steer et al., 2000). Na obrázku č. 7 je zobrazena mikroflóra GIT dospělého člověka. Obr. 7: Profilizace mikroflóry trávicího traktu člověka (Zbořil et al., 2005) Lidský trávicí trakt obsahuje asi 1,5 kilogramu živých bakterií. Je osídlen více než 500 identifikovanými druhy (Komprda, 2009), z nichž se v horní části střeva nacházejí 21

zejména fakultativně anaerobní bakterie Bacillus, Enterobacter, Lactobacillus, Propionibacterium, Streptococcus a Staphylococcus; v dolní části střeva se pak nachází striktně anaerobní druhy Bacteroides, Bifidobacterium, Clostridium, Eubacterium, Fusobacterium a Peptococcus (Zbořil et al., 2005). Celkový počet bakteriálních buněk více než 10krát převyšuje počet eukaryotních buněk lidského těla. Bakteriální biomasa tvoří více než 60 % hmoty stolice (Komprda, 2009). 3.6 Vliv probiotik na některá onemocnění Potenciál využití probiotik zahrnuje prevenci a léčbu různých zdravotních potíží a nemocí, jako jsou gastrointestinální infekce, zánětlivá onemocnění střev, intolerance laktózy, alergie, urogenitální infekce, cystická fibróza, různé druhy rakoviny, snížení vedlejších účinků antibiotik, ale také jako prevence zubního kazu, onemocnění parodontu, ústního zápachu a mnoho dalších efektů, které jsou předmětem zkoumání (Singh et al., 2013). 3.6.1 Průjmová onemocnění Důvodem používání probiotik k léčbě a zabránění průjmových onemocnění je fakt, že upravují složení mikroflóry tlustého střeva a působí proti střevním patogenům. Nicméně, přesný mechanismus působení probiotik proti enteropatogenům u lidí zůstává neznámý. Bylo navrženo několik možných mechanismů, většinou na základě výsledků in vitro a studiích na zvířatech. Patří mezi ně: syntéza antimikrobiálních látek soutěž o živiny potřebné pro růst kompetitivní inhibice a úprava toxinů nebo jejich receptorů. Některé studie navíc ukázaly, že probiotika stimulují nebo modifikují nespecifické a specifické imunitní reakce s patogeny: ve skutečnosti, některá probiotika zvyšují počet lymfocytů, stimulují fagocytózu, zvyšují specifickou protilátkovou odpověď na vakcínu proti rotavirům apod. Bylo provedeno šest meta-analýz zaměřených na vliv probiotik na akutní infekční průjmy. Na základě výsledků se zjistily tyto příznivé účinky probiotik: zmírnění průjmu a snížení doby trvání 22

důležitá je volba kmenu, nejúčinnější jsou Lactobacillus GG a S. boulardii závisí také na dávce (vyšší pro perorální podání > 10 10 KTJ), významné pro vodnatý průjem a virové gastroenteritidy, ale ne pro invazivní, bakteriální průjem vyšší účinnost při zahájení léčby již v průběhu nemoci (Szajewska, 2007). 3.6.2 Zánětlivá onemocnění střev Složení trávicího traktu je silně ovlivněno různými faktory - věk, strava a nemoci. Probiotika mohou být účinná z hlediska jejich dopadu na hostitelův gastrointestinální trakt a podporu střevní sliznice. Jsou totiž dobře snášena, ale kvalita studií a zdravotních tvrzení je proměnlivá. Existuje mnoho krátkodobých studií prokazující účinnost probiotik při syndromu dráždivého tračníku (IBS). Doporučuje se však vhodná volba specifického kmene pro každý specifický příznak. U zánětlivých střevních onemocnění (IBD) byla prokázána řada výhod po podání probiotik, zejména u ulcerózní kolitidy; u Crohnovy choroby se však neprokázaly žádné důkazy o pozitivním účinku těchto bakterií. Je tedy zřejmé, že některá probiotika mají značný potenciál v řízení IBS a IBD, ale výhody jsou spíše kmenově specifické (Whelan et al., 2013). 3.6.3 Nádorová onemocnění Hlavní příčinou úmrtí na rakovinu v západním světě je kolorektální karcinom (CRC). Přibližně 70% CRC je spojeno s faktory životního prostředí, hlavně se stravou. Díky tomu jsou předmětem zájmu fermentovaná mléka s obsahem probiotických kultur proti CRC. Probiotika mohou příznivě modulovat několik významných střevních funkcí: detoxikační, střevní fermentaci, tranzitní a imunitní systém. Ty totiž mohou výrazně ovlivnit rozvoj rakoviny tlustého střeva (Saikali et al., 2004). Neexistuje však žádný přímý experimentální důkaz potlačení rakoviny u lidí v důsledku spotřeby mléčné kultury ve fermentovaných mléčných výrobcích (Hirayama et al., 2000). 23

3.6.4 Atopický ekzém Dětský atopický ekzém je často prvním příznakem alergie a je spojen ve vysokém počtu případů s přecitlivělostí na jídlo. Epidemiologické údaje naznačují, že změny mikrobů ve střevech nebo mikroby v potravinářských výrobcích mohou mít vliv na vznik alergických onemocnění. Nepřímým důkazem je zjištění, že děti s atopickým ekzémem mají více koliformních bakterií a klostridií a méně bifidobakterií a laktobacilů ve střevní mikroflóře než děti bez tohoto onemocnění (Viljanen et al., 2005). Bezpečnou alternativní stimulaci potřebnou pro vyvíjející se imunitní systém u dětí mohou poskytnout právě probiotika. Klinické studie prokázaly, že standardní léčba dětí s atopickým ekzémem může být významně pozitivně ovlivněna podáním Lactobacillus rhamnosus GG nebo Bifidobacterium lactis BB12. Bylo také prokázáno snížení výskytu alergie na polovinu po podání L. rhamnosus GG nastávajícím maminkám a následně jejich dětí v průběhu prvního půl roku života (Ouwehand, 2007). 3.6.5 Onemocnění vyvolaná Helicobacter pylori Helicobacter pylori bývá hlavní příčinou chronického zánětu žaludku, žaludečních vředů a je rizikovým faktorem vzniku žaludečního karcinomu. Antibiotika proti H. pylori jsou účinná z 90 %, avšak léčba je drahá a způsobuje mnoho vedlejších účinků, včetně rezistence vůči antibiotikům. Právě probiotika by mohla představovat dostatečnou a hlavně levnou alternativu pro zabránění a snížení počtu tohoto patogenu. Různé studie ukazují, že probiotika mají inhibiční účinek na H. pylori jak na zmírnění onemocnění, tak na redukci počtu patogenů. Avšak žádná studie nemůže prokázat úplné vymýcení infekce. Měli bychom tedy probiotika konzumovat spíše dlouhodobě, abychom snížili riziko vzniku tohoto onemocnění (Lebros-Pantoflickova et al., 2007). 3.7 Probiotikum jako funkční potravina Funkční potravina je potravina obsahující takovou složku (živina, jiná složka), která záměrně pozitivním způsobem ovlivňuje jednu nebo více funkcí lidského organizmu a má fyziologický nebo psychologický účinek nad rámec tradičního nutričního účinku. Účinné složky funkčních potravin nazýváme nutriceutika, jejichž hlavní úlohou je především prevence. Významným nutriceutikem jsou právě probiotika. Aby se jejich účinek působení zvýšil, přidávají se do potravin prebiotika (Komprda, 2009). 24

3.7.1 Prebiotika Prebiotikum je skupina nestravitelných látek, které pozitivně ovlivňují růst, přežití a aktivitu probiotických mikroorganismů ve střevě člověka. Nejčastěji se jako prebiotika využívají oligosacharidy inulin a oligofruktosa a musí splňovat následující požadavky: v horní části gastrointestinálního traktu nesmí být látka hydrolyzována nebo absorbována slouží jako selektivní substrát pro pozitivní bakterie tlustého střeva upravují a stabilizují rovnováhu střevní mikroflóry Fermentací inulinu a jemu podobných látek vznikají nižší mastné kyseliny (máslová, mléčná, propionová a octová) a plyny. Vzniká i velké množství bakteriální hmoty, která zvyšuje objem a hmotnost stolice (Görner, 2004). 3.7.2 Synbiotika Podstatou účinku synbiotik je společné působení probiotika a příslušného prebiotika v tlustém střevě po příjmu v potravině. Zajistí se tak, že prospěšná bakterie má k dispozici vhodný substrát a zvýší se tak šance bakterií prosadit se v konkurenčním prostředí trávicího traktu (Komprda, 2009). 3.8 Zdroje probiotik Probiotika se běžně přidávají především do jogurtů a řady dalších fermentovaných mléčných produktů, které pro ně představují přirozené prostředí. Takovéto výrobky jsou označovány např. bifi, bijo, ABT. Dle legislativy musí obsah těchto živých bakterií v produktu být minimálně 10 6 v jednom mililitru nebo gramu (Šustová, 2012). V posledních letech je snaha zařadit tyto prospěšné bakterie i do technologie ostatních mlékárenských výrobků jako jsou sýry, mražené krémy, mléčné deserty, ale i do technologie nemléčných potravin typu cereálních tyčinek, dětské výživy, nemléčných nápojů apod. (Horáčková et al., 2012). 25

3.8.1 Kysané mléčné výrobky Dle vyhlášky č.77/2003 Sb. je kysaným mléčným výrobkem mléčný výrobek, získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi za použití mikroorganismů uvedených v tabulce 4, tepelně neošetřený po kysacím procesu. Tabulka 4: Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích Název kysaného výrobku Použitá kultura Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g Acidofilní mléko Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, příp. termofilní kultury bakterií mléčného kvašení 10 6 Lactobacillus acidophilus Jogurty Kysané mléko, včetně smetanového zákysu, podmáslí, kysané smetany protosymbiotická směs Streptococcus salivarus ssp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus monokultury nebo směsné kultury bakterií mléčného kvašení 10 7 10 6 Kefír Kluyveromyces marxianus i nezkvašující laktózu Sacharomyces unisporus, Sacharomyces cerevisiae, Sacharomyces exignus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství 10 6 BMK 10 4 kvasinky Kefírové mléko Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze Bifidobacterium spp. v kombinaci s mezofilními a termofilními bakteriemi mléčného kvašení 10 6 BMK 10 2 kvasinky 10 6 bifidobakterie 26

3.8.2 Sýry Některé vědecké studie považují jako vhodné nosiče probiotických bakterií sýry. Sýry splňují podmínky vyššího ph, vyššího obsahu tuku a pevné struktury sýra. Tyto parametry zajišťují lepší ochranu probiotik během skladování výrobku i během průchodu gastrointestinálním traktem (Stanton et al., 1998). 3.8.3 Zmrzlina a mražené krémy Probiotické mikroorganismy mohou být přidávány i do zmrzlin a mražených krémů. Musí se však brát ohled na působení velmi nízkých teplot a možné ovlivnění životaschopnosti buněk. Používají se různé kombinace laktobacilů a bifidobakterií. Probiotika mohou být přidávána přímo (při míchání směsi a bezprostředně před zmražením) nebo již při fermentaci mléka pro pomnožení probiotických buněk (Tamime, 2005). 3.8.4 Sušené výrobky Výroba sušených výrobků je velmi rychlá a má nízké provozní náklady. Je to běžná metoda používaná pro výrobu potravinových doplňků, které jsou po vysušení stabilní a zabírají malý objem. Během sušení jsou mikroorganismy vystaveny vysoké teplotě a může dojít k dehydrataci, je tedy nutné zvolit vhodné podmínky sušení, aby nedošlo ke zničení buněk (Lian et al., 2002). Sušené probiotické výrobky se částečně využívají při výrobě kojenecké výživy. Právě děti představují rizikovou skupinu náchylnou k průjmovým onemocněním. Studie Weizmana et al. prokázala, že po přidání L. reuteri a B. lactis do výrobku měly děti krmené tímto přípravkem méně častá a kratší průjmová onemocnění (Weizman et al., 2005). 3.8.5 Fermentované masné výrobky Probiotické masné výrobky jsou poměrně nové a je důležité zajistit probiotickým mikroorganismům vhodné podmínky pro přežití. Na jedné straně představují fermentované masné výrobky dobrý substrát pro probiotické bakterie, jelikož nebývají tepelně opracovávány; na druhé straně mohou být tyto bakterie inaktivovány vysokou koncentrací soli, nízkým ph nebo nízkou aktivitou vody. Je tedy důležité najít kompromis mezi technologickými aspekty, bezpečností, kvalitou a zdravotně prospěšnými účinky potravin (Kołożyn-Krajewskaa et al., 2012). 27

4 METODY STANOVENÍ PROBIOTICKÝCH MIKROORGANISMŮ 4.1 Mikrobiologické metody Mikrobiologické metody umožňují poměrně rychle a s možností vyjádřit výsledek v běžných jednotkách určit přítomnost mikroorganismů ve sledovaném výrobku. Počet a přítomnost daných mikroorganismů se stanoví pomocí kultivačních metod. Principem těchto metod je příprava živné půdy s dostatkem živin pro sledovaný mikroorganismus a výběr správného primárního ředění vzorku - nejčastěji se používá desítkové ředění. Petriho misky se inokulují vzorkem, buď metodou zalití inokula do půdy (1 ml) nebo roztěrem (0,1 ml). Podmínky inkubace jsou pro každý MO odlišné. Po uplynutí doby inkubace se vzorky hodnotí. 4.2 Biochemické metody Mikroorganismy můžeme identifikovat i pomocí biochemických testů. K jejich rozpoznání nestačí pouze určit morfologické, mikroskopické nebo makroskopické znaky, ale je třeba zjistit celou řadu dalších biologických vlastností. Pomocí jednoduchých biochemických testů se prokáže enzymatická aktivita bakterií. Mikrobiální enzymy dělíme na intracelulární a extracelulární. Extracelulární enzymy jsou většinou hydrolytické povahy a působí na látky vně buňky. Proteiny, lipidy a polysacharidy jsou příliš velké pro vstup do buňky, a proto musí být předem degradovány. Intracelulární enzymy jsou důležité pro výrobu energie a udržení funkcí buňky. Účastní se metabolických pochodů v buňce. 4.2.1 Extracelulární enzymatická aktivita mikroorganismů Extracelulární enzymy degradují komplexní látky až na nejnižší podjednotky. Ty pak mohou být transportovány do buňky a metabolizovány. Provádí se např. důkaz amyláz, kdy dochází k hydrolýze škrobu až na dextriny, maltosu a glukosu. Při hydrolýze kaseinu pomocí proteáz dochází ke štěpení peptidických vazeb za vzniku peptidů, dipeptidů až aminokyselin. Lipázy hydrolyzují lipidy štěpením esterických vazeb na glycerol a mastné kyseliny. 28

4.2.2 Intracelulární enzymatická aktivita mikroorganismů K nejdůležitějším diagnostickým testům bakterií patří fermentace sacharidů. Bakterie tvoří při zkvašování sacharidů organické kyseliny, plyny nebo obojí dohromady. Do živných půd se přidává vhodný indikátor, díky kterému se sleduje tvorba kyselin. Pro testování schopnosti fermentovat sacharidy se používá médium obsahující živný bujón pro růst MO, testovaný sacharid sloužící jako substrát a acidobazický indikátor fenolovou červeň (při neutrálním ph má červenou barvu, v kyselém prostředí se barví žlutě). Pokud dochází k tvorbě plynu, zachytí se v Durhamově zkumavce. Výsledky se vyhodnocují do 48 hodin. Laktosa se štěpí na galaktosu a glukosu. Stanovuje se aktivita enzymu β-d-galaktosidasy, který katalyzuje štěpení laktosy. V mikroorganismu musí být přítomen i enzym permeáza, který umožňuje vstup laktosy do buněk. Bezbarvý substrát o-nitrophenyl-β-galaktopiranosid (ONP) je štěpen β-d-galaktosidasou. Uvolní se o-nitrofenol, který dává žluté zbarvení. (Collins, 1967) Mezi další biochemické testy na intracelulární aktivitu enzymů patří např. důkaz tvorby indolu, test na stanovení produkce H 2 S, schopnost redukce dusičnanů ad. 4.2.3 Diagnostické testy Diagnostické testy jsou na rozdíl od klasických biochemických testů rychlejší a standardnější. Využívá se tzv. mikrotestů, kde je reprezentativní vzorek uspořádán na plastových mikrodestičkách. V jamkách destiček jsou média s příslušným substrátem. Zaočkování se provádí suspenzí z čistých kultur o dané hustotě. Inkubace probíhá 18 24 hodin, dochází k barevným změnám. Výsledky se odečítají a vyhodnocují buď převedením na příslušný kód a následnou identifikaci mikroorganismu v identifikačním registru nebo pomocí počítačových programů. Nejčastěji se využívá McFarlandovy zákalové stupnice, kdy srovnáním zákalu bakteriální suspenze se zákalem BaSO 4 můžeme orientačně určit počet mikroorganismů. 4.2.4 Doplňkové testy Mezi doplňkové testy patří test pohyblivosti, který zjišťuje přítomnost bičíků. Provádí se ve zkumavce v polotuhém médiu, které umožňuje pohyb mikroorganismů. Naočkování 29

se provádí vpichem do média, kdy u pohyblivého kmene se půda zakalí a u nepohyblivého zůstane čirá (Burdychová, 2007). 4.3 Molekulárně - biologické metody Metody molekulární biologie jsou kultivačně nezávislé, rychlé, vynikají specifitou a vysokou citlivostí. Jsou založeny na detekci specifického úseku DNA nebo RNA určitého mikroorganismu. Využívají se především při detekci virů, mykobakterií nebo mikroorganismů, u kterých není možná kultivace nebo je příliš zdlouhavá. V potravinářství se nejčastěji uplatňuje při ověření přítomnosti určitých mikroorganismů v analyzovaném produktu. Základní molekulárně biologickou metodou je polymerázová řetězová reakce (PCR), která je založena na identifikaci genů (Burdychová, 2007). 4.3.1 Modifikace PCR využitelné pro stanovení probiotik Pro stanovení probiotických bakterií se mohou využít i různé modifikace PCR. 4.3.1.1 Interrepetitivní PCR (REP-PCR) Modifikovanou metodou polymerázové řetězové reakce je interrepetitivní PCR (REP - PCR). Tato metoda analyzuje celý genom a využívá přítomnost repetitivních elementů. Amplifikace probíhá pomocí známých repetitivních sekvencí, které se v genomu nachází ve více kopiích a proběhne pouze v případě, že se sekvence nachází v genomu v obrácené orientaci a amplifikovatelné vzdálenosti. Výsledkem je tzv. fingrprint, který je jedinečný. Je to více produktů různé velikosti, jejichž tvorba vychází z rozdílné lokalizace opakujících se elementů a rozdílné vzdálenosti (Šmarda, 2005). 4.3.1.2 Kvantitativní PCR (qpcr) Tato metoda se využívá ke kvantitativnímu stanovení DNA. Je to rychlá, vysoce citlivá a specifická metoda, která umožňuje průběžné sledování tvorby PCR produktů již během jednotlivých amplifikačních cyklů. Velkou výhodou je široké detekční rozmezí v rozsahu několika řádů (Priglová et al., 2002). Principem je amplifikace známého množství kompetitivního templátu spolu se stejným množstvím cílové DNA. Templát obsahuje stejné sekvence pro vazbu primerů jako DNA, rozdíl je pouze ve velikosti. Kvantitativní vyhodnocení získáme z kalibrační 30

křivky porovnáním signálu cílové DNA se signálem templátu, jehož koncentraci známe (Šmarda, 2005). Dnes se nejčastěji využívá metoda pro přímou kvantifikaci PCR-produktu tzv. Real - time PCR neboli PCR v reálném čase (RT PCR, qpcr). Množství nasyntetizované DNA se monitoruje po každé jedné reakci (Bílek et al., 2005), přístroj tedy zaznamenává produkty PCR bezprostředně po jejich vzniku, po každém jednotlivém cyklu PCR (Priglová et al., 2002). Zajistí se tak vysoká senzitivita a robustnost reakce, při které jsme schopni detekovat i malé rozdíly nebo nepatrné množství DNA (Bílek et al., 2005). Využívá se vlastností interkalačních barviv ethidiumbromid (Et-Br) nebo SYBR Green, která fluoreskují po navázání na dvouřetězcovou DNA (Priglová et al., 2002). Je zde i riziko navázání barviv na chybný produkt reakce, proto se používají speciální sondy, které se vážou pouze na specifický produkt reakce a zvyšují tak její účinnost. Sondy fungují na principu interakce dvojice fluoroforů, což jsou specifické molekuly, které emitují světlo určité vlnové délky po předchozí absorpci jiné vlnové délky, přičemž emitovaná vlnová délka je vždy vyšší než absorbovaná (Šmarda, 2005). Fluorofory jsou vázány na 5 a 3 konci oligonukleotidové sondy. Jeden z fluoroforů (na 5 konci) má funkci zářiče (reporter, R ), druhý (na 3 konci) má funkci zhášeče (quencher Q ). Fluorescenční záření je zaznamenáno přístrojovým analyzátorem. Jeho intenzita narůstá s každou vytvořenou molekulou amplikonu. V závislosti na počtu cyklů nebo z kalibrační křivky vnitřního standardu, je pak možno stanovit koncentraci neznámého vzorku (Priglová et al., 2002). Pro detekci produktů qpcr se používá celá řada technologií: barvivo SYBR Green fluoreskuje po navázání na DNA a zvyšuje se s vzrůstajícím množstvím amplikonu sonda TaqMan TM oligonukleotidy, delší než primery, s fluorescenční značkou na 5 konci a zhášečem na 3 konci přenos energie fluorescenční rezonancí (FRET) dvojice fluorescenčně značených sond detekuje změny vzdáleností na základě změny intenzity fluorescence 31

molekulární majáky oligonukleotidy tvoří strukturu vlásenky, která detekuje přítomnost nukleové kyseliny v roztoku Scorpions k hybridizační sondě je kovalentně vázaný PCR - primer AmpliFluor TM včlenění fluorescenčně značeného primeru s vlásenkovou smyčkou do amplikonu LUX využívá dvou primerů a pouze jeden je fluorescenčně značený (Šmarda, 2005). Real Time PCR je vhodná pro aplikace, jako jsou kvantifikace nebo detekce genové exprese (Bílek et al., 2005). 4.3.1.3 Reverzně transkripční PCR (RT PCR) Tato metoda detekuje a analyzuje RNA. Dochází k syntéze dvouřetězcové DNA podle templátu, kterým je mediátorová RNA (mrna) tvořící pouze 1-2 % z celkové RNA. Principem je kopírování mrna do cdna pomocí reverzní transkriptázy. Nejdříve se uskuteční reverzní transkripce a po ní následuje amplifikace DNA. Reverzní transkripce sestává z teplotní denaturace nukleových kyselin, ke které dochází při 94 98 C a inkubace, kde dochází k nasedání primeru na komplementární místa a dochází k syntéze komplementárního řetězce DNA, označovaného jako cdna (Kopecký, 2008). Používají se reversní transkriptázy jako např. MLV (izolovaná z Moloneyho myšího leukemického viru), AMV (izolovaná z ptačího myeloblastického viru) nebo Tth (izolovaná z termofilních mikroorganismů Thermus aquaticus). Reversní transkriptázy M-MuLV a AMV syntetizují cdna až do 10 kb (kilobazí), zatímco termostabilní Tth DNA polymeráza jen do 2 kb. Jedinečnou výhodou enzymu Tth je schopnost uskutečnit reversní transkripci a PCR v jedné reakci a v jedné zkumavce, podstatně se tím snižuje riziko kontaminace a celý proces se zjednodušuje. RT-PCR se nejčastěji využívá k analýze genové exprese, detekci infekčních agens, detekci genetických nemocí apod. (Průša et al., 1998). 32

4.3.1.4 Náhodná PCR (AP PCR) Náhodná PCR bývá také někdy označována jako náhodná amplifikace polymorfní DNA (RAPD). Je to rychlá a jednoduchá technika pro fingrprinting DNA. Je vhodná pro rychlou srovnávací typizaci genomových DNA mikroorganismů a některých rostlin (Šmarda, 2005). Primery o libovolné sekvenci nasedají náhodně na více míst obou řetězců cílové DNA 3 konci směrem k sobě a vznikají tak rozdílné fragmenty s různou velikostí a s různým molárním množstvím. Celá reakce probíhá za mírných podmínek, přičemž se jedná o vysoce účinnou metodu. AP-PCR produkty se využívají pro přípravu hybridizačních sond pro tzv. binární typizaci mikroorganismů, kdy se genomová DNA podrobí hybridizaci se sérií sond. Hybridizace se sondou se udává jako hodnota 1, nezhybridizované molekuly se vyjadřují hodnotou 0. Každý mikroorganismus má pak svůj binární kód vypočtený z celé série hybridizačních sond (Vychodilová, 2009). 4.3.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) PCR byla poprvé zavedena v r. 1985 Kary B. Musillem (Šmarda, 2005). Znamenala obrovský pokrok pro řadu experimentálních přístupů, které byly dříve neproveditelné. Neustále vzrůstá počet aplikací PCR, je snadno ovladatelná, rychlá, levná a přesná. Její použití můžeme snadno aplikovat na potraviny, fekální i střevní vzorky (Karapetsas et al., 2010). Uplatňuje se i při dalších analýzách, např. při detekci mikroorganismů v potravinách, vodě a půdě; mapování geonomů; diagnostice dědičných chorob; v kriminalistice při průkazu identity; analýze DNA z fosilií apod. Tato metoda se vyznačuje vysokou citlivostí a je možné ji využít pro zjištění velmi malého množství nukleové kyseliny ve vzorku. Důležité je použít neporušený úsek DNA a vhodné primery. Je tedy nutná znalost struktury DNA a sekvence, k níž jsou primery komplementární (Králová, 2008). 4.3.2.1 Princip PCR Princip metody je založen na replikaci nukleových kyselin. V podstatě jde o cyklicky se opakující enzymovou syntézu nových řetězců vybraných úseků DNA prostřednictvím DNA polymerázy. Syntéza probíhá ve směru 5 3 (Šmarda, 2005). 33

Nejprve je DNA zahřátá na takovou teplotu, aby došlo k oddělení dvou řetězců nukleové kyseliny. Přidají se dva primery, které jsou komplementární k úseku, jež má být pomnožen. Po ochlazení tyto primery nasednou na DNA. Poté se do reakce dodá enzym DNA-polymeráza a směs deoxynukleotidů. Probíhá inkubace při vhodné teplotě do dokončení celého úseku. Nově vzniklá vlákna slouží jako templáty neboli matrice pro syntézu dalších vláken (Králová, 2008). 4.3.2.2 Komponenty reakce templátová DNA: bakteriální DNA izolovaná z bakteriálních buněk. deoxyribonukleotidy (dntp): ekvimolární směs všech čtyř nukleárních bází (datp, dttp, dctp, dgtp). Slouží jako stavební kameny pro syntézu nových řetězců nukleové kyseliny podle templátu. primery: 2 krátké oligonukleotidy o velikosti 18 25 nukleotidů, které ohraničují specifický úsek DNA. Mají vyvážený poměr G/C a A/T párů a nejsou vzájemně komplementární. enzym DNA polymeráza: katalyzuje syntézu nového vlákna DNA. Pro reakci se používá Taq polymeráza, izolovaná z termofilních mikroorganismů Thermus aquaticus, které žijí v extrémních podmínkách u mořských sopek. Jsou velmi odolné vůči vysokým teplotám (až 1000 o C). Nebo se může použít HotStar polymeráza, která se aktivuje až při prvním kroku reakce denaturaci. reakční pufr: směs iontů, která obsahuje minerální látky pro správnou funkci polymerázy (Mg 2+, K +, ad.) Mg 2+ : kofaktor, tvoří rozpustný komplex s dntp. Pro každou aplikaci je nutno určit optimální koncentraci hořečnatých iontů, jelikož reagují i s primery, templátovou DNA a může tak docházet k chybám a vzniku nespecifických produktů. 34

4.3.2.3 DNA templát pro PCR DNA se skládá z: deoxyribosy (sacharid) fosfodiesterové vazby (mezi sacharidem a bází) báze (purinové adenin, guanin nebo pyrimidinové cytosin, thymin) Fosfát spojuje 5 uhlík jedné deoxyribosy s 3 uhlíkem dalšího sacharidu (Králová, 2008). DNA zajišťuje předávání informací o celém genomu díky dvěma komplementárním řetězcům spojených interakcemi komplementárních bází - A/T, G/C (Obr. 8). Komplementární řetězce drží pohromadě vodíkové můstky; přestože jsou tyto vazby slabé, jejich součet zajišťuje stabilitu molekuly. Mezi adeninem a thyminem je vazba dvojná, mezi cytosinem a guaninem vazba trojná. Podle počtu G/C párů se volí teplota. Obr. 8: Báze DNA (http://orion.chemi.muni.cz) 4.3.2.4 Kroky PCR Reakce probíhá v zařízení zvaném termocykler ve třech po sobě jdoucích krocích (Obr. 9). Teplota se v něm automaticky mění v časových intervalech (Šmarda, 2005). Vzorek se 35

vkládá do tenkostěnné mikrozkumavky, která umožňuje rychlou změnu teploty vzorku. Příprava vzorku obvykle probíhá při teplotě okolo 0 o C, aby nedošlo k předčasné aktivaci enzymu (Burdychová, 2007). Obr. 9: Kroky PCR (Vierstraete, 1999) Denaturace Templát je zahříván na teplotu 95 o C, čímž dochází k jeho denaturaci. Po denaturaci vodíkových můstků se vlákna DNA od sebe oddělí a vzniknou 2 jednovláknové molekuly. Denaturace probíhá zpravidla 1 až 5 minut. Hybridizace Primery se připojují na vlákna vzniklá při denaturaci pomocí vodíkových můstků, které tvoří při vhodných reakčních podmínkách. Dochází tedy k ochlazení na teplotu 55 o C. Teplota závisí na délce oligonukleotidů a na kvantitativním zastoupení párů A/T a G/C. 36

Elongace Dochází k prodlužování řetězce pomocí DNA-polymerázy. Deoxynukleotidy jsou připojovány ve směru 5 3. Teplota se zvyšuje na optimální teplotu enzymu 75 o C. Je nutné optimalizovat reakční podmínky, aby byl výsledek přesný zejména koncentraci Mg 2+ a teplotu hybridizace. Tyto kroky se opakují zpravidla po 30 až 40 cyklech (Obr. 10). Dochází k syntéze úseku (fragmentu) definovaného primery a ty jsou včleněny do nově vznikajících molekul. Hlavní produkt reakce tvoří fragmenty vymezené primery. V prvním cyklu vznikají delší fragmenty, ve druhém již pak fragmenty požadované délky, jejichž množství se exponenciálně zvyšuje v následujících krocích (Králová, 2008). Obr. 10: Exponenciální amplifikace genu (Vierstraete, 1999) 4.3.2.5 Detekce produktu PCR Produkt PCR se nazývá amplikon, je to úsek DNA definované délky o velikosti většinou desítky až tisíce pb (počtu bází). Ověřuje se na agarové gelové elektroforéze (Šmarda, 2005). 37

4.3.2.5.1 Agarová gelová elektroforéza Agarová elektroforéza je standardní metoda pro separaci DNA a RNA fragmentů, analýzu a čištění DNA (Westermeier, 2005). Fragmenty DNA se dělí v elektrickém poli podle jejich velikosti a lze je izolovat přímo z gelu a použít pro další účely. Vhodné podmínky pro jejich dělení zajišťuje typ a koncentrace gelu (Králová, 2008). Agarosa je lineární polymer skládající se z D- a L- galaktosy spojených α - (1 3) a β - (1 4) glykosidickými vazbami (Obr. 11). Agarosové gely se používají pouze pro separaci molekul o velmi vysoké molekulové hmotnosti (Sambrook, 2001), nejčastěji v rozmezí 1000 až 23000 pb. Gely jsou obarveny fluorescenčními barvivy, používá se ethidiumbromid nebo SYBR Green, které jsou viditelné po ozáření pod UV světlem v tzv. transiluminátoru. Vzhledem k tomu, že jsou vmezeřeny do šroubovice, citlivost je závislá na velikosti DNA fragmentu a je nižší pro detekci RNA (Weistermeier, 2005). Obr. 11: Chemická struktura agarosy (Sambrook, 2001) Polyakrylamidové gely se používají pro separaci menších molekul o velikosti 10 až 1000 pb (Šmarda, 2005). Lze tak dělit i jednořetězcové molekuly DNA. Pro posouzení velikosti se používají komerčně dostupné směsi DNA fragmentů o definované velikosti, tzv. markery (Králová, 2008). 38

5 ZÁVĚR V práci jsem se zabývala probiotickými mikroorganismy a metodami jejich detekce. Účinky probiotik na různá onemocnění jsou zkoumány v mnoha studiích, avšak výsledky těchto studií a výzkumů jsou často rozdílné. Některé studie prokázaly jasné důkazy o zlepšení stavu pacientů po podání probiotických kultur, jiné studie naopak vyšly negativně. Jednohlasně se však odborníci shodují na tom, že probiotika mají svůj důležitý a neopomenutelný význam v regulaci střevní mikroflóry a posílení imunity. Jejich konzumace je tedy žádoucí a zdraví prospěšná. S konzumací probiotik také nejsou spojena žádná zdravotní rizika, probiotické výrobky by tedy měly být součástí každodenní stravy. Stanovení probiotických MO ve výrobku se může provádět různými metodami. Přítomnost a koncentraci MO můžeme poměrně rychle určit pomocí mikrobiologických metod, při kterých je důležité zvolit správné ředění vzorku a vhodnou živnou půdu. U biochemických metod se využívá jednoduchých testů, prokazuje se tak extracelulární nebo intracelulární enzymatická aktivita. Extracelulární enzymy degradují komplexní látky až na nejnižší podjednotky. K nejdůležitějším diagnostickým testům bakterií patří fermentace sacharidů. Nejvýznamnější metodou pro stanovení MO je metoda molekulární biologie polymerázová řetězová reakce (PCR) a její modifikace, protože je nejrychlejší, nejpřesnější a vysoce citlivá. Princip je založen na replikaci nukleových kyselin, kdy se cyklicky opakuje syntéza nových řetězců vybraných úseků DNA prostřednictvím DNA polymerázy. Výsledný produkt je pak vyhodnocen pomocí agarové gelové elektroforézy. U některých modifikací např. qpcr dochází k detekci produktu již v průběhu reakce. 39