OPTIMIZATION CHROMATOGRAPHIC ISOLATION OF ANTHOCYANINS

Podobné dokumenty
Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC

ÚSTAV CHEMIE A ANALÝZY POTRAVIN

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

P. Martinková, D. Pospíchalová, R. Jobánek, M. Jokešová. Stanovení perfluorovaných organických látek v elektroodpadech

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS

ROLE SEPARAČNÍCH METOD

Chromatografie. Petr Breinek

UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ DISERTAČNÍ PRÁCE

Příloha 2. Návod pro laboratorní úlohu

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU A SEMDURAMICINU METODOU HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC

EFFECT OF MALTING BARLEY STEEPING TECHNOLOGY ON WATER CONTENT

Hmotnostní detekce v separačních metodách

Acta fytotechnica et zootechnica Mimoriadne číslo Nitra, Slovaca Universitas Agriculturae Nitriae, 2009, s

Klinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie

Pentachlorfenol (PCP)

L 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie

Stanovení sacharidů ve vybraných přírodních matricích pomocí kapalinové chromatografie s odpařovacím detektorem rozptylu světla (HPLC-ELSD)

Diagnostika bronchiálního. ho astmatu HPLC/MS analýzou. Kamila Syslová Ústav organické technologie

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - OCHRATOXIN A

Superkritická fluidní extrakce (SFE) Superkritická fluidní extrakce

Příloha 1. Návod pro laboratorní úlohu

P. Martinková, R. Jobánek, D. Pospíchalová. Stanovení vybraných léčiv v čistírenském kalu

RESEARCH OF ANAEROBIC FERMENTATION OF ORGANIC MATERIALS IN SMALL VOLUME BIOREACTORS

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

CS Úřední věstník Evropské unie L 54/89

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Vyhledávání a charakteristika genů zodpovědných za modré zabarvení obilky pšenice seté (Triticum aestivum L.)

CS Úřední věstník Evropské unie L 54/85

Obor: Zemědělské biotechnologie Specializace: Rostlinné biotechnologie Katedra agroekologie. Bakalářská práce

Iontové zdroje II. Iontový zdroj. Data. Vzorek. Hmotnostní analyzátor. Zdroj vakua. Iontové zdroje pracující za sníženého tlaku

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu metodou HPLC

The target was to verify hypothesis that different types of seeding machines, tires and tire pressure affect density and reduced bulk density.

VÝSLEDKY PLOŠNÉHO SLEDOVÁNÍ VYBRANÝCH PESTICIDŮ A JEJICH METABOLITŮ V PITNÉ VODĚ V ČESKÉ REPUBLICE

Sarkosin jako jednoduchý test na rakovinu prostaty analytická studie přednášky Natalia Cernei

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

THE PREDICTION PHYSICAL AND MECHANICAL BEHAVIOR OF FLOWING LIQUID IN THE TECHNICAL ELEMENT

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Hmotnostní spektrometrie. Historie MS. Schéma MS

COMPARISON OF VOLATILE OIL CONTENT EVALUATION METHODS OF SPICE PLANTS SROVNÁNÍ METOD STANOVENÍ OBSAHU SILICE V KOŘENINOVÝCH ROSTLINÁCH

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE - kvalitativní i kvantitativní detekce v GC a LC - pyrolýzní hmotnostní spektrometrie - analýza polutantů v životním

SBORNÍK PŘÍSPĚVKŮ. XLI. Symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin Skalský Dvůr

Repetitorium chemie IX (2016) (teorie a praxe chromatografie)

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Příloha 1: Série chromatogramů vybraných standardů polyfenolických látek zaznamenány pomocí metody HPLC s detekcí UV-DAD.

Hmotnostní spektrometrie - Mass Spectrometry (MS)

Kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí Teoretický úvod

Metodický postup pro stanovení PAU v půdách volných hracích ploch metodou HPLC a GC

Separační metody v analytické chemii. Kapalinová chromatografie (LC) - princip

2. Stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu v medu pomocí kapilární elektroforézy

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti LC-NMR 1. Jan Sýkora

STUDIUM KINETIKY SORPCE TĚKAVÝCH ORGANICKÝCH LÁTEK NA VLÁKNA SPME PŘI ANALÝZE METODOU GC/MS

STUDIUM KONDENZOVANÝCH ANTHOKYANINOVÝCH PIGMENTŮ. Renáta Myjavcová

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Studium migrace látek z UV zářením vytvrzovaných systémů UV/VIS spektroskopií a kapalinovou/plynovou chromatografií.

Analytická technika HPLC-MS/MS a možnosti jejího využití v hygieně

Význam a stanovení antioxidantů v čaji. Bc. Kateřina Zehnalová

Úloha: Hmotnostní spektrometrie kapsaicinoidů

SBORNÍK PŘÍSPĚVKŮ. XXXVIII. Symposium o nových směrech výroby a hodnocení potravin Skalský Dvůr

EFFECT OF FEEDING MYCOTOXIN-CONTAMINATED TRITICALE FOR HEALTH, GROWTH AND PRODUCTION PROPERTIES OF LABORATORY RATS

Danica Pospíchalová. Stanovení nelegálních drog a jejich metabolitů v odpadních vodách

EXTRAKČNÍ METODY. Studijní materiál. 1. Obecná charakteristika extrakce. 2. Extrakce kapalina/kapalina LLE. 3. Alkalická hydrolýza

SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků, která užívá

STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM

ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (UPLC) ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (UHPC)

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

LANDFILL LEACHATE PURIFICATION USING MEMBRANE SEPARATION METHODS ČIŠTĚNÍ PRŮSAKOVÝCH VOD ZE SKLÁDEK METODAMI MEMBRÁNOVÉ SEPARACE

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU REZIDUÍ POLÁRNÍCH PESTICIDŮ METODOU LC-MS

Separační metody v analytické chemii. Plynová chromatografie (GC) - princip

UNIVERZITA PARDUBICE Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie. Nám. Čs. Legií 565, Pardubice.

L 54/76 CS Úřední věstník Evropské unie

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU A A VITAMÍNU E METODOU HPLC

Chromatografie. Petr Breinek. Chromatografie_2011 1

L 54/80 CS Úřední věstník Evropské unie

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - ZEARALENON

Přímá analýza reálných vzorků hmotnostní spektrometrií s využitím nanodesorpčního elektrospreje (nano-desi-ms)

jako markeru oxidativního

Název: Vypracovala: Datum: Zuzana Lacková

Zpráva ze zahraniční odborné stáže

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU METODOU HPLC

ROSTLINNÉ FENOLOVÉ LÁTKY A FLAVONOIDY

INFLUENCE OF CONSTRUCTION OF TRANSMISSION ON ECONOMIC PARAMETERS OF TRACTOR SET TRANSPORT

Stanovení fenolických látek pomocí kapalinové chromatografie

THE APPLICATION OF 2-MERCAPTOPHENOL FOR PRECONCENTRATION AND DETERMINATION OF MERCURY SPECIES IN SEDIMENTS AND WATERS

Hmotnostní spektrometrie

Analytické nástroje pro analýzu iontů v prostředí. Analytical tools for environmental metal ions determination

THE USE OF HIGH PRESSURE PROCESSING ON ELIMINATION OF MICROORGANISMS IN VEGETABLE AND FRUIT JUICES

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ FAKULTA CHEMICKÁ STUDIUM PŘÍRODNÍCH LÁTEK OBSAŽENÝCH VE VYBRANÝCH BYLINÁCH A MÉNĚ OBVYKLÝCH DRUZÍCH DROBNÉHO OVOCE

STANOVENÍ KOFEINU V NÁPOJÍCH METODOU HPLC

EXTRAKCE, CHROMATOGRAFICKÉ DĚLENÍ (C18, TLC) A STANOVENÍ LISTOVÝCH BARVIV

Transkript:

OPTIMIZATION CHROMATOGRAPHIC ISOLATION OF ANTHOCYANINS Chabinová J., Zítka O., Húska D., Klejdus B., Kizek R. Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemĕdĕlská 1, 613 00 Brno, Czech Republic E-mail: xspilko1@node.mendelu.cz ABSTRACT Anthocyanins are natural colorants. They have been shown to have some beneficial health effect. Red and amber durum wheats contain as major xanthophylls pigments, carotenoids and flavones. Blue and purple wheats are different from those that contain another group of pigments, anthocyanins. Grain from six wheat lines differing in pigmentation was used in this study: UC 660 49 (blue aleurone), A. Arraseita (purple perikarp), TBS (blue aleurone), ANK 28B (purple perikarp), N 67 (red pericarp), Heroldo (white pericarp). Wheat grains were harvested every five days begining 15 th day post anthesis, ending once the grains reached physiological maturity (40 th day post anthesis), for a total six sampling dates. Anthocyanins were extracted with 10 ml acidifield methanol (methanol and 1.0 N HCl, 85:15 v/v) and shaking on Ika Ultra-Turrax Tube Drive, for 2x29 min. The filtred extract were evaporated at 50 C to dryness and redissolved in acidifield methanol. Individual anthocyanins were separated and and quantifield by highperformance liquid chomatography (HPLC). Anthocyanin concentration increased rapidly during grain development and then decreased before maturity. Cyanidin 3-glucoside was the predominant anthocyanin in purple wheat. Delphinidin 3-glucoside is the principal one in blue wheat. Anthocyanins are considered to be physiologically active substances, whose importance in promoting health and reducing the risk of chronic disease has been scientifically documented. This means that the presence of wheat anthocyanins in pigmented wheat, can be a source of bioactive compounds for use in the food industry. Key words: anthocyanins, blue wheat, purple wheat, extraction, HPLC, mass spectrometry Acknowledgement: The work has been supported by the grant of the IGA FA MENDELU No. TP 7/2011. 1003

ÚVOD Anthokyany jsou ve vodě rozpustné přírodní pigmenty, zodpovědné za červené, fialové až modré zabarvení květů, plodů a jiných částí rostlin. Aglykonová (necukerná) část anthokyanů se označuje jako anthokyanidin (Obr. 1). Nejčastěji zastoupené sacharidy, které se vyskytují v anthokyanech jsou xylóza, arabinóza, rhamnóza, glukóza, galaktóza. Cukry mohou být acylovány organickými kyselinami. Nejběžnější acylační činidla jsou kyselina octová, malonová, p-kumarová, kávová, hydroxybenzoová. Mezi nejběžnější anthokyanidiny v rostlinných částech patří: pelergonidin, kyanidin, peonidin, delphinidin, petulidin a malvidin (Escribano-Bailón et al., 2004). Delphinidin je zodpovědný za namodralou barvu, kyanidin a pelargonidin dodávají rostlinám fialové a červené zabarvení (Hosseinian et al., 2008; Abdel-Aal,Hucl, 2003; Lee J. et al., 2005; Mazza et al., 2004). Obrázek 1. Struktura anthokyanidinu (Castaneda-Ovando et al., 2008) Isolace anthokyanů z rostlinných matric je poměrně složitá díky jejich nestabilitě a zvýšené náchylnosti k degradaci (Giusti, Wrostad, 2003). Stabilita anthokyanů se zvyšuje s počtem methoxy- skupin v kruhu B a klesá s počtem hydroxy- skupin. Nejstabilnější je malvidin, následují peonidin, petunidin, kyanidin a dephinidin. Obecně platí, že anthokyany jsou stabilní při kyselém ph. Glykosilace a acylace sacharidů také zvyšuje stabilitu, proto jsou diglykosidy stabilnější než jejich odpovídající monoglykosidy. Při analýze je důležité kontrolovat teplotu, jelikož rychlost rozkladu anthokyanů stoupá se zvyšující se teplotou. Kromě toho také světelné záření urychluje odbourávání anthokyanů (Escribano-Bailón et al., 2004). Funkce anthokyanů v rostlinách jsou shodné s obecnými vlastnostmi flavonoidů. Mezi jejich významné vlastnosti patří antioxidační aktivita, která hraje důležitou roli v prevenci kardiovaskulárních a nádorových onemocnění. (Konczak, Zhang, 2004; Castaneda-Ovando et al., 2008). Byla prokázána jejich schopnost vázat těžké kovy, jako je železo, zinek a měď. Působí také jako induktory enzymů glutathion-s-transferásy (GST) a superoxid dismutásy (SOD) (Hosseinian et al., 2008). 1004

Hlavními pigmenty v červené a oranžové tvrdé pšenici jsou xantophyly, karotenoidy a flavony. Anthokyany jsou obsaženy v odrůdách modré a fialové pšenice. Modré pigmenty se nachází v aleuronové vrstvě zrna, zatímco fialové pigmenty se soustředí ve vrstvách oplodí. Cyanidin-3- glukosid byl nalezen jako hlavní anthokyan ve fialové pšenici a jako druhý nejčastější v modré pšenici. Delphinidin-3-glukosid je dominantní v modré pšenici, kde zaujímá zhruba 41% z celkového obsahu anthokyanů. (Abdel-Aal, Hucl, 2003; Abdel-Aal et al., 2006; Hosseinian et al., 2008). Koncentrace anthokyanů prudce vzrůstá v průběhu zrání zrna, zatímco v době zralosti zrna poklesne (Knievel et al., 2009). Anthokyany jsou polární molekuly, proto se pro extrakci obvykle používají vodné směsi ethanolu, methanolu a acetonu. Pro zvýšení stability anthokyanů se do rozpouštědla přidává malé množství kyseliny (kys. trifluoroctvá, kys. chlorovodíková, kys. mravenčí, kys. octová) (Castaneda-Ovando et al., 2008; Barnes et al., 2009; Downeya, Rochfortb, 2008; Tian et al., 2005; Huang et al., 2009; Pati et al., 2009; Lee et al., 2008; McCalluma et al., 2007, Hosseinian et al., 2008; Chun Hu et al., 2007; Barnes et al., 2009). V poslední době byly pro extrakci fenolických sloučenin zavedeny nové techniky, jako jsou extrakce urychleným tokem rozpouštědla (PLE), superkritická fluidní extrakce (SFE) (Escribano-Bailón et al., 2004) nebo mikrovlnná extrakce (MAE) (Yang, Zhai 2010; Liazid et al., 2010). Tyto metody mohou být použity i pro extrakci anthokyanů. Pro izolaci a identifikaci se v současné době nejčastěji používají metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Před provedením této metody se pro přečištění surového extraktu může použít extrakce na pevné fázi (SPE) (Escribano-Bailón et al., 2004). V kombinaci s HPLC lze zvolit celou řadu detektorů. Giusti, Wrostad (2001) a Giusti, Wrostad (2003 se ve svých publikacích zabývali UV-Vis metodami používanými pro charakterizaci a kvantifikaci anthokyanů. V současné době jsou však nejpoužívanějšími technikami pro jejich identifikaci tandemy HPLC-MS, HPLC-NMR (Castaneda-Ovando et al., 2008). MATERIÁL A METODIKA Chemikálie, standardy Jako standard byly použity standardní roztoky antokyanů (cyanidin-3-glukosid, delphinidin-3- glukosid) od firmyextrasynthese (Francie). Methanol a ostatní chemikálie byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MI, USA). Standardy byly připraveny navážením 1 mg sloučeniny do 100 ml methanolu a 1,0 M HCl, 85:15 v/v. Reálné vzorky Pro analýzy byly použity obilky barevných pšenic: UC 660 49 (modrý aleuron), A. Arraseita (purpurový perikarp), TBS (modrý aleuron), ANK 28B (purpurový perikarp), N 67 (červená 1005

obilka), Heroldo (bílá obilka). Všechny odrůdy byly vysety a sklizeny v areálu Mendelovy univerzity v Brně. Odebrány byly vzorky zrajících obilek vždy 10., 15., 20., 25., 30., 35. a 40. den post anthesis. Pro analýzu anthokyanů byly použity odběry 15. 40. den post anthesis (tedy celkem 6 odběrů na genotyp). Obilky byly rozdrceny v třecí misce. Extrakce Pro extrakci byly vybrány dvě metody: extrakce v ultrazvukové lázni (60 min) a extrakce pomocí homogenizátoru Ika Ultra-Turrax Tube Drive (2x29 min). Pro obě extrakce byly použity vodné směsi methanolu (50: 50 v/v, 70:30 v/v, 90:10 v/v, methanol a 1 M HCl, 85:15 v/v). Objem solventu byl 10 ml. Pro optimalizaci metody byly použity vzorky zralých obilek i nezralých obilek. U všech vzorků se zkoušely navážky 20 mg a 50 mg. Pro vlastní analýzu byla vybrána extrakce pomocí homogenizátoru Ika Ultra-Turrax Tube Drive (2x29 min.). Jako rozpouštědlo byl použit roztok methanolu a 1 M HCl, 85:15 v/v. Objem solventu 10 ml. Použité navážky obilek jsou uvedeny v Tab. 1. Po extrakci byly vzorky přefiltrovány a odpařeny v proudu předehřátého (50 C) dusíku za pomocí bezkontaktního systému. Odpařené vzorky byly až do provedení chromatografické analýzy skladovány ve tmě při teplotě 4 C. HPLC a MS/MS Pro isolaci a identifikaci anthokyanů bylo využito přístroje Agilent 1200 Series Rapid Resolution LC system (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany). Přístroj je vybaven on-line odplynovačem, binární pumpou, autosamplerem a kolonovým termostatem. Detekce separovaných látek probíhala pomocí UV-Vis detektoru s fotodiodovým polem a MS detektoru Agilent Technologies MSD 1100 Single quad LC/MS. Pro separaci byla použita kolona Zorbax SB-C18 (30 x 2,0; 1,8 µm velikost částic, Algient Technologies, USA). Rychlost průtoku byla 0,7 l min -1. Separace probíhala při teplotě 40 C. Gradientová eluce byla v čase 0 min 98 % vodné fáze, 0,5 min 95 % vodné fáze, 0,8 min. 50 % vodné fáze, 1,8 min. 98 % vodné fáze. Složení mobilní fáze bylo acetonitril/0,3 % kyselina mravenčí. Objem nástřiku byl 1-5 µl (ředění 1:100), 1 a 2µl (ředění 1:10) pro standardní roztok. Nástřik reálného vzorku byl v rozsahu 0,5-5µl. Pro identifikaci a kvantifikaci látek je MS detektor vybaven elektosprejovou ionizací a specifické fragmenty jsou následně analyzovány pomocí kvadrupólového analyzátoru, přístroj pracoval v negativním modu. Parametry hmotnostního spektrometru byly: teplota plynu 350 C, průtok plynu 13 l min -1, tlak nebulizéru 50 psi, napětí na kapiláře 4000 V. Signál byl snímán v SIM modu při m/z 463 pro delphinidin-3-glukosid a m/z 447 pro cyanidin-3-glukosid. VÝSLEDKY A DISKUZE Optimalizace metody zpracování vzorku Byla provedena optimalizace různých parametrů ovlivňujících extrakční proceduru, jako je složení rozpouštědla, extrakční čas, množství vzorku a metoda extrakce. Výsledné parametry optimalizace této metody jsou podrobně popsány v části M&M. Pro optimalizaci byly použity vzorky zralých 1006

obilek odrůd Heroldo, ANK 28B, UC 660 49 a nezralých obilek odrůdy A. Arraseita. Byly testovány dva homogenizační postupy extrakce v laboratorní ultrazvukové lázni K-5LM (doba extrakce 60 min.) a extrakce pomocí homogenizátoru Ika Ultra-Turrax Tube Drive (2x29 min). U všech vzorků se pracovalo s navážkami 20 mg a 50 mg. Pro obě extrakce u všech vzorků byly, jako rozpouštědla, použity vodné směsi methanolu (50: 50 v/v, 70:30 v/v, 90:10 v/v, methanol a 1,0 N HCl, 85:15 v/v). Objem solventu byl 10 ml. Pro analýzu reálných vzorků byla vybrána extrakce pomocí homogenizátoru Ika Ultra-Turrax Tube Drive, čas 2 x 29 min., rozpouštědlo methanol a 1 M HCl, 85:15 v/v. Navážky reálných vzorků použitých pro analýzu jsou uvedeny v Tab. 1. Tabulka 1. Navážky vzorků použitých pro analýzu Odrůda 1. 2. 3. 4. 5. 6. Heroldo 0,08 g 0,14 g 0,09 g 0,09 g 0,09 g 0,07 g UC 660 49 0,06 g 0,09 g 0,08 g 0,09 g 0,07 g 0,07 g A.Arraseita 0,08 g 0,07 g 0,08 g 0,05 g 0,06 g 0,08 g TBS 0,08 g 0,08 g 0,07 g 0,07 g 0,05 g 0,05 g ANK 28B 0,08 g 0,08 g 0,07 g 0,08 g 0,09 g 0,08 g N 67 0,09 g 0,08 g 0,09 g 0,07 g 0,05 g 0,05 g Změny obsahu anthokyanů v průběhu zrání obilky U všech vzorků byl sledován obsah dvou anthokyanů (cyanidin-3-glukosid, delphinidin-3- glukosid). Při prvním odběru (15. den post anthesis) byly zjištěny nízké koncentrace anthokyanů u všech šesti odrůd pšenic. Ke změnám koncentrací docházelo v průběhu zrání. Odrůdy Heroldo (bílá obilka) a N 67 (červená obilka) obsahují nízké koncentrace obou sledovaných látek v průběhu celého zrání. Cyanidin-3-glukosid byl identifikován jako dominantní anthokyanin u pšenic s purpurovým perikarpem (A. Arraseita, ANK 28) a jako druhý nejčastěji se vyskytující anthokyanin u modré pšenice (UC 660 49, TBS), což odpovídá publikovaným výsledkům (Abdel- Aal, Hucl, 2003; Abdel-Aal et al., 2006; Hosseinian et al., 2008). Nejvíce zastoupeným antokyanem ve vzorcích modré pšenice je delphinidn-3-glukosid. UC 660 49 (modrý aleuron) dosahuje nejvyšších koncentrací obou sledovaných látek během 35. dne post anthesis, v době zralosti (40. den) však obsah anthokyanů prudce klesá. Trend poklesu je podobný u odrůdy TBS (modrý aleuron) s rozdílem, že zde je nejvyšší obsah anthokyanů zaznamenán během 30. dne post anthesis. Odrůdy A. Arraseita a ANK 28B (purpurový perikarp) obsahují nízké koncentrace delphinidin-3-glukosidu během celého zrání. Koncentrace cyanidin-3-glukosidu je u A. Arraseita nejvyšší během 30. dne post anthesis, u ANK 28 během 25. dne. U vzorků pšenic s purpurovým perikarpem je rovněž patrný trend poklesu koncentrace cyanidin-3-glukosidu v době zralosti zrna. 1007

Graf 1. (A) Cyanidinin-3-glukosid [ng.g -1 D], (B) Delphinidin-3-glukosid [ng.g -1 DW] ZÁVĚR Analýze přírodních biologicky aktivních látek v rostlinném materiálu by vždy měla předcházet komplexní optimalizace použitých extrakčních technik a separačních metod. Složitost přírodních matric a stopová množství analytů v nich obsažených vyžaduje aplikaci přesných a citlivých instrumentací. V neposlední řadě je nutná znalost maximálního množství informací o struktuře matrice a lokalizaci analyzovaných látek uvnitř matrice. Anthokyany jsou považovány za fyziologicky aktivní látky, jejichž význam v podpoře zdraví a snížení rizika chronických onemocnění je vědecky doložen. Přítomnost těchto látek v potravinových surovinách, jako jsou barevné odrůdy pšenice, může významně ovlivnit nutriční hodnotu u výsledných potravinářských produktů. LITERATURA Abdel-Aal el S. M et al., (2006). Anthocyanin composition in black, blue, pink, purple, and red cereal grains, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 4696 4704. Abdel-Aal el S. M., Hucl P., (2003). Composition and stability of anthocyanins in blue-grained wheat, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 2174 2180. Barnes J. S. et al., (2009). General method for extraction of blueberry anthocyanins and identification using high performance liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap-time of flight-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216, 4728-4735 Castaneda-Ovando A. et al., (2008). Chemical studies of anthocyanins: A review. Food Chemistry, 113, 859-871 1008

Downeya M. O., Rochfortb S., (2008). Simultaneous separation by reversed-phase highperformance liquid chromatography and mass spectral identification of anthocyanins and flavonols in Shiraz grape skin. Journal of Chromatography A, 1201, 43-47 Escribano-Bailón M. T. et al., (2004). Anthocyanins in cereals. Journal of Chromatography A, 1054, 129-141 Giusti M. M., Wrostad R. E., (2001). Anthocyanins. Characterization and measurement of anthocyanins by UV Visible spectroscopy. Current protocols in food analytical chemistry, F1.2., 1-13 Giusti M. M., Wrostad R. E., (2003). Acylated anthocyanins from edible sources and their applications in food systems, Biochemical Engineering Journal, 14, 217 225 Hosseinian F. S et al., (2008). Measurement of anthocyanins and other phytochemicals in purple wheat. Food Chemistry, 109,916-924 Huang Z. et al., (2009). Identification of anthocyanins in muscadine grapes with HPLC-ESI-MS. Food Science and Technology, 42, 819 824 Chun Hu et al., (2007). Anthocyanin characterization and bioactivity assessment of a dark blue grained wheat (Triticum aestivum L. cv. Hedong Wumai) extract. Food Chemistry. 104, 955-961 Knievel D. C. et al., (2009). Grain color development and the inheritance of high anthocyanin blue aleurone and purple pericarp in spring wheat (Triticum aestivum L.), Journal of Cereal Science, 50, 113-120 Konczak I., Zhang W., (2004). Anthocyanins-more than nature s colours, Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2004, 239 240. Lee J. H. et al., (2008). Characterisation of anthocyanins in the black soybean (Glycine max L.) by HPLC-DAD-ESI/MS analysis. Food Chemistry, 112, 226 231 Lee J. et al., (2005). Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the ph differential method: Collaborative study, Journal Association of Official Analytical Chemists International, 88, 1269 1278. Liazid A. et al., (2011). Microwave assisted extraction of anthocyanins from grape skins. Food Chemistry 124, 1238 1243 Mazza G. Et al., (2004). Methods of analysis for anthocyanins in plants and biological fluids, Journal Association of Official Analytical Chemists International, 87, 129 145. McCalluma J. L. et al., (2007). Improved high performance liquid chromatographic separation of anthocyanin compounds from grapes using a novel mixed-mode ion-exchange reversed-phase column. Journal of Chromatography A, 1148, 38 45 Pati S. et al., (2009). Rapid screening for anthocyanins and anthocyanin dimers in crude grape extracts by high performance liquid chromatography coupled with diode array detection and tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1216, 3864 3868 1009

Tian Q. et al., (2005). Screening for anthocyanins using high-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry with precursor-ion analysis, production analysis, common-neutral-loss analysis, and selected reaction monitoring. Journal of Chromatography A, 1091, 72 82 Yang, Z, Zhai, W., (2010). Optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from purple porn (Zea mays L.) cob and identification with HPLC MS. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 11, 470 476 1010