Mendelova univerzita v Brně

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Stanovení optimálního termínu sklizně a jeho vliv na aromatický profil vína Diplomová práce Vedoucí diplomové práce Doc. Ing. Pavel Pavloušek Ph.D. Vypracoval Bc.Tomáš Harašta Lednice 2011

Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na Stanovení optimálního termínu sklizně a jeho vliv na aromatický profil vína psal samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici, dne.. Podpis. 2

Poděkování Děkuji všem, kteří mi cennými radami a připomínkami pomáhali při vypracování diplomové práce. Především bych chtěl poděkovat svému vedoucímu Doc. Ing. Pavlu Pavlouškovi Ph.D. za rady a odborné vedení při realizaci práce. Dále bych chtěl poděkovat Ing. Petře Bábíkové, DiS a Bc. Rostislavu Slavíkovi za pomoc a ochotu při provádění experimentální části. V neposlední řadě také děkuji své rodině za trpělivost, kterou se mnou měla v průběhu celého studia. 3

Obsah 1.ÚVOD... 8 2. CÍL PRÁCE... 9 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED... 10 3.1 Morfologické složení hroznu... 10 3.2 Chemické složení hroznu... 11 3.3. Chemické složení hroznů a jeho význam pro kvalitu vín... 14 3.4 Bobule, základ kvality hroznů a vína... 14 3.5 Vývojové fáze bobule... 15 3.6 Typy zralosti hroznů... 17 3.7 Aromatické látky v hroznech... 17 3.7.1 Monoterpeny... 17 3.7.2 Norisoprenoidy C13... 18 3.7.3 Methoxypyraziny... 19 3.7.4 Thioly... 20 3.8 Rozmístění aromatických látek v bobuli... 21 3.8.1 Aromatické látky ve slupce... 21 3.8.2 Aromatické látky v dužnině... 21 3.9 Vývoj aromatických látek v hroznech... 21 3.10 Vliv agrotechniky na změny aromatických látek... 22 3.10.1 Volba stanoviště a odrůdy... 23 3.10.2 Odlistění zóny hroznů (defoliace)... 23 3.10.3 Regulace násady... 24 3.10.4 Hnojení dusíkem... 24 3.11 Možnosti stanovení aromatických látek a aromatického potenciálu hroznů... 26 3.11.1 Senzorické hodnocení... 27 3.11.2 Metody analytického hodnocení... 30 4

4. MATERIÁL A METODIKA... 32 4.1. Charakteristika stanoviště... 32 4.1.1 Vývoj počasí v roce 2010 a výskyt chorob... 32 4.2. Charakteristika zkoumané moštové odrůdy... 33 4.2.1 Hibernal... 33 4.3 Způsob odběru vzorku pro senzorické hodnocení... 33 4.3.1 Použitá metodika, založení pokusu senzorické hodnocení... 34 4.4 Způsob odběru vzorku pro analytické hodnocení... 35 4.4.1 Použitá metodika založení pokusu analytické hodnocení... 36 4.5 Příprava mikrovzorků vín... 37 4.6. Chemický rozbor vín... 38 4.6.1 Alkohol... 38 4.6.2 Veškeré titrovatelné kyseliny a ph... 38 4.6.3 Redukující cukry dle Rebeleina... 39 4.6.4 GC-MS Stanovení jednotlivých volatilních sloučenin... 39 4.6.5 Senzorické hodnocení mikrovzorků... 41 4.7. Statistické hodnocení... 42 5. VÝSLEDKY A DISKUZE... 44 6.ZÁVĚR... 50 7.SOUHRN... 51 8.RESUME... 52 9. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 53 10.PŘÍLOHY... 57 5

Seznam tabulek Tab. č.1 : Látky obsažené v moštu bobulí Tab. č.2 : Monoterpenoly a jejich aromatický projev Tab. č.3 : C13 Norisoprenoidy a jejich aromatický projev Tab. č.4 : Methoxypyraziny a jejich aromatický projev Tab. č.5 : Thioly a jejich aromatický projev Tab. č.6 : Umístění volných a vázaných monoterpenolů v hroznech Tab. č.12 : Chemická analýza vzorku vína Tab. č.13 : Senzorická analýza vzorku vína Tab. č.14 : Přehled denních srážek za rok 2010 Tab. č.15 : Přehled denní doby slunečního svitu za rok 2010 Tab. č.16: Klimatologické podmínky v roce 2009 Tab. č.17: Klimatologické podmínky v roce 2010 Seznam grafů Graf č. 1: Analytické parametry bobulí v době zrání Graf č. 2: Senzorické hodnocení slupky u odrůdy Hibernal Graf č. 3: Senzorické hodnocení dužniny u odrůdy Hibernal Graf č. 4: Aromatický profil mikrovzorků odrůdy Hibernal Graf č. 5: Vývoj počasí v Lednici na Moravě v období IX. 2009-VIII. 2010 Graf č. 6: Podíl měsíčních srážek na ročním srážkovém úhrnu v roce 2010 Graf č. 7: Podíl měsíčních sum slunečního svitu na roční délce v roce 2010 Seznam obrázků Obrázek č. 5: Graf podílu aromatických látek ve víně (10.9.2010) Obrázek č. 6: Graf podílu aromatických látek ve víně (24.9.2010) Obrázek č. 7: Graf podílu aromatických látek ve víně (8.10.2010) Obrázek č. 8: Graf vývoje aromatického profilu vín Obrázek č. 9: Graf podílu aromatických látek ve víně (10.9.2010) Obrázek č. 10: Graf podílu aromatických látek ve víně (24.9.2010) Obrázek č. 11: Graf podílu aromatických látek ve víně (8.10.2010) 6

Obrázek č. 12: Chromatogram analytů z mikrovzorků vína (10.9.2010) Obrázek č. 13: Chromatogram analytů z mikrovzorků vína (24.9.2010) Obrázek č. 14: Chromatogram analytů z mikrovzorků vína (8.10.2010) 7

1.ÚVOD Vinařství je maximálně fascinující a komplexní proces přeměny surového materiálu. Začíná s příchodem sklizně do sklepa a pokračuje rozhodujícími kroky ve formě kvašení. Po těchto krocích začíná, pro některá vína, dlouhý proces stárnutí, během kterého se zdokonaluje buket a chuť vína. Přeměna hroznového moštu v konečný produkt, víno, je a priori spontánní jev. Mikrobiální komplex nacházející se na hroznové bobuli je přiřazen do nového ekosystému, ve kterém jsou hrozny rozdrcené a vylisované. Další průběh je ve spontánní úrovni, kdy jsou podmínky přizpůsobené povaze mikroorganismů. Bez dovednosti a pozornosti vinařů a enologů by se celý proces vyvinul do fermentovaného výrobku s velmi nízkou kvalitou, který by měl velice malou možnost najít si svého spotřebitele. Jejich kvalifikace je doplněna na základě vědeckých poznatků o jevy, které se vyskytují v tomto složitém prostředí. Ze začátku bylo vedeno vše na základě pozorování a empirismu, nyní jde o poznatky z enologie, chemie, biologie a mikrobiologie. Vzhledem k znalostem v těchto oborech, které je možné aplikovat do výroby a zrání vína se primárně zlepšila kvalita vína. Znalosti ve výše uvedených oborech se stali přesnější a spolehlivější a při použití dalších technických nástrojů, které budou uvedeny v této práci, může nyní vinař kontrolovat vývoj systému jako celku. Poněvadž mnoho lidí po celém světě se zajímá o vína nejvyšší kvality je zvýšené pátraní po znalostech o víně zaměřených na chuť a jeho chemii relevantní. Za poslední dvě desetiletí došlo k obrovskému rozvoji znalostí o vinohradnictví a technologií ve výrobě vína, to vše má za následek mnohem větší zlepšení jakosti vína. Zejména pokroky ve vývoji nových analytických přístrojů byly pro vinařství a vinohradnictví obrovským přínosem. Zajímavým pokrokem byl také vývoj smyslové vědy a to zejména analyticko - senzorických technik umožňujících vědcům určovat vnímání vína, včetně měření rozdílů mezi víny a popisování senzorických vlastností. 8

2. CÍL PRÁCE Hlavním cílem této práce je prostudování literatury zabývající se problematikou aromatických látek ve víně a popsat stanovení optimálního termínu sklizně vzhledem k aromatickému profilu vín. Dalším důležitým bodem této práce je provedení praktického hodnocení aromatických látek u bílé moštové odrůdy Hibernal v průběhu procesu zrání. 9

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Morfologické složení hroznu Bobule révy vinné se skládá: Vosková vrstva tenká vosková vrstva (kutikula) potahuje celou bobuli a chrání ji před mechanickým poškozením a nadměrným vypařováním. Slupka bobule činí 9-11% z celkové hmotnosti hroznů. Její složení je závislé na odrůdě a má velký vliv na barvu, vůni, chuť a celkový odrůdový charakter vína. Obsahuje cukry, kyseliny, třísloviny, barviva, aromatické látky, vosky, dusíkaté a minerální látky. Dužnina je pro nás z hlediska zpracování i přímé spotřeby nejvýznamnější součástí. Tvoří průměrně 85-90% hmotnosti bobule. Z toho 5-8% tvoří svazky cévní, zbytek je mošt. Semena a třapiny- třapina tvoří 3-5% hmotnosti hroznu. Její chemické složení závisí především na odrůdě hroznu, dále pak na podmínkách stanoviště a zralosti. (Steidl, 2002). Obrázek č. 1 Morfologická stavba bobule podle Coombe a Iland (2005). 10

3.2 Chemické složení hroznu Voda Voda je hlavní složkou a rozpouštědlem pro všechny ostatní látky. Při přezrávání se může obsah vody snižovat v důsledku výparu. Co se týče obsahu, je nejvýznamnější složkou bobule révy vinné voda. Přibližně 99 % z celkového obsahu vody obsažené v moštu přijímá réva vinná kořenovým systémem z půdy. Nedostatek vody vede k menším bobulím, díky zpomalení dělení buněk. Existuje představa, že velikost bobule je určujícím faktorem kvality hroznů (Conde et al, 2007). Závlaha může být prostředkem ovlivnění kvality hroznů ve vinici, proto časování nedostatku vody, například s využitím kapkové závlahy, je pro kvalitu hroznů a vína velmi významné. Cukry Tato skupina látek slouží v přírodě jako stavební kámen buněčných stěn a jako chemický akumulátor energie, proto je pro rostliny velmi důležitá. Nejjednoduššími sacharidy jsou cukry, které se označují jako monosacharidy, jsou-li tvořeny pouze jedinou jednotkou, disacharidy v případě dvou jednotek a sloučeniny více monosacharidů se nazývají oligosacharidy a polysacharidy. Nejvýznamnější cukry obsažené v bobulích jsou glukóza a fruktóza. Glukóza je jednoduchý cukr a vyváří se v bobulích jako první. Fruktóza je nejsladší přírodní cukr a v bobulích vzniká až později při dozrávání (Steidl, 2002). α-d-glukóza α-d-fruktóza 11

Kromě glukózy a fruktózy se v bobulích nacházejí ve velmi malém množství také rafinóza, maltóza, galaktóza, arabinóza, xylóza. Maltóza Galaktóza Arabinóza Nejdůležitějším transportním cukrem v révovém keři je sacharóza. Tento disacharid je složen z molekuly glukózy a fruktózy. Může být v malém množství obsažen v bobulích. Buď vlastními kyselinami bobulí, nebo pomocí enzymu invertázy dochází k jejímu úplnému štěpení na glukózu a fruktózu. Po zaměkání bobulí má větší zastoupení glukóza než fruktóza. V době zralosti je jejich poměr 1:1. Sacharóza 12

Kyseliny Stejně jako cukry vznikají kyseliny asimilací listů z vody a oxidu uhličitého. Celkové množství kyselin závisí na odrůdě, viniční trati, vyzrálosti hroznů a ročníku. Během vývoje bobule vzniká nejdříve kyselina jablečná a později kyselina vinná, obě tyto kyseliny jsou zastoupeny v bobulích nejčastěji. V podstatně menším množství se vyskytují ostatní kyseliny, a to kyselina citronová, glukonová apod. (Farkaš, 1980, Steidl, 2002). Kyselina vinná Kyselina jablečná Kyselina citrónová Kyselina glukonová Kyselina vinná se hromadí především ve slupce a ve vnější části dužniny. Kyselina jablečná pak ve středu dužniny a její obsah klesá směrem k povrchu. Kyseliny ovlivňují hlavně senzorický projev vína a zároveň mohou sloužit jako konzervační činidlo. U bílých vín je obsah kyselin žádoucí, protože podporují svěžest chuti. (Steidl, 2002). Minerální látky (popeloviny) Mají velký podíl na tvorbě chuťových látek a jejich vlastností. Množství těchto látek závisí na počasí, druhu půdy, hnojení, odrůdě a vyzrálosti. Jednou z hlavních minerálních látek je draslík. V průběhu dozrávání se jeho koncentrace zvyšuje. Nachází se v buňkách dužniny. Draslík působí jako aktivátor enzymatických procesů. Ovlivňuje tvorbu organických kyselin a extraktu vína (Steidl, 2002). 13

Dusíkaté sloučeniny Jde v podstatě o sloučeniny bílkovin, aminokyseliny a amonné sloučeniny. Dusíkaté sloučeniny v hroznech, respektive v bobulích, nejsou rovnoměrně rozmístěné. Nejvíce je jich ve vnějších vrstvách slupky (Švejcar et al., 1976). V posledních letech se ukázalo, že obsah dusíku a hlavně aminokyselin je důležitý kvalitativní parametr. Aminokyseliny poskytují dusík kvasinkám, jež ho potřebují pro vlastní rozmnožování buněk. Jestliže je obsah dusíku v moštu nízký, dochází k poruchám v průběhu kvašení např. ke vzniku nežádoucích aromatických tónů, případně k neúplnému prokvašení moštů. Hlavní zdroj dusíku pro kvasinky představují primární aminokyseliny a amonné ionty (Steidl, 2002). 3.3. Chemické složení hroznů a jeho význam pro kvalitu vín Biochemické procesy zrání lze charakterizovat jako transformaci tvrdé, kyselé a zelené bobule do měkké, barevné bobule, která je bohatá na obsahové látky v bobulích. Důležitým předpokladem procesu dozrávání je spojení hroznu s ostatními částmi rostliny révy vinné. Základ kvality bobule podmiňuje velké množství chemických sloučenin, které jsou v bobuli a v moštu bobule obsaženy. viz Příloha, Tab. 1 podle Coombe a Iland (2005) uvádí látky obsažené v moštu bobulí. 3.4 Bobule, základ kvality hroznů a vína Pro každého pěstitele révy vinné a výrobce vína je důležité, aby znal proces vývoje bobulí a hroznů v průběhu vegetačního období. Díky teoretickým znalostem, které se týkají vývojových změn bobulí, je možná aplikace v praxi. Jsou tím myšleny agrotechnické zásahy ve vinici, jako například výživa a hnojení, ošetřování půdy ve vinici, ochrana révy vinné proti škůdcům a chorobám, zelené práce, případně výše zmíněná doplňková závlaha révy vinné. 14

3.5 Vývojové fáze bobule Veškeré organické i anorganické látky, které určují kvalitu hroznu, se soustřeďují v bobulích. Vývoj bobulí členíme do 3 vývojových fází. 1. fáze trvá přibližně 35 55 dní. Fáze probíhá od června do poloviny července s ohledem na odrůdu a pěstitelské podmínky (Pavloušek, 2006). Významné jsou zde hlavně klimatické podmínky. V průběhu této fáze je bobule zelená a tvrdá. Dochází k intenzivnímu dělení buněk ve slupce a tvoří se potenciální základ její velikosti. Bobule vykazují výraznou metabolickou aktivitu. Dominantní je hlavně tvorba organických kyselin a prekurzorů fenolických a aromatických látek (Pavloušek, 2006). 2. fáze je fází pomalého růstu a trvá 3-30 dnů a řadíme ji do měsíce srpna. V této fázi dochází k vybarvování a zaměkání bobulí a můžeme pozorovat akumulaci cukrů, fenolických a aromatických látek v bobulích (Pavloušek, 2006). Semena dosahují plné velikosti a vytvářejí se kyseliny (Steidl, 2004). Největší koncentrace kyselin se vztahuje, dle odrůdy, na konec druhé nebo na počátek třetí fáze. V průběhu druhé růstové fáze bobule dochází také ke změnám obsahu taninů. Obsah taninů, které se nachází v bobulích, klesá. Snížení taninů obsažených v semenech je pravděpodobně způsobené oxidací taninů, které se nachází v semenných obalech (Kennedy et al., 2000). Taniny obsažené ve slupce v průběhu druhé růstové fáze klesají nebo zůstávají víceméně stabilní. Současně dochází k jejich změnám polymerizaci. Pro tvorbu textury vína a stability barvy je tedy velice významná znalost složení bobule. K výrazným změnám dochází i z hlediska antokyaninových barviv. Během druhé růstové fáze dochází v bobule k akumulaci antokyaninových barviv. Aromatické látky se nachází ve slupce i dužnině bobulí. Některé z aromatických látek se vytváří v bobulích jako prekurzory, které nejsou aktuálně těkavé. Tyto prekurzory jsou přítomné ve formě glukosidů (Francis et al., 1999). Při druhé růstové fázi dochází ke stagnaci obsahu methoxypyrazinů, transformaci karotenoidů na C-13 norisoprenoidy, tvorbě monoterpenů, thiolů a těkavých fenolů. 3. fáze tato fenofáze se označuje jako zaměkání bobulí nebo také véraison, což v překladu znamená vybarvování bobulí. Trvá opět 35 55 dnů, od zaměkání bobulí do sklizně. Je rozhodujícím obdobím pro kyseliny. Malá, tvrdá a kyselá bobule s malým obsahem cukru se postupně mění v bobuli, která je větší, měkčí, sladší, s nižším 15

obsahem kyselin a výrazně aromatická a barevná (Kennedy et al., 2000). Zvětšování bobulí závisí hlavně na příjmu vody a na metabolické aktivitě, která probíhá v bobulích. Zároveň se v bobulích uskutečňuje tvorba aromatických látek. Teplé a slunečné dny, následované chladnými nocemi, podporují vytváření barevných a aromatických látek (Steidl, 2004). Během zrání se zvyšuje obsah cukrů ve šťávě bobulí a zvyšuje se její hustota. Současně se snižuje obsah veškerých kyselin, kyselina jablečná je prodýchána na cukr. Zevně se bobule vybarvují a zaměkají, stopky začínají dřevnatět. Zaměkání bobulí způsobuje účinek hroznových enzymů (pektináz), které štěpí pektinové látky na stabilizující buňky. Tak se slupka stává průhlednější a snadněji napadnutelnou plísní. Srážky a vysoké teploty podporují hnilobu (Steidl, 2002). Coombe (1992) klasifikoval od oplození do zralosti 3 hlavní fáze vývoje bobule. Načrtl také křivku růstu bobule révy vinné: během vývoje doznávají bobule změn ve velikosti, složení, barvě, textuře, aromatických a chuťových vlastnostech a v citlivosti na houbové choroby a škůdce. Vývoj bobule spočívá ve dvou postupných růstových obdobích. Ty jsou od sebe separovány fází pomalého růstu, nazývanou také lag fáze. Obrázek č.2 Tvorba bobule a změny obsahových látek v bobulích podle Coombe (2001). 16

V jednotlivých vývojových fázích bobule se mění její průměr, hmotnost a velikost semen. Na základě konkrétních hodnot těchto veličin lze určit tři periody ve vývoji bobule, přičemž platí, že v jednotlivých vývojových fázích se tyto znaky odlišují. V průběhu vývoje dochází také k výrazným změnám obsahových látek v bobulích. 3.6 Typy zralosti hroznů V závislosti na přístupu k vypěstovaným hroznům rozlišujeme několik typů zralostí hroznů. Průmyslová zralost hroznů koresponduje pouze s vysokým obsahem cukrů při pokud možno při vysokém výnosu. Ostatní parametry se neberou příliš v úvahu. Fyziologická zralost hroznů hrozny by měli být v takovém stupni zralosti, aby jejich semena byla schopná reprodukce. Technologická zralost hroznů úzce souvisí s tím, jaké chceme vyrobit víno a jakou technologií. Zahrnujeme sem především aromatickou a fenologickou zralost. Technologická zralost by měla být v budoucnosti základem produkce kvalitních hroznů (Pavloušek, 2006). 3.7 Aromatické látky v hroznech 3.7.1 Monoterpeny Ve světě rostlin je velmi rozšířena početná skupina terpenových sloučenin (přibližně 4000). Sloučeniny, které nejvíce voní, jsou ze skupiny monoterpenů (látky s 10 uhlíkovými atomy) a seskviterpenů (látky s 15 uhlíkovými atomy), vytvořené ze dvou a tří isoprenových jednotek (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Monoterpeny můžeme najít ve formě jednoduchých uhlovodíků (limonen, myrcen, atd.), aldehydů (linelal, geranial, atd.), alkoholů (linalol, geraniol, atd.), kyselin (linalová kys., atd.), a dokonce i esterů (linalyl acetát, atd.). Čichové prahové hodnoty těchto látek jsou spíše nižší, jen několik stovek µg.l ¹. Nejvíce aromatické jsou citronelol a linalol. Kromě toho čichový dopad terpenových sloučenin je synergický a hraje významnou roli ve vůni muškátových odrůd (Ribéreau-Gayon et al., 2000). 17

V hroznech bylo identifikováno na 40 terpenových sloučenin. Monoterpeny, které jsou běžnou součástí mnoha ovoce, jsou přítomny ve volné (vonné) formě a početněji ve vázané (nevonné) formě glykosidů (Y.Z.Günata et al.,1985 in Mateo a Jimenez, 2000). Přehled hlavních monoterpenolů s jejich aromatickým projevem jak senzorickým, tak i analytickým. (Günata, 1984; in Ribéreau-Gayon et al.,2000) viz Příloha, Tab. 2. α-terpeniol Citronellol Geraniol Nerol Linalol 3.7.2 Norisoprenoidy C13 C13 norisoprenoidy jsou velice důležité aromatické sloučeniny nacházející se v mnoha odrůdách Vitis vinifera L. a příspívají k celkovému aroma. Výrazně zvyšují aromatický projev např. u odrůd Ryzlink rýnský, Chardonnay. Jsou generovány z karotenoidů, jako jsou lutein a β-karoten (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Norisoprenoidy se vytváří oxidací karotenoidů, jako jsou lutein a ß-karoten a jsou ukládány jako glykosidy (Eggers, 2006). Z chemického hlediska jsou deriváty norisoprenoidů členěny do 2 hlavních skupin (Ribéreau-Gayon et al., 2000) : I. megastigmany β-damascenon (megastigma-3,5,8-trien-7-on) s vůní po květinách, tropickém ovoci a po kompotovaném jablku. Má velmi nízkou prahovou hodnotu vnímání ve vodě 18

(2 ng.l ¹) a relativně nízkou ve zředěném alkoholovém roztoku (45ng.l ¹) (Ribéreau- Gayon et al., 2000). β-ionon se svým charakteristickým aroma po fialkách má prahovou hodnotu 7 ng.l ¹ ve vodě a 800 ng.l ¹ ve zředěném alkoholovém roztoku. Vliv na aroma bílých vín je nepatrný, ale může hrát důležitou roli u aroma červených vín (Ribéreau- Gayon et al., 2000). II. Ne-megastigmany tyto deriváty již byly také stanoveny, včetně několika velmi aromatických sloučenin. Nejdůležitější z nich je TDN (1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaftalen), který má výrazné petrolejové aroma. Významně se podílí na petrolejovém aroma starších vín odrůdy Ryzlink rýnský. Nevyskytuje se v hroznech a mladém víně, ale může se objevit během zrání v láhvi, přičemž prahová hodnota je někde 20 µg.l ¹ (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Dalšími ne-megastigmany jsou Actinidol a Vitispiran. Jejich vůně může silně připomínat kafr (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Přehled jednotlivých norisoprenoidů a jejich aromatický projev včetně prahových hodnot viz Příloha, tab. 3 3.7.3 Methoxypyraziny Methoxypyraziny jsou dusíkaté heterocykly produkované metabolismem aminokyselin. Tyto aromatické látky poskytují vůně připomínající zelenou papriku a chřest nebo také dokonce zemité tóny (Ribéreau-Gayon et al., 2000). 19

Mezi nejdůležitější methopyraziny nacházející se v hroznech patří: 3-isobutyl-2-methoxypyrazin (IBMP) 3-sec-butyl-2-methoxypyrazin (SBMP) 3-isopropyl-2-methoxypyrazin (IPMP) Přehled jednotlivých methoxypyrazinů, jejich aromatický projev a prahové hodnoty viz Příloha, tab. 4 3.7.4 Thioly Sirnaté sloučeniny ze skupiny thiolů jsou zpravidla zodpovědné za čichové defekty. Nicméně byl prokázán jejich podíl na aroma ovoce aromatických rostlin (Ribéreau-Gayon et al., 2000). (Eggers, 2006) ve své studii uvádí, že u nejpěstovanější odrůdy Vitis vinifera L., Sauvignon blanc se trojice sirnatých sloučenin podílí na celkovém aroma, které je obvykle v koncentracích značně převyšujících práh vnímání. Dvojice sirnatých sloučenin připomínající zimostráz a janovec byly identifikovány jako 4-methyl-4- mercaptopentan-2-on a 3-mercaptohexyl acetát, třetí 3-mercaptohexan-1-ol má ovocné aroma citrusových plodů. Přehled jednotlivých thiolů, jejich aromatický projev a prahové hodnoty viz Příloha, tab. 5 20

3.8 Rozmístění aromatických látek v bobuli 3.8.1 Aromatické látky ve slupce Slupka je charakteristická významným množstvím důležitých sekundárních produktů (fenolické a aromatické látky). Tyto látky se vytvářejí během zrání (Ribéreau Gayon et al., 2000). Slupka zralého hroznu obsahuje velké množství aromatických sloučenin a aromatických prekurzorů. U muškátových odrůd slupka může obsahovat více než polovinu volných terpenolů v bobuli a obsahuje více volných a glykosidovaných monoterpenů, než je v dužnině nebo šťávě. Geraniol a nerol se vyskytuje ve větší míře ve slupce než v dužnině nebo šťávě. Vzájemný poměr volných a vázaných sloučenin závisí na odrůdě (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Množství karotenoidů se nachází ve slupce dvakrát až třikrát více než v dužnině (Ribéreau-Gayon et al., 2000). V Příloze Tab. 6 nalezneme umístění volných a vázaných monoterpenolů v hroznech. 3.8.2 Aromatické látky v dužnině Dužnina tak jako slupka obsahuje značné množství aromatických látek. U muškátových odrůd může mošt obsahovat i 2/3 terpenových heterosidů. Dužnina je charakterizována především shromažďováním rozmanitého druhu alkoholů, aldehydů a esterů, které se podílí na celkovém aroma hroznů (Ribéreau-Gayon et al., 2000). 3.9 Vývoj aromatických látek v hroznech Volné a vázané formy terpenolů se hromadí v průběhu zrání. Někteří autoři zaznamenali kontinuální akumulaci monoterpenů dokonce i v přezrálých hroznech. (Wilsonet al., 1984; Park et al., 1991 in Ribéreau-Gayon et al., 2000). Ale také se setkáváme s více rozšířeným názorem, že množství volných monoterpenů se začíná snižovat souběžně se zvyšováním cukrů v hroznech (Marais, 1983; Günata, 1984 in Ribéreau-Gayon et al., 2000). 21

C13 - norisoprenoidy se mohou vyvíjet stejným způsobem jako monoterpeny. Koncentrace karotenoidů klesá spolu se změnou barvy hroznů, což souvisí se vzrůstající kumulací derivátů C13 - norisoprenoidů (TDN, Vitispiran atd.), zejména v jejich glykosidických formách. Tyto změny pravděpodobně vyžadují činnost hroznového enzymu, a to nejprve v oxidačním rozkladu karotenoidů a poté v glykosilačním mechanismu. (Razungles and Bayonove,1996 in Ribéreau-Gayon et al., 2000). Vystavení hroznů vlivům slunečního záření během doby zrání se urychluje narušení hromadění karotenoidů a je doprovázeno nárůstem obsahu glykosidačních derivátů C13- norisoprenoidů. Tento jev byl pozorován u odrůd Ryzlink a Syrah (Marais, 1993; Razungles and Bayonove, 1996 in Ribéreau-Gayon et al., 2000). Největší koncentrace methoxypyrazinů se nachází v ještě nezralých hroznech až do 100-200 ng.l ¹ v odrůdě Sauvignon Blanc nebo Cabernet Sauvignon (Allen and Lacey, 1993; Roujou de Boubel, 2000 in Ribéreau-Gayon et al., 2000). Koncentrace postupně klesá během dozrávání, a to vlivem slunečního záření. Tento jev je způsoben zřejmě citlivostí těchto sloučenin na světlo (Heymann1986; Maga, et al., 1989 in Ribéreau-Gayon et al., 2000). 3.10 Vliv agrotechniky na změny aromatických látek Klíčové postavení v managementu kvality ve vinici představují zelené práce. Zelené práce jsou spojeny s produkcí hroznů požadované kvality pro konečné využití, u nichž rozhoduje zejména mikroklima révového keře. Syntéza aromatických látek je ovlivněna počasím, a to zejména teplotou a slunečním zářením. Vysoká intenzita slunečního záření působí velmi negativně na tvorbu žádoucích aromatických látek a může podporovat naopak tvorbu nežádoucích aromatických látek. Zavádění moderních zelených prací do vinohradnické velkovýroby vyžaduje znalosti fyziologie rostlin, vztahu zrání hroznů k počasí a znalosti správných termínů provedení zelených prací. Velmi zásadní je vynikající zdravotní stav hroznů, tzn. minimalizace napadení hroznů padlím révovým a plísní šedou. Takto napadené hrozny neposkytují kvalitní obsah aromatických látek ( Pavloušek, 2007). 22

3.10.1 Volba stanoviště a odrůdy Umístění vinohradu zásadně určuje, zda jeho podnebí je anebo není vhodné pro vinohradnictví. Všechna území produkující víno na světě leží mezi 30 a 50 zeměpisné šířky obou polokoulí. Jsou to zóny mírného podnebí, kde průměrná roční teplota kolísá mezi 10 a 20 C. Nejsevernější vinohrady Německa leží těsně na hranici, mezi 50 a 51 zeměpisné šířky, kde přežívají díky kontinentálnímu klimatickému vlivu, který zajišťuje teplejší léta a kratší dny; ty brzdí růst výhonů a podporují růst plodů. Je zajímavé, že většina nejjemnějších vín světa se produkuje v území západních pobřeží. Lesní a horská pásma chrání révu před větrem a deštěm. Relativní blízkost lesů a velké plochy vody ovlivňují podnebí transpirací a evaporací, a tím zabezpečuje žádanou vlhkost v období sucha, mohou však vyvolat hnilobu (Iacono and Scienza, 1999). Dalším z faktorů k optimální zralosti hroznu je správné zvolení odrůdy k danému klimatu. Hrozny, které dozrávají brzy, bývají většinou pěstovány v chladnějších klimatických pásmech, naopak hrozny dozrávající později jsou pěstovány v pásmech teplejších. V teplých klimatických pásmech, kde jsou průměrné měsíční teploty nad 10 C, je vývoj hroznů velice krátký, třeba i u zralosti. Příliš rychlé zvyšování koncentrace cukrů může být příčinou předčasného sběru i za předpokladu, že ostatní složky v hroznech nejsou v plné zralosti. V chladných klimatických podmínkách nemusí být naopak proces zrání dostačující, vývoj bobule může být delší. Také půda ovlivňuje podmínky zrání. Jako se různým zahradním květinám, zelenině či keřům daří v jednom typu půdy lépe a v jiném hůře, reagují na různé typy půd i určité odrůdy révy. Alkalické půdy s vysokým ph (jako půdy křídové), podporují metabolismus révy k produkci mízy a hroznové šťávy s relativně vysokým obsahem kyselin. Soustavné používání hnojiv snížilo hladinu ph některých vinohradských území Francie a ta nyní produkují hrozny s vyšším ph (tj. s nižší kyselostí). Teplota i intenzita světla hrají důležitou roli v procesu zrání a formaci látek v bobuli (Ribéreau-Gayon et. al., 2000). 3.10.2 Odlistění zóny hroznů (defoliace) V posledních letech nachází mezi pěstiteli stále širší uplatnění defoliace (odlistění) vinic. Zejména při integrovaném pěstování révy vinné je tento trend posílen rostoucími nároky na kvalitu hroznů a zvyšujícími se požadavky na ekologické aspekty produkce. 23

Defoliace keřů révy vinné je základní operace ke zlepšení mikroklimatu v zóně hroznů révového keře. Odlistění má velmi významný vliv na kvalitu hroznů. Zlepšení provzdušnění révového keře a tím rychlejší osychání hroznů představuje preventivní opatření proti plísni révy, šedé hnilobě a padlí révy. Zlepšené světelné neboli sluneční poměry uvnitř révového keře podporují tvorbu látek, které určují kvalitu hroznů (obsah cukrů, kyselin, minerálních a aromatických látek (Hanni, 2004; Pavloušek 2007). Odlistění zóny hroznů působí velmi významným způsobem na obsah organických kyselin a konkrétně u bílých odrůd lze pomocí odlisťování ovlivňovat obsah aromatických látek. V agrotechnice bílých odrůd je třeba věnovat odlistění zóny hroznů velkou pozornost. U odrůd s nižším obsahem kyselin a muškátovým aroma, jako jsou Müller Thurgau, Muškát moravský, může docházet k rapidnímu snížení obsahu organických kyselin a negativnímu ovlivnění aromatu (hořknutí), které vyústí ve zhoršenou kvalitu hroznů a následně i vyrobeného vína (Pavloušek, 2007). 3.10.3 Regulace násady Regulací počtu hroznů ve vinici v průběhu vegetačního období se snažíme upravit případné vysoké zatížení ponechané při zimní řezu révy vinné. Nejedná se zde pouze o odstřihování hroznů na letorostu, ale i odstraňování celých letorostů (Pavloušek, 2007.) Další technologií používanou k regulaci hroznů v době vegetace je aplikace kyseliny giberelové v době květenství. U moštových odrůd je hlavním cílem tvorba volnějších hroznů, částečné sprchnutí a tím vyšší kvalita hroznů (Pavloušek, 2007). Regulace násady v době vegetace a odlistění zóny hroznů působí velmi příznivě na tvorbu aromatických látek. Musí se brát ale v úvahu počasí daného ročníku. Nadměrné odlistění v průběhu velmi slunečných a teplých letech může nepříznivě ovlivnit tvorbu aromatických látek (Pavloušek, 2004). 3.10.4 Hnojení dusíkem Dusík vykonává mnoho různých funkcí v rostlině. Dusík je stavební kámen všech aminokyselin, které potom následně vytváří rostlinné bílkoviny. Dusík je silně zúčastněný na všech biologických procesech, které probíhají v rostlinách. Dusík je 24

obsažený v chlorofylu a mnoha enzymech a stimuluje průběh fotosyntézy v listech. Z tohoto důvodu je zodpovědný za kvalitní vyzrálost hroznů. Optimalizace dusíkatého hnojení vyžaduje přesné znalosti časového průběhu příjmu dusíku rostlinou. Doba příjmu u révy vinné je ve srovnání s jinými kulturními rostlinami velmi krátká. Dusíkaté hnojení nastává především organickými nebo minerálními hnojivy přes půdu. Při akutním nedostatku živin je možné dodat tyto živiny pomocí více aplikací listových hnojiv. Dusíkaté látky jsou velmi důležité pro rozmnožování a vlastní činnost kvasinek. Pokud je v moštu nedostatek dusíkatých látek, dochází ke snížení rozmnožování kvasinek, snižování intenzity kvašení. Kvasinky druhu Saccharomyces cerevisae nemohou využívat nitrátový dusík v amonné formě a ve formě aminokyselin a lze potom souhrnně hovořit o kvasinkami asimilovatelném dusíku. Aminokyseliny mají největší význam pro dusíkatou výživu kvasinek, Tyto aminokyseliny lze přesněji označit jako volné α-aminokyseliny. Mezi tyto volné α- aminokyseliny nelze zahrnout aminokyselinu prolin, kterou nemohou kvasinky využívat pro svoji výživu. Nedostatek asimilovatelného dusíku se projevuje u nedokonale vyzrálých hroznů, stresovaných a hroznů, které jsou napadené šedou hnilobou (Botrytis cinerea). U hroznů s nízkým obsahem dusíku je možné tento nedostatek kompenzovat výživou pro kvasinky. Z pohledu kvality vína však toto není ideální řešení, protože aminokyseliny v moštu mají významný vliv i na aromatický projev vyrobeného vína. Aromatické látky jsou velmi významným ukazatelem kvality vín. Dusíkaté látky v hroznech a moštech jsou rovněž velmi významné pro tvorbu aromatických látek ve vínech. Dusíkaté látky ovlivňují především vyšší alkoholy a následné estery, které určují aromatický projev vína (Pavloušek, 2006). Každoroční hnojení dusíkem by nemělo přesáhnout určitou povolenou hranici (30 kg.ha ¹), protože důsledkem přehnojení je značný vegetativní růst keře, který blokuje proces zrání. Úroda je v tomto případě bohatá, ale koncentrace cukrů a fenolických sloučenin je nízká. Tento nadbytek může snížit koncentrace anthokyanů a taninů v bobuli (Delgado et al., 2004 in Conde et al., 2007). 25

Studie, která poukazuje na vztah zásobování dusíkem a tvorbu aromatických norisoprenoidů ukazála, že přihnojováním dusíkem se snižuje množství TDN v hroznech Ryzlinku rýnského. Naopak menší zásoba dusíku vede ke snižování koncentrací velmi ceněné aromatické látky β-damascenon (Linsenmeier and Löhnertz, 2007). 3.11 Možnosti stanovení aromatických látek a aromatického potenciálu hroznů Jestliže sklízíme hrozny pouze na základě zjištěné cukernatosti, mluvíme o průmyslové zralosti hroznů. Průmyslová zralost koresponduje pouze s vysokým obsahem cukrů a pokud možno při vysokém výnosu, ale ostatní parametry se neberou příliš v úvahu. Pokud se budeme dále držet cukernatosti hroznů, bude se kvalita našich vín pohybovat možná na současné úrovni, ale nebude mít stoupající tendenci. A pokud budeme mít povolený výnos 16t.ha -1, staneme se přeborníky vysokých sklizní, ale producenti nízké kvality hroznů. Kvalita hroznů by měla být stanovována pomocí jejich aromatického a u červených vín fenolického potenciálu, neboli aromatické a fenolické zralosti. Technologie zpracování hroznů musí navazovat na kvalitu hroznů. Prvotním předpokladem úspěšné sklizně hroznů je stanovit si požadavky na kvalitu hroznů v době sklizně. Tyto kvalitativní požadavky se musí pohybovat v rozsahu hroznů pro kvalitní jakostní víno a vína přívlastková. Agrotechnické zásahy ve vinici a požadavky na sklizeň potom musí být přizpůsobeny určitému cíly. Zákonitě navazuje i plánovaná technologie zpracování hroznů, což je velmi důležité především u červených vín. U bílých vín potom hraje významnou roli použití vhodného kmene kvasinek, případně vhodné macerace hroznů, k extrakci vyššího množství aromatických látek. Za kritické lze považovat kvalitu sklizně hroznů, kterou nám ukazuje pouze cukernatost a použití identického způsobu zpracování hroznů bez ohledu na odrůdu kvalitativní stupeň. Jako pěstitele nás musí zajímat především technologická a fyziologická zralost hroznů. Při hodnocení fyziologické zralosti hroznů bereme v úvahu dva základní 26

parametry, a to parametry analytické a senzorické hodnocení keře révy vinné a hroznů. (Pavloušek, 2005). 3.11.1 Senzorické hodnocení Aromatické látky se tvoří v bobulích révy vinné ve slupce a těsně pod slupkou. Aromatickou zralost můžeme hodnotit vizuálně na základě zbarvení slupky a senzoricky na základě chuti volných aromatických látek v bobulích. Barva slupky může velmi výrazně napovědět o skutečné kvalitě hroznů. Zelená slupka bobule je většinou znakem nedostatečné aromatické zralosti bobulí. V takových bobulích potom převažují travnaté tóny, které jsou výrazným znakem nevyzrálosti hroznů. Opačným extrémem je bobule nahnědlá, připálená od slunečního úpalu. V bobulích s takto zbarvenou slupkou je vysoký obsah prekurzorů těkavých fenolických látek, které potom ve víně způsobují připálené tóny, plastové tóny a zatuchlost. Za optimální z pohledu aromatické zralosti lze považovat, v závislosti od odrůdy, nažloutlé tóny barvy slupky, s jemně načervenalými tečkami na slupce, typické zejména u Ryzlinku rýnského, nebo v optimální zralosti i u Ryzlinku vlašského. Také u odrůdy Hibernal lze orientačně odhadovat aromatický potenciál podle zbarvení slupky. Při zelené až lehce narůžovělé slupce bobule je následné aroma vína s tóny bezového květu a mírně travnaté, kdežto naopak u velmi intenzivního růžového zbarvení je potom aroma vína výrazně ovocné jako u Ryzlinku rýnského. Díky sklizni v optimální aromatické zralosti můžeme docílit skutečně vynikající kvality výchozí suroviny pro výrobu vína. Někdy je potom vhodná dřívější sklizeň hroznů nežli čekání na vysokou cukernatost. Slupka bobulí potom může výrazně zhnědnout a zpracování takových hroznů by bylo problematické a kvalita vína nižší. Senzorické stanovení aromatické zralosti hroznů je proto v současné době základní metodou stanovení přímo na vinici (Pavloušek, 2007). Z pohledu sklizně kvalitních hroznů je optimální stupeň 4. Velký počet hroznů se v našich vinicích sklízí velmi často ve stupni 5, který je již nekvalitním pro výrobu vína. Na základě této stupnice je proto možné přímo ve vinici hodnotit aromatickou zralost. 27

Tab. č. 7 hodnocení aromatické zralosti slupky (Pavloušek, 2008) Hodnocený znak 1 2 3 4 5 Barva slupky zelená zelenožlutá žlutozelená žlutozelená s odstínem do zlatava nebo růžova zlatavá s hnědými skvrnami Kyselá chuť velmi silnánepříjemná silnánepříjemná střednípříjemná svěžípříjemná nepříjemnáagresivní Trpká chuť Silná střední nízká žádná silná Ovocné aroma Slabé střední silná velmi silná slabá-cizí Travnaté aroma silné střední slabé nepřítomné střední intenzita-cizí Tab. č.8 Hodnocení aromatické zralosti dužniny (Pavloušek, 2008) Hodnocený znak 1 2 3 4 5 Kyselá chuť velmi silnánepříjemná silnánepříjemná střednípříjemná freshpříjemná nepříjemnáagresivní Sladká chuť velmi slabá slabě sladká středně sladká velmi sladká sladká s cizími tóny Ovocné aroma slabé střední silná velmi silná slabá-cizí Travnaté aroma silné střední slabé nepřítomné nepřítomné 28

3.11.1.1. Senzorická jakost vín Senzorické hodnocení vín je základním prostředkem stanovení jakosti a konkurzního srovnávání. V současnosti můžeme víno považovat za potravinářskou komoditu, která je u nás cíleně senzoricky hodnocena nejčastěji a to jak nejširším okruhem informovaných laiků, tak školených odborných posuzovatelů a expertů (Balík in Máchal, 2007). 3.11.1.2 Posuzované organoleptické parametry - Senzorická analýza vín Senzorická analýza vín představuje hodnocení kvality a intenzity vjemů, které jsou vytvářené organoleptickými vlastnostmi vín, smyslovými orgány. Prostřednictvím našich receptorů a zkušeností uložených v paměti víno poznáváme, identifikujeme, srovnáváme, popisujeme a klasifikujeme. Mezi základní posuzované organoleptické znaky révových vín patří: Vzhled vína - skládá se z posouzení čistoty, dokonalé čirosti a barvy vína, kde hodnotíme barevnou intenzitu a odstín s ohledem na kategorii vína a jeho ročník. Vůně a aroma vůni vína (buket) hodnotíme na základě senzorického posouzení její kvality, intenzity a harmonie. Aroma vína představuje sekundární čichový podnět. Podle původů rozeznáváme primární (hroznové) vůně a aroma, sekundární (kvasné) a terciální vůně a aroma (ležácký buket, chlebnatost, barrique). Chuť vína patro vína reprezentuje hodnocení kvality, intenzity a harmonie všech netěkavých a těkavých látkových složek vína. Významnými posuzovanými znaky jsou rovněž kvalita dochuti a perzistence chuti (délka trvání pozitivního chuťového vjemu (Balík in Máchal, 2007). Postupy degustace pro vědecké účely odhady a posudky amatérů či odborníků můžeme shrnout do 3 hlavních bodů: 1) Předložení samotného vzorku osobě ve správné sklenici, při správné teplotě a světle a hlavně bez jakéhokoliv rozptylování. 2) Přesně popsané úlohy co má degustátor při degustaci dělat a jak má výsledky interpretovat. 29

3) Postupy pro shromažďování, analýzu, interpretaci a prezentaci informací (Clarke and Bakker, 2004). 3.11.2 Metody analytického hodnocení 3.11.2.1 Chromatografie Chromatografie je separační metoda, při které se oddělují (separují) složky obsažené ve vzorku. Je to především metoda kvantitativní a kvalitativní analýzy vzorku. Vzorek je vnášen mezi dvě fáze, přičemž stacionární je nepohyblivá, mobilní fáze je pohyblivá. Vzorek je umístěn na začátku stacionární fáze a pohybem mobilní fáze přes stacionární fázi je unášen. Složky vzorku mohou být stacionární fází zachycovány a proto se při pohybu zdržují. Více se zdrží složky, které jsou stacionární fází poutány silněji. Postupně se takto složky od sebe separují a na konec stacionární fáze se dostanou méně zadržované (Klouda, 2003). 3.11.2.2 Plynová chromatografie ( Gas Chromatography) Plynová chromatografie je dynamická metoda separace a detekce těkavých organických sloučenin a několika stálých plynů ve směsi (Seattle, 1997). Principem plynové chromatografie je distribuce složek mezi dvě fáze mobilní (plynnou) fází a stacionární (pevnou nebo kapalnou) fází (Jančářová et. al., 2003). Plynová chromatografie je analytická a separační metoda, která má výsadní postavení v analýze těkavých látek. Mezi hlavní výhody této techniky patří jednoduché a rychlé provedení analýzy, účinná separace látek a malé množství vzorku potřebné k analýze. Existuje mnoho variant, v praxi jsou nejvíce rozšířené plynové chromatografy s kapilárními kolonami. Plynová chromatografie se používá ke stanovení složek v plynných, kapalných i pevných vzorcích. Aplikační oblast plynové chromatografie je široká, využívá se především pro stanovení organických látek, při analýze polutantů životního prostředí a herbicidů. (Jančářová et. al., 2003). Plynová chromatografie je založena na mechanismu adsorpce, rozdělování nebo vylučování. (Literák, 2007). 30

3.11.2.3 Kapalinová chromatografie Pro všechny metody kapalinové chromatografie platí, že mobilní fázi tvoří kapalina. Stacionární fázi představuje sorbent, který může být umístěn plošně nebo v koloně či sloupci. Z tohoto hlediska se vyvinuly i názvy jednotlivých metod kapalinové chromatografie. V plošném uspořádání jsou to metody tenkovrstvé a papírové chromatografie, v kolonové chromatografii mluvíme o klasické sloupcové chromatografii a vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC high performance liquid chromatography) (Jančářová et. al., 2003). 3.11.2.4 Kolonová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Jedná se o nejčastější aplikaci v instrumentální analytické chemii. Tato metoda je dostatečně robustní a poskytuje reprodukovatelná data. Lze ji aplikovat na široké spektrum analytů v závislosti na druhu detekce. HPLC lze podle chemické povahy mobilní a stacionární fáze rozdělit na dva základní druhy: 1. chromatografie s normálními fázemi (NP-HPLC) stacionární fáze je polární (silikagel) a mobilní fáze je nepolární (např. pentan, hexan, chloroform) 2. chromatografie s obrácenými fázemi (reverzními) fázemi (RP-HPLC) stacionární fáze je nepolární (modifikovaný silikagel) a mobilní fáze je polární (např. metanol, acetonitril, voda). Uvádí se, že tato technika tvoří zhruba 80 % všech HPLC aplikací (Jančářová et. al., 2003). 31

4. MATERIÁL A METODIKA 4.1. Charakteristika stanoviště Vzorky byly odebírány ve vinici na Mendeleu v areálu Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Lednici. Vinice je umístěna v kukuřičném výrobním typu, subtypu ječném. Jedná se o oblast teplou a suchou s mírnými zimami. Průměrná teplota zde dosahuje dlouhodobého průměru 9 C s ročním úhrnem srážek kolem 516 mm. Pozemek je rovinatý, mírně svažitý a orientovaný na jihozápad. Půda je hlinitopísčitá. 4.1.1 Vývoj počasí v roce 2010 a výskyt chorob Vzhledem k mimořádnému vývoji počasí v roce 2010 je zde potřeba alespoň okrajově zmínit průběh počasí a zdůraznit výskyt chorob. Celý průběh roku 2010 byl pro každého vinaře na území ČR nepříjemný a výnosy byly velice nízké. Příchod jara byl velice pomalý a deštivý. Dle záznamů meteorologů bylo v měsíci dubnu a květnu 50% slunečního svitu. Co se týká srážek, byly všechny jarní měsíce velice nadprůměrné a teplotně pod dlouhodobým normálem. Měsíc červen byl také srážkově nadnormální a teploty velmi variabilní. Srážkově nadprůměrný byl také červenec, srpen, i září a navíc se v srpnu vyskytovaly i přívalové deště. Réva rašila opožděně od konce 1. dekády dubna a kvetení započalo až cca. v polovině června. Ve fázi růstu způsobily problémy výskyty hálčivců a riziko napadení vinic plísní révovou (Plasmopara viticola) bylo vysoké po celý rok. V období květu révy byly vinice ohroženy výskytem plísně šedé (Botryotinia fuckeliana), mnohé květní laty byly napadeny a došlo k jejich zaschnutí. Celé doba vegetace byla opožděna o zhruba tři týdny. Vývoj počasí v Lednici na Moravě nám ukazují grafy č. 5, 6, 7 a tabulky č. 14, 15, 16 a 17 uvedené v příloze. 32

4.2. Charakteristika zkoumané moštové odrůdy 4.2.1 Hibernal Odrůda Hibernal byla vyšlechtěna na Výzkumném ústavu Geisenheim, v Německu Dr. Helmutem Beckerem. Jedná se o křížence Seibel 7053 x Ryzlink rýnský F2. Odrůda je bujného vzrůstu. Olistění keřů je středně husté. Růst zálistků je střední. Hrozen je malý až střední, válcovitě-kuželovitý, většinou středně hustý až hustý. List je velký, mohutný, tuhý, slabě trojlaločnatý. Bobule je malá, kulatá, s pevnou, silnější slupkou a tuhou dužninou. Základní barva bobulí je zelenožlutá se špinavě červeným zbarvením na osluněné straně hroznu. V době aromatické vyzrálosti je osluněná strana intenzivně narůžovělá. Plodnost je pravidelná nejen při dlouhém řezu na tažně, ale i na kordónech s dvouokými čípky, kdy jsou hrozny menší Foto č.1 (Pavloušek, 2007) a kompaktnější. Odrůda Hibernal má vysokou odolnost proti zimním mrazům. Hrozny této odrůdy je možné díky vysokému obsahu extraktivních a kořenitých látek využívat ke speciálním technologiím k ledovým a slámovým vínům, ke školení metodou sur lies nebo v sudech barrique. Je pravděpodobné, že by víno mohlo být jako odrůdové víno nebo jako součást cuveé vhodné k výrobě sektů. Současně je využitelné jako podpora extraktu i aromatických látek a ke zvýšení obsahu kyselin. Odrůda Hibernal má širokou škálu pěstitelského využití. Jako odrůda se zvýšenou odolností proti houbovým chorobám je Hibernal zajímavým článkem sortimentu pro integrovanou produkci a pro výrobu biovín (Kraus, 2005). 4.3 Způsob odběru vzorku pro senzorické hodnocení Při hodnocení aromatické zralosti je významné především pozorování zbarvení slupky bobule a dále hodnocení chuťových vlastností bobule. Aromatická zralost u 33

různých odrůd probíhá rozdílně a není pravidlem, že se zvyšující se cukernatostí hroznů se zvyšuje i kvalita aromatické zralosti hroznů (Pavloušek, 2005). 4.3.1 Použitá metodika, založení pokusu senzorické hodnocení Při analýze jsou použity 3 bobule, které se ochutnávají současně, přičemž se samostatně hodnotí jejich vzhled a mechanické (taktilní) vlastnosti, chuť dužiny a slupky a také vzhled a eventuálně chuť jadérek. V našem případě byly hodnoceny aromatická zralost slupky a aromatická zralost dužniny bobulí. 4.3.1.1 Barva bobulí Ukazatel č.1 - s postupující zralostí se barva bobulí zvyšuje, zbarvení bobulí hodnotíme pomocí tabulky č. 7. V případě nerovnoměrného zbarvení se orientujeme podle nejintenzivnějšího vybarvení a pozornost věnujeme zejména místům kolem stopečky. 4.3.1.2 Degustace dužniny Vložíme bobulí do úst a vytlačíme z každých tří bobulí šťávu tak, že každou z bobulí přitiskneme jazykem na patro. Dužninu z těchto 3 bobulí ponecháme v ústech, vyplivneme slupky a jadérka do dlaně a podržíme je. Šťávu z dužniny pak zcela vytlačíme jazykem na patro. Během oddělování dužniny od slupky posoudíme snadnost, s níž se toto oddělení děje. Posoudíme jadérka a všimneme si zda na nich neulpívá dužnina. Nakonec během toho, co slupku definitivně rozžvýkáme, všimneme si, zda se ještě neuvolňuje šťáva. U směsi šťávy ze tří zrnek pak posoudíme chuť sladkou (ukazatel č.2), kyselou chuť (ukazatel č.3) a povahu a intenzitu aroma (ukazatel č. 4 a 5) Ukazatel č.2- sladkost dřeně se s postupující zralostí zvyšuje. Posoudíme chuť vnímanou po oddělení slupky a smíchání šťávy ze 3 bobulí podle stupnice viz tabulka č. 7 Ukazatel č.3 - kyselost dřeně se s postupující zralostí snižuje. Posoudíme chuť vnímanou po oddělení slupky a smíchání šťávy ze tří bobulí podle stupnice viz tabulka č. 7 34

Ukazatel č.4 - aroma dřeně se s postupující zralostí zvyšuje. Posoudíme chuť, která se nám vybaví při degustaci šťávy ze tří bobulí. viz tabulka č. 7 Ukazatel č.5 - intenzita dominantního aroma dřeně je hodně závislý na odrůdě a na počtu hroznů na keři. V průběhu dozrávaní se tento ukazatel nevyvíjí vždy zcela rovnoměrně viz tabulka č. 7 4.3.1.3 Degustace slupky Po vyplivnutí šťávy a dřeně vložíme do úst 3 slupky. Rozžvýkáme slupku 10x-15x (pokaždé musíme dbát na to, aby počet pohybů čelistí byl vždy stejný). Posléze dáme rozžvýkanou směs na patro, pak mezi vnitřní stranu tváře a dásně a na sliznici rtů. Po vyplivnutí této směsi přejedeme dvakrát jazykem po patře zezadu dopředu a posoudíme kyselost slupky a sladkost slupky (ukazatel č.1 a 2). Nakonec posoudíme povahu aroma slupky (ukazatel č.3). Ukazatel č.1 - Kyselost slupky se s postupující zralostí snižuje. Kyselost ohodnotíme tak, že rozžvýkanou kaši necháme působit na patro a na vnitřní stěnu tváře. Podobně jako dřeň je tento ukazatel hodnocen opačným způsobem než ukazatele ostatní (1 označuje slupku málo kyselou, 4 slupku velmi kyselou a nezralou) viz tabulka č.8 Ukazatel č.2 - Sladkost slupky se s postupující zralostí zvyšuje. Sladkost ohodnotíme tak, že rozžvýkanou kaši necháme působit na patro a na vnitřní stěnu tváře viz tabulka č. 8 Ukazatel č.3 - Aroma slupky se s postupující zralostí zvyšuje. Dominantní aroma, které vnímáme po degustaci slupek hodnotíme podle stupnice viz tabulka.č.8 4.4 Způsob odběru vzorku pro analytické hodnocení Vzorek obsahoval cca 200 g bobulí. Bobule musí být v dobrém zdravotním stavu, bez napadení houbovými chorobami a škůdci. Vzorek se odebírá z celé plochy vinohradu. Hrozny se odebírají z obou stran listové stěny. Samozřejmě rovnoměrně bobule exponované slunci a zastíněné. Analýzu provádíme co v nejkratším termínu po sběru. 35

4.4.1 Použitá metodika založení pokusu analytické hodnocení Ve zkoumaných vzorcích byly měřeny následující hodnoty: cukernatost hodnota ph obsah veškerých titrovatelných kyselin přepočtených na kyselinu vinnou. 4.4.1.1 Stanovení veškerých titrovatelných kyselin Stanovení veškerých titrovatelných kyselin bylo provedeno metodou alkalimetrie. Součástí titrační aparatury byla digitální byreta, kádinka, magnetická míchačka a digitální ph metr. Pipetou bylo odměřeno 10 ml analyzovaného vzorku do titrační kádinky, přidáno 10 ml destilované vody a za stálého míchání pomocí magnetické míchačky bylo přidáváno z byrety 0,1 mol.l ¹ roztoku NaOH. Do kádinky byla před započetím titrace ponořena kombinovaná elektroda ph metru, která zaznamenává v průběhu titrace změnu ph roztoku. ph metr byl před měřením kalibrován při 20 C na standardní tlumivé roztoky o ph 7 a ph 4. Jakmile dosáhnul analyzovaný roztok ph 7 a tato hodnota vydržela i při důkladném promíchání, byla titrace ukončena. Následně bylo odečteno množství spotřebovaného NaOH a dosazeno do vzorce pro výpočet obsahu veškerých titrovatelných kyselin vyjádřených jako kyselina vinná: X = a f 0,75 [g l ¹] X - obsah veškerých titrovatelných kyselin v g. l ¹ a - spotřeba NaOH v ml f - faktor NaOH V - objem moštu v ml 36

4.4.1.2 Stanovení cukernatosti Při stanovení cukernatosti bylo použito Abbého refraktometr. Testovaný vzorek byl upraven na teplotu 20 C a filtrován přes suchou gázu. Připravený vzorek byl nanesen na očištěný a suchý hranol pomocí skleněné tyčinky. Po uzavření refraktometru bylo posunuto ukazatelem do takové polohy, aby se rozhraní světla a tmy v okuláru refraktometru nacházelo na středu nitkového kříže. Následně bylo odečteno hmotnostní procento rozpustné sušiny filtrátu s přesností na 0,1%. Po každém měření byl hranol očištěn destilovanou vodou a osušen. Měření bylo vždy několikrát zopakováno a průměrem z těchto měření byla získána výsledná hodnota vzorku. 4.4.1.3 Stanovení hodnoty ph Na stanovení hodnoty ph moštu bylo použito digitálního ph metru s kombinovanou elektrodou, která v sobě integruje měrnou i referenční elektrodu. Do kádinky bylo nalito takové množství vzorku, ošetřeného filtrací přes sítko, aby obě elektrody byly ponořeny. Vzorek byl v průběhu měření promícháván magnetickou míchačkou. Vzorek měl běžnou laboratorní teplotu (20 C). Po zapnutí ph metru a ustálení hodnoty byla odečtena výsledná hodnota. Následně byl ph metr vypnut a elektroda vytáhnuta ze vzorku, před dalším měřením byla elektroda očištěna pomocí destilované vody a osušena. Měření ph nesmí probíhat moc dlouhou dobu, hrozí navázání oxidu uhličitého obsaženého ve vzduchu do roztoku a ovlivnění výsledné hodnoty. 4.5 Příprava mikrovzorků vín Bylo odebíráno 5 7 kg hroznů v termínech odběru 10. 9. 2010, 24. 9. 2010 a 8. 10. 2010, hrozny byly vzápětí přeneseny do školní laboratoře. Následovalo ruční odstopkování a mošt byl získán lisováním na malém laboratorním košovém lisu. Bylo získáno zhruba 3 l moštu, který byl následně doslazen na 21 NM a zakvašen univerzálními kvasinkami, které jsou určeny pro všechny bílé odrůdy révy vinné. Kvasinky mají vysokou odolností k alkoholu, nízkou tvorbu pěny a nízkou tvorbu 37

těkavých kyselin. Jsou vhodné také pro kvašení bez řízené teploty. Kvasinky patří k druhu Saccharomyces cerevisiae. Kvašení probíhalo při teplotě 16 C. Po vykvašení bylo víno stočeno a zasířeno dávkou 40 mg.l -1 SO 2. U vzorků následně proběhla chemická analýza a senzorické hodnocení, při kterém se degustátoři zaměřili zejména na aromatický projev vína. 4.6. Chemický rozbor vín 4.6.1 Alkohol Hodnoty alkoholu ve vzorcích byly stanoveny destilačně na přístroji Gibertiny s vyhodnocením pomocí hustoměrných vah Densi Mat. Postup práce: Měrná nádobka byla naplněna po rysku vzorkem vína zbaveného CO 2 a pomocí hustoměrných vah byla stanovena hustota vzorku. K destilaci bylo odebráno 100 ml vzorku. Destilát byl jímán do speciální 100 ml odměrné baňky. Následně byla na hustoměrech vahách stanovena hustota destilátu a automatickým výpočtem stanoven obsah alkoholu a celkového extraktu (Balík, 1998). 4.6.2 Veškeré titrovatelné kyseliny a ph Obsah veškerých kyselin byl stanoven potenciometrickou titrací 0,1M NaOH do ph 7 na automatickém titrátoru TitroLine Easy. Postup práce: k analýze bylo nedělenou pipetou odebráno 10 ml vína do 50 ml kádinky, vzorek byl zbaven CO 2 (povařením), ve vzorku bylo změřeno ph pomocí kombinované elektrody. Následně bylo ke vzorku přidáno 10 ml destilované vody. Vzorek byl titrován 0,1 M roztokem NaOH do ph 7 a promíchání vzorku bylo zajištěno pomocí elektromagnetického míchadla. Při ph 7 byla titrace ukončena (Balík, 1998). 38

4.6.3 Redukující cukry dle Rebeleina Stanovení je založeno na principu jodometrie, z rozdílu spotřeb roztoku thiosíranu sodného na titraci měďnatého kationu o definované koncentraci a jeho zůstatku po reakci s redukujícími cukry, bez předcházejícího odstranění interferujících látek (Balík, 1998). Postup práce: Do kuželové baňky bylo pipetou odměřeno 10 ml roztoku 1(CuSO 4 ) a 5 ml roztoku 2 (zásaditý vinan sodno-draselný) a 2 ml zkoušeného vzorku. Baňka byla přivedena k varu a obsah vařen po dobu 1,5 min. Poté bylo ke vzorku přidáno 25 ml destilované vody a po ochlazení 10 ml roztoku 3 (zásaditý jodid draselný), 10 ml 16% H 2 SO 4 a 10 ml škrobového mazu. Obsah baňky byl titrován roztokem thiosíranu sodného do mléčného zbarvení. Při analýze slepého vzorku bylo postupováno stejně, místo vzorku vína však byly do kuželové baňky napipetovány 2 ml destilované vody. 4.6.4 GC-MS Stanovení jednotlivých volatilních sloučenin Příprava vzorku Koncentrace jednotlivých volatilních byla stanovena dosud nepublikovanou metodou extrakce methyl-t-butyletherem. Do 25ml odměrné baňky bylo odpipetováno 50 µl roztoku 2-nonanolu v ethanolu, sloužícího jako vnitřní standard, o koncentraci 400 mg/l. Poté byla baňka po značku doplněna zkoumaným vzorkem a přidáno 1,5 ml extrakčního rozpouštědla, kterým byl MTBE s přídavkem 1% cyklohexanu. Po důkladném protřepání a oddělení fází byla vrchní organická vrstva i s podílem vzniklé emulze odebrána do mikrozkumavky, odstředěna a čirá organická fáze byla vysušena bezvodým síranem hořečnatým. Takto upravený extrakt byl dále použit k GC-MS analýze (Kumšta, 2011). 39

GC-MS Analýza Instrumentace: Shimadzu GC-17A Autosampler: AOC - 5000 Detektor: QP-5050A Software: GCsolution Podmínky separace: Kolona: DB-WAX 30m x 0,25mm; 0,25µm stacionární fáze (polyethylenglykol) Objem nástřiku vzorku: 1ul split poměr 1:5 Průtok nosného plynu He: 1 ml/min (lineární rychlost plynu 36 cm/s) Teplota nástřikového prostoru: 180 C Počáteční teplota kolonového prostoru 45 C byla udržována 3,5 minuty, poté následoval gradient teploty: do 75 C o 6 C/min do 126 C o 3 C/min do 190 C o 4 C/min do 250 C o 5 C/min. Konečná teplota byla držena 6,5 min. Celková délka analýzy byla 60 minut. Detektor pracoval ve SCAN modu s intervalem 0,25 s v rozmezí 14-264. Napětí detektoru 1,5 kv. Jednotlivé látky byly identifikovány na základě MS spektra a retenčního času. Kvantifikace byla provedena porovnáním plochy píku vzorku a vnějšího standardu s korekcí na vnitřní standard. Chemikálie použité k pokusu Methyl t-butyl ether (MTBE) a cyklohexan byly čistoty pro GC. V tabulce uvedené látky pocházely od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) a byly použity jako standardy. 40

Tabulka č. 20 Použité chemikálie k pokusu na GS Ethyl acetát Ethyl oktanoát Nerol Methanol Kyselina octová 2-Phenylethyl acetát Diacetyl Furfural Beta-Damascenon Isobutyl acetát 2-Nonanol Hexanová kys. Ethyl butyrát Propionová kys. Geraniol 1-Propanol 2,3-Butandiol Benzylalkohol 1-Butylacetát Linalool 2-Phenylethanol Hexanal Isomáselná kys. Beta-Ionon Isobutylalkohol Gama-butyrolakton 4-Ethylguaiacol Isoamyl acetát Máselná kys. Furaneol 1-Butanol Beta-Terpineol Diethylmalát Isoamylalkohol Ethyl dekanoát Oktanová kys. (E)-2-Hexenal Furfurylalkohol 4-Ethylfenol Ethyl hexanoát Isovalerová kys. 4-Vinylguaiacol 1-Hexyl acetát 2-Methylbutanová kys. 2-Aminoacetophenon Acetoin Diethyl sukcinát Methyl antranilát Ethyl laktát Alfa-Terpineol Dekanová kys. 1-Hexanol Methionol 4-Vinylfenol (E)-2-Hexen-1-ol Beta-Citronellol Dodekanová kys. Penta). Ostatní použité chemikálie byly p.a. kvality od lokálního dodavatelů (Lachema, 4.6.5 Senzorické hodnocení mikrovzorků Při senzorické hodnocení byl posuzován vzhled vína, vůně, chuť a dochuť a podle komplexního názoru byl včleněn do 100 hodnocení v tabulce. Víno bylo degustováno ve sklence určené pro mezinárodní standardy a to na stopce naplněné malým množstvím vína. Sklenka byla zvednuta proti světlu nahnuta do úrovně 30 až 45 a zhodnocena jiskra a barva vína. Chuť byla posuzována degustací cca. 10 ml vína, které byly pováleny na jazyku ze strany na stranu a na kořenu jazyka. Dále bylo víno necháno sklouznout přes horní patro a pomalu polknuto. Dále byl hodnocen celkový dojem z vína a jeho projevů (Jackson, 2002). Degustátoři se zaměřili i na aromatický projev hotového vína. Čirost vína byla hodnocena u všech vzorků počtem 5 bodů. 41

Senzorického hodnocení se účastnilo 5 degustátorů s platným osvědčením. Výsledky degustace byly zprůměrovány. Obrázek č. 3 Postup degustace vína (Jackson, 2002) 4.7. Statistické hodnocení Pro zjištěné analytické parametry bobulí máme rozsah dat dostatečný pro provedení statistické analýzy lineární závislosti. Mírou lineární závislosti dvou nezávislých výběrů x a y může být výběrový koeficient korelace, definovaný pro s 1, s 2 > 0 jako r xy n 1 x = n 1 i m s i= 1 1 1 y i m s 2 kde n je rozsah náhodných výběrů, m 1 a m 2 jsou průměry a s 1, s 2 jsou výběrové rozptyly (Budíková, 2010). Výběrový koeficient korelace nabývá hodnot od -1 do 1, přičemž rovnost nastává tehdy, je-li mezi výběry úplná lineární závislost, tedy platí, že y i = a + bx i. Čím je výběrový koeficient korelace blíže 1, tím silnější je přímá lineární závislost mezi výběry, čím je bližší -1, tím silnější je nepřímá lineární závislost. Hodnoty blízké nule značí lineární nezávislost. Statistickou významnost výběrového koeficientu korelace je nutno testovat, protože zejména pro malé rozsahy výběrů může být i relativně velký koeficient korelace statisticky nevýznamný. Použijeme přístup pomocí p-hodnoty, kdy hypotézu o nulovosti korelace zamítneme, pokud bude p-hodnota menší než hladina významnosti (budeme pracovat na hladině významnosti 0,05). Výpočty provedeme v statistickém software GENSTAT 13.1 (http://www.vsni.co.uk/). 2, 42