Teorie chromatografie - II

Teorie chromatografie - II Příprava předmětu byla podpořena projektem OPP č. CZ.2.17/3.1.00/33253

2.2 Interakce mezi molekulami Mezi elektroneutrálními molekulami působí slabé přitažlivé síly, které sdružují molekuly. Těmito interakcemi je ovlivňován bod varu a tenze par složky. Interakcemi různých molekul jsou ovlivňovány hodnoty aktivních koeficientů složek rozpuštěných ve stacionární fázi Mezimolekulární síly působí nejen v mobilní fázi, nýbrž i ve fázi stacionární, kapalné i pevné van der Waalsovy síly Rozlišují se tři typy van der Waalsových interakcí: 1. Síly působící mezi dvěma dipóly, tj. orientační, Coulombické, Keesomovy Uplatňují se mezi molekulami s permanentními dipóly Fyzikální podstata je elektrostatická Permanentní dipóly se přitahují tak, že opačné póly jsou u sebe Tepelný pohyb působí proti přitažlivým silám, výsledně se ustaví rovnováha závislá na teplotě

2. Síly působící mezi dipólem a indukovaným dipólem, tj. indukční, Debeyovy Molekula s permanentním dipólem může, po přiblížení k molekule nepolární (bez permanentního dipólu), deformovat elektronový obal této molekuly za vzniku indukovaného dipólu Interakce je závislá na deformovatelnosti elektronového obalu nepolární molekuly, deformovatelnost je možno vyjádřit jako elektrickou polarizovatelnost molekuly α [C m 2 V -1 ] Polarizovatelnost roste se zvětšující se vzdáleností valenčních elektronů od jádra 3. Síly působící mezi dvěma nepolárními molekulami, tj. disperzní, Londonovy Interakce se vyskytují i u vzácných plynů Kladné náboje jader atomů nejsou úplně odstíněny vlastními elektrony a působí na elektronový obal jiných molekul, které se příslušně přiblíží Londonovy síly jsou nejdůležitější interakcí působící při adsorpci nepolárních látek na nepolárním povrchu

Vodíkové můstky Vodík může za jistých okolností tvořit můstek mezi dvojicí jiných atomů Může spojovat dva atomy téže molekuly-intramolekulární můstek, nebo dva atomy odlišných molekul-intermolekulární vodíkový můstek Základní podmínkou pro vznik vodíkového můstku je vazba na silně elektonegativní atom, např. kyslík, dusík, fluor Za vzniku vodíkového můstku dochází k tvorbě dipólu, záporný náboj je posunut směrem k elektronegativnímu atomu a kladný směrem k vodíku Vodíkový můstek bývá pevný, energie vazby ~20 KJ/mol Mnoho látek může poskytovat nevazebný elektronový pár, pro vznik vodíkového můstku, např. étery, aldehydy, estery atd. Vodíkové můstky se mohou podílet na adsorpci polárních látek na adsorbentech, jejichž povrch nese např. hydroxylové skupiny

3. Kinetický aspekt chromatografické separace V předchozích částech (2.1 Interakce mezi fázemi, 2.2 Interakce mezi molekulami) byly uvedeny faktory, které ovlivňují termodynamiku dělícího procesu V následující části jsou prezentovány základní procesy přispívající k rozšiřování zón separované složky během postupu kolonou 3.1 Základní pojmy Retenční čas t R, mrtvý retenční čas t M, mrtvý retenční objem V M V M je obvykle ztotožněno s V m (objem mobilní fáze v koloně) Objemová rychlost F m [cm 3 s -1 ] a lineární rychlost mobilní fáze u [cm s -1 ] Platí vztah: V M = F t V (1) m M m

Délka kolony se značí L [cm], pak pro lineární rychlost mobilní fáze platí: L u = (2) t M Složka retardovaná na koloně se pohybuje lineární rychlostí u : L u = (3) t R Poměr rychlosti u k u je tzv. relativní retence R F a vyjadřuje pravděpodobnost, že molekula složky se nachází v mobilní fázi: R F u u ( n ) m 1 = ( n ) + ( n ) 1+ k = = (4) m S k je retenční (kapacitní) faktor a platí: ( n ) S VS K D ( n ) Vm k = = (5) m

Z rovnice (4) lze odvodit: k 1 u u R u F + = = (6) Po substituci za u z rovnice (3) a za u ze vztahu (2) platí: ( ) k 1 t L t L M R + = (7) Ze vztahu (7) je možno odvodit rovnici pro retenční faktor k: M R M M R M R M M R V V V V V t t t t t k = = = = (8) t R je redukovaný retenční čas a V R je redukovaný retenční objem

Ze vztahu (8) plyne, že z chromatogramu je možno získat hodnotu retenčního faktoru a další data, za předpokladu platnosti V m =V M, lze odvodit: V = V + K V (9) R R M D S D S V = K V (10) Při chromatografii na tenké vrstvě a na papíře je běžné měřit vzdálenost čela rozpouštědla od startu l a vzdálenost středu skvrny od startu l : R u u l l F = = (11) Na základě rovnice (4) platí: 1- R R F k = (12) F

3.2 Tvar eluční křivky 3.2.1 Gaussův model Nejčastěji je chromatografický pík popisován pomocí Gaussovy funkce, která má v tomto případě tvar: h (t) = G -(t - t ) exp 2 σ G 2π 2σ G G 2 (13) h G (t) je výška píku v čase t, je plocha píku, t G je čas ve vrcholu píku, σ G je standardní odchylka píku Křivka má zvonový tvar a je symetrická podle t G Gaussův model je poměrně jednoduchý a z teoretického hlediska opodstatněný

Na základě Gaussova modelu byl původně definován vztah pro účinnost kolony: n = t G 2 G 2 σ (14) kde σ 2 G je rozptyl pro pík měřený v jednotkách času Protože odečtení hodnoty σ G přímo z chromatogramu je obtížné (polovina šířky píku v 60,7% jeho výšky), je často užíván následující vztah: 2 G n = a t 2 (15) y kde y označuje šířku píku naměřenou v jeho určité výšce, a je konstanta závislá na výšce píku v níž je šířka y měřena Tento postup umožňuje měřit účinnost s dobrou správností, např. na základě měření šířky píku v jeho poloviční výšce s užitím konstanty a = 5,54. Obecně existuje celá řada metod umožňujících počítat účinnost kolony pomocí dobře měřitelných parametrů píku s využitím Gaussova modelu Výpočet účinnosti podle rovnic (14, 15) je správný pouze pokud je pík symetrický, tzn. řídí se Gaussovou funkcí

3.2.3 Model exponenciálně modifikované Gaussovy funkce - EMG Obecně je dobře známo, že dokonale symetrické píky jsou v oblasti HPLC a GC získány spíše výjimečně. Většinou reálné chromatogramy vykazující určitou asymetrii V takových případech je aplikace Gaussova modelu nevhodná, a proto už od konce 50.let byl hledán vhodnější model pro popis nesymetrických píků Postupně bylo prokázáno, že chromatografické píky lze ve většině případů dobře aproximovat pomocí tzv. exponenciálně modifikované Gaussovy funkce (EMG) Za vznik nesymetrických píků jsou odpovědny kolonové a mimokolonové efekty, např. nejednotnost interakcí solutstacionární fáze, mrtvé objemy systému, technika nástřiku, nehomogenita spojů v systému, časová prodleva detektoru a zesilovače apod.

Průběh EMG funkce může být vyjádřen následujícím vztahem: 2 σ G h (t) 2exp 1 σ G t - t EMG = τ 2 τ τ přičemž z = (t t ) / σ σ / τ G G G G z/ 2 _ 2 exp(-x )dx (24) EMG funkce je definována třemi parametry: retenčním časem t G a standardní odchylkou σ G mateřské Gaussovy funkce a časovou konstantou τ exponenciální funkce Poměr τ/ σ G je fundamentálním vyjádřením asymetrie EMG funkce EMG má některé zajímavé vlastnosti: Maximum asymetrického píku (s rozptylem σ 2 = σ 2 G + τ 2 ) odvozeného od jeho mateřské Gaussovy funkce (s rozptylem σ 2 G ) leží na jejím průběhu, přitom poměr τ/ σ G určuje polohu průsečíku maxima asymetrické EMG křivky s mateřskou Gaussovou křivkou, plocha vymezená oběma funkcemi je stejná

Příkladem uplatnění EMG modelu s využitím těchto snadno měřitelných parametrů píku může být výpočet účinnosti kolony podle vztahu (Foley-Dorsey): n = 41,7 (t / y ) * R 0,1 2 B / + 1,25 (29) kde t R je čas vrcholu píku, parametr je časová vzdálenost od počátku píku do jeho vrcholu v 10% výšky píku, B je časová vzdálenost od vrcholu píku do konce píku v 10% výšky píku, y 0,1 je šířka píku v 10% jeho výšky Jak plyne z výše uvedeného textu, problematika charakterizace píku v chromatografii je složitá a v případě použití nepřiměřené metody pro zpracování dat může docházet k velkým chybám. Např. aplikace vztahu: 2 G n = a t 2 (15) y který pro výpočet účinnosti užívá Gaussova modelu, na EMG pík s poměrem τ/σ G = 2.0, poskytuje hodnotu počtu teoretických pater přibližně o 100% vyšší než je hodnota správná

3.3 Teorie popisující vznik a tvar chromatografických zón Empiricky je např. známo, že: Pokud postupují dvě složky v chromatografickém systému různými rychlostmi, budou na konci kolony odděleny zcela nebo jen částečně K plnému dělení složek je třeba, aby jejich zóny byly dostatečně úzké Dělení závisí na rychlosti migrace složky kolonou a na rozšiřování zóny během chromatografického procesu Byly hledány modely schopné vysvětlit charakteristický tvar zón a jejich rozšiřování Lze řešit na základě dvou teoreticky rozdílných přístupů: 1. Předpoklad dosažení rovnováhy na koloně Teorie chromatografického patra 2. Předpoklad nerovnováhy na koloně Teorie dynamická Oba přístupy dochází ke stejnému závěru: Tvar zóny odpovídá Gaussově funkci

3.3.1 Teorie chromatografického patra Tato teorie postuluje pět výchozích zjednodušujících předpokladů: 1. Celá kolona je rozdělena na velké množství elementárních jednotek pater 2. Na každém patře dochází k distribuci složky mezi mobilní a stacionární fázi a tato distribuce dosáhne rovnovážného stavu 3. Hodnota distribuční konstanty zůstává stejná na všech patrech 4. Difúzi ve směru toku lze zanedbat 5. Průtok mobilní fáze není kontinuální, ale probíhá po malých přírůstcích, které mají objem patra

Teorie chromatografického patra byla přes svoji dílčí úspěšnost vystavena námitkám proti pěti vstupním předpokladům Zanedbání vlivu difúze ve směru osy pohybu mobilní fáze je neakceptovatelné především v plynové chromatografii Diskontinualita průtoku je v případě chromatografie nerealistická Předností teorie je její relativní jednoduchost a srovnatelnost s procesy jako je destilace apod. Dnes se tato teorie příliš nepoužívá Nicméně, účinnost kolon se stále vyjadřuje pomocí teoretických pater, pojmu vyplynulého z uvedené teorie

Pokud je uváděn počet pater, je vždy třeba uvést pro jakou délku kolony L byl počítán Ke srovnání kolon různých délek se běžně užívá výškový ekvivalent teoretického patra H (výška patra): H L L Y = n 16 t R 2 t = 2 σ L = (41) Výškový ekvivalent má rozměr délky a lze chápat jako výšku jednoho teoretického patra na koloně H je také možno definovat jako rozptyl zóny složky vztažený na délku kolony. Menší rozptyl představuje menší H a tedy vyšší n

Snaha vzájemně porovnávat různé kolony (především z hlediska separační účinnosti) vedla k zavedení pojmu redukovaná výška teoretického patra h: H h = (42) d p d p je průměr zrn sorbentu a pojmu redukovaná rychlost mobilní fáze ν: u d p ν = (43) D m u [cms -1 ] je lineární rychlost mobilní fáze a D m [cm 2 s -1 ] je difúzní koeficient složky v mobilní fázi Použití pojmů (42, 43) dovoluje vzájemně srovnávat kolony z hlediska účinnosti nezávisle na délce kolony, velikosti zrn sorbentu a viskozitě mobilní fáze