Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství a mikrobiologie a výživy rostlin Mikroflóra kečupů Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Bc. Monika Kozelková Brno 2009

Zadání diplomové práce

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Mikroflóra kečupů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně, dne..2009 Podpis diplomanta

PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucímu diplomové práce Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady při tvorbě diplomové práce i při mikrobiologických rozborech. Mé poděkování patří také celému Ústavu agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin. A v neposlední řadě také mým rodičům za umožnění a podporu při studiu.

ABSTRAKT Kozelková, M. Mikroflóra kečupů. Diplomová práce. Brno, 2009. Práce se zabývá stanovením mikroflóry v kečupech a jejího růstu v průběhu skladování za různých podmínek (při pokojové teplotě, v lednici). Literární rešerše je zaměřena na popis podrobného postupu výroby kečupů, od čerstvých rajčat až po finální výrobek. Dále na charakteristiku jednotlivých mikroorganismů, zejména bakterií a plísní, a produktů jejich metabolismu a v neposlední řadě uvádí možná opatření v boji proti nim. V experimentální části byly u vybraných výrobků zakoupených v obchodní síti stanovovány pomocí plotnové metody tyto skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů (CPM), bakterie mléčného kvašení (BMK), koliformní bakterie, sporulující baterie, kvasinky a plísně (K+P). V žádném ze zkoumaných vzorků nebyly detekovány koliformní bakterie, BMK, anaerobní sporulující bakterie a kvasinky. Výsledky přítomných skupin mikroorganismů byly porovnány s příslušnou legislativou a označeny jako zdravotně nezávadné, a to po celou dobu skladování. Pomocí statistických metod bylo prokázáno, že u vzorků kečupu plněného do skleněných obalů (ASk, BSk) docházelo v průběhu skladování ke zvýšení počtu všech skupin mikroorganismů. U vzorků kečupu plněného do plastových obalů (AP,BP) docházelo ke zvýšení počtu mikroorganismů v závislosti na čase jen u aerobních sporulujících mikroorganismů, naopak CPM a plísně se v průběhu skladování snížily. Pomocí Tukeyova testu bylo prokázáno, že ve většině vzorcích skladovaných v lednici byl nižší počet mikroorganismů, než ve stejných vzorcích skladovaných při pokojové teplotě. Výjimkou byl pouze vzorek kečupu ve skleněném obalu skladovaný v lednici (BSk), u kterého byl 28. den po otevření vyšší výskyt plísní než u stejného vzorku skladovaného při pokojové teplotě (ASk). Klíčová slova: mikroorganismy, rajčatový protlak, kečup.

ABSTRAKT

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK Aeroby ALT AME AOH AP ASk ATX I, II BMK BP BSk CGA CPM ČSN DIC EDTA EFSA ES FAO HPLC KTJ (CUF) K+P Koli LOQ PH MRS MZe PCA ppm TA VRBG WHO aerobní sporulující bakterie altenuen alternariol monometyl éter alternariol rajčatový kečup v plastovém obalu skladovaný při pokojové teplotě rajčatový kečup ve skleněném obalu skladovaný při pokojové teplotě altertoxin I, II, bakterie mléčného kvašení rajčatový kečup v plastovém obalu skladovaný v lednici rajčatový kečup ve skleněném obalu skladovaný v lednici Chloramphenicol Glukose Agar celkové množství mikroorganismů Česká národní norma diferenciální interferenční kontrast ethylendiamintetraoctová kyselina European Food Safety Authority, Evropský úřad pro bezpečnost potravin Evropské společenství Food and Agriculture Organization, Organizace spojených národů pro výživu a zemědělství high-performance liquid chromatography kolonii tvořící jednotka (colony forming unit) kvasinky a plísně koliformní bakterie limit of quantification, mez stanovitelnosti přípustná hodnota Man, Rogosa, Sharpe agar Ministerstvo zemědělství Plate Cound agar pars per milion, jedna miliontina (celku) kyselina tenuazonová Violet Red Bile Agar with Glukose World Health Organization, Světová zdravotnická organizace

OBSAH 1 ÚVOD...10 2 CÍL PRÁCE...12 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED...13 3.1 Legislativní požadavky pro rajčatový kečup... 13 3.2 Výroba rajčatového kečupu... 14 3.2.1 Hlavní surovina na výrobu rajčatového kečupu... 15 3.2.2 Technologický postup výroby rajčatového protlaku.... 17 3.2.2.1 Sběr, příjem a skladování rajčat... 17 3.2.2.2 Přísun rajčat ke zpracování, praní rajčat a inspekce... 20 3.2.2.3 Drcení, třídění a odsemeňování, předehřívání suroviny a pasírování. 21 3.2.2.4 Zahušťování... 23 3.2.2.5 Tepelné ošetření a plnění rajčatového protlaku do obalů... 23 3.2.3 Parametry rajčatového protlaku dodávaného na trh, jako vstupní suroviny na výrobu kečupu... 26 3.2.4 Mikrobiální kontaminace rajčatového protlaku... 27 3.3 Stručný technologický postup výroby rajčatového kečupu... 28 3.3.1 Míchání, zahušťování, tepelné ošetření kečupu... 28 3.3.2 Plnění kečupu do skleněných a plastových obalů, chlazení a skladování... 29 3.3.3 Mikrobiální kontaminace rajčatového kečupu... 30 3.4 Mikroorganismy, které by se mohly vyskytovat v rajčatovém kečupu při nedodržení správné výrobní a hygienické praxe... 31 3.4.1 Bakterie... 31 3.4.1.1 Bakterie mléčného kvašení... 31 3.4.1.2. Bakterie octového kvašení... 34 3.4.1.3 Bakterie máselného kvašení... 35 3.4.1.4 Rod Bacillus (čeleď Bacillaceae)... 36 3.4.1.5 Koliformní bakterie a rod Escherichia (čeleď Enterobacteriaceae)... 38 3.4.1.6 Koagulázapozitivní stafylokoky (čeleď Staphylococcaceae)... 39 3.4.2 Plísně... 40 3.4.2.1 Plísně kontaminující rajčatový kečup... 40

3.4.2.2 Plísně napadající rajčata... 41 3.4.2.3 Mykotoxiny rajčatového kečupu... 44 3.4.3 Kvasinky... 48 3.5 Boj proti mikroorganismům... 49 3.5.1 Technologické operace působící na mikroorganismy v rajčatovém kečupu.. 49 3.5.1.1 Fyzikální prostředky... 49 3.5.1.1 Chemické prostředky... 51 4 MATERIÁL A METODY ANALÝZY...53 4.1 Materiál... 53 4.1.1 Charakteristika materiálu... 53 4.1.2 Použité chemikálie, laboratorní pomůcky a přístroje... 54 4.1.3 Použitá kultivační média... 54 4.2 Metody analýzy... 56 4.2.1 Příprava laboratorních pomůcek... 56 4.2.2 Postup při vaření agarových půd... 56 4.2.3 Vlastní mikrobiologická analýza... 56 4.2.4 Způsob vyhodnocování výsledků... 58 4.2.4.1 Odečet kolonie tvořících jednotek na plotnách... 58 4.2.4.2 Statistické vyhodnocení výsledků... 58 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE...60 5.1 Závislost počtu mikroorganismů na čase v průběhu skladování u výrobků: ASk, BSk, AP, BP... 63 5.2 Prokázání rozdílu mezi stejnými výrobky skladovanými za různých podmínek... 68 6 ZÁVĚR...71 7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...73 8 SEZNAM OBRÁZKŮ, TABULEK, GRAFŮ A PŘÍLOH...79

1 ÚVOD Rajče jedlé (Lycopersicum esculentum) patří k světově nejpěstovanější zelenině a je konzumováno většinou syrové, ale protože se rychle kazí, zpracovává se k výrobě rajčatového džusu, pyré nebo protlaku. Rajčatový protlak je hlavní surovinou pro výrobu kečupu. Ochucenou hustou rajčatovou omáčku, kterou si oblíbily děti na celém světě, začal první vyrábět Henry Heinz v roce 1869 v americké Pensylvánii. Otázka, kdo je prvním objevitelem kečupu, je tak trochu tajemstvím. Původ má prý v asijské rybí omáčce z fermentovaných ryb, korýšů a koření, které Číňané říkali ketsiap. Oblíbili si ji britští námořníci a na konci 17. století ji dovezli z Malajsie do Evropy. Nápad nahradit ryby rajčaty dostal prý jako první anglický kuchař Richard Brigg v roce 1792. Jiná verze přisuzuje prvenství dnešního kečupu Henry Heinzovi. Jisté je, že to byl on, kdo začal v roce 1869 jako první nabízet konzervovanou rajčatovou omáčku ve skleničce. Tak vznikl slavný tomato ketchup, dnes nejznámější a nejrozšířenější hotová omáčka. Rajské protlaky, rajčatové pyré a kečupy se řadí do skupiny tzv. zpracovaných zeleninových výrobků, tzn. jejichž charakteristickou složku tvoří zelenina, a které jsou upraveny konzervováním. Podle Vyhlášce MZe č. 332/1997 Sb., resp. v poslední úpravě č. 650/2004 Sb., musí výrobek označený jako kečup obsahovat nejméně 25 % refraktometrické sušiny, z čehož nejméně 7 % musí činit refraktometrická sušina vnesená rajčatovou surovinou. Obsah soli by měl být nejvýše 3,5 %. V uvedené vyhlášce jsou také stanovené smyslové požadavky na jakost kečupů. V průmyslovém měřítku se kečup vyrábí ředěním zahuštěného rajčatového protlaku o koncentraci refraktometrické sušiny 28 až 30 %. Rajčatový protlak se smíchá ve vhodné nádobě s vodou, ochucovadly, potřebnými aditivy a zahušťuje na požadovanou refraktometrickou sušinu. Po zahuštění následuje tepelné ošetření směsi při teplotě okolo 80 C. Další fáze výroby se liší, podle plnění kečupů do různých typů spotřebitelských obalů. Zatímco kečupy plněné do skleněných obalů se konzervují opětovným tepelným ošetřením při teplotě okolo 90 C, výrobky v plastu se již tepelně neošetřují, protože jsou stabilizovány chemickou konzervací. 10

Rajčatový kečup s hodnotami ph 3,7 až 4,6 se kazí zřídka, ale jeho kažení není vyloučené. Může podléhat například kažení působením: bakterií octového kvašení rodů Acetobacter a Gluconobacter, bakterií mléčného kvašení rodů Lactobacillus a Leuconostoc, bakterií máselného kvašení, bakteriím rodu Bacillus, nebo působením kvasinek a plísní. Mikrobiologické požadavky na jakost kečupů jsou uvedené v normě ČSN 56 9609, která stanovuje pravidla správné výrobní a hygienické praxe a uvádí mikrobiologická kritéria pro potraviny a principy stanovení a aplikace. V Nařízení Evropské unie č. 2073/2005, o mikrobiologických požadavcích na potraviny, nejsou limity mikroorganismů pro rajčatový kečup uvedeny. Kečup není, ale jen pochutina, má i určitou výživovou hodnotu, danou obsahem vitamínů, minerálních látek a vlákniny. Tepelně upravená rajčata, mezi které můžeme počítat i kečupy, obsahují lépe využitelný karotenoid lykopen než rajčata syrová. Lykopen řadíme mezi látky ochranné, zejména snižující riziko srdečně-cévních onemocnění a některých onemocnění nádorových. 11

2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo: Zpracovat literární rešerši, v níž budou shrnuty poznatky o kečupech. Zaměřit se na kontaminující mikroorganismy. Charakterizovat mikroorganismy a produkty jejich metabolismu negativně ovlivňující lidské zdraví. Charakterizovat opatření v boji proti nežádoucím mikroorganismům. Experimentálně stanovit významné skupiny mikroorganismů ve vybraných výrobcích. Výsledky zpracovat tabelárně popř. graficky. Vyhodnocení provést formou diskuse a výsledky shrnout v závěru práce. 12

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Legislativní požadavky pro rajčatový kečup Fyzikální a chemické požadavky Podle Vyhlášky MZe. č. 332/1997 Sb., pro čerstvé ovoce a čerstvou zeleninu, zpracované ovoce a zpracovanou zeleninu, suché skořápkové plody, houby, brambory a výrobky z nich, ve znění pozdějších novel, musí výrobek označený jako kečup obsahovat nejméně 25 % refraktometrické sušiny, z čehož nejméně 7 % musí činit refraktometrická sušina vnesená rajčatovou surovinou. U kečupů označených Prima, Extra, Speciál s refraktometrickou sušinou nejméně 30 %, musí sušina vnesená rajčatovou šťávou činit nejméně 10 %. Obsah soli by měl být nejvýše 3,5 % a obsah těkavých kyselin stanovaných jako kyselina octová se u kečupů nestanovuje. V rajčatovém protlaku zahuštěném, který je vstupní surovinou pro výrobu kečupů, je jejich obsah nejvýše 2,2 %. Smyslové požadavky V téže vyhlášce jsou uvedené i smyslové požadavky na jakost kečupů., které vypadají následovně: Kečup by měl být: řídce kašovitý až kašovitý, homogenní, jemný, případně s hrubšími částicemi přísad (zeleniny), bez zbytků slupek, semen a jiných částí rajčat, bez černých částic s výjimkou tmavých částic pocházejících z koření. Mikrobiologické požadavky Podle Vyhlášky č. 132/2004 Sb., o mikrobiologických požadavcích na potraviny, způsobu jejich kontroly a hodnocení, byly stanoveny tyto přípustné hodnoty pro množství mikroorganismů v 1 ml kečupu: Celkový počet mikroorganismů 10 4 PH Escherichia coli 10 PH Kvasinky 10 4 PH 13

Vyhláška č. 132/2004 Sb., byla zrušena Nařízením Evropské unie č. 2073/2005, o mikrobiologických požadavcích na potraviny, které limity pro mikroorganismy v rajčatovém kečupu neuvádí. Od roku 2008 platí ČSN 56 9609, pro pravidla správné hygienické a výrobní praxe, která uvádí mikrobiologická kritéria pro potraviny a principy stanovení a aplikace. V této normě jsou specifikovány mikrobiologické požadavky pro výrobu kečupů (viz. tab.1), ve kterémkoliv stadiu potravinového řetězce, od prvovýroby až ke konečnému spotřebiteli. Tab. 1 Přípustné množství jednotlivých skupin mikroorganismů pro kečupy ( ČSN 56 9609, B.5.2.17.2). Skupina mikroorganismů n c m M Koliformní balterie 5 2 50 5. 10 2 Koagulázopozitivní stafylokoky 5 1 0 d 2. 10 2 Laktobacily 5 2 10 3 10 4 Legenda: n m M c Rozsah výběru, čímž se rozumí počet vzorků určený k vyšetření, jehož účelem je rozhodnout zda posuzovaná šarže výrobku, nebo její část bude posouzena jako vyhovující, nebo nevyhovující stanoveným mikrobiologickým požadavkům. Množství mikroorganismů, které se připouští u všech vzorků výběru n Množství mikroorganismů, které se ještě připouští u počtu vzorků, který je nižší nebo se rovná c Rozhodnuté číslo, čímž se rozumí počet vzorků z výběru n, u nichž se připouští hodnota M 0 d Počet mikroorganismů je 150 KTJ/ml (g) kečupu 3.2 Výroba rajčatového kečupu Z čerstvých rajčat se kečup prakticky nevyrábí, v tom případě by výroba byla velmi podobná výrobě protlaku. V průmyslovém měřítku se kečup vyrábí ředěním zahuštěného rajčatového protlaku o koncentraci refraktometrické sušiny 28 až 30 %. Rajčatový protlak se míchá ve vhodné nádobě s vodou a ochucovadly. Stabilitu vzniklého výrobku je třeba upravit stabilizátory (např. modifikované škroby, tragant, pektin, atd. v množství cca 2 až 5 %), které brání rozdělování pevného a kapalného podílu a současně upravuje konzistenci kečupu, který má být hladký, jemný a lesklý. Nezanedbatelný příznivý vliv na stabilitu kečupů vykazují i fytoncidní látky přítomné v extraktech použitého koření (KADLEC et al., 2002). 14

3.2.1 Hlavní surovina na výrobu rajčatového kečupu Rajčatový protlak Rajčatový protlak je výrobek připravený zahuštěním rozmělněných rajčat zbavených jader a větších kusů slupky v našich podmínkách na koncentraci refraktometrické sušiny 28 %. Toho by mělo být dosaženo bez přídavků aditiv, jako např. kyselin, barviv, zahušťovadel atd., jejichž přídavek je zakázán a považován za falšování. Někdy bývá do rajčatového protlaku přidávána jedlá sůl, v množství do 10 % jako konzervovadlo. Podle české legislativy sůl mepatří mezi aditiva. U nás se solený protlak na výrobu kečupů nepoužívá. V některých zemích se někdy povolují přídavky extraktů koření, to však musí být deklarováno na etiketě (DOBIÁŠ, 2004). Uvedené hodnoty refraktometrické sušiny a obsahu soli vychází z Vyhlášky MZe. č. 332/1997 Sb., ve znění pozdějších novel. Podle DOBIÁŠE (2004) se lze v zahraničí setkat i s jinými stupni zahuštění: polokoncentrovaný protlak (semi-concentrated paste) - min. 12 % sušiny, koncentrovaný protlak (concentrated paste) min. 18 %, dvakrát koncentrovaný protlak (double concentrated paste) min. 28 %, třikrát koncentrovaný protlak (triple concentrated paste) min. 36 %, šestkrát koncentrovaný protlak (sextuple concentrated paste) min. 55 %. Kromě protlaku se můžeme na trhu setkat s výrobky z rozmělněných rajčat označovanými jako tomato purée, což může být synonymum pro protlak, ale většinou je tak označován výrobek s nízkým stupněm zahuštění, tomato pulp pro podrcená rajčata s kusy slupek a semeny, tomato juice vznikne protřením tomato pulp, tj. odstraněním slupek a semen. Filtrací, tj. odstraněním suspendovaných pevných částic se získá tomato serum a jeho zahuštěním tomato syrup. Požadavky na rajčata pro výrobu protlaku, upravené podle DOBIÁŠE (2004) Intenzivní zbarvení (bez bílé dužniny), lahodná chuť, co nejvíce vitaminu C (20 až 40 mg/100 g). 15

Co nejvyšší obsah sušiny: zásadně rozhoduje o efektivnosti výroby, běžně 4 až 6 %, v jižních zemích i 7 % a více. Stejnoměrná vyspělost, dokonalá vyzrálost. Způsobilost k transportu a několikadenní skládce. Nepukavost rajčat (jinak dochází ke kontaminaci plísněmi produkující mykotoxiny). Ranné odrůdy (prodlužují sezónu). Složení rajčat: Tab. 2 Souhrnný přehled o látkovém složení rajčat (KYZLINK, 1980, tab. 16). hodnoty sušina (%) voda (%) hrubý protein(n*6,25) (% hrubý tuk (% glyceridy (%] hrubá vláknina (% popel (% průměrné 6,24 93,76 0,98 0,24 3,70 0,72 0,59 maximální 6,58 94,10 1,00 0,30 3,99 0,84 0,61 minimální 6,90 93,42 0,95 0,19 3,40 0,60 0,57 Údaje se rozumí v procentech čerstvé hmoty zbavené nepoživatelných částí. ph 4,20 Novější údaje o složení rajčat se podle JAY et al. (2005) přiklánějí spíše k maximálním hodnotám: Voda 94,1 %, bílkoviny 1,0 %, tuk 0,3 % a popel 0,6 %. Další typické složení: pokožka tvoří 1,4-1,8 % hmotnosti plodů, semena 2-3 % (DOBIÁŠ, 2004). 16

3.2.2 Technologický postup výroby rajčatového protlaku. VODA SUROVINA (rajčata) Praní VSTUP ŠPINAVÁ ZÓNA Inspekce Drcení a odsemeňování ODPAD Předehřátí suroviny ČÍSTÁ ZÓNA Pasírování Zahušťování Tepelné ošetření OBALY Chlazení Plnění a uzavírání Skladování a expedice VÝSTUP Obr. 1 Výroba rajčatového protlaku, upraveno podle KADLECE et al. (2002). 3.2.2.1 Sběr, příjem a skladování rajčat Sběr rajčat V posledních letech se čím dál častěji uplatňuje strojový sběr rajčat. Výrobní systém, který se zakládá na strojovém sběru, vyžaduje nové druhy rajčat s novými vlastnostmi. Nejdůležitější požadavky na nové druhy můžeme shrnout do několika bodů. Především jde o velké úrody (často ho producent považuje za rozhodující), determinovaný růst, koncentrované zrání a velkou mechanickou odolnost plodů. 17

Odrůdy s větší mechanickou odolností mají silnější podpůrná pletiva a vyšší obsah vlákniny. Při mechanizovaném sběru se zvyšuje podíl nečistot, zralost jednotlivých plodů je odlišná a sbírají se i špatné plody. Zanedbatelné není ani mechanické poškození, kterým se může urychlit i mikrobiální a enzymatické poškození. Při sběru se také mohou používat chemikálie, které uvolňují plody, nebo chemikálie, které plody zpevňují. Musí se dát pozor na to, aby se nesbírala nahnilá rajčata, která by následně mohla kontaminovat rajčatový protlak či vzniklý rajčatový kečup. Proto jsou přímo u pěstitele tzv. posběrová střediska, která umožňují vytřízení zelených, poškozených a plesnivých plodů (DRDÁK, 1989). Podle HORČINA (2004) se také v těchto střediscích odměřují hodnoty refraktometrické sušiny rajčat. Podle KYZLINKA (1980) jsou projevy hnilob rajčat vyvolané: Gloeosporium phomoides - Na povrchu rajčat jsou hnědé zahnívající skvrny, jejichž povrch bývá pokryt plodničkami a výtrusy. Phytophthora infestans - Na povrchu se nejprve vytváří zašedlé až hnědé vmáčknuté skvrny. Napadená dužnina podléhá hnědé nekrose. Hned za Phytophthorou vnikají do plodu i jiné houby popřípadě i bakterie např.: Bacterium phytophthorum. Phytobacter lycopersicum (Pseudomnas lycopersicum) - Na plodových vrcholech vyvolává hnědé vmáčknuté skvrny. Plody pak měknou a rychle hnijí. Erwinia carotovora - Vyvolává velmi rychlou hnilobu. Choroba se přenáší do skladišť už z pole a šíří se dotykem zdravých a napadených míst. Geotrichum candidum podle DOYLE, et. al (2001) v kombinaci s dalšími mikroorganismy způsobuje kyselou hnilobu. Plíseň se vyskytuje v půdě a na rozkládajících se plodech, napadá řadu druhů zeleniny a ovoce, na nichž vytváří kolonie bělavé barvy (KYZLINK, 1980). Podle TOMÁNKOVÁ et al. (2006) je přenášena muškou octomilkou (Drosophila melanogaster) z nakažených plodů na zdravé. 18

Infekce rajčat způsobené mikroorganismy: A Obr. 2 Rajčatové infekce A a B: špendlíková skvrnitost; C a D: bakteriální skvrnitost; E: bakteriální rakovina, F: bakteriální skvrnitost (JAY et al., 2005). Příjem rajčat Přeprava rajčat do závodu by neměla trvat déle jak 2 hodiny. Příjem suroviny se u nás řídí vizuálním posouzením a obsahem rozpustné sušiny, která se stanovuje refraktometricky. Při příjmu dodávky se uplatňuje princip first in, first out. Ve světě je běžný výkup podle dalších objektivních ukazatelů, jako je barva, viskozita apod., které slouží nejen na kvalitativní ocenění, ale pomáhají dalšímu řazení výroby. Skladování rajčat Na zabezpečení pravidelné výroby se plody rajčat uskladňují ve skladišti surovin. Ztráty sušiny závisí na teplotě uskladnění. Například při 25 C za 22 hodin dosahují ztráty až 5 %, za 36 hod 7 % (DRDÁK, 1989). 19

Podmínky pro skladování rajčat podle DOBIÁŠE (2004): Při skladování v přepravkách je nutná: Minimálně zastřešená plocha skýtající ochranu před světlem a teplem, nepropustná, omyvatelná podlaha opatřená stokem do kanálu. Důležitou roli hraje také cirkulace vzduchu nad zbožím. Doba skladování by neměla přesáhnout 48 hodin. Skladování volně ložených rajčat: Pokud se rajčata skladují v plavícím žlabu ve vodě, musí se zpracovat do 24 hodin. V chladírnách můžeme rajčata uskladňovat při teplotě 0 až 5 C do 20 dnů. 3.2.2.2 Přísun rajčat ke zpracování, praní rajčat a inspekce Přísun rajčat ke zpracování Rajčata můžeme dopravovat buď v bednách po 20 až 25 kg pomocí válečkové dráhy, kde se na konci vyklápí do plavícího žlabu, nebo jsou uskladněny přímo v něm. K vlastnímu zpravování jsou unášena silným proudem vody, díky němuž se z rajčat odstraňují hrubé nečistoty a to zejména zbytky hlíny, přimíšené kamínky atd. Z plavícího žlabu přechází surovina do pračky. Praní rajčat Vlastní praní se uskutečňuje ve vzduchové a sprchové pračce, při spotřebě vody 0,7 až 1,2 l na 1 kg suroviny (LOS, 2008). Po praní jsou rajčata osprchována čistou pitnou vodou. Důležité je, aby po osprchování neobsahovala žádné mechanické nečistoty, protože zvýšený obsah písku v dodávané dřeňové šťávě urychluje opotřebování technologického zařízení a v neposlední řadě se nedosahuje požadovaný účinek v odstraňování epifytní mikroflóry, která by se měla během účinného praní snížit o 87 až 97 %. Ztráty sušiny při praní závisí na množství poškozených plodů (popraskané, roztlačené). Dokonale oprané plody jdou po sprchování na válečkový dopravník, který slouží jako inspekční pás. 20

Inspekce Na inspekčním páse se plody axiálně otáčí, a tak lze jednoduše provádět kontrolu suroviny a nevyhovující rajčata vytřídit. Odstraňují se nahnilé, začínající plesnivět, mikrobiálně napadené, nebo jinak poškozené plody, nebo také stopky či cizí předměty. Během této operace je poslední možnost odstranění zelených plodů (DRDÁK, 1989). Po kontrole jakosti přechází rajčata do drtiče s odsemeňovací pasírkou. 3.2.2.3 Drcení, třídění a odsemeňování, předehřívání suroviny a pasírování Drcení, třídění a odsemeňování Úkolem drtiče je zbavit rajčata semen. Je doporučováno odstranění semen před zahřátím, protože by mohlo dojít k možnosti extrakce tuku ze semen do konečného produktu (možnost žluklé chuti konečného produktu). Drtič rozruší slupku rajčat a v třídiči se na sítu o velikosti 5 až 10 mm oddělí semena od dužniny a slupky. Uvolněná drť obsahující semena jde do odsemeňovací pasírky, která má rozměry síta o velikosti 1,5 mm (LOS, 2008). Předehřívání Drtina zbavená semen se průtokově zahřívá ve šnekovém předehřívači na teplotu v rozmezí od 60 do 90 C (DOBIÁŠ, 2004). Tato teplota způsobuje změnu pektinů, odvzdušnění pletiv, zvyšuje stabilitu vitamínů a dalších přítomných látek, a také je důležitá pro inaktivaci enzymů. Pokud nejsou enzymy inaktivovány, dochází k velmi rychlému odbourávání pektinových látek, které jsou žádoucí pro pastovitou konzistenci protlaku. Díky předehřívání se zkracuje proces odpařování. Dosažením teploty asi 80 C se sníží až 90 % přítomné mikroflóry. Na úplné zničení, především plísní, by však byla potřeba průtoková sterilizace při teplotě 110 až 120 C po dobu 35 sekund (DRDÁK, 1989). 21

Pasírování Zahřátá rajčatová drť putuje na pasírovací stanici, kde se odstraňují nepoživatelné části tj. slupky, stopky a semena, pokud by nebyl použit odsemeňovač. Na docílení homogenity se spojí 2 nebo 3 pasírky nad sebou. Ve zdvojené pasírce má první síto rozměry 1,2 až 1,5 mm na oddělení slupek a semen a druhé 0,5 až 0,8 mm, které dává pasírovací hmotě homogennost, po případě třetí síto 0,4 mm. Pasírovaný protlak se shromažďuje v zásobní nádrži (DRDÁK, 1989). Činnost pasírek je nutno kontrolovat, neboť jejich správná funkce má vliv na kvalitu a výtěžnost výroby. Nejjednodušší je vizuální kontrola protlaku za pasírkami. Hodnotí se: Nadměrné množství černých teček - Indikují nám, že bylo zpracováváno příliš mnoho rajčat shnilých nebo nezbavených stopek či zbytků stonků. Připalování při předehřívání v tepelném výměníku. Přítomnost cizích příměsí, nebo poškození síta pasírky či její špatnou funkci. Přítomnost červených skvrn - Signalizují separaci barviva, v důsledku varu drti v předehřívači, nebo přílišného pěnění protlaku v zásobní nádobě za pasírkou. Hrubá textura - Signalizuje nesprávné síto v pasírce, špatné nastavení vystíracích lišt v pasírce, nebo blokování odvodu odpadu z pasírky. Dále může signalizovat příliš velkou rychlost vystíracích lišt v posledních pasírkách. Přítomnost semen či útržků slupky - Signalizuje poškození síta v pasírce. Další možností operativní kontroly je posouzení odpadu z poslední pasírky, který musí být výrazně drobivý bez známek volné vlhkosti, která by se uvolňovala např. při zmáčknutí v dlani. Není-li tomu tak, je třeba nastavení pasírek upravit, jinak dochází ke zbytečným ztrátám (DOBIÁŠ, 2004). Odpad při pasírování představuje 4 až 6 % a závisí na odrůdě, stupni rozvaření a nastavení pasírek. 22

3.2.2.4 Zahušťování Pasírovaný protlak se podle technologických postupů dopravuje do vakuových odparek, ve kterých se zahušťuje na požadovaný obsah rozpustné sušiny, což je minimálně 24 % (obsah sušiny je závislý na počtu odparek). Čím menší jsou částice hmoty, tím nižší je viskozita a var proběhne intenzivněji (DRDÁK, 1989). Odpařování se provádí na dvou až tříčlenných odparkách. Využitelné teplotní rozmezí je omezeno horními teplotami okolo 75 až 80 C. Dolní hranicí jsou teploty okolo 45 C, kdy viskozita produktu již brání účinnému odpařování. Vlastní uspořádání odparek je různé. Zahušťovaný protlak je čerpán přes automatický refraktometr do zásobníku (KADLEC, 2002). 3.2.2.5 Tepelné ošetření a plnění rajčatového protlaku do obalů Tepelné ošetření sterilace Během koncentrování rajčatové suroviny nenastává podstatná změna aktuální kyselosti. Surovina má ph 3,7 až 4,5 a výsledný protlak 3,7 až 4,6. Uvedená kyselost je optimální pro různorodou mikroflóru. Z technologického hlediska patří výrobek do skupiny málo kyselých až kyselých výrobků. Za takových podmínek probíhá kvašení, které zapříčiňuje pokles ph. V podstatě za optimálních podmínek, ne jen při uskladňovacích teplotách vyšších jak 20 C, můžou vyklíčit některé spory bakterií např.: Bacillus coagulans (Bacillus thermoacidurans), Clostridium pasteurianum a jiné. Spory těchto bakterií snáší teplotu do 100 C po dobu několika minut. Likvidace je neúspěšná při zahřívání nezahuštěné šťávy pomocí průtokového sterilátoru při teplotách 115 až 120 C. Protože v zahuštěném protlaku jsou horší podmínky na vyklíčení spor, a také vzhledem na snahu snižovat infekci po dobu technologických procesů na minimum (praní, rozvaření), se volí sterilizační režim nižší jak 100 C. Podle dostupných údajů mléčné a máselné bakterie hynou v prostředí okolo ph 3,5 při teplotě 90 C za několik sekund, zvýšení ph na hodnotu 4,3 si vyžaduje prodloužení času na několik minut. Na zabezpečení dostatečné inaktivace mikroorganismů se před plněním po zahuštění volí vyhřívání na 85 C v případě použití 23

následné sterilizace produktu, a nebo na 95 až 96 C při konzervování horkým rozlevem. Sterilátor je doplněn svazkem potrubí, které slouží pro výdrž sterilační teploty výrobku (DRDÁK, 1989). Výdrž lze regulovat v rozmezí od 3 do 180 sekund (LOS, 2008). Délka sterilizačního režimu je dána velikostí obalu. Teplota protlaku po sterilaci musí dosahovat 92 až 95 C. Tato operace má mikrobicidní charakter. Plnění protlaku Protlak se plní do připravených mikrobiologicky čistých obalů rozdílné velikosti na automatických plničkách a uzavírá se. Při plnění horkým rozlevem se klade důraz na dosažení dobrého odvzdušnění protlaku v obalu. Při nedostatečném odvzdušnění, dochází ke kondenzaci par nad protlakem, a zejména u vyšších obalů může nastat jejich deformace. Hotový výrobek se průtokově sterilizuje. Na chlazení obalů se používají kontinuální zařízení, přičemž se volí přechod přes vodní koupel, nebo chlazení sprchováním. Zahuštěný rajčatový protlak skladujeme při teplotách asi 15 C, kdy je uchovatelnost asi 6 měsíců. Na uchovávání protlaku v nehermetickém obalu se využívá také konzervování přídavkem kyseliny benzoové nebo sorbové. Kyselina sorbová působí baktericidně na plísně a kvasinky už při koncentraci 0,025 až 0,05 %. Podle údajů konzervování kyselinou sorbovou v rozmezí od 0,05 do 0,1 % se docílí už za dvě hodiny odumření plísní, kvasinek a nesporulujících bakterií, ne však spor. Konzervování kyselinou benzoovou si vyžaduje vyšší dávky, a to 0,2 až 0,3 % (DRDÁK, 1989). Nejčastěji používaná koncentrace se při konzervaci pohybuje okolo 50 až 500 ppm (TOMÁNKOVÁ et al, 2006). Rajčatový protlak, který slouží jako polotovar pro výronu kečupů se plní do ocelových sudů o hmotnosti kolem 250 kg a obsah konzervačních látek je nepřípustný (www.rolfroz.pl, 2009). 24

Obr. 3 Schématické znázornění linky na výrobu zahuštěného rajčatového protlaku, upraveno podle DOBIÁŠE (2004). 25

3.2.3 Parametry rajčatového protlaku dodávaného na trh, jako vstupní suroviny na výrobu kečupu Předmět nabídky: Rajčatový koncentrát získaný z čerstvých, zralých, červených rajčat pomocí procesů pasterace, zahušťování na obsah refraktometrické sušiny 30 %, sterilace a asepticky plněn po 200 kg (podle www.rolfroz.pl, 2009). Tab. 3 Organoleptické vlastnosti, podle www.rolfroz.pl (2009). Parametr Vzhled Barva Konzistence Chuť Pach Požadavek Pastovitá hmota, jednolitý vzhled barvy a konzistence Červená, cihlově červená Homogenní hmota Specifická dle koncentrátu, sladko-kyselý, bez cizí příchuti Specifický dle koncentrátu, bez cizího pachu Tab. 4 Fyzikálně chemické parametry podle www.rolfroz.pl (2009). Parametr Požadavek Obsah refraktometrické sušiny 30 ± 2 % Kyselost přepočítaná na kys. citronovou v % max 2,5 % ph max 4,5 Roztékavost v cm max 12 cm Obsah min. látek v mg 0,05 mg Obsah konzervačních látek a umělých barviv Bez obsahu konzervačních látek a umělých barviv Obsah cizích kovů, V souladu s platnou legislativou Tab. 5 Mikrobiologické parametry, podle www.rolfroz.pl (2009). Název Neprodyšnost obalu Účinnost tepelného ošetření pomocí termostatové zkoušky CPM v 1 g Kvasinky a plísně v 0,1 g Anaerobní sporulující bakterie v 0,1 g Hodnota Neprodyšný Vzhled balení i organoleptické vlastnosti produktu po podrobení termostatové zkoušky beze změn v porovnání se vzorkem bez termostatové zkoušky 50 KTJ nepřítomnost nepřítomnost 26

3.2.4 Mikrobiální kontaminace rajčatového protlaku Hořknutí protlaku mohou způsobovat termorezistentní formy Torulopsis, Hormiscium ve výrobku, mikroby v surovině (Bacillus coagulans), nebo také mykotoxiny plísní vegetujících na surovině. Detekce plísní v hotovém produktu se provádí počítáním zbytků plísňových hyf po obarvení methylenovou modří a naředění protlaku na refrakci 8,4 % pomocí Howardova čísla. (DOBIÁŠ, 2004) Howardovo číslo se používá na posouzení mikrobiálního znečištění rajčatového protlaku, ale i rajčatových produktů a vyjadřuje počet plísní viditelných pod světelným mikroskopem. Postup stanovení je v tom, že se protlak ředí na rozpustnou sušinu 8,4 %, ze kterého se připraví mikroskopický preparát barvený methylenovou modří. Na posouzení se bere 100 polí Bürkerovy komůrky a počítá se počet polí, ve kterých byly pozitivně zjištěné hyfy plísní. Maximálně přípustné číslo pro rajčatový protlak je 40 (DRDÁK, 1989). Zkušený operátor dokáže vyhodnotit 25 mikroskopických polí během několika minut. Tato metoda je však velmi subjektivní a vyžaduje speciální zaškolení a zkušené operátory. Výsledky metody jsou ovlivněny typem výrobního zařízení, stupněm homogenizace výrobku a zkušeností operátora v oblasti kontroly kvality, jak dokáže rozlišit v poli mikroskopu vlákna plísní od tkáně rajčat. Vzhledem k těmto nedostatkům souvisejících s používáním metody počítání plísňových hyf se zvyšuje význam ergosterolu pro vyhodnocování mikrobiologické kvality rajčat a rajčatových výrobků. Zjistilo se, že ergosterol (provitamin D 2 ), který je hlavním sterolem plísní, lze využít k měření růstu plísní v rostlinných materiálech. Byla již publikována řada prací zabývajících se kvantitativním stanovením ergosterolu v rajčatech a rajčatových výrobcích pomocí HPLC. HPLC stanovení ergosterolu je poměrně citlivé (0,1 ppm) a je objektivnější, než metoda počítání plísňových hyf. V bakteriích je ergosterol přítomen pouze ve stopách. Nikdy nebylo nalezeno v bakteriích více sterolů než 0,01 % sušiny buňky, přičemž jen malou část z tohoto množství představuje ergosterol. U četných druhů rostlin i živočichů je ergosterol pouze minoritní složka směsi sterolů. Pokud se vyskytne v rajčatových výrobcích, pochází téměř výhradně z přítomných plísní. Ergosterol se proto v současné době považuje za potenciální objektivní parametr vhodný pro stanovení kvality zpracovaných rajčat (KVASNIČKOVÁ, 2005). 27

3.3 Stručný technologický postup výroby rajčatového kečupu Kečup ve SKLE: Kečup v PLASTU: VSTUP VODA + Ingredience SUROVINA (protlak) Míchání VODA + Ingredience + konzervanty ČÍSTÁ ZÓNA Zahušťování Tepelné ošetření kečupu OBALY Plnění a uzavírání Chlazení Tepelné ošetření kečupu v lahvích OBALY Chlazení Skladování a expedice Plnění a uzavírání Skladování a expedice ŠPINAVÁ ZÓNA VÝSTUP Obr. 4 Výroba kečupu do skleněných a plastových obalů podle KLEINOVÉ (2009). 3.3.1 Míchání, zahušťování, tepelné ošetření kečupu Rajčatový protlak o refraktometrické sušině 28 až 30 % se naváží dle receptury, vakuovou pumpou se načerpá do varného kotle většinou o objemu 1500 l, smíchá se s vodou a cukrem, a směs se předehřeje na cca 50 C (MIKYŠKA, 2008). Používá-li se mleté koření, oddělí se část směsi a v ní se koření rozmíchá a zahřeje. Koření se tak lépe extrahuje. Zbytek směsi se zahřívá ve vakuové odparce při teplotě asi 65 C až k dosažení požadované refrakce (cca 25 %). Zruší se vakuum a přidá se sůl, 28

ocet, stabilizátor, extrakty koření, modifikovaný škrob a směs se za stálého míchání zahřívá na teplou asi 90 C. Až potud je výroba kečupů do všech typů obalů stejná. (DOBIÁŠ, 2004). 3.3.2 Plnění kečupu do skleněných a plastových obalů, chlazení a skladování Kečupy ve skleněných obalech Při tomto způsobu výroby kečupů se uvařenou směsí naplní skleněné obaly, které jsou již propláchnuté desinfekčním roztokem a následně vodou o teplotě kolem 80 C a uzavřou se pomocí automatické uzavíračky (MIKYŠKA, 2009). V dalším kroku jsou skleněné obaly s kečupem sterilovány v kontinuálním sterilátoru, kde produkt prochází fázemi podávání, předehřívání, ohřevu, předběžného chlazení, chlazení a sušení (vww.mze.cz, 2006). Ohřev se provádí pomocí horké vody nebo páry o teplotě asi 85 až 90 C, přiváděnou shora na obaly řadou trysek. Doba sterilační výdrže je, závislá na velikosti obalu, ale běžně se pohybuje okolo 20 min. Chlazení se také provádí postřikem (sprchováním) vodou na výslednou teplotu kečupu okolo 30 až 40 C. Po ochlazení se na obaly nalepí etikety a následuje balení do supinových obalů (MIKYŠKA, 2009). Kečupy se skladují při teplotě do 25 C (VÁVROVÁ, 2009). Kečupy v plastových obalech Při této výrobě kečupů plněných do plastových obalů, které se nedají tepelně sterilovat, se kečup konzervuje chemicky směsí solí kyseliny benzoové (benzoanu sodného) a kyseliny sorbové (sorbanu draselného). Takto zakonzervovaná uvařená směs se musí vychladit, aby se následně mohla naplnit do plastového obalu (MIKYŠKA, 2009). Chlazení probíhá pomocí deskového pastéru, který je naplněn studenou vodou. Po vychlazení kečupu následuje jeho plnění do čistých plastových obalů, uzavírání a lepení etiket (KLEINOVÁ, 2009). Modifikací výroby kečupů do plastových obalů je tzv. horký rozliv. Jedná se o plnění horké směsi o teplotě 85 až 92 C bez konzervačních látek do plastových obalů, které mají speciální vlastnosti (odolnost vůči vyšší teplotě a vyšší bariérové vlastnosti atd.). Horký kečup je sám sterilní a také svou teplotou vysteriluje vnitřek obalu. Poté se okamžitě obal hermeticky uzavře. Výsledkem je tedy chemicky nekonzervovaný kečup v plastovém obalu (MIKYŠKA, 2009). 29

3.3.3 Mikrobiální kontaminace rajčatového kečupu. Rajčatový kečup je považovaný za velmi stabilní produkt. Nízké ph získané většinou od solí kyseliny benzoové a tepelná sterilace směsi během výroby přispívá k jeho stálosti (BJORKROTH, KORKEALA, 1996). Kečupy s hodnotami ph 3,7 až 4,6 obsahující asi 0,9 % kyseliny octové a asi 0,2 % kyseliny citrónové se kazí zřídka, ale jejich kažení není vyloučené. Za studena vyrobené produkty mohou podléhat kažení působením : bakterií octového kvašení rodů Acetobacter a Gluconobacter, bakterií mléčného kvašení rodů Lactobacillus a Leuconostoc, nebo působením kvasinek a plísní. Pomnožení octových bakterií může způsobit bombáž výrobku v plastovém obalu. Pokud jsou tyto obaly propustné pro plyny, bombáž po jistém čase zanikne, produkt zůstane senzoricky nezměněný, výrobek sice není zdravotně škodlivý, ale není hygienicky bezchybný. Kažení způsobené bakteriemi mléčného kvašení se také může projevit bombáží. Při intenzivním pomnožení homofermentativních laktobacilů (L. plantarum) byla pozorována v produktu tvorba bílých kolonií o velikosti špendlíkové hlavičky (GÖRNER, VALÍK, 2004). Laktobacily pravděpodobně přežívají teplotní záhřev ve výrobním zařízení v suchých úkrytech nebo ve formě biofilmu (FABÍKOVÁ et al., 2004). V produktech plněných do velkospotřebitelských obalů za studena se občas na povrchu může vyskytnout povlak plísně nebo kvasinek (Saccharomyces ssp., Candida ssp.), bez zjevného kvašení. V produktech vyrobených a plněných za horka se na kažení mohou podílet Bacillus coagulans, Bacillus stearothermophilus a Bacillus macerans polymyxa. Tato chyba se projevuje mírným zkysnutím produktu, přičemž hodnota ph poklesne asi o půl jednotky. Existuje také kmen Bacillus stearothermophilus, který za anaerobních podmínek a při teplotách 40 až 50 C redukuje dusičnan a tvoří plyn. Endospory B. coagulans klíčí při hodnotách ph nad 4,0 a spory B. stearothermophilus klíčí při hodnotách ph vyšších než 4,6 (GÖRNER, VALÍK, 2004). Bacillus macerans polymyxa naopak klíčí při ph 4,0 až 3,8, ale jeho růst je zpomalený (BJORKROTH, KORKEALA, 1996). V příliš teplém skladu, nad 40 C se kyselý 30

produkt může kazit také působením Alicyclobacillus acidoterrestris. Kažení způsobené tímto organismem se pozná senzorickými změnami vůně a chuti. Kečupy se mohou také kazit působením amyláz (ztekucení následkem hydrolýzy škrobu). Takovéto amylázy bývají přítomné v koření. Kečupy pasterizované při teplotách nižších než 85 C mohou obsahovat neinaktivované enzymy. Na jakost kečupů má významný vliv jakost suroviny - rajčatová dužnina. Rozhodující je obsah plísní (konidií) ve výchozím produktu. Ukazatelem jakosti suroviny je obsah ergosterolu (vit. D). V čerstvých rajčatech se pohybuje mezi 0,04 až 0,13 µg. g -1 sušiny. Patogenní a toxinogenní bakterie se v silně kyselých produktech nerozmnožují. V plesnivých výrobcích, kde dochází ke zvýšení hodnoty ph v důsledku spotřeby organických kyselin plísněmi, se může vyskytnout i Clostridium botulinum a jeho toxiny. U naočkované rajčatové šťávy plísněmi rodu Cladosporium a Penicillium se původní hodnota ph 4,2 pod porostem plísní zvýšila za 6 dní na ph 5,9 a za 9 dní na ph 7. Už při hodnotě ph 5 rostlo v rajčatové šťávě, po naočkování, Clostridium botulinum A za tvorby toxinu. (GÖRNER, VALÍK, 2004) 3.4 Mikroorganismy, které by se mohly vyskytovat v rajčatovém kečupu při nedodržení správné výrobní a hygienické praxe 3.4.1 Bakterie 3.4.1.1 Bakterie mléčného kvašení Rod Lactobacillus (čeleď Lactobacillaceae) Jsou velmi dobře popsanou skupinou mikroorganismů, čítající více než 50 druhů. Jedná se o pravidelné, dlouhé, většinou nepohyblivé gram-pozitivní tyčinky. Bakterie tohoto rodu jsou nesporulující, v naprosté většině nepatogenní. Rostou v anaerobních podmínkách, některé druhy jsou mikroaerofilní, nebo dokonce fakultativně anaerobní. Jsou velmi náročné na růstové látky, zejména vitamíny a aminokyseliny (FABÍKOVÁ et al, 2004). Optimální ph pro růst lactobacilů je 5,4 až 6,4 minimální 3,8 až 4,4 a maximální 7,2. Jsou schopni růst při 8 % koncentraci NaCl (RAY et al., 2006, tab. 3). 31

Podle Produktů katabolického metabolismu rozdělujeme rod Lactobacillus na tzv. homofermentativní mléčné bakterie, (např. druhy L. delbrueckii, L. acidophilus, L. plantarum) a na tzv. heterofermentativní (L. fermentum, L. brevis) (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Obr. 5 Teplotní resistence rodu Lactobacillus (FABÍKOVÁ et al., 2004). Obr. 6 Resistence vůči konzervačním látkám. (FABÍKOVÁ et al., 2004). Bakterie rodu Lactobacillus přežívají teplotu 90 C až po dobu 10 min. Jsou tedy schopny přežívat teplotní zákroky během výroby. Naměřené D hodnoty jsou D 75 = 10,77 min, D 80 = 3,58 min, D 85 = 1,89 min, D 90 = 1,85 min a hodnota z = 16,7 C. Laktobacily rostou i v přítomnosti kyseliny benzoové a sorbové. Jejich kombinace má na inhibici laktobacilů nejmenší účinek, jak je vidět na obrázku 6. Již dříve bylo prokázáno, že tyto konzervační látky, které jsou běžně používány pro konzervaci kečupů nejsou účinné proti rodu Lactobacillus. Obr. 7 Inaktivace mikroorganismů v kečupu (FABÍKOVÁ et al., 2004). Obr. 8 Inaktivace mikroorganismů v majonéze (FABÍKOVÁ et al., 2004). 32

Na grafech (obr. 7, 8) je znázorněn inhibiční efekt monolaurinu na rod Lactobacillus. V kečupu, nemá příliš velký účinek, pouze snižuje nárůst, ale výrazný inhibiční účinek má v majonéze. To je způsobeno lepší rozpustností monolaurinu v tucích než ve vodě. Monolaurin je relativně drahý a v České republice není prozatím povolen jako konzervační látka. Obr. 9 Inhibiční efekt EDTA a snížení ph proti rodu Lactobacillus v kečupu. (FABÍKOVÁ et al., 2004). Na tomto grafu (obr. 9) je vidět inhibiční účinek EDTA (ethylendiamintetraoctová kyselina) a snížení ph na rod Lactobacillus v kečupu. EDTA snižuje nárůst mikroorganismů stejně jako snížení ph na hodnotu 2,8, přičemž snížení ph na hodnotu 3,3 se jeví jako dostatečné. Největší inhibiční účinek by měla kombinace EDTA a snížení ph na hodnotu 3,3. (FABÍKOVÁ et al, 2004) Podle GÖRNERA a VALÍKA (2004) se z rodu Lactobacillus v rajčatovém kečupu nachází homofermentativní Lactobacillus plantarum, který při intenzivním přemnožení způsobuje tvorbu bílých kolonií, velikosti špendlíkové hlavičky. Lactobacillus plantarum je podle MOLENAAR et al. (2005) velice přizpůsobivý druh, se kterým se setkáváme na rostlinných materiálech, a který využívá jako zdroj energie širokou škálu zkvasitelných sacharidů. Roste při 15 C, výjimečně při 45 C. Jeho teplotní optimum je 28 až 32 C (HAMPL, 1968). Obr. 10 Lactobacillus plantarum Nárůst bakterie po 18 hod. kultivace v MRS médiu. (SAVICKÁ, 2003). 33

Na kažení rajčatového kečupu podílí i Lactobacillus fructivorans. Přítomnost tohoto druhu se projevuje charakteristickým vypouknutím plastového obalu, které je způsobeno tvorbou plynů. Při laboratorních experimentech bylo prokázáno, žepři kultivaci na MRS agaru nastalo kažení tímto druhem jen u vzorků inkubovaných při teplotě 15 až 30 C (BJORKROTH, KORKEALA, 2006). Podle KYZLINKA (1980) také Lactobacillus lactis a Lactobacillus bulgaricus nejsou při konzervaci zeleniny žádoucí, protože silně okyselují výrobek a nedodávají zeleninovým výrobkům odpovídající chuť. Rod Leuconostoc (čeleď Leukonostocaceae) Jedná se gram-pozitivní mikroaerofilní koky (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Rod Leuconostoc má buňky kulovité. Za určitých podmínek, např. v kyselých šťávách a na rostlinách se mohou buňky prodlužovat v tyčinky (HAMPL, 1968). Optimální růstová teplota se pohybuje při 20 až 30 C, nerostou při 45 C (SEDLÁČEK, 2007). Pro svůj růst vyžadují řadu růstových látek, zejména vitamíny a aminokyseliny (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Určité typy rostou za tvorby charakteristického slizu na cukernatých médiích. Rod Leuconostoc zkvašuje sacharidy na kyselinu mléčnou, ethanol a CO 2, a proto patří mezi heterofermentativní mléčné bakterie. V rostlinných materiálech se vyskytuje Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum a Leuconostostoc mesenteroides ssp. cremoris (GÖRNER, VALÍK, 2004) 3.4.1.2. Bakterie octového kvašení Rod Acetobacter (čeleď Acetobacteraceae) Původci octového kvašení, které je často složkou metabios spontánního rozkladu cukernatých kyselých potravin, k nimž má přístup vzduch, jsou bakterie z rodu Acetobacter. (KYZLINK, 1980). Mají schopnost oxidovat ethanol na kyselinu octovou. Při poklesu koncentrace ethanolu oxidují vzniklou octovou kyselinu až na CO 2 a vodu (tzv. přeoctění). Jedná se o gram-negativní, striktně aerobní bakterie. Mají tvar peritrichních nebo atrichních tyčinek, které však často tvoří tzv. involuční formy, tj. nepravidelné tvary (nepravidelně zduřené až kulovité, zakřivené, vláknité apod.), vyskytují se jednotlivě, v párech nebo řetízcích (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 34

Rostou při teplotě od 5 do 42 C. Jejich teplotní optimum je 25 až 30 C. Optimální ph pro růst je mezi 4,5 až 6,3. Minimální ph je 4,3. (GÖRNER, VALÍK, 2004) Do rodu Acetobacter jsou dnes zařazovány druhy Acetobacter aceti, Acetobacter liquefaciens a další (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Rod Gluconobacter (čeleď Acetobacteraceae) Podle GÖRNERA a VALÍKA (2004) také rod Gluconobacter oxiduje ethanol na kyselinu octovou, z laktátu a acetátu netvoří CO 2. Patří mezi gram-negativní, striktně aerobní tyčinky. Tvoří elipsoidní až tyčinkovité buňky bez bičíků nebo se svazkem bičíků na pólu (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Optimální teplota pro růst je 25 až 30 C, rozmezí tolerance 7 až 41 C, některé kmeny nerostou nad 37 C. Optimální ph je 5,5 až 6,0; růst a tvorba kyseliny octové při ph 4,0 až 4,5; rostou i v mírně alkoholickém prostředí (GÖRNER, VALÍK, 2004). 3.4.1.3 Bakterie máselného kvašení Rod Clostridium (čeleď Clostridiaceae) Rod Clostridium je velmi rozsáhlý a z potravinářského hlediska velmi důležitý. Jeho druhy tvoří peritrichní tyčinky, které jsou gram-pozitivní. Spora je širší než vegetativní buňka. Rod Clostridium je obligátně anaerobní. Kyslík inhibuje růst a po 5 až 10 minutách působení usmrcuje vegetativní buňky většiny druhů. Některé druhy jsou ke kyslíku méně citlivé, a jsou proto schopny pomalého rozmnožování i za omezeného přístupu vzduchu (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Rod Clostridium rozdělujeme na druhy proteolytické (Clostridium botulinum typ A, C. sporogenes, C. histolyticum a jiné) a sacharolytické (Clostridium botulinum typ E, C. butyricum, C. felsineum, C. pasteurianum, C. tyrobutyricum, C. perfringens a jiné) (GÖRNER, VALÍK, 2004). Nejznámější původci máselného kvašení bývají přísně anaerobní Clostridium pasteurianum a Clostridium butyricum. Obranou proti máselnému kvašení je především vyšší kyselost potraviny (ph < 4,2) a přítomnost kyslíku, která ovšem nebývá mnohdy žádoucí z jiných důvodů (KYZLINK, 1980). 35

Z konzervárenského hlediska je důležitý termofilní druh Clostridium thermosaccharolyticum jehož spory mohou přežívat sterilační teploty používané při sterilaci kyselých konzerv (TOMÁNKOVÁ et al., 2006). Jejich přítomnost se projeví kažením produktu, které je doprovázeno bombážemi (KLABAN, 2001). Rajčatový kečup patří z technologického hlediska mezi málo kyselé až kyselé výrobky a za optimálních podmínek, ne jen při uskladňovacích teplotách více jak 20 C, mohou vyklíčit některé spory bakterií Clostridium pasteurianum, jejichž přítomnost se za anaerobních podmínek projeví tvorbou kyselin a poklesem ph. Spory těchto bakterií snáší teplotu do 100 C po dobu několika minut. Podle dostupných údajů mléčné a máselné bakterie hynou v prostředí okolo ph 3,5 při teplotě 90 C za několik sekund, zvýšení ph na hodnotu 4,3 si vyžaduje prodloužení času na několik minut (DRDÁK, 1989). 3.4.1.4 Rod Bacillus (čeleď Bacillaceae) Rod Bacillus je také velmi rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený. Jeho druhy tvoří většinou peritrichní gram-pozitivní aerobní nebo fakultativně anaerobní tyčinky, které mají bohaté enzymové vybarvení, takže mohou rozkládat nejrůznější organické sloučeniny (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Závažné pro lidské zdraví jsou patogenní druhy Bacillus anthracis a B. cereus. Ostatní rody Bacillus ssp. jsou jen příležitostně patogenní (SPICER, 2002). Společným znakem bacilů je tvorba endospor, které jsou v důsledku své stavby vybaveny odolností vůči teplu, radiaci a desinfekčním činidlům (BEDNÁŘ et al., 1996). Sporulace probíhá pouze za přítomnosti kyslíku, protože pro sporulaci získává buňka energii především oxidací zásobních lipidů z cytoplazmy (VOTAVA, 2006). Kultivační teplota se pohybuje od 5 do 70 C (HUDECOVÁ, MAJTÁN, 2002). Rod Bacillus tedy můžeme rozdělit na druhy psychrofilní, které rostou při teplotě 0 C, nerostou při teplotě 30 C. Patří sem např.: Bacillus insolitus, B. globisporus; mezofilní: Bacillus cereus, B. anthracis, B. megaterium, B. thuringiensis a jiné. Rostou při teplotě 7 až 4 C, nerostou při teplotě 43 C; termofilní: Bacillus stearothermophilus, B. coagulans, B. acidicaldarius (nově Alicyklobacillus acidicaldarius, B. subtilit, B. licheniformis). Rod Bacillus štěpí bílkoviny za vzniku amoniaku, sacharidy fermentují obyčejně s méně významnou 36

tvorbou kyselin, některé také s tvorbou plynů. Dobře rostou v rozmezí ph 5,5 až 8,5. Jen některé (B. coagulans, B. polymyxa - nově Paenibacillus polymyxa, B. acidicaldarius) rostou také při ph 5,0 a nižším. Z rodu Bacillus se v rajčatovém kečupu nachází: Bacillus coagulans, B. thermoacidurans, B. stearothermophilus atd. (GÖRNER, VALÍK, 2004). Bacillus stearothermophilus se nověji nazývá Geobacillus stearothermophilus (KLABAN, 2005). Je schopen aktivního růstu za nepřístupu kyslíku. Může být příčinou plynuprostého kysnutí nekyselých konzerv, neboť při vhodné teplotě tvoří značné množství kyselin. Je schopen se rozmnožovat nad ph 4,8. Intenzivně se rozmnožuje při teplotách 55 až 65 C. Minimální teplota je 44 až 45 C. Vegetativní buňky jsou velmi citlivé na snížení teploty, takže při ochlazení na laboratorní teplotu často hynou. Aby se zabránilo činnosti Bacillus stearothermophilus v teplem sterilovaných konzervách při zvýšené teplotě, je třeba konzervy po sterilaci ihned zchladit (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Druh Bacillus stearothermophilus se používá jako biologický indikátor k testování správné funkce autoklávů. Dobře fungující autokláv by měl během stanovené teploty a délky sterilace usmrtit všechny zárodky B. stearothermophilus (KLABAN, 2005). Bacillus coagulans je z konzervárenského hlediska také důležitý. Jeho optimum růstu je při teplotě 45 až 55 C, spory jsou schopny vyklíčit při ph 4,0 až 5,0. Bývá rovněž příčinou plynuprostého kažení teplem sterilovaných konzerv (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). VADY KEČUPŮ ZPŮSOBENÉ RODEM BACILLUS Plynuprosté kysnutí konzerv: Při těchto procesech se nevyvíjejí plyny, proto také nedochází k bombážím. Tuto závadu způsobuje hlavně Bacillus stearothermophilus, někdy však též Bacillus aerothermophilus. Spory těchto mikrobů jsou vesměs neobyčejně odolné vůči teplotě. Probíhá-li tento proces působením mikroba Bacillus stearothermophilus, projevuje se změnou chuti a poklesem ph původně nekyselé potraviny, obvykle asi na 4,2 až 4,5, někdy však jen asi na 5,0. Původce totiž nesnáší, na rozdíl od dále uvažovaného mikroba Bacillus thermoacidurans, kyselejší prostředí. Kromě toho bývá poněkud ovlivněna v nepříjemném smyslu i vůně hmoty. Při mikroskopickém vyšetřování takto 37

zkažených konzerv nalézáme zpravidla jen vegetativní tyčinky; spory mikroba se vyvíjejí jen při diagnostické kultivaci v neutrálních půdách. Kysnutí zeleninových konzerv hrozí hlavně tehdy, nebyly-li konzervy dostatečně sterilovány a po sterilaci rychle a řádně vychlazeny, tj. byly-li delší dobu vystaveny teplotě blízké 37 C. Kysnutí sterilovaných výrobků z rajčat Bývá pozorováno, že toto kysnutí vede k poměrně hlubokému poklesu ph, z původní hodnoty 4,3 až na 3,7. V podstatě jde o zvláštní formu mléčného kvašení, která spolutvoří za přítomnosti kyslíku plyny a za anaerobních podmínek pouze okyseluje. K bombáži konzerv tedy zpravidla nedojde, závada však bývá charakterizována zvláštním, nepříjemným lékárnickým zápachem kazící se hmoty. Příčina se připisuje rozvoji mikroba Bacillus thermoacidurans (Bacillus coagulans), jehož spory mohou klíčit je-li jimi substrát značněji zamořen, ještě při poměrně nízkém ph pod 4,0. Je-li infekce nevelká, hraniční inhibující ph se zvyšuje. V prostředí okyseleném pod ph 4,0 tvoří B. thermoacidurans nanejvýš jen vegetativní formy. Přenést infekci na bakteriologické kultivační půdy se většinou nedaří, neboť při postupujícím okyselování napadené hmoty dochází během uložení konzerv k inaktivaci (při asi 20 C). Prakticky dosažitelným odvzdušněním konzerv se klíčivost spor Bacillus thermoacidurans nedá inhibovat (KYZLINK, 1980). 3.4.1.5 Koliformní bakterie a rod Escherichia (čeleď Enterobacteriaceae) Koliformní bakterie jsou gram - negativní fakultativně anaerobní tyčinky z čeledi Enterobacteriaceae. Kmeny patřící do koliformních bakterií jsou součástí střevní mikroflóry člověka a hospodářských zvířat, a vyskytují se tedy i ve výkalech a ve vnějším prostředí. Patří sem Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae a zástupci rodů Klebsiella a Citrobacter (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). Mohou růst při teplotách -2 až 50 C a rozmnožovat se při ph v rozmezí 4,4 až 9 (TOMÁNKOVÁ et al., 2006). Z hygienického hlediska je nejdůležitější rod Escherichia a druh Escherichia coli. Jedná se o patogenní nebo podmíněně patogenní nesporotvorné tyčinky, které se vyskytují jednotlivě ve dvojicích, nebo v krátkých řetízcích. Optimální teplota růstu je okolo 37 C a ph 6,8 a 7,2 (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). 38

Nepřežívají záhřev 16 až 17 sekund při teplotách vyšších než 64 C (SEDLÁČEK, 2007). E. coli zkvašuje cukry za intenzivní tvorby kyselin a plynů (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). Tvoří hlavně kyselinu mléčnou, pyrohroznovou, octovou a mravenčí, přičemž část kyseliny mravenčí rozkládá na oxid uhličitý a vodík (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). V potravinářské mikrobiologii mají koliformní bakterie a tedy i E. coli význam jako indikátorové mikroorganismy, jsou indikátory sekundární kontaminace potravin, indikátory správné sanitace technologického zařízení a nářadí a v pitné vodě jsou indikátory její jakosti. 3.4.1.6 Koagulázapozitivní stafylokoky (čeleď Staphylococcaceae) Jedná se o gram pozitivní fakultativně anaerobní kokovité bakterie rostoucí při teplotách 10 až 45 C. V přírodě se stafylokoky vyskytují v prachu, ve vodě, jsou součástí mikroflóry kůže a srsti, nebo dutiny ústní či nosní. Ubikvátní rozšíření stafylokoků dává předpoklady k jejich výskytu v mase a potravinách s vysokým obsahem bílkovin. Častým zdrojem stafylokoků jsou drobná hnisavá poranění na rukou pracovníků manipulujících s potravinami. Nebezpečné jsou kmeny, které za vhodných podmínek tvoří enterotoxin, způsobující enterotoxikózy. Vhodné podmínky pro produkci enterotoxinu jsou při teplotě nad 15 C a hodnotě ph 4,0 v aerobním prostředí a ph 5,3 v anaerobním prostředí. Vzhledem ke značnému rozšíření stafylokoků a vysoké rezistenci je nejlepší prevencí kontaminace potravin uchování potravin při teplotách pod 10 C a rychlé zchlazení hotových pokrmů. Za koaguláty pozitivní stafylokoky jsou považovány bakterie, které tvoří typické, a/nebo atypické kolonie na povrchu selektivní kultivační půdy (půda podle Baier - Parkera), a které mají pozitivní koagulázovou reakci. (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007) 39

3.4.2 Plísně 3.4.2.1 Plísně kontaminující rajčatový kečup Rod Alternaria (čeleď Pleosporaceae) a) b) c) Obr. 11 a) Rod Alternaria na rostlinném materiálu (SEDLÁŘOVÁ, 20007); b) Makrohabitus Alternaria alternata na PDA agaru při 25 C po 5 dnech inkubace (OSTRÝ et al., 2008); c) Zďovité tmavě pigmentované konidie (1000 x, DIC) : preparát byl připraven do kyseliny mléčné obarvené bavlnovou modří; (KUBÁTOVÁ, 2004). Rod Alternaria je důležitý rostlinný patogen napadající a způsobující zánik mnoha zemědělských plodin (nejčastěji ječmene, pšenice, ovsa a rajčat) jak na poli, tak i po sklizni. Alternarie způsobují například časnou sněť brambor či tzv. bledničku u rajčat a citrusů. Optimální teplota pro růst alternarií je cca 25 C, min -5 C a max 36 C (RADOVÁ-SYPECKÁ, HAJŠLOVÁ, 2003). Minimální vodní aktivita pro růst je 0,88 při teplotě 25 C. Optimální ph je od 4 do 5,4 (OSTRÝ, et. al, 2008). Rod Alternaria zahrnuje vláknité mikromycety, které se na kultivačních médiích vyznačují různým růstem a tvoří zpočátku bílé, později šedé až olivově hnědé kolonie. Charakteristická je tvorba zďovitých (muriformních) tlustostěnných, ve více rovinách přepažených makrokonidií (dictyospór), obvykle zbarvených v tmavohnědých odstínech (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003). Tmavá barva spor i tmavé zbarvení mycelia chrání tuto plíseň před nepříznivými účinky slunečního světla, a proto se vyskytuje často ve vzduchu, v přírodě i v různých potravinářských provozovnách (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 40