Liberace acikloviru z mukoadhezivních matric

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické technologie Liberace acikloviru z mukoadhezivních matric Diplomová práce Hradec Králové 2014 Lenka Šišáková 1

Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita pro získání jiného nebo stejného kvalifikačního titulu. Za pomoc a odborné vedení při vypracování diplomové práce děkuji PharmDr. Evě Šnejdrové, Ph.D. 2 Lenka Šišáková

OBSAH: 1 ABSTRAKT... 5 2 ABSTRACT... 6 3 ZADÁNÍ PRÁCE... 7 4 ÚVOD... 8 5 SEZNAM ZKRATEK... 9 6 TEORETICKÁ ČÁST... 10 6.1 Disoluce... 10 6.1.1 Disoluční testy... 10 6.1.2 Disoluční médium... 10 6.1.3 Disoluce tablet... 11 6.1.4 Disoluce transdermálních přípravků... 12 6.1.5 Disoluce lipofilních tuhých lékových forem... 13 6.2 Bioadheze... 15 6.2.1 Teorie bioadheze... 16 6.2.2 Mechanismus bioadheze... 18 6.2.3 Faktory ovlivňující bioadhezi... 18 6.2.4 Struktura, funkce a složení mukusu... 19 6.2.5 Měření bioadheze... 20 6.2.6 Bioadheziva... 23 7 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 26 7.1 Použité suroviny... 26 7.2 Použité přístroje... 26 7.3 Příprava fosfátcitrátového pufru o ph 7,4 pro mukoadhezivní test... 27 7.4 Sestrojení kalibrační přímky acikloviru... 27 7.5 Příprava substrátu pro disoluční a adhezivní test... 28 7.6 Příprava matric pro disoluční a adhezivní test... 28 3

7.7 Disoluční test oligoesterových matric... 29 7.8 Testování adhezivní síly... 30 8 VÝSLEDKY... 32 8.1 Výsledky disoluce acikloviru... 32 8.2 Výsledky testování adhezivní síly... 38 9 DISKUZE... 41 9.1 Vliv metodiky na výsledky disolučního testu... 41 9.2 Vliv plastifikátoru na mukoadhezivní test... 41 9.3 Vliv plastifikátoru na adhezivní sílu... 43 10 ZÁVĚR... 44 11 SEZNAM LITERATURY... 45 4

1 ABSTRAKT Cílem diplomové práce bylo studium mukoadhezivních vlastností plastifikovaného oligoesteru kyseliny mléčné a glykolové větveného 3 % mannitolu. V teoretické části jsou shrnuty poznatky o zkouškách disoluce aktivních látek z lékových forem, o základních teoriích a mechanismech mukoadheze a o testování adhezivních přípravků. V experimentální části byly hodnoceny matrice složené z terpolymeru kyseliny D,L-mléčné a glykolové větveného mannitolem, plastifikátoru a 5 % acikloviru. Jako plastifikátor byl použit ethylpyruvát (EP), ethylsalicylát (ES), methylsalicylát (MS) a triethylcitrát (TEC). Byl proveden disoluční test. Jako podklad byl použit hydratovaný mucin z prasečích žaludků. Jako disoluční médium byl použit fosfátcitrátový pufr ph 7,4. V časovém intervalu 15, 30, 60 a 90 minut byl proveden odběr vzorků. Množství uvolněného acikloviru ve vzorcích bylo stanoveno spektrofotometricky. Za 90 minut se z matrice plastifikované 30 % TEC uvolnilo 43 % acikloviru, z matrice plastifikované 20 % EP 55 %, z matrice plastifikované 20 % ES 35 %, z matrice plastifikované 20 % MS 26 % a z matrice plastifikované 30 % EP 31 %. Nejrychleji se aciklovir uvolňuje z matrice plastifikované 20 % ethylpyruvátu. Adhezivní síla oligoesterových matric plastifikovaných 20 % EP a 20 % ES byla měřena tahovou zkouškou in vitro tzv. odtrhávací metodou. K měření byl použit materiálový zkušební stroj. Jako modelový substrát byl použit hydratovaný mucin z prasečích žaludků. Adhezivita byla vyjádřena jako maximální síla potřebná pro odtržení matrice od substrátu, vztažená k velikosti kontaktní plochy [N cm -2 ]. Při plastifikaci oligoesterové matrice ethylpyruvátem je adhezivní síla vyšší než při plastifikaci ethylsalicylátem. Klíčová slova: disoluční testy, mukoadheze, mukoadhezivní testy, oligoestery, aciklovir. 5

2 ABSTRACT The aim of this diploma thesis was the study of the mucoadhesive parameters of plasticized oligoester of lactic acid and glycolic acid and 3% mannitol as a branching monomer. Knowledge of dissolution testing of drug release from dosage form, principal theories and mechanisms of mucoadhesion and mucoadhesion testing of adhesive formulation is described in theoretical part. Matrices formed from terpolymer of D,L-lactic acid, glycolic acid branched with mannitol and 5 % aciclovir were examined in the experimental part. Triethylcitrate (TEC), ethylpyruvate (EP), methylsalicylate (MS) and ethylsalicylate (ES) were used as plasticizers. Dissolution test has been done. Hydrated mucin from porcine stomach was used as a base. Phosphate-citrate buffer ph 7.4 was used as a dissolution medium. Dissolution was defined as a quantity of released aciclovir in to the dissolution medium after 15, 30, 60 and 90 minutes. The quantity of the released aciclovir was defined by a spectrophotometry. In 90 minutes was released 43 % of aciclovir from the matrice plasticized with 30 % TEC, 55 % from the matrice plasticized with 20 % EP, 35 % from the matrice plasticized with 20 % ES, 26 % from the matrice plasticized with 20 % MS and 31 % from the matrice plasticized with 30 % EP. The rate of aciclovir release from matrice plasticized with 20 % ethylpyruvate was the highest. The bioadhesive test of matrices plasticized with 20 % EP and 20 % ES has been done using an in vitro detached method. Hydrated mucin from porcine stomach was used as a biological substrate. Bioadhesion was measured by material testing machine. The adhesion was defined as a maximum force necessary for detachment the matrice from the substrate relative to the size of the contact area [N cm -2 ]. The adhesive force of matrice plasticized with 20 % ethylpyruvate was higher than the adhesive force of matrice plasticized with 20 % ethylsalicylate. Key words: dissolution testing, mucoadhesion, mucoadhesion testing, oligoesters, aciclovir 6

3 ZADÁNÍ PRÁCE V rámci teoretické části diplomové práce je zadáno shrnout dosavadní poznatky o zkouškách disoluce léčivých látek z různých lékových forem a mechanizmech mukoadheze, vysvětlit základní teorie a faktory mukoadhezi ovlivňující. Popsat metody testování mukoadheze, substráty používané při mukoadhezivních testech. V experimentální části práce studovat mukoadhezivní vlastnosti plastifikovaného oligoesteru kyseliny mléčné a glykolové, větveného mannitolem a liberaci acikloviru z těchto systémů. Zadání experimentální části práce lze formulovat do následujících úkolů: 1. Připravit reotropní matrice tvořené oligoesterem, plastifikátorem a léčivem. Použít oligoester kyseliny mléčné a kyseliny glykolové, větvený mannitolem v koncentraci 3 % v reakční směsi. Jako plastifikátor použít triethylcitrát, ethylpyruvát, methylsalicylát a ethysalicylát v koncentraci 20 % nebo 30 %. Inkorporovat aciklovir v koncentraci 5 %. 2. Provést mukoadhezivní testy tzv. smívací technikou za využití třepačky s vodní lázní a hydratovaného mucinu z prasečích žaludků jako substrátu pro mukoadhezi. Množství acikloviru uvolněného z matric po jejich aplikaci na mukózní podklad stanovit měřením absorbance v absorpčním maximu acikloviru. 3. Měřit mukoadhezivní sílu matric na materiálovém zkušebním stroji firmy Zwich/Roell za těchto zkušebních podmínek: kontaktní doba 10 min, kontaktní síla 10 N a rychlost odtržení marice od podkladu 100 mm/min. 7

4 ÚVOD Polyestery kyseliny mléčné a glykolové jsou biodegradabilní a biokompatibilní polymery, které se v medicíně používají jako vstřebatelný šicí materiál nebo ortopedické implantáty. Ve farmacii nacházejí uplatnění jako nosiče léčiv při léčbě nádorových onemocnění, drogové závislosti, infekčních onemocnění, dále v antikoncepčních přípravcích, vakcínách nebo při aplikaci růstových hormonů. Na katedře farmaceutické technologie byly syntetizovány větvené polyestery stupňovou kopolymerací z reakční směsi s ekvimolárním množstvím kyseliny glykolové a kyseliny DL-mléčné. Jako větvící složka byly použity vícesytné alkoholy, např. mannitol a tripentaerythritol. Ke zlepšení zpracovatelnosti a umožnění aplikace bioadhezivních přípravků byly polyestery plastifikovány např. ethylpyruvátem, methylsalicylátem, ethylsalicylátem nebo triethylcitrátem (1). Tato diplomová práce se věnuje studiu mukoadhezivních vlastností plastifikovaných oligoesterových matric. Diplomová práce navazuje na již obhájenou diplomovou práci Marie Líbenkové (2). V této práci byla použita barviva a sledována jejich disoluce během mukoadhezivního testu. V předložené práci bylo do plastifikovaných oligoesterů inkorporováno léčivo aciklovir. 8

5 SEZNAM ZKRATEK 3M oligoester větvený mannitolem v koncentraci 3 % v reakční směsi ACV aciklovir EP ethylpyruvát ES ethylsalicylát HMPC hypromelosa MS methylsalicylát PAL povrchově aktivní látky TEC triethylcitrát 9

6 TEORETICKÁ ČÁST 6.1 Disoluce Disolucí se ve farmacii rozumí uvolňování aktivní látky z lékové formy a následný přechod této aktivní látky do roztoku (3). Disoluce je zkoumána již od konce 19. století. Teprve před 50 lety si vědci uvědomili, jak důležitou roli hraje disoluce v dostupnosti léčiva. Protože disoluční procesy již byly dříve probádány, vědci při studiu dostupnosti léčiva nepotřebovali objevovat nové zákonitosti disoluce (4-5). 6.1.1 Disoluční testy Dnes jsou disoluční testy využívány především při in vitro hodnocení kvality léčivých přípravků. Disoluční testy byly zavedeny za účelem demonstrace efektivnosti uvolnění aktivní látky z lékové formy (6). Na základě jejich výsledků lze odhadnout in vivo biologickou dostupnost léčivé látky z přípravku nebo bioekvivalenci generických přípravků. Disoluční testy jsou nyní nedílnou součástí lékopisných kontrolních metod (7). Bývají obsaženy v dokumentaci při žádosti o registraci léčivého přípravku. Původně se tyto zkoušky využívaly k hodnocení uvolňování aktivních látek z tablet a tobolek. V poslední době se disoluční testy začaly používat i k hodnocení dalších lékových forem, mezi které patří prášky, žvýkací tablety, bukální a sublinguální tablety, měkké želatinové tobolky, čípky nebo transdermální náplasti. Díky významným rozdílům ve formulacích a mezi vlastnostmi jednotlivých lékových forem není možné používat jeden univerzální testovací systém. V průběhu vývoje disolučních testů vzniklo několik různých metod a systémů testování specifických pro příslušné lékové formy. Pro všechny testovací systémy však platí, že všechny jejich části, které mohou přijít do kontaktu s disolvovaným léčivem nebo disolučním médiem, musí být vyrobeny z chemicky inertního materiálu a nesmí s nimi interagovat. Kovové části by měly být vyrobeny z ušlechtilé ocele nebo pokryty vhodnou ochrannou vrstvou (8). 6.1.2 Disoluční médium Po perorálním podání léku prochází léčivý přípravek v trávící soustavě několika prostředími o různém ph a dostává se do styku s některými enzymy či povrchově aktivními látkami. Za účelem nejpřesnějšího napodobení tohoto fenoménu in vitro se při disolučních testech využívají disoluční média s různým ph. Pro konkrétní prostředí jednotlivých částí gastrointestinálního traktu pak volíme médium o podobném ph. Například pokud chceme napodobit kyselé prostředí žaludku, jako disoluční médium 10

volíme 0,1 M HCl. K dosažení ještě lepších výsledků testů se doporučuje přidat do média povrchově aktivní látky nebo enzymy přirozeně se vyskytující v trávicím traktu. Tyto látky by ovšem neměly interagovat s uvolňující se léčivou látkou. Ohled by měl být brán i na dobu setrvání léčivého přípravku v jednotlivých částech GIT a na patologické změny ph způsobené onemocněním trávicího traktu. Například ulcerózní kolitida nebo Crohnova choroba snižují fyziologickou hodnotu ph v distální části tlustého střeva na 4-6 (7). Tabulka 1: Hodnoty ph v jednotlivých částech trávící soustavy, doba průchodu a návrh hodnot ph disolučního média (7) Část GIT Doba průchodu Fyziologické hodnoty ph Návrh ph pro disoluční test ph hodnoty u pacientů s Crohnem a ulcerózní kolitidou Návrh ph pro disoluční test u pacientů s Crohnem a ulcerózní kolitidou Žaludek 1-5 hod 1,2-5 1,2 1,55-4,4 3,0 Dvanáctník 5-60 min 4,5-6,5 5,5-5,5 Proximální tenké střevo Distální tenké střevo Tlusté střevo - 6-7 6,8 6,3-7,2 6,8 3-5 hod 6,5-7,5 6,8 a 7,5 6,8-8,3 7,5 15-72 hod 5,5-8 6,8 4-6 4 a 6 6.1.3 Disoluce tablet Disoluční testování tablet nám pomáhá při výběru vhodné lékové formulace, při její optimalizaci a při monitorování její stability (9). V poslední době se navíc rozmáhá trend lékových forem s prodlouženým uvolňováním a disoluce nám poskytuje důležitý odhad chování této formy in vivo (10). K testování disoluce pevných lékových forem se vyžívají hlavní čtyři typy přístrojů a to přístroj s košíčkem, přístroj s míchadlem, přístroj s vratným válcem a přístroj s průtokovou celou. Každý má své výhody i nevýhody. V počátcích testování byl velmi populární přístroj s košíčkem, ale díky vývoji lékových forem s modifikovaným uvolňováním ho nahradily ostatní aparáty (11). Pro lékové formy se zrychleným uvolňováním se využívá přístroj s míchadlem. Jeho výhodou je jednoduché použití, reprodukovatelnost a hydrodynamika. Pro lékové formy s prodlouženým uvolňováním je vhodný přístroj 11

s vratným válcem a přístroj s průtokovou celou, protože umožňují v průběhu testování měnit ph disolučního média. Přístroj s vratným válcem je díky jeho jednodušší instalaci, obsluze a odběru vzorků preferován. Pro disoluci těžce rozpustných léčiv se využívá přístroj s průtokovou celou díky možnosti kontinuálního přívodu nového disolučního média během testování (6). Obrázek 1: Plně automatizovaný disoluční systém AT70 od firmy Sotax (12) 6.1.4 Disoluce transdermálních přípravků Termín transdermální systém se používá pro přípravky, které po jejich aplikaci na kůži řízeně uvolňují do cirkulace léčivou látku. V poslední době zažívají ve farmacii významný rozvoj. Kromě charakteristického formátu kožní náplasti se transdermální systémy odlišují mechanismem uvolnění léčiva do organismu. Např. uvolnění léčiva z tablety probíhá v několika fázích tablety se nejprve dezintegrují na agregáty, ty se dál deagregují na částice a ty se poté disolvují do roztoku. Naopak transdermální systémy již obsahují roztok léčiva v polymerech, který se difuzí přímo vstřebává do organismu. Nejjednodušší model systému se skládá z jedné vrstvy zásobníku léčiva a z krycího filmu. Léčivo je dispergováno a disolvováno do monolitu tvořeného polymerem, ze kterého se difunduje do cirkulace. Množství uvolněného léčiva je závislé na povrchu plochy, difuzním koeficientu léčiva, tloušťce polymerního monolitu 12

a na koncentraci léčiva v polymeru. Složitější model systému obsahuje navíc vrstvu, která kontroluje míru uvolňování a další adhezivní vrstvu (13). Přestože bylo ke studiu disoluce léčiv z transdermálních náplastí využito několik různých metod a aparátů, jako nejvhodnější se osvědčila disková metoda, metoda s extrakční celou a metoda s rotačním válcem (14). Nejčastěji využívanou je disková metoda díky snadné reprodukovatelnosti (15). Navzdory rozdílům v designu fungují testovací přístroje na stejném principu. Transdermální náplast se uchytí na pevnou oporu a ponoří se do disolučního média (16). ph disolučního média by se mělo pohybovat v rozmezí 5-6, aby napodobilo fyziologické podmínky kůže (8). Teplota by měla být 32±0,5 C, i když po přilepení transdermální náplasti může být teplota kůže zvýšená. Obrázek 2: Přístroj s extrakční celou (17) 6.1.5 Disoluce lipofilních tuhých lékových forem Zkouška disoluce tuhých lipofilních lékových forem je určena k testování lipofilních čípků a měkkých želatinových tobolek s lipofilním obsahem. K disolučním zkouškám měkkých želatinových tobolek se využívá přístroj s košíčkem, přístroj s pádlem nebo speciálně upravený přístroj s průtokovou celou (18). Kvůli lipofilní povaze léčiv se do disolučního média přidávají povrchově aktivní látky, které usnadňují disoluci léčiv. Nevýhodou je možná zkřížená reakce nebo tvorba komplexů léčiva s tenzidy obsaženými v disolučním médiu (19-20). Alternativou tenzidů je použití většího objemu disolučního média nebo použití směsi s ethanolem ve funkci kosolventu (21-23). Nevýhodou lékopisných zkoušek je nedostatečná definice 13

disolučních podmínek pro disolučního média. Odebírání vzorků proto může být složité. Jedním z možných řešení tohoto problému je použití přístroje s průtokovou celou, který má lépe definované podmínky průtoku. Odběr vzorku je snadný, protože léčivá látka je oddělena od pomocných látek nepřetržitou extrakcí a filtrováním. Standardní přístroj s průtokovou celou není vhodný pro měkké želatinové tobolky, protože po prasknutí tobolky se olejovitá kapalina dostává rychle do filtru v horní části přístroje a ucpává ho. Speciální přístroj s průtokovou celou upravený pro lipofilní obsah tobolek funguje jinak než standardní. Disoluční médium se přivádí z pravé strany cely doleva, vytlačuje z kapiláry vzduch a pokračuje k filtru. Poté co kapsle praskne v pravé straně cely, lipofilní složka stoupá k hladině díky malé hustotě. Jakmile dosáhne trojúhelníkového prostoru v levé straně cely, zůstane v něm. Takto disoluční médium nepřetržitě extrahuje léčivo z lipofilního obsahu kapsle (24). Obrázek 3: Průtoková cela upravená pro použití lipofilních kapslí (17) 14

Podobně jako u měkkých želatinových kapslí je i u lipofilních čípků těžké najít vhodnou metodu disolučního testování. Hlavním problémem je deformace a tání čípku v disolučním médiu. Lipofilní čípky uvolňují v konečníku léčivou látku poté, co roztají. Tání čípků je významně ovlivněno teplotou v konečníku. Léčivo se v konečníku rozděluje mezi lipofilní bázi čípku a fyziologickou tekutinu. Pro in vitro testování je potřeba znát teplotu tání lipofilní báze čípku a teplotní podmínky musí být napodobovat fyziologické podmínky v konečníku. Využívá se modifikovaného přístroje s pádlem, přístroje s košíčkem s kovovou mřížkou a přístroj s průtokovou celou stejný jako u měkkých želatinových kapslí (25). 6.2 Bioadheze Bioadheze bývá definována jako přilnutí materiálu k podkladu, přičemž alespoň jeden z nich má biologický původ. V případě bioadhezivního systému uvolňujícího léčivo adheze často vzniká mezi pomocnou látkou a biologickým substrátem (26). Bioadheze se dělí do tří typů. Prvním typem je adheze mezi dvěma biologickými materiály, např. agregace krevních destiček k otevřené ráně. Druhým typem je adheze biologického substrátu k umělému povrchu, např. adheze buněk ke kultivačnímu médiu nebo tvorba biofilmu na protézách. Třetím typem je adheze umělého povrchu k biologickému substrátu, např. adheze hydrogelu k měkké tkáni nebo adheze zubní výplně k zubní sklovině (27-28). Termín bioadheze se používá již několik desítek let. Původně byl používán složený termín biologická adheze, který byl spojován s adhezí buněk k různým materiálům. V 70. letech se studie zaměřovaly na výzkum biologických materiálů a informovaly o velkém významu bioadheze a biokompatibility. Myšlenka využití bioadhezivních materiálů v lékových formách se objevila na počátku 80. let. Cílem bylo vynalézt systém podávání léku, který by díky prodlouženému styku s absorpční vrstvou mohl zvýšit lokální i systémový účinek (29). Pojem mukoadheze se používá v případě, že bioadhezivní materiál přilne k mukózní vrstvě pokryté hlenem. Mukoadheze je tedy podskupina bioadheze, tyto dva termíny však bývají v odborné literatuře často zaměňovány. V 80. létech se koncept mukoadheze dostával stále více do podvědomí odborné sféry. Nyní se mukoadhezivní a bioadhezivní systémy používají k podání nosnímu, očnímu, bukálnímu, vaginálnímu, rektálnímu i perorálnímu (26). 15

6.2.1 Teorie bioadheze Na základě studia adheze polymerů vzniklo 6 základních teorií vzniku bioadheze. Obrázek 4: Schéma teorií bioadheze Teorie bioadheze Chemická Elektronová Fyzikální Adsorbční Smáčecí Difúzní Frakční Mechanická Elektronová teorie Je založena na předpokladu, že bioadhezivní materiál a biologický substrát mají opačný náboj. Když tedy přijdou do kontaktu, dojde mezi nimi k přenosu elektronů, které způsobují vznik elektronové dvojvrstvy na povrchu obou materiálů. Bioadhezivní sílu zajišťují přitažlivé síly v této elektronové dvojvrstvě. Adsorpční teorie Podle adsorpční teorie bioadhezivní systém adheruje k biologické vrstvě díky chemickým interakcím jako jsou Van der Waalsovy síly, vodíkové můstky, přitažlivé elektrostatické síly nebo hydrofobní interakce. Například vodíkové můstky převládají u polymerů obsahující karboxylovou skupinu. Přestože jsou tyhle chemické interakce samy o sobě slabé, ve velkém počtu vedou k intenzivní adhezi (30). Smáčecí teorie Smáčecí teorie je spojována s kapalnými bioadhezivními systémy, které se rozprostírají po biologickém substrátu, a tím vzniká adhezivní síla. Afinita kapaliny k biologickému povrchu může být změřena pomocí rozprostíracího koeficientu a kontaktního úhlu. Platí zde pravidlo, že čím menší je kontaktní úhel, tím silnější vzniká adhezivní síla. Rozprostírací koeficient lze vypočítat podle vztahu: (1) kde γa je povrchová energie kapaliny, γa je povrchová energie pevného biologického substrátu a γa je mezipovrchová energie mezi kapalinou a biologickým substrátem. 16

Aby se kapalina samovolně rozprostírala po povrchu pevného biologického substrátu, hodnota rozprostíracího koeficientu musí být kladná. Adhezivní práce představuje energii potřebnou k odtržení obou fází a je dána vztahem: (2) Čím vyšší jsou jednotlivé povrchové energie materiálů oproti mezipovrchové energii, tím větší je adhezivní síla (31). Difúzní teorie Popisuje interdifúzi polymerních řetězců adheziva do biologické membrány. Tento proces se řídí koncentračním spádem a je ovlivňován velikostí přítomných molekulárních řetězců a jejich možností se pohybovat. Hloubka penetrace řetězců závisí na difúzním koeficientu a na době kontaktu (31). Obrázek 5: Schéma difúzní teorie proplétání molekulárních řetězců (32) Frakční teorie Tato teorie je nejčastěji využívána při mechanickém měření bioadheze. Zkoumá sílu potřebnou k oddělení obou povrchů během vzájemné adheze. Tato síla je popsána následujícím vztahem: (3) Kde F m je maximální odtrhávací síla a A 0 je povrch kontaktní plochy. Frakční teorie nepočítá s interdifúzí ani s penetrací polymerních řetězců. Proto je vhodné ji využívat v případě měření vlastností tuhých nebo polotuhých bioadhezivních materiálů, u kterých nedochází k penetraci polymerních řetězců. Mechanická teorie Mechanická teorie předpokládá vznik adheze díky vyplňování nepravidelností v nerovném povrchu. Nerovnosti na povrchu biologického substrátu navíc zvětšují plochu pro adhezi, čímž zároveň napomáhají k rozptýlení energie (30). 17

6.2.2 Mechanismus bioadheze Bioadhezivní děj má tři fáze. První fází je kontakt mezi povrchem biologického substrátu a bioadhezivem. Aby došlo k vzájemnému kontaktu, je nezbytné, aby byl povrch sliznice vlhký. Ve druhé fázi dochází k penetraci adheziva do povrchu biologického substrátu a dochází k vzájemnému proplétání oligosacharidových řetězců glykoproteinu mucinu s volnými zakončeními adhezivního polymeru. Ve třetí fázi interaguje adhezivum s hlenem na povrchu sliznice pomocí vodíkových můstků. Původní rozhraní dvou povrchů zaniká a snižuje se celková povrchová energie. Vzniká pevná gelovitá formace (32). Obrázek 6: Fáze bioadheze (32) 6.2.3 Faktory ovlivňující bioadhezi Hydrofilní vlastnosti Bioadhezivní polymery obsahují obvykle různé hydrofilní skupiny jako karboxylová nebo hydroxylová skupina. Tyto skupiny umožňují vznik vodíkových můstků k biologickému substrátu. Dále umožňují bobtnání polymeru ve vodném médiu, čímž lze dosáhnout maximální expozice povrchu polymeru k povrchu substrátu. Nabobtnalé polymery mají maximální vzdálenost mezi jednotlivými řetězci v molekule, která vede k lepší flexibilitě a penetraci do substrátu (28). Molární hmotnost Polymery s nižší molární hmotností mají lepší schopnost interdifúze, zatímco polymery s vyšší molární hmotností mají zase lepší schopnost proplétání se do řetězců substrátu. Optimální molární hmotnost k dosažení maximální možné adhezivní síly závisí na konkrétním typu polymeru (33). 18

Hodnota ph Hodnota ph může ovlivnit formální náboj vlhkého povrchu biologické membrány a také ionizaci adhezivní látky. Při různých hodnotách ph dochází k rozdílům v disociaci funkčních skupin sacharidů a proteinů tvořících hlen na sliznici a tím se mění hodnota náboje hlenu (34). Koncentrace Koncentrace polymeru má velký vliv na adhezivní sílu. Optimální koncentrace závisí na fyzikálních vlastnostech systému s patrnými rozdíly mezi pevným a polotuhým skupenstvím. V polotuhém systému existuje pro každý polymer optimální koncentrace. Jiná koncentrace může způsobit nedostatek polymerních řetězců potřebných pro interpenetraci do substrátu a tím se sníží i adhezivní síla. V tuhém sytému platí, že čím větší je koncentrace polymeru, tím je větší adhezivní síla (35). 6.2.4 Struktura, funkce a složení mukusu Mukus je komplex viskózního adhezivního sekretu, který je syntetizován speciálními pohárkovitými buňkami. Pohárkovité buňky jsou žlázovité sloupkovité epiteliální buňky pokrývající všechny orgány těla, které jsou vystaveny vnějšímu prostředí. Mukus má hned několik funkcí, patří mezi ně především lubrikace sliznice, hydratace epiteliální vrstvy, bariérová funkce chránící před patogeny a škodlivými látkami a zajištění průchodu plynů skrz epiteliální vrstvu (36). Jednotlivé složky mukusu jsou hojně rozšířeny v přírodě. Např. žirafy si na jazyk pokrytý velkou vrstvu mukusu lepí listy akátu a tím je odtrhávají (37). Mukus je z více jak 95 % tvořen vodou a mucinem, což jsou glykoproteiny vysoké molekulové hmotnosti v rozmezí 2-14x10 6 g/mol. Dalšími složkami jsou proteiny, lipidy, mukopolysacharidy, imunoglobulin A, lysozomy a laktoferin (38). Mucinové glykoproteiny tvoří zapletenou síť makromolekul, které se navzájem vážou nekovalentními vazbami. Tato síť se nachází v centru struktury mucinu a je zodpovědná za jeho reologické vlastnosti. Přítomná kyselina sialová a sulfátové skupiny způsobují, že se mucin při neutrálním ph chová jako anionický polyelektrolyt (39). Glykoproteiny mucinu se skládají ze základní stavební jednotky tvořené jednořetězcovým polypeptidem, který je rozdělen na dvě odlišné části. V centru struktury je hustě glykosylovaný protein, ke kterému se řetězce ostatních uhlovodíků připojují přes O-glykosylickou vazbu. Okraje tohoto proteinu tvoří řídce glykosylovaná místa, kterým se říká nahá oblast proteinu. 19

Obrázek 7: Struktura a interakce uvnitř glykoproteinu v mucinu (40) 6.2.5 Měření bioadheze Během studia bioadheze bylo vyvinuto několik různých metod měření. Některé z nich napodobují podmínky in vivo a jsou užitečné ke srovnávání různých materiálů a formulací bioadhezivních systémů. Další metody byly vynalezeny ke zkoumání mechanismu mukoadheze. Správnou metodu měření volíme podle toho, jakou zkoumáme lékovou formu a jaké informace o ní chceme získat. Výběr metody měření není jednoduchý a má velký vliv na kvalitu výsledků. Metody založené na měření síly nebo na měření práce potřebné k odtržení formulace od biologického povrchu dostatečně korelují s in vivo podmínkami, ale mohou podávat výsledky koheze kterékoliv z vrstev bioadhezivního komplexu. Tento problém lze řešit použitím měřící metody, při které simulujeme interpenetrační vrstvu. Výsledky však budou relevantní pouze v případě, že tato interpenetrační vrstva in vivo opravdu existuje a k odtržení dojde přímo v této vrstvě. Z praktického hlediska není tolik důležité, ve kterém místě k odtržení došlo, ale pokud chceme zkoumat a vyvíjet formulaci léčiva, je vhodné se hlouběji zaměřit na mechanismus děje. Vhodnou metodu proto volíme podle toho, 20

jestli se chceme co nejvíce přiblížit in vivo podmínkám, nebo se chceme spíše zaměřit na podrobný mechanismus děje (26). V případě, že si ke studiu bioadheze vybereme in vitro metodu, musíme zvolit i vhodný biologický substrát. Tím může být buď izolovaný mucin nebo vypreparovaná tkáň. Díky měření bioadheze na povrchu vypreparované tkáně dokážeme dokonale napodobit in vivo podmínky. Výsledky měření se liší podle různých zdrojů mukózní tkáně (41). Pro lékové formy, které adherují díky hydrataci vodou z biologického substrátu, lze beze změny výsledků zaměnit povrch mukózní tkáně jiným podobným materiálem (42). Alternativou k vypreparované tkáni je izolace mucinu. Čištěné muciny se vyrábí v prášku a před použitím musí být hydratovány. In vivo metody Tyto metody měření bioaheze jsou spíše vzácné. Jsou finančně i časově náročné a vzbuzují etické otázky. Některé in vivo metody monitorují bioadhezi značením adheziva látkou vyzařující gamma záření a následným použitím gamma-scintigrafie (43). Bioadhezivní polymery se mohou označit i barvením (44). Jiné monitorovací metody využívají ke značení radioizotopy (45). Nejčastěji se používají při analýze adhezivních systémů pro perorální podání (40). In vitro metody Pomocí in vitro metod měříme sílu potřebnou k odtržení bioadhezivního systému od biologického substrátu. K měření adhezivní síly využíváme nejčastěji peelingové, smykové a tahové zkoušky. Obrázek 8: Schéma měření adhezivní síly (26) 21

Peelingové zkoušky Jsou používány pro měření adheze bukálních a transdermálních přípravků, nejčastěji kožních náplastí a transdermálních náplastí. Smykové zkoušky Při smykových zkouškách je měřena síla, která umožňuje bioadhezivu klouzat rovnoběžně s kontaktní plochou. Příkladem smykové zkoušky je metoda s Wilhelmovou destičkou. Tuto metodu vypracoval Smart a kol. v roce 1984. (46) Skleněná destička obalená bioadhezivním materiálem zavěšená na mikrováhy se ponoří do temperovaného roztoku mucinu. Mikrováhy měří sílu potřebnou k vytažení destičky z roztoku mucinu (40, 47, 30). Obrázek 9: Schéma metody s Wilhelmovou destičkou (40) Tahové zkoušky Tahové zkoušky jsou velmi rozšířené a používají se pro testování širokého spektra bioadhezivních přípravků. Měří se síla potřebná k roztržení vazby mezi bioadhezivem a membránou. K měření se využívají speciální váhy nebo tenzní testery (40). Rheologické zkoušky Mnoho autorů se v odborné literatuře domnívá, že by reologický profil směsi bioadhezivního polymeru a mukusu mohl přinést dostatečně podobný model in vivo podmínkám (48). Studie udávají, že směsi bioadheziva a mukusu vykazují synergický reologický profil způsobený vzájemnými vazbami. Reologický profil se měří pomocí reometrů různých typů (40, 47). 22

6.2.6 Bioadheziva Většina bioadheziv jsou polymerní látky. Bioadhezivní polymery jsou ve vodě rozpustné i nerozpustné látky schopné bobtnat. Musí mít optimální polární vlastnosti, aby mohly být smáčeny mukusem. Dále musí mít optimální vlastnosti, které způsobí dostatečnou interpenetraci a interdifúzi do membrány. Mezi přírodní bioadhezivní polymery patří např. tragant, alginát sodný, guarová klovatina, xantanová klovatina, lektiny, želatina nebo pektin. Mezi syntetické bioadhezivní polymery patří deriváty celulosy např. metylcelulosa, hypromelosa (HPMC), polyakrylové polymery, povidon nebo polyvinylalkohol. Mukoadhezivní polymery dělíme na první a druhou generaci podle způsobu adheze (30). Bioadheziva první generace Jedná se o hydrofilní polymery, které adherují díky bobtnání a tím tvoří hydrogely. Hydrofilita těchto polymerů roste s počtem hydrofilních skupin. První generace se dále dělí na kationické, anionické a neionické polymery (49). Anionické polymery jsou z nich nejvíce rozšířené, protože jsou netoxické a mají univerzální využití. Charakteristická je pro ně přítomnost sulfátové nebo a karboxylové skupiny. Typickým příkladem jsou polyakryláty a jejich slabě zesíťované deriváty nebo karmelosa sodná sůl. Polyakryláty a karmelosa sodná sůl vykazují výborné adhezivní vlastnosti díky velkému množství vodíkových můstků (50). Nejpoužívanějšími deriváty polyakrylové kyseliny jsou polykarbofil a karbomery. Nejznámějším z kationických polymerů je bezpochyby chitosan. Chitosan je polysacharid, který vzniká deacetylací chitinu (51). Obrázek 10: Schéma vzniku chitosanu (52) Díky své schopnosti tvořit film je chitosan hojně používán v kosmetice. Chitosan adheruje k biologické membráně díky iontovým interakcím mezi primárními aminoskupinami chitosanu a sialovou a sulfátovou kyselinou mukusu (53). 23

Mezi neionické polymery patří hypromelosa, což je viskoelastický derivát celulosy. HPMC vytváří gel při vyšších teplotách, tomuto fenoménu se říká tzv. převrácená termoreverzibilita. Dalšími zástupci jsou hyetelosa nebo hyprolosa (49). Bioadheziva druhé generace Oproti první generaci nespecificky adherujících polymerů dokáží bioadheziva druhé generace specificky adherovat ke konkrétním strukturám biomembrány a proto jsou nazývána cytoadheziva. Mezi adheziva druhé generace patří např. lektiny, bakteriální proteiny a thiolované polymery (40). Lektiny jsou skupinou strukturálně odlišných proteinů a glykoproteinů, které se reverzibilně váží na uhlovodíkové zbytky (54). Přirozeně se vyskytují v organismech a hrají hlavní roli při rozpoznávání buněk a proteinů. Např. při infekčním onemocnění některé bakterie využívají lektiny k připojení se k buňkám hostitele. Díky jejich specifické cytoadhezi k danému biologickému substrátu je lze s výhodou využívat v bioadhezivních systémech. Po vytvoření mukoadhezivní vazby lektiny setrvávají na biologické membráně a v případě receptor-mediátorové adhezivní vazby si biologický materiál osvojuje lektiny pomocí endocytózy. Bioadhezivní systémy s lektiny tedy dokáží působit dvojím mechanismem. Obrázek 11: Schéma endocytózy léčivé látky z bioadhezivního systému (52) 24

Tyto systémy mohou kromě tvorby cílených vazeb zároveň kontrolovaně uvolňovat makromolekulární léčiva díky vychytávání léčiva buňkami (55). Přestože použití lektinů skýtá pozitiva v cílení adheze, mnohé z nich jsou jedovaté a imunogenní látky. Navíc efekt opakovaného podání lektinů není doposud řádně prostudován (54). Thiolované polymery jsou deriváty hydrofilních polymerů, mezi které patří např. polyakryláty, chitosan nebo deacetylovaná gelanová guma (56). Přítomnost thiolové skupiny dovoluje vznik kovalentní vazby s cysteinem obsaženým v mukóze, což zvyšuje dobu adheze a zlepšuje biodostupnost (57). Oproti adhezivům první generace nevede přítomnost kovalentní vazby u thiolovaných polymerů k citlivosti na změny ph (58-59). Patogenní bakterie velmi ochotně adherují k mukózní membráně v GIT. Tohoto fenoménu lze taktéž využívat při cílené adherenci bioadhezivních systémů. Ve studiích byla použita tzv. K99 fimbrie, což je protein derivovaný z E.coli. Ve srovnání s kontrolním vzorkem přítomnost upravených polymerů z fimbrií razantně zvyšuje in vitro adhezi k membráně (60). 25

7 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 7.1 Použité suroviny Čištěná voda (Faf UK HK) Mucin z prasečího žaludku typ III (Sigma Aldrich, USA) Oligoester kyseliny DL-mléčné a glykolové větvený 3% mannitolu (Faf UK HK) Ethylpyruvát (Sigma Aldrich, USA) Ethylsalicylát (Sigma Aldrich, USA) Methylsalicylát (Sigma Aldrich, USA) Triethylcitrát (Sigma Aldrich, USA) Kyselina citronová monohydrát (Lachema, Brno) Hydrogenfosforečnan disodný dodekahydrát (Dr. Kulich Pharma, s.r.o., HK) Aciklovir (Zentiva) Aceton (Lachema, Brno) 7.2 Použité přístroje Analytické digitální váhy KERN ABS 220-4, max. 220 g, d = 0,1 mg Digitální stolní ph metr, HANNA HI 221 Digitální stopky DS 35, ZPA Pragotron Digitální váhy KERN 440-35N, max. 400 g, d = 0,01 g Horkovzdušná sušárna, Memmert Spektrofotometr Specord 205 UV VIS, Analytik Jena, SRN Třepačka s vodní lázní, GFL 1083, Analytik Jena, SRN Materiálový zkušební stroj T1-FR050TH.A1, Zwick/Roell 26

7.3 Příprava fosfátcitrátového pufru o ph 7,4 pro mukoadhezivní test Smíchaním 0,1 M roztoku kyseliny citronové (roztok A) s 0,2 M roztokem hydrogenfosforečnanu disodného dodekahydrátu (roztok B) bylo připraveno 2000 ml fosfátcitrátový pufr ph 7,4. Roztok A byl připraven ze 4,12 g kyseliny citronové doplněné čištěnou vodou na objem 196 ml. Roztok B byl připraven z 129,16 g hydrogenfosforečnanu sodného doplněným destilovanou vodou na 1804 ml. 7.4 Sestrojení kalibrační přímky acikloviru Byla sestrojena kalibrační přímka acikloviru. Rozpuštěním acikloviru v čištěné vodě byly připraveny roztoky o koncentracích 25, 20, 15, 10, 5 a 1 mg/l. Bylo zjištěno absorpční maximum acikloviru. Poté byla naměřena absorbance řady roztoků acikloviru při vlnové délce 256 nm proti čištěné vodě. Z naměřených hodnot absorbancí byla sestrojena kalibrační přímka. Výsledná rovnice kalibrační přímky acikloviru je: y = 0,0616x + 0,0045 (4) Tabulka 2: Naměřené hodnoty absorbance roztoků acikloviru Koncentrace acikloviru [mg/l] A 25 1,546 20 1,236 15 0,927 10 0,621 5 0,312 1 0,067 27

Obrázek 12: Kalibrační přímka acikloviru 1,8 1,6 1,4 1,2 y = 0,0616x + 0,0045 R 2 = 1 A 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 5 10 15 20 25 30 c [mg/l] 7.5 Příprava substrátu pro disoluční a adhezivní test Jako modelový substrát pro mukoadhezivní test byl zvolen mucin z prasečího žaludku typ III. K 3,0 g mucinu bylo postupně za stálého míchání přidáno 6,0 ml fosfátcitrátového pufru. 7.6 Příprava matric pro disoluční a adhezivní test Na katedře farmaceutické technologie byl syntetizován větvený oligoester z reakční směsi s ekvimolárním množstvím kyseliny glykolové a kyseliny DL-mléčné. Jako větvící složka byl použit mannitol v koncentraci 3 %. Větvený oligoester byl roztaven v horkovzdušné sušárně při 80 C a následně do něj byly přidány jednotlivé plastifikátory v předem daných koncentracích (viz. tabulka 3). Do roztavených nosičů bylo dále inkorporováno léčivo aciklovir v 5 % koncentraci. 28

Tabulka 3: Složení matric Matrice 1 Nosič Plastifikátor 30 % Triethylcitrátu Terpolymer kyseliny D,Lmléčné, kyseliny glykolové a mannitolu (48,5:48,5:3) 2 3 4 5 Léčivo 20 % Ethylpyruvátu 20 % Ethylsalicylátu 5% acikloviru 20 % Methylsalicylátu 30 % Ethylpyruvátu 7.7 Disoluční test oligoesterových matric Na korkový podklad o průměru 4,5 cm bylo naneseno přibližně 0,55 g hydratovaného mucinu, který byl důkladně rozetřen do tenké vrstvy. Podklad s vrstvou mucinu byl vytárován a následně na něj byla nanesena vrstva oligoesterové matrice o hmotnosti 5,50 g. Jednotlivé podklady s matricemi byly pomocí pinzety vloženy na dno disolučních nádob a byly zality 20,0 ml fosfátcitrátového pufru. Pro oligoesterovou matrici plastifikovanou 30 % ethylpyruvátu byl použit místo korkového podkladu plastový podklad o průměru 5 cm, opatřený hydrofilní gázou. Místo 20 ml pufru bylo použito 40 ml pufru. Disoluční nádoby byly vloženy do třepací vodní lázně temperované na 37 C, která se pohybovala frekvencí 50 min-1 s amplitudou 22 mm. V časových intervalech 15, 30, 60 a 90 minu byl proveden odběr vzorků z disoluční kapaliny. Odebrané vzorky s uvolněným aciklovirem byly zbaveny nečistot filtrací a následnou centrifugací rychlostí 6000 ot/min po dobu 10 minut. U vzorků byla pomocí spektrofotometru Specord proměřena absorbance. Měření absorbance vzorků bylo provedeno při vlnové délce λmax = 256 nm a jako slepý vzorek byl použit fosfácitrátový pufr. Na základě výsledků naměřené absorbance bylo vypočteno množství acikloviru uvolněného z podkladu v daných časových intervalech. Množství acikloviru uvolněného z oligoesterové matrice do použitého objemu disoluční kapaliny bylo vypočteno dle následujícího vztahu: (5) kde A je naměřená hodnota absorbance, V je objem použitého pufru a D ředění vzorku. Ve vztahu byly použity hodnoty z rovnice kalibrační přímky acikloviru. 29

Procentuální podíl uvolněného acikloviru byl vypočten dle následujícího vztahu: (6) kde c je vypočtená koncentrace uvolněného acikloviru [mg/ml] dle vztahu (5) a q je celkové množství acikloviru v matrici. Byl sestrojen graf závislosti uvolněného množství acikloviru v % na čase. Obrázek 13: Spektrofotometr Specord 250 (61) 7.8 Testování adhezivní síly Na korkový podklad o poloměru 1,325 cm bylo v tenké vrstvě rozetřeno 0,20 g hydratovaného mucinu. Byl vypočten obsah plochy podkladu v [cm 2 ] dle vztahu: (7) Na horní mobilní plochu zkušebního přístroej bylo naneseno 0,20 g oligoesterové matrice. Test adhezivní síly byl proveden s oligoesterovými matricemi plastifikovanými 20 % ethylpyruvátu a 20 % ethylsalicylátu. Materiálovým zkušebním strojem byla naměřena maximální síla v Newtonech potřebná k odtržení adhezivního vzorku od podkladu. Kontaktní doba byla 10 minut, kontaktní síla 10 N a rychlost odtržení od podkladu byla 100 mm/min. Výsledky byly přepočteny na velikost kontaktní plochy S a vyjádřeny v N.cm -2. Přepočet síly na plochu je dán následujícím vztahem: (8) Kde F adh je adhezivní síla vztažená na jednotku plochy [N.cm -2 ], F max je maximální síla potřebná pro odtržení adheziva od podkladu v [N] a S je kontaktní plocha [cm 2 ]. Byla stanovena průměrná hodnota adhezivní síly pro každou matrici. 30

Obrázek 14: Materiálový zkušební strojt1-fr050th.a1k firmy Zwick/Roell 31

8 VÝSLEDKY 8.1 Výsledky disoluce acikloviru Tabulka 4: Množství acikloviru uvolněného z oligoestrové matrice plastifikované 30 % triethylcitrátu čas [min] A ředění 15 30 60 90 ACV [mg/20ml] ACV % 2,1336 1 0,6942 21,48 1,9578 1 0,6371 19,65 0,8941 1 0,2918 8,99 1,0703 1 0,3490 10,74 0,8602 1 0,2807 8,65 0,8806 1 0,2874 8,79 0,3675 1 0,1208 3,71 0,3411 1 0,1122 3,42 ACV % průměr kumulativní % 20,52 20,52 9,88 30,40 8,70 39,12 3,57 42,69 Tabulka 5: Množství acikloviru uvolněného z oligoesterové matrice plastifikované 20 % ethylpyruvátu čas [min] A ředění 15 ACV [mg/20ml] ACV % 0,3886 10 1,2763 39,31 0,421 10 1,3815 42,31 ACV % průměr kumulativní % 40,81 40,81 30 60 90 0,8129 1 0,2654 8,21 0,6364 1 0,2081 6,42 0,3009 1 0,0992 3,06 0,3007 1 0,0991 3,04 0,477 1 0,1563 4,80 0,2557 1 0,0845 2,59 7,32 48,13 3,05 51,18 3,70 54,87 32

Tabulka 6: Množství acikloviru uvolněného z oligoesterové matrice plastifikované 20 % ethylsalicylátu čas [min] A ředění 15 ACV [mg/20ml] ACV % 0,1896 1 0,0630 1,94 0,2143 1 0,0710 2,19 ACV % průměr kumulativní % 2,07 2,07 30 60 90 0,7776 1 0,2539 7,81 0,6534 1 0,2136 6,62 2,2342 1 0,7269 22,23 2,1553 1 0,7012 21,66 0,3803 1 0,1249 3,88 0,3799 1 0,1248 3,81 7,22 9,24 21,95 31,14 3,85 34,97 Tabulka 7: Množství acikloviru uvolněného z oligoesterové matrice plastifikované 20 % methylsalicylátu čas [min] A ředění 15 ACV [mg/20ml] ACV % 0,9352 1 0,3051 9,30 0,9344 1 0,3048 9,29 ACV % průměr kumulativní % 9,27 9,30 30 60 90 0,6681 1 0,2184 6,64 0,6361 1 0,2080 6,45 0,5840 1 0,1911 5,87 0,5235 1 0,1714 5,23 0,4769 1 0,1563 4,81 0,4479 1 0,1469 4,61 6,53 15,84 5,53 21,39 4,69 26,10 33

% acikloviru Tabulka 8: Množství acikloviru uvolněného z oligoestrové matrice plastifikované 30 % ethylpyruvátu čas [min] A ředění 15 ACV [mg/20ml] ACV % 0,398 1 0,2614 7,98 0,3806 1 0,2501 7,67 ACV % průměr kumulativní % 7,80 7,83 30 60 90 0,371 1 0,2438 7,55 0,3888 1 0,2554 7,81 0,3927 1 0,2579 8,02 0,3854 1 0,2532 7,82 0,3763 1 0,2473 7,71 0,3791 1 0,2491 7,61 7,65 15,51 7,89 23,34 7,63 31,09 Obrázek 15: Průběh liberace acikloviru z oligoesterové matrice plastifikované 30 % triethylcitrátu 60 50 40 30 20 10 0 0 15 30 45 60 75 90 čas [min] 34

% acikloviru % acikloviru Obrázek 16: Průběh liberace acikloviru z oligoesterové matrice plastifikované 20 % ethylpuryvátu 60 50 40 30 20 10 0 0 15 30 45 60 75 90 čas [min] Obrázek 17: Průběh liberace acikloviru z oligoesterové matrice plastifikované 20 % ethylsalicylátu 60 50 40 30 20 10 0 0 15 30 45 60 75 90 čas [min] 35

% acikloviru % acikloviru Obrázek 18: Průběh liberace acikloviru z oligoesterové matrice plastifikované 20 % methylsalicylátu 60 50 40 30 20 10 0 0 15 30 45 60 75 90 čas [min] Obrázek 19: Průběh liberace acikloviru z oligoesterové matrice plastifikované 30 % ethylpyruvátu 60 50 40 30 20 10 0 0 15 30 45 60 75 90 čas [min] 36

% acikloviru Obrázek 20: Porovnání množství acikloviru uvolněného po 90 minutách disolučního testu 60 50 40 30 20 10 0 3M + 30% TEC 3M + 20% EP 3M + 20% ES 3M + 20% MS 3M + 30% EP 37

8.2 Výsledky testování adhezivní síly Tabulka 9: Naměřené hodnoty odtrhávací síly u oligoesterové matrice plastifikované 20 % ethylpuryvátu měření F max [N] S F adh [N.cm -2 ] S 1 10,57 1,92 2 8,68 1,58 3 9,90 1,80 0,74 4 10,35 1,88 0,12 5 9,68 1,76 9,84 1,79 Tabulka 10: Naměřené hodnoty odtrhávací síly u oligoesterové matrice plastifikované 20 % ethylsalicylátu měření F max [N] S F adh [N.cm -2 ] S 1 7,40 1,35 2 5,25 0,95 3 7,89 1,43 1,80 4 8,46 1,54 0,2 5 7,64 1,39 7,24 1,32 38

Obrázek 21: Záznam z měření adhezivní síly oligoesterové matrice plastifikované 20 % ethylpuryvátu 39

Obrázek 22: Záznam z měření adhezivní síly oligoesterové matrice plastifikované 20 % ethylsalicylátu 40

9 DISKUZE 9.1 Vliv metodiky na výsledky disolučního testu Podle zkušeností z dříve vypracovaných diplomových prací byl jako podkladový materiál pro disoluční test zvolen korek. Tento savý materiál byl jako podklad použit při disoluční zkoušce u čtyř matric. U oligoesterové matrice plastifikované 30 % EP bylo po návrhu obměny jako podklad zvoleno plastové kolečko obalené hydrofilní gázou. Z oligoesterové matrice plastifikované 20 % EP, u které byl použit korkový podklad, se v prvních 15 minutách uvolnilo o 33 % více acikloviru než u oligoesterové matrice plastifikované 30 % EP. Po 90 minutách se z oligoesterové matrice plastifikované 20 % EP uvolnilo o více jak 20 % acikloviru. Tento výsledek neodpovídá předpokladu, že se zvyšující koncentrací plastifikátoru se snižuje viskozita oligoesteru a léčivo se z něj uvolňuje rychleji. Obměna podkladu pro disoluční zkoušku mohla ovlinit její průběh. Pro stanovení množství uvolněného acikloviru bylo zvoleno spektrofotometrické měření. Přestože byly odebrané vzorky důkladně přefiltrovány a odstředěny po dobu 10 min v centrifuze, zbyla ve vzorku rezidua z použitého biologického substrátu a z podkladu. Projevilo se to především znečištěním křemíkových kyvet, ve kterých byl vzorek proměřován. Během měření absorbance vzorku ve spektrofotometru potom kvůli nečistotám docházelo k odchylkám hodnot. Delší doba centrifugace by mohla snížit množství nečistot ve vzorku. 9.2 Vliv plastifikátoru na mukoadhezivní test Plastifikátory jsou využívány za účelem snížení teploty skelného přechodu oligoesteru a snížení dynamické viskozity. Snížení teploty skelného přechodu u polymeru je výhodné jednak kvůli lepší aplikovatelnosti a zpracovatelnosti a také kvůli snazší inkorporaci termolabilních léčiv. Aby plastifikátory mohly být použity k plastifikaci polymerů v bioadhezivních systémech, musí být biokompatibilní a biodegradabilní. Výhodou je multifunkčnost plastifikátoru. Ethylpyruvát má antioxidační a protizánětlivé účinky, methylsalicylát a ethylsalicylát mají antiseptické, protizánětlivé a analgetické účinky. 41

% acikloviru Obrázek 23 : Srovnání průběhu liberace acikloviru z testovaných matric 60 50 40 30 20 10 0 0 15 30 45 60 75 90 TEC EP 20% ES MS EP 30% Na obrázku 22 je znázorněno srovnání průběhu liberace acikloviru z testovaných matric, které se lišily typem a koncentrací použitého plastifikátoru. Z výsledků mukoadhezivního testu je patrné, že nejrychleji se aciklovir uvolňoval z matrice plastifikované 20 % EP. Po 15 minutách se uvolnilo 41 % z celkového množství acikloviru, poté se rychlost uvolňování snížila. Po 90 minutách se z ní uvolnilo 55 % acikloviru. Podobný průběh s rychlým uvolňováním měla liberace acikloviru z matrice plastifikované 30 % TEC. Po 15 minutách se z matrice uvolnilo 21 % acikloviru, po 90 minutách 43 % acikloviru. Plastifikátory EP a TEC by mohly najít své uplatnění v bioadhezivních systémech, kde je žádoucí rychlejší nástup účinku léčiva. U matrice plastifikované 20 % ES se po 15 minutách uvolnilo pouze 9 % acikloviru, k výraznému zrychlení liberace došlo mezi 30 a 60 minutami. Plastifikace ES by mohla být použita u bioadhezivních systémů se zpožděným uvolňováním. Liberace z matric plastifikovaných 20 % MS a 30 % EP probíhala téměř lineárně. Liberace acikloviru z matrice plastifikované 30 % EP však mohla být ovlivněna změnou v metodice testu. Plastifikace MS by mohla být vhodná pro polymery v bioadhezivních systémech, u kterých je žádoucí postupné uvolňování. Po dobu aplikace těchto systémů by byla zajištěna kontinuální hladina léčivé látky v krvi. 42

9.3 Vliv plastifikátoru na adhezivní sílu Z naměřených hodnot adhezivní síly u oligoesterových matric plastifikovaných 20 % EP a 20 % ES vyplývá skutečnost, že matrice vykazují adhezivitu k modelovému podkladu. Matrice plastifikovaná EP vykazuje větší adhezivitu, což je pravděpodobně způsobeno lepší schopností EP snižovat dynamickou viskozitu systému. Dynamickou viskozitu ovlivňuje typ plastifikátoru i jeho koncentrace. K vysvětlení adheze plastifikovaných systémů lze uplatnit smáčecí a mechanickou teorii. Tyto systémy adherují k biologickému substrátu tak, že se rozprostírají po jeho povrchu a zakrývají jeho nerovnosti. V případě že by hodnoty dynamické viskozity systému byly příliš nízké nebo vysoké, nedocházelo by k potřebnému rozprostírání a k dostatečné adhezi nosiče. Použité koncentrace i typ plastifikátorů v předložené práci spadají do rozsahu hodnot, při kterých dochází k adhezi plastifikované matrice k substrátu. 43

10 ZÁVĚR Z výsledků získaných v experimentální části této diplomové práce je možné vyvodit níže uvedené závěry: 1. Plastifikované oligoesterové matrice vykazují v in vitro testu odtrhávací metodou adhezivitu na modelový mucinový substrát. 2. Při plastifikaci oligoesterové matrice 20 % ethylpyruvátu je adhezivní síla vyšší než při plastifikaci 20 % ethylsalicylátu. 3. Liberace acikloviru z plastifikovaných matric po aplikaci mucinový podklad je ovlivněna typem použitého plastifikátoru. 4. Nejrychleji se aciklovir uvolňuje z oligoesterové matrice plastifikované 20 % ethylpyruvátu. 44

11 SEZNAM LITERATURY 1. ŠNEJDROVÁ E., DITTRICH M. Poly(-hydroxykyseliny) jako nosiče léčiv. Chemické listy. 2011, 105(1), 27-33. ISSN 0009-2770 2. LÍBENKOVÁ M.. Testování bioadheze sprejově aplikovaných roztoků větvených oligoesterů, Diplomová práce. Hradec Králové : Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, 2013. 3. PRAJAPATI S., GAMIT A., PATEL A., SOLANKI J., KYADA Ch. Dissolution technology in pharmaceutical science. Indo American Journal of Pharmaceutical Research. 2013, 3(4), 3535-3564. ISSN 2231-6876 4. History. Dissolution solutions Network. [Online] [Citace: 16. 2 2014.] http://www.dissolutionsolutions.net/?page_id=38. 5. DOKOUMETZIDIS A., MACHERAS P. A century of dissolution research: From Noyes and Whitney to the Biopharmaceutics Classification System. International Journal of Pharmaceutics. 2006, 321, 1-11. ISSN 0378-5173 6. TADEY T., CARR G. Dissolution Testing for Solid Oral Dosage Forms. Pharmaceutical formulation and quality. 2009. ISSN 1531-2135 7. DVOŘÁČKOVÁ K., BAUTZOVÁ T., RABIŠKOVÁ M. Disoluční studie v hodnocení perorálních léků s řízeným uvolňováním. Chemické listy. 2011, 105(1), stránky 50-54. ISSN 0009-2770 8. SIEWERT M., DRESSMAN J., BROWN C.K., SHAH V.P. FIP/AAPS Guidelines to Dissolution/in Vitro Release Testing of Novel/Special Dosage Forms. Dissolution technologies. February 2003, 10(1), 6-15. ISSN 1521-298X 9. TONG Ch., LOZANO R., MAO Y., MIRZA T., LÖBENBERG R., NICKERSON B., GRAY V., WANG Q. The Value of In Vitro Dissolution in Drug Development: A Position Paper from the AAPS In Vitro Release and Dissolution Focus Group. Pharmaceutical technology. 2009, 4(33), 52-64. ISSN 1543-2521 10. FDA/CDER. Orally Disintegrating Tablets. U.S. Food and Drug Administration. [Online] 12 2008. [Citace: 13. 2 2014.] http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/gui dances/ucm070578.pdf. 11. HOA N.T., MICHOEL A., KINGET R. Dissolution testing of artemisinin solid oral dosage forms. International Journal of Pharmaceutic. 1996, 138, 185-190. ISSN 0378-5173 45