MĚŘENÍ ADHEZE PLASTIFIKOVANÝCH OLIGOESTERŮ IN VITRO

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické technologie MĚŘENÍ ADHEZE PLASTIFIKOVANÝCH OLIGOESTERŮ IN VITRO Diplomová práce Hradec Králové 2008 Lenka Veselá 1

2 Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Děkuji PharmDr. Evě Šnejdrové, Ph.D. za odborné vedení. Lenka Veselá 2

3 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE SEZNAM ZKRATEK TEORETICKÁ ČÁST BIOADHEZE TEORIE BIOADHEZE MECHANIZMUS BIOADHEZE FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ BIOADHEZI BIOADHEZIVNÍ POLYMERY SUBSTRÁTY PRO BIOADHEZI MUKOADHEZE MĚŘENÍ BIOADHEZE Metody in vivo Metody ex vivo Metody in vitro Další metody BIOADHEZIVNÍ LÉKOVÉ FORMY EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST POUŢITÉ SUROVINY: POUŢITÉ PŘÍSTROJE: Brookfieldův digitální viskozimetr model DV-E Materiálový zkušební stroj T1-FR050TH.A1K firmy Zwick/Roell PŘÍPRAVA VZORKŮ: POSTUP MĚŘENÍ: Měření viskozity Měření adheze VÝSLEDKY TABULKY Měření viskozity: Měření adheze: GRAFY Měření viskozity: Měření adheze: DISKUZE Dynamická viskozita plastifikovaných oligoesterů Adhezivita plastifikovaných oligoesterů ZÁVĚRY SOUHRN LITERATURA

4 1 ÚVOD Bioadheze je charakterizována jako jev, odehrávající se mezi substrátem a adhezivem, přičemţ alespoň jedna sloţka je biologicky ţivá. Adhezivum je schopné přilnout k substrátu adhezivními vazbami po určitou dobu. Bioadheze se v přírodě vyskytuje poměrně často, z lékařského hlediska je bioadheze např. důleţitou podmínkou patogenity bakterií na sliznicích nebo na zubní sklovině, dále je předstupněm vzniku trombózy, kdy na cévní stěnu adherují krevní destičky, nebo tvorby nových tkání na umělých orgánech nebo implantátech (např. srdeční chlopně, kyčelní klouby). Významnou roli v bioadhezi hraje vodné prostředí, které umoţňuje přilnutí k substrátu, zatímco v technické adhezi lepení znemoţňuje. Ve farmaceutické technologii se bioadhezivní syntetické nebo přírodní polymery vyuţívají k přípravě lékových forem se zvýšenou biodostupností léčiva a s řízeným uvolňováním léčiva, čímţ se zlepší compliance pacienta a sníţí se nutnost častých aplikací různými cestami podání, zejména injekčního podání, nebo k přípravě takových lékových forem, které umoţňují podání jinak pouze parenterálně aplikovatelných léčiv. K přípravě těchto lékových forem je výhodné pouţití biodegradabilních bioadhezivních látek, které jsou v organismu enzymaticky nebo neenzymaticky odbourávány a jejichţ degradační produkty jsou neškodné a z těla se snadno vylučují. Tyto přípravky se tedy z organismu nemusí odstraňovat. Volbou vhodných nosičů je moţné různé dávkování léčiva v závislosti na čase. Další výhodou těchto přípravků je relativně snadné začlenění léčivé látky do biodegradabilního adhezivního systému. Díky vysoké specifičnosti v místě účinku se tyto systémy vyuţívají při léčbě lokálního onemocnění, dále např. při hormonální léčbě. Adhezivní látky se ve zdravotnictví dále pouţívají např. jako součást obvazového materiálu na rány nebo při fixaci zubních protéz. 4

5 2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je studium reologických a adhezivních vlastností větvených terpolymerů kyseliny D,L-mléčné, glykolové a mannitolu (resp.dipentaerythritolu). Úkol diplomové práce je moţno rozdělit do těchto dílčích kroků: 1. Připravit vzorky pro měření viskozity a adheze: pro plastifikaci oligoesterů pouţít methylsalicylát v koncentraci 10%, 20%, 30%, 40% a 50%. 2. Na viskozimetru Brookfield DV-E s adaptérem pro malé mnoţství vzorku změřit viskozitu plastifikovaných oligoesterů při zvolené teplotě a za pouţití hřídele vhodné velikosti. 3. Na materiálovém zkušebním stroji T1-FR050TH.A1K firmy Zwick/Roell měřit adhezivní vlastnosti připravených vzorků jako maximální sílu F max v jednotkách Newton, potřebnou pro odtrţení vzorku od podkladu. 5

6 3 SEZNAM ZKRATEK 3D...Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 3% dipentaerythritolu 5D...Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 5% dipentaerythritolu 8D...Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 8% dipentaerythritolu 3M..Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 3% mannitolu 5M..Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 5% mannitolu 8M..Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 8% mannitolu 3M-8D %MS. oligoestery plastifikované 10-50% methylsalicylátu 6

7 4 TEORETICKÁ ČÁST 4.1 BIOADHEZE Bioadheze je definovaná jako přilnutí syntetického nebo přírodního materiálu - adheziva k mukóznímu či k epiteliálnímu povrchu ţivého organismu biologickému substrátu na určitou dobu. 1 Pokud dochází k bioadhezi na membráně pokryté vrstvou hlenu, jedná se o mukoadhezi. Buněčně specifická bioadheze je označována jako cytoadheze TEORIE BIOADHEZE V současné době existuje šest obecných teorií adheze, které byly pouţity při výzkumu a výkladu bioadheze, neboť zatím nebyla vytvořena jednotná, komplexní teorie, která by přesně popisovala bioadhezi. Elektronová teorie Adhezivní povrchy polymeru a substrátu se liší svojí elektronovou strukturou. V důsledku toho dochází při kontaktu obou adhezivních povrchů k elektronovému transferu, jehoţ výsledkem je vytvoření elektrické dvojvrstvy na mezipovrchu. 2,3,4 Díky přitaţlivým silám v této dvojvrstvě dochází k adhezi. Takový systém se chová analogicky jako kondenzátor, který je nabit, kdyţ dva povrchy přijdou do kontaktu, a vybit, kdyţ jsou odděleny. 5 k překonání vzniklého elektrického potenciálu. 6 Adsorpční teorie K separaci substrátu a adheziva je zapotřebí energie Bioadhezivní polymery adherují k substrátu působením povrchových sil mezi atomy obou povrchů. Jedná se hlavně o slabé interakce typu van der Waalsových sil a vodíkové vazby. Podskupinou této teorie je tzv. chemisorpční teorie, která říká, ţe interakce na mezipovrchu je dána silnými kovalentními 2,3,4 a iontovými vazbami. 7 Difúzní teorie Podstatou této teorie je vzájemná interdifúze a interpenetrace řetězců adheziva a substrátu do dostatečné hloubky s následným vytvořením semipermanentní adhezivní vazby. Hnací silou interpenetrace je koncentrační gradient na mezifázi. Rychlost penetrace závisí na difúzním koeficientu obou interagujících polymerů, který je dán molekulovou hmotností a hustotou zesítění. Neméně významnou roli hraje téţ pohyblivost segmentů řetězce, flexibilita bioadhezivního polymeru i mukózního 7

8 glykoproteinu a rozprostírací schopnost obou systémů. 8,9 Hloubka, do které řetězce pronikají, aby dosáhly dostatečné bioadheze, závisí také na difúzním koeficientu a na době kontaktu. Pro maximální difúzi a bioadhezivní sílu je důleţité, aby parametry solubility ( ) byly pro bioadhezivní materiál i glykoproteiny mucinu podobné. 7 U větvených polymerů probíhá interpenetrace rozlehlých řetězců s velkými obtíţemi. Teorie smáčení Tato teorie byla prvotně aplikovaná na kapalné systémy a vyuţívá povrchovou a mezipovrchovou energii. Zahrnuje schopnost kapaliny rozprostřít se spontánně po povrchu substrátu v důsledku těsného kontaktu obou povrchů, coţ je nezbytné pro adhezi. 2,3,4 Míra rozprostření je udávána rozprostíracím koeficientem S, který je hnací silou procesu smáčení. Rozprostírací koeficient S lze vypočítat ze vztahu: S A B AB AB (1) kde γ A je povrchové napětí (energie) kapaliny A, γ B je povrchové napětí pevné látky B a γ AB je mezipovrchové napětí mezi kapalinou a pevnou látkou. Hodnota S AB při rozprostírání musí být kladná. Pro adhezivní práci W A, definovanou jako energii nutnou pro odtrţení obou fází, platí: W A γ A γ B γ (2) AB Afinita kapaliny k povrchu je hodnocena měřením kontaktního úhlu kapaliny k povrchu substrátu, přičemţ platí, ţe niţší hodnota kontaktního úhlu má za následek vyšší afinitu kapaliny k substrátu, 2,3,4 čili kontaktní úhel mezi polymerem a buňkami se musí blíţit nule. Smáčený povrch je ovlivněn strukturální podobností, stupněm zesítění adhezivního polymeru nebo uţitím surfaktantu. 10 Mechanická teorie Jedná se o tzv. koncept zámek-klíč. Adheze vzniká mechanickým zapadáním kapalného adheziva do nepravidelností hrubého povrchu substrátu, který zajišťuje větší mezipovrch přístupný pro interakce spolu s lepším smáčením. Navíc vzrůstající drsnost povrchu zvyšuje i viskoelastickou a plastickou energii při porušeném nebo nedostatečném spoji. 4 Teorie lomu Tato teorie se liší od předešlých teorií tím, ţe adhezivní sílu vztahuje k silám nutným k odtrţení dvou povrchů účastnících se adheze. Předpokládá lom (porušení) adhezivní 8

9 síly na linii mezipovrchu, nikoli uvnitř nejslabšího komponentu, coţ je obvykle kohezivní linie uvnitř jednoho adherujícího povrchu. 2,3,4 Síla lomu, která je ekvivalentní adhezivní síle, je dána následující rovnicí: σ Eε L 1 2 (3) kde E je Youngův modul pružnosti, je energie lomu, a L je kritická délka v okamţiku, kdy dojde k oddělení dvou povrchů. Práce lomu elastomerní sítě G c je dána: G (4) 1 2 c K(M c ) kde K je konstanta závisející na hustotě polymeru, efektivním mnoţství, délce, flexibilitě jednotlivé hlenové řetězové vazby a vazebné disociační energii. G c roste s molekulovou hmotností M c vláken sítě MECHANIZMUS BIOADHEZE Mechanizmus bioadheze je zaloţen na přitaţlivých a odpudivých molekulárních silách. Obvykle je bioadheze popisována jako proces probíhající ve dvou krocích. Prvním krokem je vytvoření bezprostředního kontaktu mezi povrchy adheziva a substrátu hovoříme o kontaktní fázi. Následně dochází k interdifúzi a interpenetraci obou fází hovoříme o konsolidační fázi. 12 Obr. 1: Schématické znázornění adsorpce řetězců adhezivního polymeru (A) na glykoproteinovou strukturu hlenu (B) a jejich interpenetrace. 13 9

10 Obr. 2: Fáze bioadheze 14 V kontaktní fázi se uplatňují účinky povrchové energie a rozprostírací proces obou fází, hlenu a mukoadhezivního materiálu. Bezprostředního kontaktu je dosaţeno, pokud je hodnota rozprostíracího koeficientu S jedné ze dvou fází kladná. Rozprostírací koeficient vyjadřuje rozdíl mezi prací adheze W a a prací koheze W c jedné z těchto dvou fází. W a W S (5) c K rozprostírání adheziva na substrátu dochází, je-li S 0, tj. je-li adhezní práce větší neţ práce kohezní (přitaţlivé síly mezi molekulami kapaliny A a B jsou větší neţ přitaţlivé síly mezi molekulami v jednotlivých kapalinách). 12 Adheze označuje přilnavost a koheze soudrţnost materiálů. Konsolidační fáze zahrnuje vzájemné propletení řetězců obou fází na značné vzdálenosti. Řetězce polymerů obou fází interdifundují a výsledkem tohoto procesu je zesílení adhezních sil mezi oběma fázemi. Vzdálenost interpenetrace popisuje následující rovnice: s 2Dt (6) kde s je difúzní vzdálenost, D je difúzní koeficient a t je kontaktní čas. 12 Na molekulární úrovni dochází při bioadhezi k vytvoření vazeb mezi molekulami adheziva a substrátu (adsorpce molekul adheziva na molekuly substrátu). Uplatňují se elektrostatické a hydrofobní interakce, vodíkové vazby a van der Waalsovy síly. Funkční skupiny, které usnadňují adsorpci tvorbou vodíkových vazeb jsou karboxylové, hydroxylové, amidové a sulfátové skupiny. Polyanionty jsou upřednostňovány 10

11 před polykationty a karboxylové skupiny jsou pro mukoadhezi výhodnější neţ neutrální skupiny FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ BIOADHEZI 1) Vlastnosti polymeru - Molekulová hmotnost M W : Nízká molekulová hmotnost je výhodná pro interpenetraci molekul polymeru. Naopak vyšší molekulová hmotnost je důleţitá pro fyzikální propletení řetězců. Za optimální molekulovou hmotnost (práh bioadhezivity) se povaţuje molekulová hmotnost nejméně Da. Dále bioadhezivita roste se zvyšující se molekulovou hmotností pro lineární polymery, naopak bioadhezivní vlastnosti nelineárních struktur mají opačný trend v důsledku např. helixové konformace molekuly dextranu, která stíní ostatním adhezivním skupinám. 16 Většina pouţívaných bioadhezivních polymerů má molekulovou hmotnost vyšší neţ 1 milión Da, díky níţ se samy mohou jen velmi těţko absorbovat a jejich pouţití je tedy výhodné i z hlediska lékové bezpečnosti Flexibilita polymerního řetězce: Dostatečná ohebnost řetězců polymeru je důleţitá pro jejich interpenetraci a propletení s řetězci substrátu. U vysoce zesítěných polymerů klesá mobilita jednotlivých polymerních řetězců, coţ vede k poklesu bioadhezivních vlastností. 18,19 - Konformace a koncentrace polymeru: U kaţdého polymeru existuje určité optimální rozmezí koncentrací, při kterém je adheze maximální. Překračuje-li koncentrace polymeru toto rozmezí, klesá významně adhezivní vlastnost v důsledku stočení molekul s následnou separací látky od média a konečným omezením interpenetrace. 20 2) Podmínky v místě aplikace - ph: Hodnota ph má velký vliv na náboj povrchu hlenu i ionizaci bioadhezivních polymerů. Hlen můţe mít různou hustotu náboje v závislosti na ph, danou rozdílnou disociací funkčních skupin v cukerné části a aminokyselin hlavního polypeptidového řetězce. Podle některých studií je ph média důleţité pro stupeň hydratace zesítěných polyakrylových kyselin. Vzrůst hydratace nastává od ph 4,0 do 7,0 a poté dochází k náhlému poklesu úměrnému vzrůstu ph a iontové síle. Při vyšším ph jsou díky elektrostatickým silám karboxylových anionů tyto řetězce plně rozprostřeny. 21,22 11

12 - Doba kontaktu a tlak působení: Kontaktní čas mezi bioadhezivem a substrátem určuje stupeň bobtnání a interpenetrace bioadhezivních polymerních řetězců. Se vzrůstající dobou kontaktu roste i bioadhezivní síla. V gastrointestinálním traktu však nelze tyto faktory ovlivnit. Bioadhezi ovlivňuje i tlak vyvinutý na kontaktní plochu, který ovlivňuje hloubku interpenetrace polymeru s mucinem. Vysoký tlak po dostatečně dlouhou dobu zlepšuje adhezi mezi polymerem a substrátem Stupeň bobtnání: Stupeň bobtnání je závislý na koncentraci polymeru, iontové síle a přítomnosti vody. V experimentech probíhajících in vitro je maximální bioadheze úměrná optimálnímu mnoţství vody. Nadměrná hydratace způsobuje tvorbu slizu a sníţení či ztrátu adhezivity. 24,25 3) Fyziologické faktory - Vlastnosti mucinu a obměna mucinové vrstvy: Viskozita hlenu, stupeň propletení řetězců a obsah vody jsou důleţitými faktory, které způsobují interakce mezi adhezivem a substrátem. Kontaktní doba adheziva a substrátu je dána rozpustností polymeru ve vodě a rychlostí přeměny mucinu. 26 Rychlost obměny mucinové vrstvy limituje dobu setrvání bioadhezivního materiálu na mukózní membráně. V gastrointestinálním traktu závisí tato doba na přítomnosti jídla. Rychlá obměna hlenové vrstvy - řádově v hodinách, způsobí zkrácenou dobu kontaktu adheziva na substrátu s následnou niţší absorpcí léčivé látky. Pokud je mukóza dráţděna, např. vystavením vlivu alkoholu nebo ţlučníkových kyselin, dochází k urychlení uvolnění hlenu. - Zdravotní stav jedince: Některé nemoci jako např. vředová ţaludeční choroba, ulcerózní kolitida, cystická fibróza, bakteriální a houbové infekce, záněty, ale i běţné nachlazení, mohou změnit vlastnosti mukózy, např. sloţení a tloušťka vrstvy hlenu. 7 Při různém onemocnění je běţnější hypersekrece neţ hyposekrece, coţ zapříčiňuje zrychlený transport v gastrointestinálním traktu a sníţení doby působení bioadhezivních přípravků. 27 Faktory negativně ovlivňující bioadhezi: - Rychlá obměna hlenové vrstvy obměna řádově v hodinách, coţ způsobí zkrácenou dobu kontaktu adheziva se substrátem a následnou niţší absorpci léčivé látky - Nedostatečná specifita adheze hlavně u první generace adheziv - Dynamika v místě aplikace např. tvorba slin, pohyb jazyka ţvýkání, řeč 12

13 - Nemožnost ovlivnit např. kontaktní dobu a kontaktní čas u GIT aplikace lze ovlivnit jen při zevní aplikaci, např. při aplikaci do oka BIOADHEZIVNÍ POLYMERY Bioadhezivní polymery jsou vysokomolekulární látky, které splněním těchto poţadavků zajišťují dostatečnou adhezi: - Vysoká molekulová hmotnost pro kaţdou látku existuje optimální rozmezí molekulové hmotnosti, obecným předpokladem je ale molekulová hmotnost větší neţ Da (např. dextran ~ Da). - Dostatečný stupeň polarity větší mnoţství hydrofilních funkčních skupin (především karboxylových, hydroxylových, amidových a sulfátových) váţících se k substrátu různými interakcemi, hlavně vodíkovými vazbami, zajišťují vysokou polaritu, podmiňují bobtnání polymeru a tím obsazení maximální adhezivní plochy. Hydratace a zbobtnání jsou nezbytné, avšak nadměrná hydratace obvykle způsobí vytvoření slizu o nízké viskozitě a následnou ztrátu bioadhezivních vlastností. - Flexibilita polymerního řetězce je důleţitá především pro prostoupení a propletení řetězců a je ovlivněna zesítěním. Výhodnou konformací je dvojitá šroubovice. Významný vliv má i elektrický náboj polymeru. Dle náboje dělíme adhezivní polymery na anionické polymery (váţící se na mucus vodíkovými můstky; síla adheze roste v kyselém prostředí) a kationické polymery (váţící se na záporně nabitý mucin při ph 7,4 elektrostatickými interakcemi). Jsou preferovány anionické polymery, neboť kationické polymery jsou v důsledku buněčné agregace toxičtější. 21 Podle mechanismu účinku dělíme bioadhezivní polymery na polymery I. a II. generace. Adhezivní polymery I. generace mají nízkou specifitu, váţou se k jakémukoli mukóznímu povrchu fyzikálně-chemickými interakcemi. Dříve se pouţívaly např. k upevnění protéz, dnes mají jen omezené pouţití, neboť jsou nahrazeny adhezivy II. generace. Adhezivní polymery II. generace se váţou specifickými ligandy na receptory, u nich hovoříme o targetingu, tedy o cílené distribuci léčiva. 13

14 Mukoadhezivní polymery dále můţeme rozdělit z hlediska původu: - přírodní - např. chitosan, který se získává z krunýřů krabů, je netoxický, biodegradabilní, kationický polysacharid o vysoké molekulové hmotnosti - dále pektin, jedná se o netoxický, hydrofilní polysacharid pocházející z rostlinných buněčných stěn - syntetické - např. deriváty kyseliny akrylové karbomer, polykarbofil (vysoce dlouhodobá adhezivní vazba), polyakrylová kyselina - deriváty celulózy karboxymethylcelulosa, hydroxyethylcelulosa, hydroxypropylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy (aniontový polymer s neobyčejně dobrými mukoadhezivními vlastnostmi, biokompatibilitou a stabilitou) Tab. 1: Porovnání bioadheziv vztaţeno k pektinu (100%) 12 Testovaný polymer Průměrná adhezivní síla [%] Polycarbophil 200 Karbomelosa sodná sůl 192,4 Polyakrylová kyselina 185,0 Tragant 154,4 Polyethylen oxid 128,6 Polymethylvinylether co-maleinový 147,7 anhydrid Methylcelulosa 128,0 Alginát sodný 126,2 Hydroxypropylmethylcelulosa 125,2 Karayová guma 125,2 Methylethylcelulosa 117,4 Rozpustný škrob 117,2 Ţelatina 115,8 Pektin 100,0 Povidon 97,6 Polyethylenglykol 96, Polyvinylalkohol 94,8 Polyhydroxyethylmethakrylát 88,4 Hydroxypropylcelulosa 87,1 Kvalita adheze výborná vyhovující docela dobrá slabá Jako adheziva se pouţívají známé farmaceutické pomocné látky, neboť velký počet farmaceutických polymerů má za jistých podmínek mukoadhezivní vlastnosti, ale 14

15 hlavně především z důvodu snadnější registrace bioadhezivních léků. Vyuţívají se především polosyntetické nebo syntetické polymery, které tvoří hydrogely, např. celulózové deriváty nebo vysokomolekulární deriváty kyseliny polyakrylové. Pro farmaceutické pouţití je zajímavá i bioadhezivní bílkovinná sloučenina mušlový adhezní protein MAP mořské mušle Myrtilus edulis SUBSTRÁTY PRO BIOADHEZI Epiteliální membrána Buněčná membrána je tvořena fosfolipidovou dvojvrstvou, do níţ jsou vmezeřeny molekuly bílkovin a polysacharidů. Charakter membrány nejlépe popisuje tzv. model tekuté mozaiky, který říká, ţe se proteiny a sacharidy mohou relativně volně pohybovat v membránové lipidové dvojvrstvě. Některé z nich jsou volně připojeny k membráně. Hlavními sloţkami membrány jsou lipidy (cholesterol, fosfolipidy a sfingolipidy), proteiny a sacharidy. Fosfolipidy se skládají z polární a nepolární části, vytvářejí dvojvrstvu tak, ţe hydrofobní část molekuly směřuje směrem dovnitř membrány a hydrofilní část směrem vně membrány. Díky tomuto charakteru je membrána semipermeabilní, propustí vodu, nepolární a malé molekuly. Nepropustí polární a nabité částice. Proteiny mají hlavně transportní funkci a dostávají dovnitř látky, pro které je membrána nepropustná. Nečastěji jsou tyto transportní bílkoviny označovány jako pumpy, přenašeče a kanály. Sacharidy jsou připojeny k proteinům nebo lipidům a vytvářejí s nimi glykoproteiny nebo glykolipidy. Struktury na vnějším povrchu buněk tvořené polysacharidy jsou nazývány glykokalyx. Tento ochranný plášť chrání membránu před mechanickým a chemickým poškozením. Na glykokalyx nebo na polysacharidy glykoproteidů jsou schopny se specificky vázat lektiny. Jsou to buněčné membránové proteinové receptory, o nichţ se předpokládá, ţe jsou částečně zodpovědné za komunikační proces mezi buňkami navzájem a také mezi buňkami a médiem. Buněčná membrána má, stejně jako hlen, celkově záporný náboj, neboť pouze malá část lipidů nese kladný náboj. Z toho vyplývá, ţe adhezivní síly mezi membránou a vrstvou hlenu musí být tak silné, ţe překonají odpudivé síly. Dochází ke vzniku indukovaného dipólu, coţ vede k velké adhezivní síle mezi tkání a hlenem. 15

16 Modelové biologické tkáně Pro testování bioadheze jsou pouţívány nejčastěji myší peritoneum, krysí střevo, králičí ţaludek, hovězí sublingvální sliznice a vepřová bukální sliznice. Nevýhodu je však obtíţné získání sliznic s jednotným povrchem a konzistencí, která by poskytla reprodukovatelné výsledky MUKOADHEZE Zvláštní typ bioadheze, kdy substrát tvoří hlen (mukus) nebo mukózní sliznice (mukóza), se nazývá mukoadheze. Mukoadheze je oddělena od jiných adhezivních systému určených k pouţití na nebo v lidském těle (např. náplasti nebo transdermální systémy, fibrinové lepidlo nebo kostní cement v chirurgii). Ve většině případů se adhezivní interakce uskutečňují nejprve mezi bioadhezivem a hlenovou vrstvou a netýkají se přímo epiteliálního povrchu. Molekulární děje probíhající na rozhraní závisí na různých vlastnostech polymeru, hlenu a membrány. 5 Obr. 3: Tři složky podílející se na mukoadhezi 4 MUKOADHEZIVNÍ POLYMERY Mukoadhezivní polymery jsou syntetické nebo přírodní makromolekuly, které se za daných podmínek významně váţou na hlen nebo mukózní povrch. Mají hydrofilní charakter molekuly a obsahují početné skupiny tvořící vodíkové můstky. Adhezi zajišťuje přítomnost hydroxylové, karboxylové skupiny a aminoskupiny. Vazba mukoadhezivních polymerů je většinou aţ na výjimky nespecifická, tzn. nehrají zde roli specifické receptor-ligandové vazby. 16

17 MUKOADHEZIVNÍ SUBSTRÁTY Mukózní membrána (mukóza) je vlhký povrch, který ohraničuje stěny tělních dutin, gastrointestinálního a respiračního traktu. Je tvořena třemi vrstvami pojivem (lamina propria), nad ním se vyskytující epiteliální vrstvou (jednovrstevná typická pro ţaludek, střevo, průdušky, nebo vícevrstevná vyskytující se v jícnu, vagině, rohovce) pokrytou vlastní mukózou vlhkou mukózní vrstvou obsahující hlen. Tato hlenová vrstva se v závislosti na lokalizaci liší tloušťkou. V ţaludku je tloušťka hlenu přibliţně 192 μm, zatímco v duodenu kolísá od 10 do 400 μm. 29 Hlen (mucus) je zcela hydratovaný, průhledný, viskoelastický gel, který přiléhá k slizničním povrchům. Pokrývá povrch oka, nosu, úst, respiračního traktu, děloţního čípku a gastrointestinálního traktu. Je produkován specializovanými epiteliálními buňkami (pohárkovými buňkami), které jsou buď roztroušené mezi obyčejnými enterocyty (v gastrointestinálním traktu) nebo organizované do specializovaných ţláz (např. slinné ţlázy). Hlen slouţí jako spojovací článek mezi bioadhezivem a membránou. 5 Sloţení hlenu se velmi mění, závisí na ţivočišném druhu, místě sekrece, typu sekrečních buněk a na tom, zda je tkáň v normálním nebo patologickém stavu % hlenu tvoří voda, zbývajících 1-5% tvoří ve vodě nerozpustný glykoprotein mucin a další nemucinové látky, mezi něţ patří elektrolyty, nukleové kyseliny, enzymy, protilátky, surfaktanty a volné lipidy. 30 Mucin má tvar kartáče, který je sloţen z postranních oligosacharidových řetězců připojených na proteinovou kostru. Proteinová kostra tvoří kolem 12% aţ 17% celkové hmotnosti a z toho přibliţně 70% tvoří serin, threonin a prolin. Zbývající část molekulové váhy připadá na oligosacharidy, které jsou tvořeny pěti sloţkami: N-acetylgalaktosaminem, N-acetylglukosaminem, N- acetyl/n-glykolyl neuramidovou kyselinou, fukosou a galaktosou. Většina glykoproteinů hlenu nese celkový záporný náboj, způsobený přítomností zbytků kyseliny sialové a sulfonové na konci některých cukerných jednotek. Přibliţné pka těchto kyselin je 1,0 2,5, coţ znamená, ţe jsou při fyziologickém ph zcela ionizovány. Tento záporný náboj se významně podílí na bioadhezi. 6 Mucinové glykoproteiny jsou důleţitou strukturní sloţkou hlenu, které zajišťují jeho charakteristické gelové vlastnosti nutné pro funkci hlenu. 17

18 Mezi nejdůleţitější funkce hlenu patří ochrana epiteliálních buněk před fyzikálním a chemickým poškozením, poskytování lubrikace, usnadnění průchodu potravy trávicím traktem, dále slouţí jako zvlhčující agens a reguluje obsah vody ve spodních vrstvách tkání. 30 Hlen můţe přijmout vodu, aţ 40krát víc neţ je jeho celková hmotnost a vytvořit tak gel. Tento gel je tvořen velkými glykoproteinovými molekulami, které drţí při sobě nekovalentními vazbami. Jedná se především o vodíkové vazby. Protoţe se gel nerozpouští v roztoku iontů, nejsou při mukoadhezi hlavním typem interakcí iontové vazby. Soudrţnost tohoto přilnavého gelu je dostatečně slabá na to, aby umoţnila jeho tok, ale zároveň dostatečně silná, aby odolal solubilizaci a osmotickým tlakům. 6 V závislosti na lokalizaci hlenu, věku a pohlaví jedince se můţe významně lišit rychlost obměny vrstvy hlenu. Přibliţný čas obměny této vrstvy v gastrointestinálním traktu myši je přibliţně 1 aţ 5 hodin. 26 Rychlá obměna hlenové vrstvy je nevýhodná pro vyuţití bioadhezivních lékových forem. Významná je interakce s vápníkem, kdy dochází k vysráţení mucinu. Vysoké koncentrace kalcia mohou zvýšit sílu adheze a také rychlost hydratace hlenu. Vzniklou sraţeninu lze rozpustit chelatačními látkami jako např. EDTA ethylendiamintetraoctovou kyselinou. Zvýšení síly adheze a hydratace hlenu je způsobeno tím, ţe pozitivně nabité ionty vápníku chrání odpudivé síly mezi záporně nabitými mucinovýni skupinami, a tím je umoţněna rychlá, aţ stonásobná expanze mucinu MĚŘENÍ BIOADHEZE Testování bioadheze je důleţité při hledání nových, potenciálních mukoadheziv a při studiu jejich mechanismu působení, neboť podmínkou dobrého vyuţití bioadhezivních aplikačních systémů léčiv je dostatečná adheze. 32 Zatím nebyly vyvinuty ţádné univerzální, standardní metody pro měření bioadheze, proto je nutné zohlednit malé odlišnosti v experimentálních proměnných, jako je počáteční zatíţení, kontaktní čas, rychlost testu a substráty pro adhezi, jeţ mají 18

19 významný vliv na výsledky měření. Proto nemůţou být přímo porovnávány výsledky měření bioadheze různých výzkumných týmů. 33 Podle charakteru lokalizace měření existuje více metod. Nejčastěji se pouţívají metody in vitro, které jako substrát vyuţívají sliznici, neboť jsou velmi vhodné ke studiu destrukce mukoadhezivních interakcí a k měření skutečné adhezivní vazebné síly Metody in vivo Tyto metody jsou poměrně nákladné, řadíme sem gamma scintigrafii, rentgenové kontrastní techniky a přímé pozorování pomocí endoskopie. Vhodné radionuklidy k testování in vivo jsou 99 Tm, 133 In a 81 Kr Metody ex vivo Pouţívají se difúzní komory, ve kterých dochází k simulaci transportu léčiva po nazální, bukální, rektální a vaginální aplikaci z mukoadhezivních peptidových náplastí. Nebo se pouţívají přímo izolované orgány a tkáně, u nichţ můţeme sledovat adhezi za podobných podmínek jako v ţivém organismu Metody in vitro Tahové zkoušky Jsou nejpouţívanější in vitro metodou pro měření síly bioadhezivních interakcí a jsou zaloţeny na měření síly nebo práce potřebné k přerušení adhezivní vazby. Jako parametry se pouţívají práce adheze, která je určena plochou pod křivkou závislosti síla/dráha, a pík síly nutné k odtržení, coţ je maximální síla potřebná pro oddělení adheziva od substrátu. Oba tyto parametry poskytují stejnou informaci o vazebné síle. Bioadhezi mohou ovlivnit různé podmínky měření např. různá kontaktní síla, kontaktní doba, rychlost odtrhávání. 35 Reologické testy Průtokové techniky Další metody Měření kontaktního úhlu Touto metodou se hodnotí polarita a vypočítává se rozdělovací koeficient adheziva. Vizualizační techniky využívající fluorescenční záření Tato metoda se pouţívá např. ke studiu interpenetrace mezi adhezivem a substrátem. 19

20 Měření viskozity Několik vědeckých skupin sledovalo, zda viskozita ovlivňuje bioadhezi. Bylo zjištěno, ţe viskozita ovlivňuje mukoadhezi jen velmi málo. Teplota skelného přechodu 4.3 BIOADHEZIVNÍ LÉKOVÉ FORMY Léčivou látku lze do bioadhezivních lékových forem inkorporovat buď v průběhu syntézy adhezivního polymeru nebo při saturaci polymeru léčivem bobtnáním polymeru v roztoku léčiva. Bioadhezivní lékové formy dělíme podle charakteru přípravku: - tuhé tablety, matrice - polotuhé gely, masti, pasty - tekuté roztoky s vyšší viskozitou Mezi výhody bioadhezivních lékových forem patří: - bezprostřední a prodlouţený kontakt v místě aplikace (několik minut v oku, několik hodin v ţaludku nebo tenkém střevě). Je také zintenzivněn kontakt mezi aplikačním systémem a absorbující biologickou membránou (sliznicí) ve srovnání s neadhezivním systémem zlepšená lokalizace - vysoká koncentrace léčiva v daném místě - je vyloučen first-pass efekt - zvýšená absorpce léčiva díky změně permeability membrány a díky zvýšení koncentračního gradientu léčiva. Byl předpoklad, ţe by se toho mohlo vyuţít především pro neparenterální aplikaci peptidů a proteinů, které by tímto systémem byly tak navíc chráněny před předčasným odbouráním luminálními nebo mukózními proteasami, avšak toto očekávání od mukoadhezivních lékových forem se experimentálně ve všech případech nepotvrdilo. Problémem byla malá spolehlivost hlenu jako substrátu pro bioadhezi a chybějící specifičnost pouţitých mukoadhezivních polymerů silnější kontakt k absorbující sliznici - zlepšení biologické dostupnosti (prodlouţení času absorpce) - lepší přijímání pacientem a lepší compliance (prodlouţení dávkovacího intervalu) 20

21 Nové koncepty bioadhezivních systémů: - inhibice proteolytických enzymů - modulace epitelové permeability (zlepšení penetrace) - indukce vezikulárních transportních procesů v buňkách (endocytóza, resp. transcytóza) - aplikace makromolekulových léčiv biotechnologického původu (proteiny nebo genové vektory) 37 Bioadhezivní lékové formy se pouţívají hlavně k lokálnímu ošetření onemocnění ústní dutiny antibiotiky, antihistaminiky nebo lokálními anestetiky. V Japonsku je pod názvem Aftac uvedena na trh bioadhezivní tableta na ošetření zápalových změn ústní sliznice. V Německu je v prodeji dentální adhezivní pasta Solcoseryl, která obsahuje ţelatinu, pektiny a methylcelulosu rozptýlené v lipofilním základu sloţeném z parafinu a polyethylenu. Tento přípravek je velmi podobný americkému přípravku Oralbase, který byl patentován ve 40. letech 20. stol. Ve Francii a Švýcarsku je na trhu hydrofilní pasta Pansoral, která obsahuje mukoadhezivní polymer hydroxyethylcelulosu. 38 V USA se prodává gel kyseliny polyakrylové bez obsahu léčiva, určený na ošetřování postmenopauzální suchosti pochvy. V tomto mukoadhezivním léku působí kyselina polyakrylová, která není neutralizována, jako slabě kyselý tlumící systém (ph hodnota přibliţně 3-4). Hodnota ph v kyselé oblasti je v tomto případě fyziologicky ţádoucí a umoţňuje tomuto polymeru lépe přilnout k sliznici neţ při neutrálním ph. Dále se bioadheziva pouţívají v oftalmologii. Někdy je však těţké rozlišit, zda důvodem prodlouţení doby působení vodného roztoku je prosté zvýšení viskozity nebo skutečná bioadheze. 17 Při rektální a intestinální aplikaci různých peptidových hormonů (insulinu, kalcitoninu, analogů vazopresinu a buserelinu) pokusným zvířatům bylo zjištěno několikanásobné zvýšení biologické dostupnosti přísadou mukoadhezivních polymerů (především kyseliny polyakrylové) ve srovnání s fyziologickým roztokem se stejnou koncentrací téhoţ léčiva. Dále bylo zjištěno, ţe některé polymery kromě mukoadheze mají ještě další biologické účinky jsou schopny krátkodobě a reverzibilně otevřít úzké průchody 21

22 (tight junctions) mezi sousedními epitelovými buňkami, které jsou běţně pro peptidy nepropustné. Tento efekt byl pozorován i po vaginální a nazální aplikaci mukoadhezivních léků s obsahem peptidových hormonů se systémovým účinkem. Hlavně kyselina polyakrylová je současně také účinným inhibitorem celé řady proteolytických enzymů (např. trypsinu a chymotrypsinu). Tato inhibice je dána chelatotvornými schopnostmi polymeru, kdy dochází k vytváření komplexů s kovovými ionty, které jsou ve funkci kofaktorů enzymů. 39 Jako specifická bioadheziva je moţné pouţít lektiny, především rostlinného původu. Jedná se o proteiny nebo glykoproteiny rozdílné velikosti (M W asi Da). Pouţívá se lektin izolovaný z ovocné šťávy zralých rajských jablek (Lycopersicon esculentum). Některé lektiny se váţou jen na povrch epitelových buněk, zatímco jiné v návaznosti na tuto primární bioadhezi mohou dát buňce podnět absorbovat vázané ligandy endocytotickými procesy do její cytoplazmy ( bioinvaze ). Pomocí moderních metod genové technologie je moţné určité lektiny na molekulární úrovni cíleně změnit, dokonce i vytvořit adhezní a invazní faktory určitých kmenů bakterií ve vysoké čistotě a výtěţku. Tímto způsobem je moţné vyrobit nové bioadhezivní, resp. bioinvazivní nosiče léčiv tím, ţe se takové molekulové struktury připojí na povrch koloidních nosičových systémů léčiv (např. lipozomů nebo nanočástic)

23 5 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5.1 POUŽITÉ SUROVINY: 3D...Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 3% dipentaerythritolu (FaF UK HK) 5D...Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 5% dipentaerythritolu (FaF UK HK) 8D...Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 8% dipentaerythritolu (FaF UK HK) 3M..Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 3% mannitolu (FaF UK HK) 5M..Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 5% mannitolu (FaF UK HK) 8M..Oligoester kys. D,L-mléčné, kyseliny glykolové a 8% mannitolu (FaF UK HK) Methylsalicylát (Fluka Chemika) 5.2 POUŽITÉ PŘÍSTROJE: Brookfieldův digitální viskozimetr model DV-E Digitální váhy KERN , max. 200g, d = 0,01g Materiálový zkušební stroj T1-FR050TH.A1K firmy Zwick/Roell Horkovzdušná sušárna HS 61 A Brookfieldův digitální viskozimetr model DV-E Obr. 4: Brookfieldův viskozimetr Jedná se o rotační viskozimetr, měřící viskozitu snímáním kroutícího momentu, nutného pro rotaci vřetena ponořeného do vzorku tekutiny konstantní rychlostí. Kroutící moment je úměrný viskóznímu tahu ponořeného vřetena a tím viskozitě kapaliny. Výhodami jsou jednak kontinuální rotace vřetena, umoţňující nepřerušované měření po dlouhou dobu (dovolující analyzovat tak na čase závislé vlastnosti tekutiny), nebo moţnost měření newtonovské i nenewtonovské 23

24 kapaliny. Dalšími výhodami je jednoduchost, přesnost, správnost a flexibilita vlastního měření. Měřící systém je tvořen Brookfieldovým digitálním viskozimetrem, adaptérem pro malé objemy vzorků a vodní lázní s cirkulací. Obr. 5: Adaptér pro malé objemy vzorků, sada vřeten a vodní lázeň Materiálový zkušební stroj T1-FR050TH.A1K firmy Zwick/Roell Obr. 6: Materiálový zkušební stroj T1-FR050TH.A1K firmy Zwick/Roell Tento zkušební stroj má univerzální pouţití. Lze ho uzpůsobit téměř pro všechny poţadavky národních a mezinárodních standardů. Je pouţitelný pro rutinní testování i pro studium mechanických vlastností materiálů, umoţňuje tlakové, tahové a ohybové testy materiálu. Software Master test lze předem definovat pro nejčastěji pouţívané zkoušky nebo komplexní testy. V softwaru Mater test byla servisním technikem vytvořena šablona Adheze 2 kn pro měření adheze materiálu. V šabloně byla předem definována většina parametrů, pouze níţe uvedené parametry byly zvoleny pro tento experiment: Zatíţení zkušební cyklus: standardní síla 5 N 24

25 Jiná rychlost pro odlehčení: 100 mm/min Prodleva na referenční hodnotu síly při zatěţování: 60 s 5.3 PŘÍPRAVA VZORKŮ: Plastifikované oligoestery Jedná se o větvené terpolymery D,L-mléčné kyseliny, kyseliny glykolové a mannitolu nebo dipenraerythritolu (viz. Tab.1). Tab. 2: Charakterizace použitých terpolymerů kyseliny D,L-mléčné, kyseliny glykolové a mannitolu (dipentaerythritolu) LA/GA/M(D) Označení polymeru Poměr LA/GA/M(D) [%] M n [g/mol] M w [g/mol] M w /M n T g ( C) 3M 48,5/48,5/3, ,5 23,7 5M 47,5/47,5/5, ,4 21,0 8M 46/46/8, ,1 19,2 3D 48,5/48,5/3, ,3 5D 47,5/47,5/5, ,2 16,3 8D 46/46/8, ,2 12,5 Příprava vzorků: Připravila jsem si vzorky tvořené oligoesterem a methylsalicylátem ve funkci plastifikátoru v koncentracích 10, 20, 30, 40 nebo 50%. Např. příprava 3M polymeru plastifikovaného 10% methylsalicylátu: 9,0 g oligoesteru 3M jsem naváţila do malé kádinky a zahřívala v sušárně do změknutí. Poté jsem přidala 1,0 g methylsalicylátu a směs zhomogenizovala kopistkou. Hotový vzorek jsem zakryla alobalem a označila názvem nosiče a koncentrací plastifikátoru. 5.4 POSTUP MĚŘENÍ: Měření viskozity Termostat vodní lázně s cirkulací jsem nastavila na 40 C a nechala temperovat. Do viskozimetru jsem našroubovala vřeteno č.15. Měřený vzorek jsem umístila do válce, který je součástí adaptéru pro malé objemy vzorků, a upevnila 25

26 do dvouplášťového obalu. Vzorek jsem nechala min. 15 minut temperovat. Zapnula jsem viskozimetr a na displeji navolila velikost pouţitého vřetena. Dále jsem nastavila rychlost rotace - hodnotu RPM (počet otáček vřetena za minutu) na nejniţší hodnotu, konkrétně 0,3 a spustila motor. Hřídel jsem v měřeném vzorku nechala pětkrát otočit. Potom jsem na displeji odečetla hodnotu dynamické viskozity v mpa.s. Pro dosaţení přesnosti měření se vynechávají údaje pod 10% kroutícího momentu. Zvýšila jsem rychlost otáčení hřídele a postup opakovala. Viskozitu vzorku jsem proměřila v celém rozsahu RPM. Změřený vzorek jsem odstranila, vyčistila válec i vřeteno. Tímto způsobem jsem proměřila všechny vzorky. Pokud při teplotě 40 C nebyla viskozita měřitelná (byla-li viskozita příliš vysoká nebo příliš nízká), zaznamenala jsem do tabulky Nenaměřeno. Do tabulky jsem zaznamenala hodnoty dynamické viskozity při daných rychlostech otáčení vřetene. Sestrojila jsem viskozitní křivky (závislost viskozity na RPM) a graficky porovnala viskozitu jednotlivých vzorků Měření adheze Po zapnutí zkušebního stroje a k němu připojeného počítače jsem nejdříve zkontrolovala předdefinované parametry měření a nastavila testovací parametry dle zadání experimentu: kontaktní síla 5 N, kontaktní doba 60 s, rychlost odtrţení vzorku od podkladu 100 mm/min. Na očištěnou spodní plochu jsem nanesla v tenké kompaktní vrstvičce měřený vzorek. Ovládáním pomocí PC jsem nastavila výchozí vzdálenost horní a dolní plochy nástavců, vynulovala sílu a spustila vlastní zkoušku. Horní plocha se pohybovala směrem dolů, (pohyb z výchozí pozice LE 25 mm rychlostí 25 mm/min do okamţiku, kdy se přiblíţí na zkušební vzdálenost čelistí 5 mm, po dosaţení této vzdálenosti rychlostí 10 mm/min) aţ se plochy dostaly do kontaktu. Následovala doba kontaktu 60 s, zatíţení 5 N a poté se horní čelist odtrhla rychlostí 100 mm/min. Snímač síly zaznamenal maximální sílu nutnou pro odtrţení obou ploch F max. Po ukončení zkoušky se automaticky nastavila výchozí polohu obou ploch LE 25 mm. Mezi kaţdým měřením jsem odstranila z horní plochy veškeré zbytky vzorku pomocí acetonu a znova vytvořila poţadovanou vrstvu vzorku na spodní ploše. Prováděla jsem vţdy pět měření pro stejný vzorek za daných proměnných podmínek. 26

27 Nenaměřeno Nenaměřeno 6 VÝSLEDKY 6.1 TABULKY Měření viskozity: Tab. 3: Dynamická viskozita oligoesteru 3M plastifikovaného různou koncentrací methylsalicylátu RPM 10 % 20% 30% 40% 50% ot./min. mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s 0, , , , , , , , , , , průměr

28 Nenaměřeno Nenaměřeno Tab. 4: Dynamická viskozita oligoesteru 5M plastifikovaného různou koncentrací methylsalicylátu RPM 10 % 20% 30% 40% 50% ot./min. mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s 0, , , , , , , , , , , průměr

29 Nenaměřeno Nenaměřeno Tab. 5: Dynamická viskozita oligoesteru 8M plastifikovaného různou koncentrací methylsalicylátu RPM 10 % 20% 30% 40% 50% ot./min. mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s 0, , , , , , , , , , , průměr

30 Nenaměřeno Tab. 6: Dynamická viskozita oligoesteru 3D plastifikovaného různou koncentrací methylsalicylátu RPM 10 % 20% 30% 40% 50% ot./min. mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s 0, , , , , , , , , , , průměr

31 Nenaměřeno Tab. 7: Dynamická viskozita oligoesteru 5D plastifikovaného různou koncentrací methylsalicylátu RPM 10 % 20% 30% 40% 50% ot./min. mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s 0, , , , , , , , , , , průměr

32 Nenaměřeno Tab. 8: Dynamická viskozita oligoesteru 8D plastifikovaného různou koncentrací methylsalicylátu RPM 10 % 20% 30% 40% 50% ot./min. mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s mpa.s 0, , , , , , , , , , , průměr

33 6.1.2 Měření adheze: Tab. 9: Adhezivní síla F max vzorků 3M plastifikovaných různou koncentrací methylsalicylátu MS [%] Měření č. F max [N] F max [N] S 1 0,09 2 0,14 10 % 3 0,16 0,27 0,20 4 0,38 5 0, , ,42 20 % 3 66,50 66,95 1, , , , ,96 30 % 3 30,32 30,32 0, , , , ,25 40 % 3 22,54 22,87 1, , , , ,61 50% 3 14,95 14,35 1, , ,63 33

34 Tab. 10: Adhezivní síla F max vzorků 5M plastifikovaných různou koncentrací methylsalicylátu MS [%] Měření č. F max [N] F max [N] S 1 1,58 2 1,67 10 % 3 1,97 2,32 0,82 4 3,39 5 2, , ,39 20 % 3 53,58 54,01 2, , , , ,80 30 % 3 31,19 30,39 0, , , , ,04 40 % 3 14,11 15,81 1, , ,32 1 6,69 2 7,38 50% 3 7,65 7,36 0,42 4 7,31 5 7,77 34

35 Tab. 11: Adhezivní síla F max vzorků 8M plastifikovaných různou koncentrací methylsalicylátu MS [%] Měření č. F max [N] F max [N] S 1 1,05 2 6,20 10 % 3 2,41 3,55 2,10 4 5,18 5 2, , ,32 20 % 3 51,45 51,19 2, , , , ,74 30 % 3 28,33 28,97 0, , , , ,75 40 % 3 15,32 15,30 0, , ,84 1 6,05 2 4,87 50% 3 4,85 5,55 0,66 4 6,29 5 5,68 35

36 Tab. 12: Adhezivní síla F max vzorků 3D plastifikovaných různou koncentrací methylsalicylátu MS [%] Měření č. F max [N] F max [N] S 1 2,05 2 6,73 10 % 3 5,39 4,15 2,02 4 2,23 5 4, , ,90 20 % 3 88,81 91,25 9, , , , ,29 30 % 3 32,87 33,32 1, , , , ,45 40 % 3 24,32 25,11 0, , , , ,93 50% 3 11,56 11,69 0, , ,08 36

37 Tab. 13: Adhezivní síla F max vzorků 5D plastifikovaných různou koncentrací methylsalicylátu MS [%] Měření č. F max [N] F max [N] S 1 113, ,00 10 % 3 153,61 129,48 25, , , , ,32 20 % 3 35,93 36,89 1, , , , ,22 30 % 3 26,84 27,11 0, , , , ,38 40 % 3 16,87 17,65 1, , , ,04 2 9,61 50% 3 11,59 10,11 0,91 4 9, ,16 37

38 Tab. 14: Adhezivní síla F max vzorků 8D plastifikovaných různou koncentrací methylsalicylátu MS [%] Měření č. F max [N] F max [N] S 1 75, ,77 10 % 3 65,52 65,02 6, , , , ,82 20 % 3 31,35 31,14 0, , , , ,63 30 % 3 17,96 20,44 1, , , , ,87 40 % 3 17,51 16,81 1, , ,30 1 2,02 2 2,60 50% 3 3,43 2,90 0,79 4 3,98 5 2,45 38

39 Viskozita (Pa.s) Viskozita (Pa.s) 6.2 GRAFY Měření viskozity: Obr. 7: Viskozitní křivka oligoesteru 3M % MS 30% MS 40% MS RPM Obr. 8: Viskozitní křivka oligoesteru 5M % MS 30% MS 40% MS RPM 39

40 Viskozita (Pa.s) Viskozita (Pa.s) Obr. 9: Viskozitní křivka oligoesteru 8M % MS 30% MS 40% MS RPM Obr. 10: Viskozitní křivka oligoesteru 3D % MS 40% MS 50% MS RPM 40

41 Viskozita (Pa.s) Viskozita (Pa.s) Obr. 11: Viskozitní křivka oligoesteru 5D % MS 30% MS 40% MS RPM Obr. 12: Viskozitní křivka oligoesteru 8D % MS 20% MS 30% MS 40% MS RPM 41

42 Viskozita (Pa.s) Viskozita (Pa.s) Obr. 13: Viskozitní křivka nosiče 3D plastifikovaného 20% MS RPM Obr. 14: Viskozitní křivka nosiče 5D plastifikovaného 10% MS RPM 42

43 Viskozita (Pa.s) Viskozita (Pa.s) Obr. 15: Závislost viskozity na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 3M % MS 30% MS 40% MS Koncentrace plastifikátoru Obr. 16: Závislost viskozity na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 5M % MS 30% MS 40% MS Koncentrace plastifikátoru 43

44 Viskozita (Pa.s) Viskozita (Pa.s) Obr. 17: Závislost viskozity na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 8M % MS 30% MS 40% MS Koncentrace plastifikátoru Obr. 18: Závislost viskozity na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 3D % MS 40% MS 50% MS Koncentrace plastifikátoru 44

45 Viskozita (Pa.s) Viskozita (Pa.s) Obr. 19: Závislost viskozity na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 5D % MS 30% MS 40% MS Koncentrace plastifikátoru Obr. 20: Závislost viskozity na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 8D % MS 20% MS 30% MS 40% MS Koncentrace plastifikátoru 45

46 Viskozita (Pa.s) Viskozita (Pa.s) Obr. 21: Srovnání testovaných vzorků podle klesající viskozity vzorků D+10%MS 3D+20%MS 8D+10%MS 3M+20%MS 5M+20%MS 8M+20%MS 5D+20%MS 3D+30%MS 3M+30%MS 8D+20%MS 5M+30%MS 5D+30%MS 8M+30%MS 3D+40%MS 8D+30%MS 3M+40%MS 5M+40%MS 8M+40%MS 8M+40%MS 3D+50%MS 8D+40%MS Obr. 22: Porovnání viskozity oligoesterů větvených mannitolem (M) a oligoesterů větvených dipentaerythritolem (D) při plastifikaci 20% MS M D

47 Viskozita (Pa.s) Viskozita (Pa.s) Obr. 23: Porovnání viskozity oligoesterů větvených mannitolem (M) a oligoesterů větvených dipentaerythritolem (D) při plastifikaci 30% MS M D Obr. 24: Porovnání viskozity oligoesterů větvených mannitolem (M) a oligoesterů větvených dipentaerythritolem (D) při plastifikaci 40% MS 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 M D 1,5 1 0,

48 Síla (N) Síla (N) Měření adheze: Obr. 25: Závislost adhezivní síly F max na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 3M % MS 20% MS 30% MS 40% MS 50% MS Koncentrace plastifikátoru Obr. 26: Závislost adhezivní síly F max na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 5M % MS 20% MS 30% MS 40% MS 50% MS Koncentrace plastifikátoru 48

49 Síla (N) Síla (N) Obr. 27: Závislost adhezivní síly F max na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 8M % MS 20% MS 30% MS 40% MS 50% MS Koncentrace plastifikátoru Obr. 28: Porovnání závislosti adhezivní síly F max na koncentraci plastifikátoru u oligoesterů řady M M 5M 8M % MS 20% MS 30% MS 40% MS 50% MS Koncentrace plastifikátoru 49

50 Síla (N) Síla (N) Obr. 29: Závislost adhezivní síly F max na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 3D % MS 20% MS 30% MS 40% MS 50% MS Koncentrace plastifikátoru Obr. 30: Závislost adhezivní síly F max na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 5D % MS 20% MS 30% MS 40% MS 50% MS Koncentrace plastifikátoru 50

51 Síla (N) Síla (N) Obr. 31: Závislost adhezivní síly F max na koncentraci plastifikátoru u oligoesteru 8D % MS 20% MS 30% MS 40% MS 50% MS Koncentrace plastifikátoru Obr. 32: Porovnání závislosti adhezivní síly F max na koncentraci plastifikátoru u oligoesterů řady D D 5D 8D % MS 20% MS 30% MS 40% MS 50% MS Koncentrace plastifikátoru 51