Imunohistochemická detekce makrofágů v aterosklerotických plátech arteria brachiocephalica II

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové katedra biologických a lékařských věd Imunohistochemická detekce makrofágů v aterosklerotických plátech arteria brachiocephalica II Immunohistochemical detection of macrophages in atherosclerotic lesions brachiocephalic artery II (Bakalářská práce) Vedoucí práce: Hradec Králové, 2013 Doc. PharmDr. Petr Nachtigal, Ph.D. Šárka Košťáková 1

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. Datum Podpis 2

Ráda bych poděkovala Doc. PharmDr. Petr Nachtigalovi, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady při sestavování této bakalářské práce. Také bych chtěla poděkovat rodině a přátelům za podporu a trpělivost. 3

Abstrakt Šárka Košťáková Imunohistochemická detekce makrofágů v aterosklerotických plátech arteria brachiocephalica II Bakalářská práce Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Zdravotní laborant Cíl práce: Cílem této bakalářské práce bylo nastavit imunohistochemickou metodu pro detekci makrofágů v arteria brachiocephalica ApoE/LDL receptor (ApoE/LDLR) deficientních myší. Dalším cílem byla kvantifikace exprese makrofágů a porovnání získaných výsledků mezi dvěma skupinami myší krmených pouze speciálních dietou (LCHP) a dietou s přídavkem kyseliny nikotinové. Metody: Myší samice (ApoE/LDLR deficientní) byly rozděleny do dvou skupin o šesti jedincích. První skupině byla podávána dieta s nízkým obsahem cukrů a vysokým obsahem proteinů po dobu 8 týdnů. Druhé skupině byla podávána stejná dieta po dobu 4 týdnů, následující 4 týdny byla do stravy přídávána navíc 1% kyselina nikotinová. Poté byly odebrány vzorky sér a biochemickou analýzou se stanovila hladina celkového cholesterolu u obou skupin myší. Provedli jsme imunohistochemickou analýzu makrofágů na 96 sklíčkách s řezy arteria brachiocephalica obou skupin myší, následně jsme všechna sklíčka použili pro stereologickou analýzu. Získané výsledky jsme statisticky vyhodnocovali nepárovým t-testem. Výsledky: Statisticky nebyl prokázán vliv diety s přídavkem kyseliny nikotinové na hladinu celkového cholesterolu v séru v porovnání s LCHP skupinou. Imunohistochemická detekce prokázala přítomnost makrofágů v intimě a medii cév u obou skupin myší. Lokalizace makrofágů v aterosklerotickém plaku nebyla nijak specifická. Stereologická analýza neprokázala významné rozdíly v expresi makrofágů u obou skupin myší. 4

Závěr: Vypracovali jsme metodu vhodnou pro imunohistochemickou detekci makrofágů v arteria brachiocephalica u ApoE/LDLR deficientních myší krmených LCHP dietou a LCHP dietou+1% kyselina nikotinová. Ze získaných dat jsme zjistili, že vliv kyseliny nikotinové na progresi aterosklerózy v arteria brachiocephalica nebyl u těchto myších modelů za použitých experimentálních podmínek signifikantní. 5

Abstract Šárka Košťáková Immunohistochemical detection of macrophages in atherosclerotic lesions brachiocephalic artery II Bachelor thesis Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Medical Laboratory Technician The aim of this study: The aim of this bachelor thesis was to evaluate an immunohistochemical method for macrophages detection in brachiocephalic artery in ApoE/LDL receptor (ApoE/LDLR) deficient mice. Another aim was to quantify the macrophage expression and to compare obtained results between two groups of mice fed only special diet (LCHP) and diet with addition of nicotinic acid. Methods: Female mice (ApoE/LDLR deficient) were separated into two groups of 6 individuals. The first group was being fed low carbohydrate high protein diet (LCHP) for a period of 8 weeks. The second group was being fed the same diet for a period of 4 weeks and for another 4 weeks with addition of 1% nicotinic acid. Consequently sera samples were collected and the general level of cholesterol was determined using biochemical analysis in both groups of mice. An immunohistochemical analysis of macrophages from 96 glasses with section of brachiocephalic artery from both groups of mice was done and stereological analysis was applied. Acquired results were statistically analyzed using unpaired t - test. Results: The influence of diet with nicotinic acid addition on the cholesterol level compared to LHCP group was not statistically significant. Immunohistochemical detection revealed presence of macrophages in intima and media of blood vessels in both groups of mice. The macrophages localization in atherosclerotic plague was not specific. Stereological analysis did not show significant differences in macrophage expression between the two groups of mice. 6

Conclusions: We developed a suitable method for the detection of macrophages in brachiocephalic artery in ApoE/LDLR mice fed LCHP diet and LCHP diet containing nicotinic acid. Obtained data showed no significant influence of nicotinic acid on atherosclerosis progression in brachiocephalic artery under these experimental conditions in this mouse model. 7

Obsah 1. Úvod... 10 2. Mikroskopická anatomie cév... 12 2.1 Obecná skladba cév... 12 2.2 Arterie... 13 3. Ateroskleróza... 14 3.1 Hypotézy vzniku aterosklerózy... 14 3.2 Faktory vyvolávající aterosklerózu... 15 3.2.1 Neovlivnitelné... 15 3.2.2 Ovlivnitelné... 15 3.3 Vývoj aterosklerózy:... 16 4. Endotel... 20 4.1 Funkce endotelu:... 20 4.2 Endotelová dysfunkce:... 20 4.3 Adhezní molekuly endotelu... 21 4.4 Apoptóza endotelových buněk... 22 5. Lipoproteiny... 23 5.1 Transport lipidů... 23 5.2 LDL částice... 23 5.2.1 Struktura:... 23 5.2.2 Oxidace:... 24 5.2.3 Oxidované LDL částice a imunitní reakce... 24 5.3 HDL částice... 24 5.3.1 Struktura a syntéza... 24 5.3.2 Funkce... 26 6. Makrofágy... 26 6.1 Průnik endotelem... 26 6.2 Aktivace makrofágů:... 27 8

6.3 Akumulace lipoproteinů v makrofázích... 27 6.4 Apoptóza makrofágů... 28 7. Niacin... 29 7.1 Mechanizmus účinku:... 29 7.2 Použití:... 29 8. Zvířecí modely... 30 8.1 Myší model:... 30 8.2 Geneticky modifikované myší modely:... 30 9. Experimentální část:... 31 9.1 Cíl práce, zadání práce... 31 10. Experimentální část... 32 10.1 Použité zvířecí modely, chov... 32 10.2 Dieta... 32 10.3 Použitý materiál... 33 10.4 Postup práce... 33 10.5 Princip imunohistochemie... 34 10.6 Kvantitativní analýza imunohistochemie stereologická analýza... 34 10.7 Statistická analýza... 35 11. Výsledky... 36 11.1 Biochemická analýza... 36 11.2 Imunohistochemická analýza... 37 11.3 Stereologická analýza exprese makrofágů v truncus brachiocephalicus... 40 12. Diskuze... 42 13. Závěr... 44 15. Použité zkratky... 45 16. Seznam použité literatury... 47 9

1. Úvod Stárneme tak rychle, že v noci, když je ticho, slyšíme, jak nám kornatějí tepny. Rudolf II. Kardiovaskulární onemocnění (KVO) je nejčastější příčinou úmrtí ve vyspělých zemích, incidence se zvyšuje i v zemích rozvojových (1). KVO je důsledkem ekonomických, sociálních a ekonomických faktorů (2). K pochopení etiologie KVO je nutné dobře znát mechanizmus patofyziologie, určit příčinu vzniku KVO, definovat míru vlivu genetické výbavy a zevních faktorů a interakci mezi nimi. Toto jsou cíle epidemiologie, která zkoumá obecné příčiny KVO, a genetické epidemiologie studující vztah mezi genetickými a zevními faktory. Nejčastější formou KVO je mrtvice a ischemická choroba srdeční (ICHS) (1). V Evropě je ICHS nejčastější příčinou úmrtí, mezi zeměmi je mortalita odlišná. Nejvyšší bývá ve východní a střední Evropě, zatímco nejnižší mortalita je z evropských zemí v Itálii a Francii. Obecně je úmrtnost způsobená ICHS vyšší u mužů než u žen, zvyšuje se s věkem a je ovlivněna i etnickými a sociálními aspekty. U jednotlivců je vznik ICHS spojován s rizikovými faktory. Studie dokazují, že kouření, nevhodná strava, nízká tělesná aktivita, nadváha a další faktory zvyšují pravděpodobnost ICHS. Ateroskleróza je rizikovým faktorem ICHS (3). Je to onemocnění cév, které se vyvíjí postupně po dobu několika let. K aterosklerotickým změnám ve stěně arterií může docházet již v dětském věku. Ateroskleróza je multifaktoriální onemocnění, u kterého se rizikové faktory se navzájem umocňují. Rizikové faktory aterosklerózy můžeme rozdělit na ovlivnitelné a neovlivnitelné. Znalost těchto faktorů umožnila vyvinout primární preventivní opatření, která zahrnují odstranění rizikových faktorů, a tak by měla být zajištěna ochrana před vznikem aterosklerózy a KVO. Eliminace byť i jednoho rizikového faktoru může značně zmírnit riziko aterosklerózy. Sekundární preventivní opatření zahrnují krom změny životního stylu i medikamentózní terapii. 10

Léčba hypolipoproteinémie zahrnuje dietu se sníženým přísunem exogenního cholesterolu a farmakoterapie (4). V současné době se pro léčbu používají statiny, které inhibují syntézu endogenního cholesterolu, dále se používají fibráty. Hlavní úlohou léčby hyperlipoproteinemie je stabilizovat plaky náchylné k ruptuře a snížit tak riziko vzniku akutní cévní příhody (2). 11

2. Mikroskopická anatomie cév 2.1 Obecná skladba cév Cévní systém se skládá ze systému krevních a mízních cév (5). Krevní cévy rozvádějí krev do tkání, která transportuje živiny, kyslík, hormony a další důležité látky. Ze tkání je krví zprostředkován odvod zplodin metabolizmu a oxidu uhličitého. Pohyb krve je zaručen rytmickými stahy srdce, které vhání krev do tepen (arteriae). Tepny se větví v síť vlásečnic, z nich se pak sbírají žíly (venae). Stěna krevní cévy se obvykle skládá ze tří vrstev: Tunica intima Tunica media Tunica adventitia Tunica intima - tvoří vnitřní povrch cévy (6). Skládá se z jedné vrstvy endotelových buněk, které jsou uloženy na bazální membráně, a vrstvy subendotelové. Endotelové buňky jsou ploché, mají protáhlý tvar ve směru toku krve (7). Bazální membránu tvoří hlavně kolagen typu IV a V, elastin, mikrofibrily a glykoproteiny (především heparan sulfát) (8). Subendotelová vrstva obsahuje řídké vazivo, mohou se v ní nacházet i hladké svalové buňky (6). Vazivová vlákna a hladké svalové buňky jeví longitudinální uspořádání. V tepnách se pod endotelem nachází membrana elastica interna, což je síť kolagenních a elastických vláken nebo soubor elastických blanek (5). Tunica media - je tvořena hlavně z koncentricky uspořádaných vrstev hladkých svalových buněk šroubovitého tvaru (6). Mezi hladkými svalovými buňkami se nachází proměnlivé množství elastických vláken a lamel, retikulárních vláken a proteoglykanů. Mezibuněčnou hmotu, kterou produkují hladké svalové buňky, tvoří především glykosaminoglykan chondroitinsulfát (7). Elastická vlákna tvoří blanky, ve kterých se nacházejí otvory (fenestrace). Tyto otvory umožňují průchod živin do hlubších vrstev stěny cévy. V tepnách se na hranici s adventicií tvoří elastickou vrstvu membrana elastica externa, která v některých tepnách může chybět (5). 12

Tunica adventitia se skládá hlavně z longitudinálně uspořádaných kolagenových a elastických vláken (6). Tato vrstva postupně přechází ve vazivo orgánu, kterým céva prochází. V této vrstvě se u cév větších než 1 mm nachází systém cév - vasa vasorum, které zasahují až do zevní oblasti medie (7). Vasa vasorum se častěji nacházejí ve stěnách vén než arterií. V adventicii a medii vén se nacházejí lymfatické kapiláry a síť sympatických nemyelinizovaných vazomotorických nervových vláken. 2.2 Arterie Stěna arterií (tepen) je pružná a pevná, uzpůsobená tak, aby odolala pulzním nárazům krve (5). Krev je z komor vržena do cév, vzniká tlaková vlna, která způsobuje roztažení stěn cév. Arterie se dělí podle velikosti na arterioly, svalové arterie (středního a velkého kalibru), (velké) elastické arterie (6). Stěna elastických arterií, mezi které patří velké cévy jako např. aorta, arteriae carotides, arteria subclavia atd., se při nárazu krve při systole roztahují a při diastole se vrací zpět do původního stavu (5). Tím napomáhají pohánět krev. Arterie svalového typu regulují průtok krve do tkání díky regulačnímu aparátu ve svalové části stěny. a) Arterioly: Jejich průměr je obecně menší než 0,5 mm (6). Mají relativně úzký lumen. V endotelových buňkách se nacházejí Weibel-Paladeho granula tyčinkovitého tvaru obsahující Willebrandův faktor (7). Medie tvoří až pět vrstev hladkých svalových buněk. Vrstva hladkých svalových buněk může být v nejmenších arteriolách nesouvislá. Mezi endotelem a vrstvou hladkých svalových buněk je membrana elastica interna (5). b) Svalové arterie: Mají silnější subendotelovou vrstvu, kde se mohou nacházet hladké svalové buňky, jinak je tunica intima shodná jako v arteriolách vlákna (6). Ve svalových arteriích je zřetelně vyvinuta membrána elastica interna. Medie může sestávat až ze 40 vrstev hladkých svalových buněk, mezi vrstvami se nacházejí elastické membrány, retikulární vlákna a proteoglykany. Membrana elastica externa se nachází ve větších svalových arteriích. V adventicii se nacházejí lymfatické kapiláry, vasa vasorum a nervová vlákna, která mohou zasahovat do vnější části medie. 13

c) Velké elastické arterie: Tyto arterie mají nažloutlou barvu díky nahromaděnému elastinu v medii vlákna (6). Intima je silnější než u arterií svalového typu, také subendotelová vrstva je silně vyvinuta. Longitudinální vazivová vlákna v subendotelové vrstvě jsou velmi důležitá při dilataci cévy a deformaci endotelu během rytmických kontrakcí. V medii se nacházejí četné perforované elastické blanky. V prostoru mezi lamelami se nachází základní hmota, hladké svalové buňky a retikulární vlákna. Obrázek 1: Stavba stěny arterie http://fau.pearlashes.com/anatomy/chapter%2032/chapter%2032.htm (6. 4. 2013) (58) 3. Ateroskleróza Ateroskleróza je onemocnění, které je charakterizováno endoteliální dysfunkcí a zánětlivou reakcí postihující cévy (9). Postižení se týká velkých a středně velkých arterií svalového typu. Dochází k přestavbě intimy cévy nahromaděním lipidů a zbytků buněk vedoucí k formování aterosklerotického plaku. Ateroskleróza je komplexní proces, který zahrnuje mnoho událostí. Mezi nejvýznamnější události aterosklerózy patří dysfunkce endotelu, oxidace lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL), aktivace určitých druhů buněk a produkce chemokinů. 3.1 Hypotézy vzniku aterosklerózy Za posledních 150 let vzniklo několik teorií, které se snažily vysvětlit procesy spojené se vznikem aterosklerózy (10). V současné době jsou předmětem zájmu tři hypotézy, které se nevylučují, ale každá z nich přikládá důležitost jinému procesu vedoucí k rozvoji aterosklerózy. Jedná se o hypotézu oxidativní modifikace, reakce na poškození (response-to-injury) a reakce na zadržování (response-to-retention). 14

Hypotéza oxidativní modifikace vychází z poznatku, že je pro všechna stádia aterosklerózy charakteristická přítomnost pěnových buněk (11). Za účelem zjištění, pomocí jakých receptorů dochází k endocytóze lipoproteinů, použili Brown a Goldstein acetylované LDL (low density lipoprotein) částice. Ty jsou internalizovány scavengerovými receptory za vzniku pěnových buněk, nicméně nebyla prokázána přítomnost acetylovaných LDl částic in vivo. O dva roky později, Henriksen a spol. zjistili, že endotelové buňky jsou schopné modifikovat LDL částice tak, že dochází k jejich pohlcování makrofágy také pomocí scavengerových receptorů. Steinbrecher a spol. prokázali inkubací endotelových buněk a LDL částic oxidativní modifikaci LDL. 3.2 Faktory vyvolávající aterosklerózu 3.2.1 Neovlivnitelné Věk Stárnutí vede k vaskulární remodelaci (12). Intima a medie se ztlušťují. Dochází k postupné ztrátě arteriální elasticity. V médii se ukládá více kolagenu na úkor hladkých svalových buněk, snižuje se obsah elastinu. Zvýšená tuhost cév může vést k hypertenzi. Pohlaví Estrogen vykazuje v kardiovaskulárním systému protektivní vlastnosti, např. snižuje insulinovou rezistenci, koncentraci LDL cholesterolu (za zvýšení HDL (hight density lipoprotein) cholesterolu), inhibuje intravaskulární akumulaci kolagenu, způsobuje vazodilataci krevních cév (13). Během menopauzy dochází ke změnám lipidového metabolizmu. Zvyšuje se hladina celkového cholesterolu, zvyšuje se riziko vzniku metabolického syndromu. 3.2.2 Ovlivnitelné Hypertenze - U pacientů trpících vysokým krevním tlakem je často zvýšená koncentrace angiotenzinu II (14). Vazbou na specifické receptory hladkých svalových buněk aktivuje fosfolipázu C, zvyšuje se intracelulární koncentrace vápníku a tak dochází ke svalové kontrakci, zvýšené syntéze proteinů a svalové hypertrofii. Dále zvyšuje aktivitu lipoxygenázy s hladkých svalových buňkách, což zvyšuje oxidativní modifikaci LDL částic. 15

Diabetes mellitus (DM) - Endotel diabetiků je mnohem náchylnější ke vzniku aterosklerotických plaků než endotel zdravých jedinců (9). V důsledku dysfunkce endotelu a zvýšené koncentraci volných mastných kyselin dochází ke snížené produkci oxidu dusnatého (NO) a tím k poruše vazodilatace. Zvýšená koncentrace volných mastných kyselin usnadňuje tvorbu oxidovaného LDL (ox-ldl). Obezita - Obezita nejenže může vést k inzulinové rezistenci a rozvoji diabetu, ale také přispívá k aterogenní dyslipidémii (15). Tuková tkáň může také produkovat cytokiny jako např. tumor nekrotizující factor α (TNF-α) a interleukin 6 (IL-6). Kouření Mnohé studie ukazují, že kouření redukuje expresi endotelové syntázy oxidu dusnatého (enos) a s ním i související produkci oxidu dusnatého (9). Cigaretový kouř redukuje počet endotelových progenitorových buněk a zabraňuje jejich diferenciaci a správné funkční aktivitě. Důsledkem je porucha funkce endotelu a snížený růst cév. Infekce V aterosklerotickém plaku může docházet k infekci způsobené mikrobiálními původci jako např. Chlamydia pneumonia (16). Tato bakterie je obligátně intracelulární organizmus, který dokáže infikovat hladkou svalovinu, endotelové buňky a makrofágy. Dále se mohou uplatnit heat schock proteins (HSPs), které mohou u lidí způsobit ztluštění intimy a kalcifikaci koronárních arterií. C-reaktivní protein (CRP) Regulátor produkce CRP během akutní fáze zánětu je IL-6 (9). CRP váže různé autologní a cizorodé ligandy, např. apoptotické buňky, nativní a modifikované lipoproteiny, fosfolipidy. Vazbou dochází k aktivaci klasické cesty aktivace komplementu. V endotelu stimuluje CRP produkci endotelinu-1, snižuje produkci NO a zvyšuje produkci superperoxidu. Homocystein Homocystein vykazuje vůči endotelovým buňkám toxicitu (14). Dále způsobuje zvýšenou produkci kolagenu a podněcuje vznik trombu. 3.3 Vývoj aterosklerózy: Ateroskleróza se vyvíjí postupně, dochází ke změnám ve stěně arterií důsledkem kumulace lipidů bohatých na cholesterol doprovázených zánětlivou reakcí (17). V pozdních stádiích vývoje se mohou vyskytovat individuální rozdíly. Vývoj aterosklerózy můžeme popsat jako sérii lézí viditelných okem (a) nebo na úrovni histologických změn (b). 16

a) 1. Lipidní proužkování: Tyto změny se mohou objevit již v dětství a u dospívajích (17). Při zvýšené koncentraci LDL částic dochází k jejich přestupu z krevního řečiště do intimy arterie. Zde dochází k jejich enzymatické modifikaci. Ox-LDL vyvolávají zánětlivou reakci v intimě. Dochází k aktivaci endotelu a spolu s hladkými svalovými buňkami v intimě produkují řadu chemokinů, které přivábí monocyty, lymfocyty, neutrofily. Po vstupu do intimy se monocyty diferencují na makrofágy, které se pohlcováním lipidových částic mění na pěnové buňky. K těmto změnám často dochází v místech, kde je intima zesílená vlivem hemodynamického tlaku. 2. Časný fibroaterom: Akumulují se makrofágy a další buňky, které se podílejí na zánětlivé reakci (17). Na extracelulární proteoglykany produkované hladkými svalovými buňkami se váží lipidy. Nekróza buněk a akumulace extracelulárních lipidových částic vede k formování nekrotického jádra, které může tvořit až 30-50% objemu arteriální stěny. Pod endotelem vzniká fibrózní čepička chránící nekrotické jádro. 3. Pokročilý fiboaterom, ruptura plátu: Toto stadium se objevuje u osob starších 55 let (17). V tomto stádiu hrozí vysoké riziko ruptury plátu v důsledku produkce proteolytických enzymů, které ztenčují ochrannou vazivovou čepičku, tyto plaky se nazývají jako nestabilní. Zvětšující se objem aterosklerotického plaku může vést ke stenóze cévy a tím zapříčinit ischemickou chorobu. Po ruptuře vzniká v lumen cévy trombus, který je příčinou infarktu myokardu nebo mrtvice. Trombogenní vlastnost léze je dána produkcí tkáňového faktoru makrofágy a endotelovými buňkami v důsledku oxldl a infekce (18). Stabilita pokročilých ateroslerotických plaků může být dale ovlivněna kalcifikací a neovaskularizací. 17

Obrázek 2: Schema vývoje aterosklerózy http://www.knowabouthealth.com/glossary-common-heart-disease-terms/1154/ (27. 3. 2013) (59) b) 1. Léze I Změny v histologické stavbě cévy jsou minimální (19). V intimě se objevují malé izolované skupiny makrofágů, které obsahují v cytoplazmě lipidové kapičky. Léze tohoto typu se objevují nejčastěji u dětí. 2. Léze II (lipidní proužkování) Stádium nazávané lipidní proužkování, které se na povrchu arterií může projevit jako viditelné žlutě zbarvené proužky či skvrny (19). Makrofágy tvoří těsně přilehlé vrstvy. Lipidové kapičky v cytoplazmě mohou obsahovat i hladké svalové buňky. Vyskytují se, i když v nízkém počtu, i T lymfocyty. Oproti zdravé intimě je zvýšen počet žírných buněk. Lipidy se nacházejí především intracelulárně, a to hlavně v makrofázích. Největší podíl lipidů tvoří estery cholesterolu, dále cholesterol a fosfolipidy. 18

3. Léze III (pokročilá léze) Hromadí se lipidy v extracelulárním prostoru pod vrstvou makrofágů a pěnových buněk (19). Dochází k migraci hladkých svalových buněk z medie (1). Zvyšuje se množství volného cholesterolu, mastných kyselin a triglyceridů oproti lézi II typu (19). 4. Léze IV (aterom) Plaky tohoto stupně vývoje vykazují celkem homogenní celulární strukturu (4). Dochází ke kvantitativnímu nárůstu extracelulárních lipidů oproti lézi III. Typu, složení lipidů je stejné. V extracelulárním prostoru se také nacházejí vlákna tvořená hlavně kolagenem I-III. Povrch léze může být zvrásněn, což způsobuje vychytávání krevních destiček. 5. Léze V (fibroaterom) Charakteristickým znakem aterosklerotického plaku je lipidové jádro (10). Obsahuje krystalky cholesterolu vzniklé nekrózou pěnových buněk. Lipidové jádro je chráněno fibrózní čepičkou a myeloproliferativní tkání, která sestává z hladkých svalových buněk a extracelulární matrix. Přechod mezi lipidovým jádrem a zdravou tkání arterie je tvořen na rozdíl od hypocelulárního jádra variabilní kompozicí hladkých svalových buněk, makrofágů a T lymfocytů. K ruptuře plaku dochází s největší pravděpodobností v této oblasti. Tyto plaky označujeme jako Va, naproti tomu léze typu Vb mají menší nekrotické jádro a vyšší podíl extracelulární vláknité matrice, která zaručuje menší riziko ruptury plátu (4). 6. Léze VI (komplikovaná léze) Léze tohoto typu mají složitou strukturu, objevují se kalcifikované vláknité oblasti s viditelnou ulcerací (10). Tyto plaky často způsobují arteriální embolizaci. Ve fibrózní čepičce dochází k akumulaci makrofágů, které produkují metaloproteinázy, kolagenázy a elastázy, což způsobuje její degradaci a zvyšuje se tak riziko ruptury (14). Aktivované T lymfocyty stimulují produkci metaloproteináz makrofágy. Zároveň dochází k produkci tkáňového faktoru a dalších hemostázových faktorů zvyšující riziko vzniku trombu. 19

4. Endotel 4.1 Funkce endotelu: Dříve byl endotel pokládán za inertní vystýlku všech cév tvořící fyzikální překážku mezi stěnou cévy a krevním řečištěm (8). Dnes je endotel považován za životně důležitý endokrinní orgán, který vykonává mnoho důležitých funkcí. Mezi nejdůležitější funkce endotelu patří (20): a) Brání vzniku trombu b) Tvoří permeabilní vrstvu umožňující výměnu látek mezi krví a arteriální stěnou c) Moduluje vazokonstrikci a vazodilataci produkcí NO, prostacyklinu a endotelinu d) Produkuje řadu cytokinů a růstové faktory e) Zabraňuje adhezi leukocytů f) Modifikuje lipoproteiny prostupující do arteriální stěny 4.2 Endotelová dysfunkce: Rizikové faktory aterosklerózy (popsané výše) iniciují dysfunkci endotelu (1). Způsobují poškození endotelu, které vede ke zvýšení propustnosti pro lipidy a zánětlivé buňky. Dalším důsledkem dysfunkce endotelu je snížení produkce NO. Při vývoji aterosklerotického plaku dochází k migraci hladkých svalových buněk z medie do intimy. Během migrace dochází k fenotypové přeměně z kontraktilní jednotky na jednotku syntetizující (1). Kontraktilní forma hladkých svalových buněk reaguje na vazokonstrikční a vazodilatační faktory (katecholaminy, leukotrieny, NO), kdežto syntetizující forma produkuje cytokiny (20). Fenotyp hladkých svalových buněk závisí na produkci NO endotelem, NO zastává ale i další velmi důležité funkce (1). Oxid dusnatý je důležitým produktem endotelové tkáně (21). Udržuje homeostázu regulací cévního tonu. Je produkován nepřetržitou aktivitou endotelové syntázy oxidu dusnatého. NO inhibuje proliferaci hladkých svalových buněk, agregaci destiček, adhezi destiček a monocytů na povrch endotelu, LDL oxidaci, expresi adhezivních molekul na povrchu endotelu (22). Poruchy všech těchto funkcí jsou důsledkem snížené produkce NO a snížené antioxidační schopnosti enzymu, což vede ke vzniku nejen aterosklerózy, ale také ICHS, DM, rejekci transplantátu a další. 20

4.3 Adhezní molekuly endotelu Molekuly, které zprostředkovávají interakci mezi buňkou a vnějším prostředím, se nazývají adhezní molekuly (9). Jsou to transmembránové proteiny, které se skládají z části intracelulární, která je v kontaktu s cytoskeletem buňky, dále domény transmembránové a extracelulární. Extracelulární doména interaguje s adhezními molekulami stejného druhu tvorbou homofilních vazeb, nebo s jinými adhezními molekulami nebo s extracelulární matrix pomocí heterofilních vazeb. Adhezní molekuly dělíme do několika skupin: Selektiny Adheze leukocytů na povrch endotelu se uskutečňuje pomocí selektinů, dochází k jejich aktivaci a je podnícen rozvoj zánětlivé reakce a trombózy (23). Selektiny zahrnují tří odlišné glykoproteiny, které jsou pojmenovány podle toho, na kterém typu buněk se nacházejí. L-selektin se nachází na leukocytech, E-selektin je specifický pro endotel a P-selektin se nachází na krevních destičkách, ale také se objevuje na endotelu. K zastavení zánětlivé reakce je velmi důležité, aby tyto molekuly byly po aktivaci odstraněny z buněčného povrchu. Po aktivaci buněk jsou odstraňovány internalizací, pomocí lysozomů (P- a E- selektiny) nebo protelýzou (L- a E- selektiny). Molekuly podobné imunoglobulinům Jsou membránové glykoproteinové receptory obsahující variabilní počet extracelulárních Ig domén (23). Intercelulární adhezivní molekuly (ICAM intercellular adhesion molecules) patří do rodiny o pěti členech. ICAM-1 se nachází na povrchu leukocytů a endotelu v nízké koncentraci, zvyšuje se vlivem zánětlivých cytokinů. ICAM-2 se nachází na povrchu leukocytů, krevních destiček a endotelu. ICAM-3 se také nachází na endotelu a leukocytech, jako jediný člen rodiny ICAM se nachází na neutrofilech. ICAM-1,2,3 zprostředkovávají adhezi leukocytů na aktivovaný povrch endotelu za vzniku silných vazeb s integriny, což usnadňuje lukocytární extravazaci. Mezi tento typ receptorů patří také PECAM-1 (platelet endothelial cellular adhesion molekule 1), který se nachází na leukocytech, krevních destičkách a endotelu. Dále sem patří VCAM-1 (vascular cell adhesion molekule 1) se nachází na endotelu, může se ale nacházet na jiných typech buněk makrofázích, myoblastech a dendritických buňkách. 21

Integriny Molekula integrinů je složena ze dvou podjednotek α, β (24). Nacházejí se ve dvou stavech odlišných v afinitě ke svým ligandům. V klidovém stavu vykazují integriny nízkou afinitu, aktivací se dostávají do vysokoafinního stavu. Leukocytární integriny spadají do skupiny β2 integrinů, hlavní adhezivní molekulou je CD11a/CD18, který váže ICAM-1,2,3. Hladina rozpustných adhezních molekul koreluje s rizikovými faktory aterosklerózy (23) Zvýšená koncentrace byla prokázána i u lidí s inzulinovou rezistencí a chronickém selhání ledvin. Obrázek 3: Adheze a průnik neutrofilů endotelem http://mulla.pri.ee/kelley's%20textbook%20of%20rheumatology,%208th%20ed./ht ML/85.htm (6. 4. 2013) (60) 4.4 Apoptóza endotelových buněk Apoptóza endotelových buněk přispívá k patogenezi aterosklerózy a dalších cévních onemocnění (25). OxLDL způsobuje pomalé zvyšování intracelulárního vápníku v endotelových bukách, což vede k jejich zániku. Tomuto fenoménu zabraňuje HDL, který brání zvyšování intracelulárního vápníku a také inhibuje nekrotický účinek TNF-α. 22

5. Lipoproteiny Lipidy jsou hydrofóbní látky, které jsou v plazmě transportovány pomocí vazby na proteiny (26). Tyto částice se nazývají lipoproteiny. Mají nepolární jádro tvořené triacylglyceroly a esterifikovaným cholesterolem, polárnější obal je tvořen volným cholesterolem, fosfolipidy a bílkovinami zvané apolipoproteiny. Dělí se do pěti tříd dle hustoty a elektroforetické pohyblivosti. Kromě transportu lipidů jsou důležité pro syntézu a sekreci specifických lipoproteinů, vazbou na specifické receptory zajišťují odstranění lipoproteinů z krevního oběhu a aktivují enzymy modifikující lipoproteiny. Ve vztahu se vznikem aterosklerózy je důležitá hladina cholesterolu v krvi (26). Rozmezí hladin v séru u dospělých osob se nachází mezi 3,5-5,2 mmol/l. U 60% pacientů postižených ICHS byla hladina cholesterol zvýšena nad 6,1 mmol/l. Riziko ICHS s rostoucí koncentrací cholesterolu v krvi roste exponenciálně, stanovení hladiny celkového cholesterolu slouží spíše jako orientační stanovení rizika. 5.1 Transport lipidů Lipidy v potravě jsou vstřebány v tenkém střevě, v krvi jsou transportovány chylomikrony do periferních tkání (27). K uvolnění mastných kyselin z chylomikronů musí dojít k jejich enzymatické degradaci, ve svalech a tukové tkáni k tomu dochází díky lipoproteinové lipáze. Zbytky chylomikronů jsou vychytávány játry. V játrech dochází k syntéze lipoproteinu s velmi nízkou hustotou (VLDL), který obsahuje ApoB. Lipolýzou VDLD lipoproteinovou lipázou vzniká LDL částice. 5.2 LDL částice 5.2.1 Struktura: LDL částice se skládá z apolipoproteinu B-100 (ApoB-100), neutrálních a polárních lipidů, dále obsahuje také ve své struktuře lipofilní antioxidanty vitamin E a β-karoten (11). Po vstupu do intimy jsou LDL částice oxidovány enzymaticky jako např. myeloperoxidázou a lipoxygenázou, nebo podstupují neenzymatickou oxidaci. 23

5.2.2 Oxidace: K oxidačním změnám dochází hlavně v subendoteliálním prostoru arteriální stěny, kde je koncentrace antioxidantů nižší (28). Při probíhajícím zánětu jsou LDL oxidovány přítomnými neutrofily a makrofágy. K oxidaci může docházet i intracelulárně, nejčastěji v lysozomech makrofágů. V arteriální stěně dochází k produkci oxidantů radikálového i neradikálového charakteru např. superoxid, hydroxylové radikály a další. Tyto látky jsou produkovány NADPH oxidázami (NO syntáza, myeloperoxidáza, lipoxygenáza). Oxidace LDL částic může být vyvolána i proteiny obsahující ve své molekule železo (ferritin, transferin, hemo- a myo-globin) a měď (ceruloplazmin). Volné radikály způsobují oxidaci polynenasycených mastných kyselin. Produkty této reakce po navázání na specifické receptory derivatizují ApoB. Oxidanty neradikálového charakteru (peroxid vodíku) modifikují proteiny přímým působením. 5.2.3 Oxidované LDL částice a imunitní reakce T-lymfocyty aktivované oxldl částicemi vyvolávají zvýšenou expresi molekul hlavního histokompatibilního komplexu II. třídy (HLA-II. třídy) v krevních monocytech (11). Dále tyto specifické T lymfocyty podporují izotypový přesmyk v B lymfocytech, které produkují protilátky namířené proti modifikovaným LDL částicím. V aterosklerotickém plaku tvoří 70% T lymfocytů subpopulace CD4+ (11). Většina CD4+ T lymfocytů je typu Th1, které jsou hlavním zdrojem interferonu γ (IFNγ) a TNF. IFN-γ inhibuje produkci kolagenu hladkými svalovými buňkami a nepřímo způsobuje jeho degradaci zvýšením produkce metaloproteináz (29). Aktivované T lymfocyty potencují produkci silného prokoagulantu tkáňového faktoru (TF), což zvyšuje trombogenní vlastnost lipidového jádra. 5.3 HDL částice 5.3.1 Struktura a syntéza HDL je sférická částice, jejíž hydrofobní jádro je tvořeno hlavně estery cholesterolu (částečně i triglycerolem), obal je tvořen jednou vrstvou fosfolipidů (hlavně fosfatidylcholinem) a apolipoproteinů (30). Dva hlavní proteiny apolipoprotein A-I (ApoA-I) tvoří asi 70% apo-hdl, zatímco apolipoprotein A-II (ApoA-II) jen 20%. 24

ApoA-I je syntetizován v játrech (70% tvorby) a ve střevě (30% tvorby) ve formě chudé na lipidy nebo zcela bezlipidové (30). Syntéza ApoA-II probíhá pouze v játrech, po sekreci do krve vzniká částice obsahující ApoA-I a ApoA-II (31). Forma ApoA-I chudá na lipidy okamžitě po sekreci váže cholesterol a fosfolipidy, zejména v hepatocytech a enterocytech. V počátečních fázích je tato vazba zprostředkována pomocí ATP vázajícího kazetového membránového přenašeče (ABCA-1), vedoucí k tvorbě formující se (nascentní) HDL částice (31). Nascentní HDL částice váže další fosfolipidy a volný cholesterol pocházející z extrahepatických tkání. Vazba fosfolipidů (eventuálně apolipoproteinů) probíhá hydrolýzou lipoproteinů bohatých na triglyceridy. Transport fosfolipidových zbytků z povrchu lipoproteinů na HDL částici je zprostředkován pomocí proteinu transportujícího fosfolipidy (31). Tyto fosfolipidy jsou nejen stavební součástí HDL částice, ale slouží jako substrát pro esterifikaci HDL cholesterolu. Esterifikace cholesterolu je katalyzována lecitin-cholesterolovou acyltransferázou. Obrázek 4: Struktura lipoproteinů http://www.revespcardiol.org/en/lipoproteins-platelets-andatherothrombosis/articulo/13142654/ (6. 4. 2013) (61) 25

5.3.2 Funkce Antioxidační Normální HDL částice obsahuje antioxidační proteiny a enzymy (32). Antioxidační působení HDL částic lze rozdělit na přímé a nepřímé. HDL přímo inhibuje oxidaci LDL částic a fosfolipidů. Transportem lipidových hydroxiperoxidů z LDL brání řadě oxidačních reakcí způsobené volnými radikály. Produkty pokročilé oxidace fosfolipidů slouží jako ligandy pro scavengerové receptory typu B a usnadňují tak pohlcování modifikovaných fosfolipidů makrofágy, a mají protrombotický efekt působením na scavengerový receptor krevních destiček CD36, který je inhibován odstraněním oxidačním produktů. Některé produkty oxidace mohou modifikovat lyzinové zbytky v ApoB, které reagují se scavengerovým receptorem typu A (SR-A) a scavengerovým receptorem endotelu (SREC). Inhibuje apoptózu endotelových buněk, agregaci krevních destiček a expresi protrombotického faktoru (31). HDL částice odstraňují nadbytečný cholesterol z pěnových buněk v aterosklerotickém plaku (31). Přebytečný cholesterol je transportován do jater a vyloučen žlučí. Prvním krokem reverzního transportu cholesterolu je hydrolýza esterů cholesterolu za vzniku volného cholesterolu. Vyloučený volný cholesterol z buňky se váže na zralou HDL částici nebo na extracelulární ApoA-I chudou na lipidy. Eflux cholesterolu je aktivní proces zprostředkován ABCA1 a ATP vázající kazetový transportér G1. 6. Makrofágy Jedním z mechanizmů, kterým makrofágy udržují homeostázu ve tkáni, je pohlcováním apoptotických částic ve tkáni (33). K tomu jim slouží scavengerové receptory. Makrofágy hrají důležitou roli v imunitní odpovědi např. vůči mikrobiálním patogenům. Oxidativně modifikované lipoproteinové fosfolipy vykazují podobné antigenní struktury jako mikrobiální. 6.1 Průnik endotelem Makrofágy jsou jednou z hlavních komponent aterosklerotických plaků (33). Pokud probíhá v cévní stěně zánětlivá reakce, dochází k rekrutaci leukocytů do postižené tkáně (34). Je to dobře regulovaný proces, který sestává z několika kroků: 26

Tzv. rolling monocytů a lymfocytů na povrchu zaníceného endotelu, který je zprostředkován selektiny Adheze molekul zprostředkovaná chemokiny a jejich receptory, nebou vazbou mezi selektiny a P-selektin glykoproteinovým ligandem-1 Adheze umožněná integriny Migrace přes endotelovou vrstvu 6.2 Aktivace makrofágů: Makrofágy vznikají diferenciací monocytů původem z kostní dřeně po uvolnění do periferních tkání (33). Pro chemotaxi, proliferaci, differenciaci a aktivaci monocytů a makrofágů hraje důležitou roli růstový faktor stimulující kolonie makrofágů (M-CSF). Vzniká populace nepolarizovaných makrofágů označovaných M0 (35). Pokud jsou tyto makrofágy stimulovány IFN-γ (produkovaného NK buňkami a T lymfocyty) a lipopolysacharidy, vzniká fenotyp M1, který produkuje TNF-α a IL-12. M1 makrofágy jsou aktivovány klasickou cestou, zatímco další populace makrofágů, M2, je aktivována cestou alternativní (36). Diferencované makrofágy v aterosklerotickém procesu vykazují řadu receptorů: pattern recognition receptor (PRRs), kam se zařazují scavengerové receptory (třídy A a B) (37). Třída A se skládá ze tří typů AI, AII, AIII, do třídy B patří receptory CD36 a typ BI a BII. Makrofágy zastávají v organizmu důležitou roli jako spojovací článek mezi vrozenou a adaptivní imunitou. Produkcí IL-12,15 a 18 napomáhají aktivované makrofágy vyvolat aktivitu pomocných T-lymfocytů v aterosklerotickém procesu. 6.3 Akumulace lipoproteinů v makrofázích Makrofágy mohou pohlcovat lipoproteiny několika mechanismy: Fagocytóza LDL částic vede k jejich rychlé lysozomální degradaci (38). Hydrofobní materiál může být také pohlcen mechanizmem zvaným patocytóza. Při fagocytóze se tvoří vakuoly, které se oddělí od membrány. U patocytózy k tomuto jevu nedochází, pohlcované částice se hromadí v cytoplazmatickém labyrintu vakuol, který je stále spojen s buněčným povrchem. Pohlcování tekutých složek makrofágy se nazývá pinocytóza (vznikají malé vezikuly) nebo makropinocytóza (vznikají velké vakuoly). Oxidované LDL částice se hromadí v lysozomech, kde dochází k hydrolýze na cholesterol a mastné kyseliny (39). 27

6.4 Apoptóza makrofágů Pohlcením oxidovaných lipidů může dojít k apoptóze makrofágů, což může vést v časných stádiích aterosklerózy k redukci progrese (35). Příliš vysoký příjem apoptotických částic a oxidované fosfolipidy způsobují poruchu endoplazmatického retikula. Porucha eferocytózy (schopnost M2 makrofágů fagocytovat apoptotické částice ) vede ke vzniku sekundární nekrózy. Dochází k uvolnění jejich intracelulárního obsahu, což zvyšuje zánětlivou reakci a formuje se nekrotické jádro. Obrázek 5: Vývoj makrofágů v ateroskleróze http://www.nature.com/nature/journal/v420/n6917/fig_tab/nature01323_f1.html (6. 4. 2013) (62) 28

7. Niacin Niacin (vitamin B 3 ) je součástí nikotinamidadenindinukleotidu (NAD) a nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADP) (40). Je esenciální pro syntézu tuků, růst a energetický metabolizmus. Deficit niacinu v organizmu je známý jako pelagra. Její projevy jsou označovány jako tři D, neboli dermatitida, diaera, demence. Neléčená pelagra končí smrtí. 7.1 Mechanizmus účinku: Niacin způsobuje vasodilataci kapilár prostřednictvím histaminu (40). V důsledku toho dochází k přechodnému zarudnutí kůže. Dalšími nežádoucími účinky užívání niacinu může být nauzea, břišní nevolnost, závrať. Grundy, Mok, Zech, & Berman (1981) prokázali, že kyselina nikotinová redukuje cholesterol a triglyceridy v plazmě (41). Hladiny triacylgylcerolů jsou sníženy cestou lipoproteinové lipázy zvýšením VLDL clearance (42). Merrill & Lemley-Stone (1957) ve své studii prokázali efekt orálně podávané kyseliny nikotinové zabraňující ukládání cholesterolu v aortě a v játrech (43). Při dlouhodobém užívání niacinu dochází k inhibici syntézy cholesterolu (42). Zvyšuje se hladina HDL a ApoA-1 v plazmě díky sníženému katabolizmu HDL. Niacin pravděpodobně zabraňuje sekreci VLDL částic, a tím tvorbu LDL. Dále niacin snižuje hladinu fibrinogenu za zvýšení koncentrace tkáňového aktivátoru plazminogenu (42). Niacin snižuje akutní cévní zánět a tak chrání před dysfunkcí endotelu nezávisle na změnách koncentrace HDL a plazmatických lipidů (44). 7.2 Použití: Niacin se používá k léčbě hypercholesterolemie (42). U nemocných postižených heterozygotní familiární hypercholesterolemií v kombinaci s pryskyřicemi vázajícími žlučové kyseliny stabilizuje hladinu LDL. Niacin dále snižuje koncentraci triacylgylcerolů v plazmě u nemocných trpících těžkou smíšenou lipidémií, u kterých nedocházelo ke zlepšení stavu dietou. 29

8. Zvířecí modely Ke studiu aterosklerózy byly dlouho používány velké zvířecí modely jako vepř, králík, primáti, křeček (45). Některé modely vykazují určité zvláštnosti, které nejsou pro studium aterosklerózy vhodné. Naopak u vepřů je vývoj i složení aterosklerotické léze podobná jako u lidí. Použitím zvířecích modelů vedlo k důležitým objevům. U prasete bylo zjištěno, že infiltrace monocytů je jednou z prvotních událostí aterosklerotického procesu. I když je prasečí model velmi vhodný pro studium aterosklerózy, jejich velkou nevýhodou je problematický chov a cena. 8.1 Myší model: Myš je vůči vzniku aterosklerózy rezistentní (většina plazmatického cholesterolu je nesena v HDL částicích), výjimkou je kmen C57BL/6, který sloužil jako první myší model aterosklerózy (45). Vznik aterosklerózy byl u nich podmíněn speciální cholesterolovou dietou. Nevýhodami byl vznik velmi malých lézí v aortě, které nebyly dostatečně reprodukovatelné, a které se odlišovaly od lidských aterosklerotických plaků. Dnes, díky prostudovanosti myšího genomu a pokrokům v molekulární biologii, je možné zabudovat do genomu mnoha živočišných druhů exogenní transgeny (46). Myší model je v tomto případě unikátní díky možnému vyřazení nebo nahrazení určitého endogenního genu. 8.2 Geneticky modifikované myší modely: V roce 1992 byl vytvořen myší model, u kterého byl inaktivován gen pro apolipoprotein E (45). Cholesterolová dieta (western-type) výrazně urychluje u těchto myší vznik aterosklerotických plátů. Vývoj aterosklerózy je u těchto myších modelů podobné jako u člověka, podobnost se vyskytuje i u histologického složení aterosklerotických plátů. Dalším důležitým modelem pro studium aterosklerózy je LDL receptor deficientní myš, u které bylo zjištěno dvojnásobné zvýšení plazmatického cholesterolu a až devětkrát vyšší nárůst lipoproteinů o střední hustotě (IDL) a LDL než u běžných myší (47). Nejnovější myší model je ApoE/LDLR deficientní myš (45). Progrese aterosklerózy je u tohoto druhu mnohem výraznější v porovnání s ApoE deficientní myší, který umožňuje sledovat antisklerotický efekt látek bez aterogenní diety. 30

9. Experimentální část: 9.1 Cíl práce, zadání práce Jedním z cílů této bakalářské práce bylo nastavit imunohistochemické metody pro detekci makrofágů v arteria brachiocephalica ApoE/LDLR deficientních myší. Dále jsme se zaměřili na kvantifikaci exprese (množství) makrofágů u myší, kterým byla podávána dieta s nízkým obsahem cukrů a vysokým obsahem proteinů a u myší, kde byla do dieta přidáván kyselina nikotinová. K vlastní kvantifikaci byly využity stereologické metody. 31

10. Experimentální část 10.1 Použité zvířecí modely, chov V naší studii jsme použili ApoE/LDLR deficientní myší samice 16-18 týdnů staré, u kterých došlo k rozvoji spotánní aterosklerózy. Zvířata byla chována ve skupině v temperovaném prostředí (22-25 o C) se střídáním světla a tmy po 12 hodinách a volným přístupem k vodě a potravě. 10.2 Dieta Do věku 16-18 týdnů byly myši na bezcholesterolové dietě krmeny komerčně dostupnými granulemi (Sniff M-Z Spezialdiäten GmbH; Soest, Germany). Poté byly rozděleny do skupin podle hmotnosti a krmeny AIN-93G dietou. Každá skupina měla 6 jedinců. LCHP skupina byla krmena dietou s nízkým obsahem sacharidů a vysokým obsahem proteinů po dobu 8 týdnů. LCHP skupina s kyselinou nikotinovou byla krmena dietou s nízkým obsahem sacharidů a vysokým obsahem proteinů po dobu 4 týdnů. Další 4 týdny byla krmena stejnou dietou s přídavkem 1% kyseliny nikotinové. Myši byly uspány 4 hodiny před eutanásií, vzorky krve byly odebrány z levé srdeční komory do zkumavek, centrifugovány a následně byly odebrány vzorky sér. Vzorky byly hluboce zamrazeny (-80 o C) a uskladněny do další analýzy. 32

10.3 Použitý materiál Primární protilátka K detekování makrofágů v preparátu byla použita Rat Anti-Mouse macrophage ředěná bovinním sérovým albuminem v poměru 1:100 (Pharmigen, USA). Sekundární protilátka Jako sekundární protilátka byla použita monoklonální protilátka ImmPRESS Anti-Rat Ig (Mouse adsorbed (peroxidase) Polymer Detection Kit, Vector laboratories, USA), ředěno myším sérem x0,02. Detekce Vizualizace navázaných protilátek byla provedena užitím roztoku diaminobenzidinu (DAB systém substrát chromogen, Dako, Dánsko). Pozitivní reakce se vybarvuje hnědou barvou. 10.4 Postup práce 1. Preparáty byly fixovány v roztoku acetonu po dobu 20 minut při teplotě -20 stupňů Celsia, poté se nechaly oschnout na vzduchu při laboratorní teplotě po dobu 20 minut. Poté jednotlivé řezy obkroužíme hydrofobní bariérou. 2. Suché preparáty byly promývány v roztoku PBS (1:10) 2 5minut. 3. Pro blokaci nespecifických vazeb primární protilátky bylo použito Ready-to-go 2.5% normal goat sérum po dobu 30 minut. 4. Následně byla aplikována primární protilátka (1:100), doba inkubace byla 60 minut. Poté byly preparáty opláchnuty v roztoku PBS (2 5minut). 5. Preparáty byly vloženy do 3% roztoku peroxidu vodíku (8ml peroxidu vodíku+70ml PBS) na 15 minut. Následně byly preparáty promyty roztokem PBS (2 5minut). 6. Poté byl aplikován Impress reagent (ready to use+mouse serum ( 0,02)) po dobu 30 minut, posléze byly preparáty opět promyty v roztoku PBS (2 5minut). 7. K vizualizaci reakce byl použit DAB (10µl v 500µl pufru), doba barvení byla 5 vteřin, preparáty byly ponořeny do roztoku PBS. 8. Jádra buněk byla obarvena hematoxylinem 1/5 po dobu 5 vteřin, následné modrání trvalo 1 minutu pod mírným prudem tekoucí vody. 33

9. Preparáty byly propláchnuty v acetonu a odvodněny v acetonu-xylenu (10:1) 3 minuty, poté v acetonu-xylenu (1:10) na 3 minuty, v xylenu 3 2 minuty. Preparáty byly zamontovány v médiu Eukit. 10.5 Princip imunohistochemie Imunohistochemie se používá k průkazu specifických antigenů ve tkáni (48). Tato metoda je založena na schopnosti protilátky tvořit vazbu se specifickým antigenem. Tato protilátka se nazývá protilátka primární. Existuje několik způsobů detekce primární protilátky, a to použitím system avidin/biotin, katalyzované amplifikace signálu nebo metody využívající polymery. V naší práci byl použit systém ImmPRESS (polymerized reporter enzyme staining system), kde je sekundární látka značena enzymem-peroxidázou (49). 10.6 Kvantitativní analýza imunohistochemie stereologická analýza Kvantifikace plochy velikosti exprese makrofágů byla provedena prostřednictvím stereologických metod. Po nakrájení série o 100 řezech síly 7 µm se z referenčního objemu řezy systematicky náhodně vybraly. Pro každé barvení se první řez vybral náhodně, potom byl vybrán každý dvanáctý řez. Tím pádem osm barvených řezů se použilo ke stereologickému hodnocení. Použila se metody bodové testovací mřížky, ta se volila tak, aby bylo napočítáno přes 100 průsečíků mezi body sítě a barvením na makrofágy na jednu z cév. Odhadovaná barvená plocha se vypočítala dle vzorce: esta = a * P, kde a je plocha odpovídající 1 testovacímu bodu, P znamená počet průsečíků mezi body testovací sítě a pozitivitou barvení (50). 34

10.7 Statistická analýza Hodnoty v grafech jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM (střední chyba průměru) pro osm myší v každé skupině. Statistická významnost rozdílů ve skupinách se hodnotila t-testem za použití softwaru GraphPad Prism 5 for Windows Version 5.00 software (GraphPad Software, Inc, San Diego, California, USA). P hodnoty 0, 05 nebo menší byly považovány za statisticky významné. 35

11. Výsledky 11.1 Biochemická analýza U všech myší byla stanovena hladina celkového cholesterolu. Statisticky nebyl prokázán vliv diety, která obsahovala kyselinu nikotinovou na hladinu celkového cholesterolu (46,61 ± 2,792 mmol/l) ve srovnání s LCHP skupinou (42,11 ± 3,946 mmol/l) (p=0,3738). Tabulka 1: Naměřené hodnoty celkového cholesterolu u obou skupin myší Chol (mmol/l) LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. 42,14 44,18 60,3 42,52 45 45,5 45,38 43,3 22,64 47,76 46,32 47,24 36

11.2 Imunohistochemická analýza Imunohistochemická detekce makrofágů byla provedena na 96 sklíčkách s řezy z obou skupin myší. Imunohistochemická analýza potvrdila přítomnost makrofágů ve všech sledovaných cévách. Jejich lokalizace v plátu nebyla nijak specifická. Makrofágy byly také detekovány v intima media u některých cév (obr. 6). Při prohlížení všech řezů jsme nepozorovali rozdíly v expresi makrofágů mezi oběma studovanými skupinami (obr. 6). Všech 96 řezů bylo použito pro stereologickou analýzu. 37

Obrázek 6: Reprezentativní obrázky imunohistochemického barvení makrofágů u kontrolní skupiny zvířat. Hnědá barva znamená pozitivní reakci na makrofágy uvnitř aterosklerotických plátů (šipky). Řezy jsou dobarveny hematoxylinem. Zvětšení 100x. 38

Obrázek 7: Reprezentativní obrázky imunohistochemického barvení makrofágů u LCHP skupiny zvířat. Hnědá barva znamená pozitivní reakci na makrofágy uvnitř aterosklerotických plátů (šipky). Řezy jsou dobarveny hematoxylinem. Zvětšení 100x. 39

11.3 Stereologická analýza exprese makrofágů v truncus brachiocephalicus Stereologická analýza neprokázala statisticky významné rozdíly v expresi makrofágů u myší, kterým byla podávána LCHP dieta, ve srovnání se skupinou kde byla přidávána nikotinová kyselina 0,04475 ± 0,004800 mm 2 vs 0,04513 ± 0,003189 mm 2 (p=0,9483). Tabulka č. 2: Průměrné hodnoty ploch exprese makrofágů u obou skupin myší Mm 2 LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. LCHP skupina + nikotinová kys. 0,0252 0,0462 0,0426 0,0611 0,0430 0,0504 0,0579 0,0489 0,0413 0,0355 0,0408 0,0464 40