Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti LC-NMR 1 Jan Sýkora
LC/NMR Jan Sýkora (ÚCHP AV ČR)
LC - NMR 1 H NMR (500 MHz) mez detekce ~ 1 mg/ml (5 µmol látky) NMR parametry doba měření (at) ~ 2 s počet skenů (nt) ~ 4-1000 relaxační prodleva (rel) ~ 1 s On-flow Stop-flow mez detekce 1 mg/ml 0.01 mg/ml nástřik 20 µl 20 µg 0,1 µmol průtok* 0,5 ml/min - NMR parametry at = 1s nt = 4 rel = 0 s 200 ng 0.001 µmol at =2 s nt = 4-1000 rel = 1 s *solventy bez jakýchkoli organických látek LC MS mez detekce ~ ng - pg nástřik 1-2 µl průtok 0,4-1 ml/min* *solventy bez anorganických solí pseudo 2D NMR spektrum On-flow módu a jeho vrstevnicová projekce Dimethylcyklosiloxany (D3,D4,D5) C18, 100% ACN, V inj = 20ul, at = 1s, nt = 4, d1 = 0s, pad = 1s
NMR spektroskopie je založena na měření frekvencí jader atomů. Nejlépe se měří jádra se spinem ½, ty poskytují ve spektru jednu linii (1H-99,9 %, 13C-1 %, 29Si-4 % atd.). Frekvence jádra každého atomu závisí na jeho chemickém okolí a odráží především to, jak je jádro stíněno elektrony ve svém okolí. Frekvence je vztažena k frekvenci standardu a podělena frekvencí spektrometru. Uvádí se jako chemický posun v jednotkách ppm. Případná interakce s okolními jádry se projevuje štěpením signálu na multiplet. převzato z Bruker Almanach
Stabilizátory & Nečistoty v rozpouštědlech Acetone HPLC grade (Sigma-Aldrich) at = 1s d1= 1s nt = 4 thanol CHROMASOLV (Sigma-Aldrich) at = 1s d1= 1s nt = 32 Acetonitrile for UV Spectroscopy (Fluka) at = 1s d1= 1s nt = 4 Cyclohexane for GC residual analysis (Scharlau) at = 1s d1= 1s nt = 64
Analýza extraktu kopřivy dvoudomé 80% HPLC Acetonitrilu v CDCl 3 sitosterol *
HPLC rozpouštědla s chemicky i magneticky ekvivalentními vodíkovými atomy poskytují v 1 H NMR spektru pouze 1 signál. 1 signál rozpouštědla je pro LC-NMR nejvýhodnější, blokuje pouze úzkou část NMR spektra. Rozpouštědla nemusí být nutně deuterovaná jako u klasického NMR. Důležitá je čistota, jakékoli další látky obsahující vodíkové atomy blokují další oblasti a znemožňují detekci v danéčásti spektra. Z hlediska čistoty jsou v současné době k dispozici pouze tři rozpouštědla v čistotě vhodné pro LC-NMR... D 2 O (99,9% D) ~ 10.000,- Kč / l CDCl 3 (99,5% D) ~ 3.000,- Kč / l CH 3 CN ~ 3.000,- Kč / l tabulka převzata z katalogu firmy Phenomenex
Signály rozpouštědel jsme v současné době schopni efektivně potlačovat. Poloautomatický software je schopen potlačit až 7 signálů. Po potlačení dále následuje digitální filtrace dané frekvence. Citlivost se tak posunuje až o několik řádů. Většina signálů měřených látek je dokonce méně intenzivní než jsou signály uhlíkových satelitů obklopujících signál rozpoutědla (0.5% celkového signálu, dáno 1% výskytem izotopu 13 C), proto je často nutné zapojit dodatečný decoupling těchto signálů. V normálních 1 H NMR spektrech tyto signály většinou kvůli vysoké koncentraci měřené látky často nevidíme nebo nevnímáme. Potlačení signálu rozpouštědla H 2 O - THF V případě gradientové eluce je třeba nastavit potlačení signálů rozpouštědel před každou akumulací 4 skenů. Jak se mění poměry rozpouštědel, mění se v mnoha případech i poloha jejich signálů. Každé spektrum potom pořídíme během 15-ti sekund. U isokratické eluce stačí nastavit potlačení jednou na začátku měření. Spektra pak snímáme každých 5 sekund.
Stop-flow experiment chinin Mw=324.4 1.5 umol 0.5 mg
Spinasterol C 29 H 48 O 1 c = 6 mg/ml Nástřik 0,1 mg (20 ul) nt = 128 t ~ 7 minut COSY nt = 16 ni = 256 t ~ 1,5 hod. HSQC nt = 200 ni = 128 t ~ 15 hod.
nt = 1000 t ~ 1 h. Peak 1 Peak 2 Peak 3 COSY ~ 24 h. HSQC ~
Největší uplatnění nachází LC-NMR ve výzkumu farmaceutických firem. Nejčastěji se využívá k identifikaci nečistot doprovázejících aktivní látku. Určení nečistoty v generiku známého anorektika: Výsledky měření LC-MS naznačovaly, že nečistota bude pravděpodobně desmethylovaná. Na HPLC se však desmethyl sibutramin eluuje jasně první, jak se ukázalo na vzorku standardu. Pomocí LC-NMR bylo změřeno protonové spektrum nečistoty. Vzorek byl bohužel příliš zředěný, takže byla část signálů překryta a špatný poměr signálu k šumu znemožňoval integraci a měření 2D spekter (korelace vodíku s uhlíkem). Jedná se nicméně o autentické NMR spektrum látky při dané separaci s charakteristickým posunem NCH 3 skupiny. Po dodání standardu sibutramine desmethylu bylo naměřeno identické spektrum během simulace podmínek separace (poměry rozpouštedel a koncentrace pufru) po přidání HCl. Sibutramin desmethyl byl tedy ve vzorku přítomen jako hydrochlorid.. LC-NMR farmak Impurity in Sibutramine sample Stop-flow mode, nt = 1000 7 6 5 4 3 2 1 ppm Sibutramine hydrochloride in CDCl 3 Sibutramine in CDCl 3 Sibutramine desmethyle in D 2 O-CH 3 CN Sibutramine desmethyle hydrochloride in D 2 O-CH 3 CN Cl N H Cl NH Cl -NCH 3 Sibutramine desmethyle Sibutramine hydrochloride
Extrakce superkritickým CO 2 Extrakce superkritickým CO 2 je velmi účinný zdroj nepolárních přírodních látek z různých částí rostlin. Extrakty neobsahují žádná rozpouštědla ani další příměsi. CO 2 se uvolňuje při závěrečné expanzi na výstupu z extraktoru. Obsah přítomných látek se stanovuje pomocí HPLC nebo GC-MS. Identifikace závisí na počtu standardů a rozsahu knihovny MS spekter. Pro identifikaci neurčených látek (obsah kolem 5%) nastupuje LC-NMR. Příklad dominantní látky v extraktu routy vonné (obsah kolem 20%, m/z = 356). Pro předseparaci byla použita gelová kolona 100% CDCl 3 (separace se dá provádět v libovolném rozpouštědle). Z 1 H NMR a 2D NMR spektrer se podařilo poskládat hlavní fragmenty molekuly. Tyto fragmenty v kombinaci s kumarinovým skeletem a znalostí celkové hmoty poskytly strukturu rutamarinu; hlavní složky routy vonné (ruta graveolens) s terapeutickými účinky podobnými papaverinu. GPC-NMR start 12 min 100% CDCl 3 inj. 50 µl 1,2 3 rutamarin 4 5 7,8 5 x CH 3 skupin CHCl 3 9 6 4 5 6 3 1,2,9 7,8