BAKALÁŘSKÁ PRÁCE. Studium adsorpčně-desorpčních vlastností porfyrinů na kovových nanopovrších

Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Petra Šimáková Studium adsorpčně-desorpčních vlastností porfyrinů na kovových nanopovrších Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: Doc. RNDr. Marek Procházka, Dr. Studijní program: Fyzika, Obecná fyzika 2007

Děkuji především Doc. RNDr. Markovi Procházkovi, Dr. za odbornou pomoc, neustálý optimismus a velkou trpělivost při vedení mé bakalářské práce. Dále bych ráda poděkovala Mgr. Natálii Hajdukové za poskytnutí obrázků a svým rodičům za podporu během studia. Prohlašuji, že jsem svou bakalářskou práci napsala samostatně a výhradně s použitím citovaných pramenů. Souhlasím se zapůjčováním práce a jejím zveřejňováním. V Praze dne 18.7.2007 Petra Šimáková 2

Obsah 1 Teoretická část... 5 1.1 Povrchem zesílený Ramanův rozptyl, jeho mechanismus a význam... 5 1.2 SERS-aktivní kovové nanopovrchy... 6 1.3 Porfyriny... 9 1.4 Absorpční spektroskopie... 10 2 Cíle práce... 14 3 Experimentální část... 15 3.1 Použité chemikálie, povrchy, aparatura... 15 3.2 Postup měření... 15 3.3 Výsledky a diskuze měření TMPyP... 16 3.4 Výsledky a diskuze měření TSPP... 21 4 Závěr... 24 Literatura... 25 3

Název práce: Autor: Katedra (ústav): Vedoucí bakalářské práce: e-mail vedoucího: Studium adsorpčně-desorpčních vlastností porfyrinů na kovových nanopovrších Petra Šimáková Fyzikální ústav UK Doc. RNDr. Marek Procházka, Dr. prochaz@karlov.mff.cuni.cz Abstrakt: Tématem této práce je studium adsorpčně-desorpčních vlastností kationického 5,10,15,20-tetrakis(1-metyl-4-pyridyl)porfyrinu (TMPyP) a anionického 5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonátofenyl)porfyrinu (TSPP) na SERS-aktivních površích připravených imobilizací zlatých koloidních nanočástic na silanizovaný skleněný substrát. Pomocí UV-VIS absorpční spektroskopie byla změřena časová závislost adsorpce pro několik koncentrací porfyrinu řádu 10 6 M. Adsorpce TMPyP byla dobře detekovatelná, k nasycení docházelo v 8-25 minutách, což odpovídá výsledkům měření závislostí intenzity SERRS spekter na adsorpčním čase. Adsorbované množství TMPyP v saturaci bylo stanoveno na 1 měřených koncentrací nebylo koncentračně závislé. V případě TSPP je adsorpce slabá a téměř není naším experimentem detekovatelná. Klíčová slova: SERS, adsorpce, zlaté nanočástice, porfyriny 14 2 10 molekul/cm 2 a v oboru Title: Author: Department: Supervisor: Supervisor s e-mail address: Adsorption-desorption properties of porphyrins on metal nanosurfaces Petra Šimáková Institute of Physics, Charles University Doc. RNDr. Marek Procházka, Dr. prochaz@karlov.mff.cuni.cz Abstract: The subject of this work is a study of adsorption-desorption properties of cationic 5,10,15,20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)porphyrin (TMPyP) and anionic 5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphyrin (TSPP) on SERS-active surfaces prepared by immobilization of gold colloidal nanoparticles to silanized glass plates. Time dependence of porphyrin adsorption was measured for porphyrin concentrations in the order of 10 6 M by using UV-VIS absorption spectroscopy. Adsorption of TMPyP was well detectable; saturation was achieved during 8-25 minutes, it corresponds to the measurements of the time dependences of SERRS intensity on adsorption time. Adsorbed amount of TMPyP in saturation was estimated as 1 2 10 molecules/cm 2 and it was not concentration dependent in the used concentration 14 range. In the case of TSPP, the adsorption is weak and almost undetectable in our experiment. Keywords: SERS, adsorption, gold nanoparticles, porphyrins 4

1 Teoretická část 1.1 Povrchem zesílený Ramanův rozptyl, jeho mechanismus a význam Spektroskopie Ramanova rozptylu je důležitou technikou optické vibrační spektroskopie. Jelikož Ramanův rozptyl je principiálně slabý efekt vyžadující relativně velké koncentrace studovaných látek, je spektroskopie povrchem zesíleného Ramanova rozptylu (Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) vítanou možností, jak jeho citlivost výrazně zlepšit. Zesílení signálu je dosaženo pro molekuly adsorbované na nanostrukturu kovu. Poprvé byl SERS pozorován M. Fleischmannem v 70. letech 20. století při měření Ramanových spekter pyridinu adsorbovaného na stříbrné elektrodě [1]. K celkovému efektu SERSu přispívají dva mechanismy. Hlavním mechanismem SERSu je velké zesílení lokálního elektromagnetického pole na nanoskopických nerovnostech povrchu v důsledku rezonanční excitace tzv. povrchových plazmonů kovu. Molekuly v blízkosti kovového povrchu zesílené záření Ramanovsky rozptýlí. Intenzita záření rozptýleného molekulou je úměrná druhé mocnině indukovaného dipólového momentu P r molekuly r t r P = α E, (1) kde E r je dopadající elektromagnetické záření a α t tenzor polarizovatelnosti molekuly. Intenzita rozptýleného záření je zvýšena opět rezonancí plazmonů. Příspěvek k 4 6 celkovému zesílení intenzity Ramanova rozptylu je řádově 10 10, ale ve speciálních případech může dosahovat až 10 14. Druhým zesilovacím mechanismem je molekulární mechanismus. Nastává při těsném kontaktu měřených molekul s kovem. Nerovnosti kovového povrchu v nanoškále zde nejsou podmínkou. Mezi povrchem a molekulou dochází k přenosu náboje, čímž se zvýší polarizovatelnost molekuly. Příspěvek k celkovému zesílení je řádově 3 10 10. Speciálním případem je jev označovaný jako povrchem zesílený rezonanční Ramanův rozptyl (Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering, SERRS). Vzniká, pokud se energie budícího záření shoduje zároveň s excitační energií plazmonů i 5

s energií přechodu mezi dvěma stacionárními stavy adsorbované molekuly. Mechanismy povrchového a resonančního zesílení nejsou aditivní. Metody SERS a SERRS přinášejí řadu výhod. Díky silnějšímu signálu lze detekovat nižší koncentrace molekul, než dovoluje normální Ramanův rozptyl, což umožňuje studovat biomolekuly ve fyziologických koncentracích. Speciální uspořádání kovových částic, tzv. hot spot (např. dimer nanočástic), umožnilo naměřit spektrum jedné molekuly [2-4]. Další výhodou SERSu oproti Ramanovu rozptylu je rychlé zhášení fluorescence měřené látky v důsledku nezářivého přenosu energie na kov. Využitím pevných povrchů lze po odpaření rozpouštědla dobře měřit signál látek nerozpustných ve vodě, u nichž by signál rozpouštědla při obyčejném Ramanově rozptylu překryl jejich vlastní [5-7]. Nevýhodou SERSu je fakt, že signál samotné molekuly je pozměněn její adsorpcí na kov. V některých případech může dojít ke změně struktury nebo konformace molekuly, např. k metalaci nebo denaturaci. Ale i toho lze v experimentech využít. Dalším omezením je, že nelze měřit jakoukoli látku, ale jen tu, jejíž molekuly jsou schopny adsorpce na daný typ povrchu. Hlavním problémem je obtížná kvantifikace množství přítomné látky, jelikož není k dispozici dostatečně homogenní reprodukovatelný povrch. U kovových koloidů je kvantifikace téměř nemožná. 1.2 SERS-aktivní kovové nanopovrchy Nezbytnou součástí měření SERSu jsou kovové povrchy, které obsahují nanoskopické nerovnosti umožňující rezonanční excitaci povrchových plazmonů. Rezonanční frekvence plazmonů závisí mimo jiné na permitivitě prostředí, permitivitě kovu, tvaru a velikosti nanočástic. Pro excitační vlnové délky používané v SERS spektroskopii jsou nejvhodnějšími kovy stříbro, zlato, měď a některé alkalické kovy. Spolu s teoretickým poznáváním a popisem mechanismu SERSu sílí snaha vyvinout reprodukovatelný stabilní povrch, jehož velký faktor zesílení by byl znám, což by umožnilo snazší interpretaci spekter a rozšíření analytického použití SERSu. V SERS spektroskopii se používají následující typy povrchů: 6

Kovové elektrody vhodné pro měření SERSu se připravují zdrsňováním povrchu elektrody pomocí oxidačně-redukčních cyklů elektrolýzy, jejichž výsledkem jsou nerovnosti povrchu o velikosti 25-500 nm. Kovové ostrůvkové filmy jsou nepravidelné soubory kovových částic o velikosti 150-600 nm vznikající napařováním nebo naopak upevněním kovu za nízké teploty na substrát (sklo, křemen). Výhodou tohoto povrchu je jeho poměrně dobrá reprodukovatelnost a stabilita. Kovové koloidy jsou suspenze kovových nanočástic ve vodě. Distribuce velikostí těchto částic je mnohem menší než u výše zmíněných pevných povrchů. Velikosti obvykle užívané pro SERS se pohybují mezi 10 80 nm [8, str. 143]. Koloidy se nejčastěji připravují chemickou redukcí kovových solí vhodným redukčním činidlem, takže na povrchu částic jsou přítomny anionty redukčního činidla, které způsobují jejich coulombovské odpuzování. Přidání měřené látky do roztoku může způsobit agregaci kovových částic. U agregovaných koloidů je pozorováno větší SERS zesílení než u neagregovaných. Stav agregace a s ním i intenzita SERS signálu se však v důsledku usazování větších agregátů mění v čase. Dalším způsobem přípravy je laserová ablace kovového plíšku ve vodném roztoku. Takto připravený koloid je chemicky čistý. Výhodou kovových koloidů je jednoduchá příprava a velké SERS zesílení, nejsou však stabilní jako pevné povrchy. Přednosti pevných povrchů i koloidů se snaží spojit další typ SERS-aktivního povrchu, kterým jsou kovové koloidní částice imobilizované na skleněném substrátu. Jeden z možných postupů přípravy znázorňuje obr. 1.1. Skleněný substrát, který nese hydroxylovou nebo oxidovou funkční skupinu je ponořen do roztoku organosilanu. Molekuly organosilanu se váží k substrátu přes skupinu OR a vytvářejí na něm samouspořádané struktury, na jejichž koncové funkční skupiny ( NH 2, SH, NC) se po ponoření do kovového koloidu mohou navázat kovové částice. V diplomové práci Mgr. Hajdukové [5] je zkoumána příprava zlatých částic imobilizovaných na silanizovaný skleněný substrát. Výsledky této práce i dalšího výzkumu vlastností těchto povrchů byly publikovány v článku [9]. Výhodou použití zlatých částic je, že lze získat SERS spektra free base porfyrinů, protože nedochází k jejich metalaci, která je častá při měření ze stříbrných povrchů. Zkoumány byly vlastnosti povrchů připravených pomocí silanů MPTMS (3-merkaptopropyltrimetoxysilan) nebo APTMS (3- aminopropyltrimetoxysilan) a koloidů vzniklých laserovou ablací, redukcí borohydridem sodným nebo citronanem sodným. Nejlepší vlastnosti pro měření SERS signá- 7

lu vykazovaly povrchy ošetřené silanem APTMS s NH 2 skupinou, na kterou se navázaly zlaté částice připravené redukcí citronanem sodným. Takto vznikly dva typy povrchů, přičemž první vykazovaly jedno maximum extinkce cca 530 550 nm, které odpovídá extinkčnímu maximu výchozího neagregovaného koloidu, a druhé vykazovaly dva extinkční pásy cca 530 550 nm a 600 650 nm. První typ povrchů byl nestabilní po několika hodinách až dnech přešel na druhý typ, který se jevil stabilním. Aby byla zajištěna reprodukovatelnost, byly povrchy po imobilizaci částic tepelně upraveny (10 min ve 100 C), čímž vznikl druhý, stabilní, typ povrchu. Pomocí AFM (mikroskopie atomárních sil) bylo zjištěno, že povrchy připravené z citrátového koloidu jsou tvořeny většinou více vrstvami částic kulovitého tvaru o průměru 30 100 nm. Druhý extinkční pás na vyšších vlnových délkách souvisí s malou vzájemnou vzdáleností částic. Obrázek 1.1: Proces silanizace (A) a imobilizace kovových částic (B). Převzato z [10]. 8

1.3 Porfyriny Porfyriny jsou deriváty porfinu, což je planární heterocyklický aromatický kruh skládající se ze čtyř pyrolů spojených metylenovými můstky. Porfiny mohou být substituovány na pyrolových kruzích nebo na metylenových můstcích. Biologicky nejvýznamnější jsou porfyriny s centrálním atomem kovu vázaným na dusíky, tzv. metaloporfyriny. Jako příklad uveďme hem obsahující centrální atom železa a chlorofyl obsahující hořčík. Metaloporfyriny se často vyskytují v komplexu s proteiny (např. hemoglobiny, myoglobiny, katalasy). Nemetalované porfyriny se nazývají free base porfyriny. Syntetické deriváty porfyrinů nacházejí široké uplatnění v medicíně. Aplikace zahrnují nádorovou fototerapii, protivirovou léčbu, aplikace v molekulární biologii, transport oligonukleotidů přes cytoplazmatickou membránu, specifickou detekci sekvencí DNA či selektivní štěpení nukleových kyselin. Porfyriny absorbují záření téměř přes celou viditelnou oblast. V absorpčním spektru se kolem 400 nm vyskytuje výrazný Soretův pás a několik slabších tzv. Q- pásů. Free base porfyriny silně fluoreskují, což je výhodné pro jejich detekci fluorescenční spektroskopií, ale ztěžuje jejich studium pomocí rezonanční Ramanovy spektroskopie. Řada porfyrinů ve vyšších koncentracích v důsledku interakce svých postranních řetězců agreguje. Studium porfyrinů při vyšších koncentracích tedy neodpovídá podmínkám jejich výskytu a použití v medicíně. Z těchto příčin je SERS spektroskopie jako citlivá analytická metoda, která navíc zháší případnou fluorescenci, vhodná ke studiu porfyrinů. Mezi deriváty porfinu, které vznikly substitucí na metylenových můstcích, patří TMPyP a TSPP. TMPyP (5,10,15,20-tetrakis(1-metyl-4-pyridyl)porfyrin, obr. 1.2 A) je kationický porfyrin, protože navázaný metylpyridyn má protonovaný dusík. TSPP (5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonátofenyl)porfyrin, obr. 1.2 B) je naopak anionický porfyrin. Vzhledem k tomu, že mají náboj, jsou oba rozpustné ve vodě. 9

Obrázek 1.2: A molekula TMPyP, B molekula TSPP. 1.4 Absorpční spektroskopie Absorpční spektroskopie [11] zkoumá vlastnosti látky na základě měření jejich schopnosti absorbovat elektromagnetické záření. Podle druhu pozorovaných molekulárních přechodů rozlišujeme elektronovou, vibrační a rotační absorpční spektroskopii. Elektronová užívá blízké infračervené, viditelné a ultrafialové záření. Vlivem záření dojde k excitaci valenčního elektronu na vyšší energetickou hladinu. Excitace elektronu je doprovázena změnami vibračního a rotačního stavu molekuly, čáry odpovídající přechodům splývají dohromady v pásové spektrum. Vibrační absorpční spektroskopie používá infračervené záření. V tomto případě dojde pouze k přechodu molekuly na vyšší vibrační hladinu, aniž by se došlo k excitaci elektronu. Přechod do vyššího vibračního stavu doprovázejí změny rotačního stavu, takže spektrum je také pásové. Rotační spektrum je nejjednodušší, čárové. K excitaci stačí malé energie odpovídající mikrovlnnému záření. Při průchodu klesá intenzita záření exponenciálně s dráhou. Tento pokles se nejčastěji charakterizuje absorbancí A definovanou I 0 A( λ ) = log, (2) I 10

kde I 0 je intenzita dopadajícího záření a I intenzita záření prošlého látkou, λ je vlnová délka záření. Exponenciální útlum intenzity pak vyjadřuje tzv. Lambertův zákon ( ) b( λ)l A λ =, (3) kde b ( λ) se nazývá absorpční (extinkční) koeficient a l je dráha záření ve vzorku. Absorbance je tedy přímo úměrná dráze. Lambertův zákon neplatí pro vícefotonové procesy. Pro roztoky a některé pevné nebo polotuhé amorfní vzorky platí tzv. Beerův zákon, který říká, že absorpční koeficient b ( λ) je přímo úměrný molární koncentraci C absorbujících molekul ve vzorku ( ) ε ( λ)c popř. zobecněno na více druhů absorbujících molekul b λ =, (4) = ( ) ε ( λ) b λ. (5) i i C i ε ( λ) se nazývá molární extinkční koeficient. Beerův zákon platí, pokud absorbující molekuly neagregují či jinak neinteragují. Vztahy (3) a (4) se obvykle spojují do Lambertova Beerova zákona ( ) ε ( λ)cl A λ =. (6) Nejjednodušší metodou stanovení absorpčního spektra je měření propustnosti T ( λ) definované jako poměr intenzity I záření vystupujícího ze vzorku ku intenzitě I 0 záření dopadajícího I T λ =. (7) ( ) Jelikož na obou rozhraních vzorek vzduch dochází k odrazu záření (odrazivost R ( λ) obou rozhraní lze považovat za stejnou), je mezi propustností a absorbancí vztah I 0 T A( λ ) ( λ) = [ 2R( λ) ] 10 1. (8) U roztoků se většinou měří tzv. relativní propustnost daná poměrem intenzity I záření vystupujícího ze vzorku ku intenzitě I ref záření vystupujícího ze samotného rozpouštědla 11

I T rel ( λ ) =. (9) I Vyloučíme tím absorbanci rozpouštědla a odrazivost rozhraní. Vztah mezi relativní propustností a absorbancí rozpuštěné látky je pak ref ( λ) ( λ) A = logt. (10) Relativní propustnost lze měřit pomocí jednoho svazku, kdy se vyměňuje reference za vzorek a měří se spektrum bod po bodu. V dvousvazkových spektrometrech je svazek za monochromátorem rozdělen. Jedna část svazku je vedena na referenci a druhá na vzorek. V případě kovových částic se absorpčním spektrometrem měří tzv. extinkce zahrnující absorpci a rozptyl záření. rel Obrázek 1.3: Schéma absorpčního spektrometru Lambda 12. Práci jsem měřila na absorpčním UV-VIS spektrometru Perkin Elmer Lambda 12. Jeho schéma je na obr. 1.3. Zdrojem záření je pro viditelnou oblast halogenová lampa, pro ultrafialovou oblast deuteriová výbojka. Emitované záření projde přes filtr, který 12

propustí pouze určitou část spektra. Konkrétní vlnová délka je vybrána difrakční mřížkou, za níž je svazek rozdělen děličem na dva, z nichž jeden prochází referencí a druhý vzorkem do detektoru. 13

2 Cíle práce Tématem této bakalářské práce bylo studium adsorpčně-desorpčních vlastností free base porfyrinů TMPyP a TSPP na SERS-aktivních zlatých nanopovrších. Naším cílem bylo pomocí UV-VIS absorpční spektroskopie podrobněji prozkoumat časovou a koncentrační závislost adsorpce těchto porfyrinů na povrch tvořený zlatými nanočásticemi imobilizovanými na skleněném substrátu připravený způsobem popsaným v diplomové práci Mgr. Hajdukové [5] a článku [9], vzájemně porovnat adsorpčně-desorpční vlastnosti obou porfyrinů a naše výsledky porovnat s výsledky časové a koncentrační závislosti intenzity SERRS spekter těchto porfyrinů měřených ze stejného typu povrchu [5, 12]. 14

3 Experimentální část 3.1 Použité chemikálie, povrchy, aparatura Při měření bakalářské práce byly použity tyto chemikálie: deionizovaná voda o specifickém odporu 18 MΩ cm 5,10,15,20-tetrakis(1-metyl-4-pyridyl)porfyrin (TMPyP), výrobce Sigma- Aldrich 5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonátofenyl)porfyrin (TSPP), výrobce Sigma-Aldrich fosfátový pufr, 100 mm, ph=7 Použili jsme zlaté substráty vyrobené z citrátového koloidu podle [5] metodou, která je stručně popsána v Teoretické části. Podložkou nesoucí SERS-aktivní povrch byla mikroskopická podložní sklíčka nařezaná na proužky o rozměrech 1x2 2 cm. Absorpční spektra jsme zaznamenávali spektrometrem Perkin Elmer Lambda 12 popsaném v Teoretické části. Spektra byla snímána rychlostí 240 nm/min v rozsahu vlnových délek 350-700 nm s krokem 1 nm. Jako referenci jsme používali druhou kyvetu naplněnou deionizovanou vodou. U 2cm kyvety nebyla referenční kyveta k dispozici, proto byl referencí prázdný prostor. Extinkční spektra zlatých substrátů byla měřena stejným způsobem v rozsahu vlnových délek 350 900 nm. Referencí byl prázdný prostor. 3.2 Postup měření Měřili jsme úbytek koncentrace porfyrinu ze zásobního roztoku, do kterého byl ponořen zlatý substrát. Měření jsme provedli pro několik koncentrací. Nejprve jsme změřili absorpční spektrum zásobního roztoku, ze kterého jsme určili výchozí koncentraci roztoku. Potom jsme do kyvety s roztokem ponořili na dobu τ SERSaktivní zlatý substrát. Po vyjmutí substrátu jsme opět změřili absorpční spektrum roztoku. Tentýž substrát jsme ponořili na čas zbývající do dalšího bodu měření zpět do kyvety a postup opakovali. Pouze jeden substrát pro každou časovou závislost 15

používáme z toho důvodu, že povrchy nejsou zcela reprodukovatelné. Doby ponoření jsme volili od 1 do 60 minut. Ze známého extinkčního koeficientu ε ( λ) pro maximum Soretova pásu, dráhy l paprsku (rozměr kyvety) a naměřené absorbance A ( λ) jsme podle vztahu (6) vypočítali molární koncentraci C porfyrinu v roztoku. Za předpokladu, že se porfyrin neusazuje na stěnách kyvety, lze množství dané rozdílem koncentrace roztoku po ponoření substrátu na dobu τ a výchozí koncentrace roztoku C = C považovat za množství porfyrinu adsorbované na substrát. Můžeme jej C 0 vyjádřit povrchovou koncentrací, tj. počtem molekul porfyrinu připadajících na jednotku plochy substrátu. 3.3 Výsledky a diskuze měření TMPyP V [12] byla publikována závislost intenzity signálu SERRS ze zlatých nanopovrchů připravených stejnou metodou na koncentraci roztoků a na době ponoření do 1 µ M roztoků porfyrinů TMPyP a TSPP. Intenzitou je přitom myšlena plocha pásu 1451 1 cm u TMPyP a pásu 1238 1 cm u TSPP. Největší intenzitu signálu vykazovaly oba vzorky pro dobu ponoření 15-20 min. Pro delší časy intenzita signálu obou porfyrinů klesla, přičemž pro TSPP výrazněji - přibližně na 40% maxima signálu. Další, dosud nepublikované, výsledky ale ukázaly u TMPyP spíše saturaci pro delší časy ponoření. Nejprve jsme provedli měření dvou koncentrací TMPyP, abychom ověřili, zda budou změny v koncentraci roztoku detekovatelné. Volili jsme τ =20 min, protože podle [12] byl po této době ponoření signál SERRS největší, což pravděpodobně odpovídá maximálnímu naadsorbovanému množství porfyrinu. Výchozí molární koncentrace roztoku a změna molární koncentrace jsou uvedeny v tabulce 3.1. Extinkční koeficient pro maximum ( λ = 422nm ) Soretova pásu TMPyP je 5 1 1 ε 422 = 2,26 10 M cm [13]. Tabulka 3.1: Výchozí koncentrace roztoku a koncentrační rozdíl TMPyP po 20 min. 6 9 7 9 měření C0 [ 10 ± 1 10 M ] C[ 10 ± 1 10 M ] 1 1,127 0,92 2 5,761 4,05 16

Naměřená absorpční spektra odpovídala spektru TMPyP. Po skončení prvního měření jsme vylili vzorek a změřili spektrum prázdné kyvety (obr. 3.2). V jejím spektru je vidět Soretův pás TMPyP, avšak je vůči pozadí malý. Pozadí vzniklo jednak absorpcí světla materiálem kyvety (měřeno bez reference), jednak rozptylem světla na zbylých kapičkách roztoku. Usazování porfyrinu na stěnách kyvety můžeme tedy vyloučit. Změna molárních koncentrací má velikost řádově 10 7 M, což je o řád nižší koncentrace než byla výchozí koncentrace roztoku. Koncentrace TMPyP adsorbovaná na substrát je tedy detekovatelná a její hodnota se pohybuje okolo 14 1 10 2 molekul / cm. Po tomto kontrolním měření jsme přistoupili ke studiu časové závislosti adsorpce TMPyP. Celkem jsme provedli čtyři měření: A B v 1cm kyvetě s 6,7 µ M TMPyP v 2cm kyvetě s 3,2 µ M TMPyP C C1 C2 v 5cm kyvetě s 1,2 µ M TMPyP v 5cm kyvetě s 1,2 µ M TMPyP Pro měření byly zvoleny tři podobné zlaté substráty pro tři různé výchozí koncentrace (A, B, C1) a jeden odlišný pro stejnou koncentraci jako u C1 (C2). Na obr. 3.1 jsou jejich extinkční spektra. Vidíme, že tři podobné patří k typu povrchu se dvěma extinkčními maximy, kdežto substrát C2 charakterizovaný jedním extinkčním maximem ani po tepelné úpravě na tento typ nepřešel (viz Teoretická část, [5, 9] ). Pro lepší orientaci ve výsledcích zopakujme, že A je největší měřená koncentrace, B přibližně poloviční a C nejnižší. Na příkladu měření A lze vidět tvar naměřeného absorpčního spektra (obr. 3.2). Je přítomen nejintenzivnější, Soretův, pás s maximem 422 nm i méně intenzivní Q- pásy, takže se jedná o spektrum TMPyP [13]. Dále můžeme pozorovat, jak v důsledku navázání molekul TMPyP na substrát absorbance roztoku s časem klesá. Změny molární koncentrace roztoku s časem jsou pro jednotlivá měření vyneseny v grafech na obr. 3.3-3.5. Body jsou proloženy vhodným fitem. 17

Obrázek 3.1: Extinkční spektra substrátů použitých při měření TMPyP. Obrázek 3.2: Absorpční spektrum TMPyP o výchozí koncentraci 6,7 µ M a spektrum prázdné kyvety po vylití vzorku. 18

Obrázek 3.3: Časová závislost koncentrace TMPyP adsorbované na zlatý substrát, výchozí koncentrace roztoku 6,7 µ M (měření A). Obrázek 3.4: Časová závislost koncentrace TMPyP adsorbované na zlatý substrát, výchozí koncentrace roztoku 3,2 µ M (měření B). 19

Obrázek 3.5: Časová závislost koncentrace TMPyP adsorbované na zlatý substrát, výchozí koncentrace roztoků 1,2 µ M (měření C). Naše závislosti mají podobný tvar jako časové závislosti intenzity signálu SERRS v dosud nepublikovaných výsledcích. Stejně jako ony vykazují naše závislosti nasycení. Maximální adsorbovanou koncentraci Cmax jsme určili extrapolací nafitovaných funkcí. Je o řád nižší než výchozí koncentrace roztoků. Maximální adsorbovanou koncentraci jsme nakonec vyjádřili jako povrchovou koncentraci c max. Výchozí koncentrace roztoku C 0 a maximální adsorbované koncentrace vyjádřené jak změnou molární koncentrace roztoku Cmax, tak povrchovou koncentrací c max jsou přehledně uvedeny v tabulce 3.2. Jak vyplývá z posledního sloupce tabulky, je maximální povrchová koncentrace TMPyP pro všechna měření srovnatelná. U použitých výchozích koncentrací, které byly všechny stejného řádu 10 6 M, tedy nelze prokázat závislost adsorbovaného množství TMPyP na koncentraci. Podobně nelze vyvodit závěr o koncentrační závislosti rychlosti adsorpce a doby nasycení. Brání nám v tom skutečnost, že každý vyrobený povrch má trochu jinou strukturu, která velmi ovlivňuje adsorpci. Lze to vidět na obr. 3.5. Vidíme, že koncentrace adsorbovaná na povrch C2, který se svou strukturou od ostatních povrchů lišil, je přibližně dvojnásobná než koncentrace na povrchu C1. 20

O době saturace řekněme, že se pohybovala mezi 8 a 25 min, což odpovídá době dosažení maxima SERRS signálu při 15-20 min [12]. Konkrétně bylo nasycení dosaženo pro koncentraci 6,7 µ M kolem 20 min (obr. 3.3), pro 3,2 µ M 8 min (obr. 3.4), pro 1,2 µ M u měření C1 po 20 min a u měření C2 došlo k výraznému zpomalení adsorpce v časech nad 24 min (obr. 3.5). Tabulka 3.2: Výchozí koncentrace roztoků a koncentrace TMPyP adsorbovaná na substrát. 6 měření C0 [ M ] [ ] 10 Cmax 10 7 14 2 M c max [ 10 molekul / cm ] A 6,706 ± 0,004 8,1 ± 0,2 2,4 ± 0,1 B 3,186 ± 0,002 1,9 ± 0,1 1,1 ± 0,1 C1 1,173 ± 0,001 0,8 ± 0,2 1,3 ± 0,4 C2 1,218 ± 0,001 1,8 ± 0,3 2,7 ± 0,5 3.4 Výsledky a diskuze měření TSPP TSPP má poměrně vysokou konstantu acidity pk=4,8. V roztoku s takovým ph se vyskytují v rovnováze dvě formy: neprotonovaná free base forma (obr. 1.2 B) a diacidická forma, která v centru molekuly váže dva protony. Obě formy TSPP se liší absorpčním spektrem. Maximum Soretova pásu diacidického TSPP je posunut z 413 nm, které přísluší neprotonované formě, na 435 nm. Podle [14] se v ph neutrálním prostředí vyskytuje výhradně neprotonovaný TSPP. Výchozí roztok jsme proto připravili rozpuštěním porfyrinu v 100mM fosfátovém pufru, který udržuje konstantní ph=7. Příklad naměřených absorpčních spekter je na obr. 3.6. Jedná se opravdu o spektrum TSPP [15], je přítomen Soretův pás na 413 nm i Q-pásy. Jednotlivé křivky se překrývají, což znamená, že absorbance a tedy i molární koncentrace roztoku se s časem měnila minimálně. Závislost změn koncentrace roztoku na čase je znázorněna na obr. 3.7. Při výpočtu koncentrace byl použit extinkční koeficient TSPP pro maximum ( λ = 413nm ) Soretova pásu, který je 5 1 1 ε 413 = 5,33 10 M cm [15]. Na stěny kyvety se TSPP neusazoval (viz spektrum prázdné kyvety na obr. 3.6), takže úbytek v koncentraci roztoku považujeme za koncentraci adsorbovanou na zlatý substrát. Maximální naměřený koncentrační 21

Obrázek 3.6: Absorpční spektrum TSPP o výchozí koncentraci 0,6 µ M a spektrum prázdné kyvety po vylití vzorku. Obrázek 3.7: Koncentrace TSPP adsorbovaná na zlatý substrát. 22

9 rozdíl C = ( 3,6 ± 0,8) 10 M jsme naměřili po 1 min, je o dva řády nižší než vý- 7 chozí koncentrace roztoku C ( 6,154 ± 0,004) M 0 = 10 a odpovídá povrchové kon- 12 2 centraci na substrátu přibližně c = 1 10 molekul / cm. To je o dva řády nižší povrchová koncentrace než u TMPyP. Malá schopnost TSPP adsorbovat se na zlatý substrát je pravděpodobně způsobena záporně nabitými sulfonátovými skupinami, které jsou odpuzovány citrátovými anionty přítomnými na povrchu zlatých nanočástic. 23

4 Závěr Metodou absorpční spektroskopie jsme změřili časové závislosti adsorpce porfyrinů TMPyP a TSPP o koncentraci řádově 10 6 M na zlaté nanočástice imobilizované na skleněné podložce. Všechny časové závislosti TMPyP mají podobný tvar jako poslední výsledky měření závislosti intenzity signálu SERRS na čase. Adsorbované množství porfyrinu s časem narůstá. Konkrétní průběh závisí zejména na vlastnostech daného zlatého povrchu. Proto nebylo možné naším měřením jednoznačně určit, zda a jak závisí rychlost adsorpce a doba nasycení na koncentraci. K nasycení došlo po 8-25 minutách. Tento čas odpovídá výsledkům měření časové závislosti intenzity SERRS spekter [5, 12]. Množství adsorbované v saturaci záviselo na typu substrátu, v oboru měřených koncentrací nebylo koncentračně závislé. Vyjádřeno jako povr- 14 2 chová koncentrace na substrátu dosahovalo hodnoty 1 2 10 molekul / cm. Adsorpční závislost TSPP na čase se nechová ani jako u TMPyP, ani jako intenzita SERRS spektra TSPP v [5, 12]. Celkově je adsorpce slabá a prakticky není naším experimentem detekovatelná. Maximální naměřená povrchová koncentrace je 12 2 1 10 molekul / cm, tedy o 2 řády nižší než u TMPyP. Horší schopnost adsorpce přičítáme zápornému náboji molekul TSPP. 24

Literatura [1] Fleischmann, M., Hendra, P. J., McQuillan, A. J.: Raman-spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode, Chem. Phys. Lett. 26 (1974), 163-166. [2] Nie, S. M., Emory, S. R.: Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering, Science 275 (1997), 1102-1106. [3] Xu, H. X., Bjerneld, E. J., Kall, M., Borjesson, L.: Spectroscopy of single hemoglobin molecules by surface enhanced Raman scattering, Phys. Rev. Lett. 83 (1999), 4357-4360. [4] Kneipp, K., Wang, Y., Kneipp, H., Perelman, L. T., Itzkan, I., Dasari, R. R., Feld, M. S.: Single molecule detection using surface-enhanced Raman scattering (SERS), Phys. Rev. Lett. 78 (1997), 1667-1670. [5] Hajduková, N.: Kovové částice imobilizivané na skleněné podložky a jejich využití jako SERS-aktivních povrchů při studiu biomolekul, diplomová práce, MFF UK, Praha, 2005. [6] Špringer, T.: Surface-enhanced photophysical processes of organic molecules in metal nanoparticles, diplomová práce, MFF UK, Praha, 2006. [7] Molnár, P.: Příprava a testování stříbrných imobilizovaných nanočástic k SERS spektroskopii biomolekul, diplomová práce, MFF UK, Praha, 2006. [8] Aroca, R.: Surface-enhanced vibrational spectroscopy, John Wiley and Sons Ltd, Chichester, 2006. [9] Hajduková, N., Procházka, M., Štěpánek, J., Špírková, M.: Chemically reduced and laser-ablated gold nanoparticles immobilized to silanized glass plates: Preparation, characterization and SERS spectral testing, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 301 (2007), 264-270. [10] Keating, C. D., Musick, M. D., Keefe, M. H., Natan, M. J.: Kinetics and thermodynamics of Au colloid monolayer self-assembly - Undergraduate experiments in surface and nanomaterials chemistry, J. Chem. Educ. 76 (1999), 949-955. [11] Prosser, V. a kol.: Experimentální metody biofyziky, Academia, Praha, 1989. [12] Procházka, M., Hajduková, N., Štěpánek, J.: Surface-enhanced resonance Raman scattering of porphyrins on gold nanoparticles attached to silanized glass plates, Biopolymers 82 (2006), 390-393. [13] Pasternack, R. F., Gibbs, E. J., Villafranca, J. J.: Interactions of porphyrins with nucleic acids, Biochemistry 22 (1983), 2406-2414. 25

[14] Schwab, A. D., Smith, D. E., Rich, C. S., Young, E. R., Smith, W. F., de Paula, J. C.: Porphyrin nanorods, J. Phys. Chem. 107 (2003), 11339-11345. [15] Fleischer, E. B., Palmer, J. M., Srivastava, T. S., Chatterjee, A.: Thermodynamic and kinetic properties of an iron-porphyrin system, J. Am. Chem. Soc. 93 (1971), 3162-3167. 26