Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE. Petra Šimáková. Fyzikální ústav UK

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE Petra Šimáková Studium biomolekul pomocí povrchem zesílené Ramanovy mikrospektroskopie Fyzikální ústav UK Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Marek Procházka, Dr. Studijní program: Fyzika Studijní obor: Biofyzika a chemická fyzika 2009

2 Děkuji především Doc. RNDr. Marku Procházkovi, Dr. za odbornou pomoc a trpělivé vedení mé diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Doc. RNDr. Jiřímu Bokovi, CSc. za napsání a poskytnutí počítačových programů pro zpracování dat a svým rodičům za podporu během studia. Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci napsala samostatně a výhradně s použitím citovaných pramenů. Souhlasím se zapůjčováním práce. V Praze dne Petra Šimáková 2

3 Obsah 1 Teoretická část Ramanův rozptyl Povrchem zesílený Ramanův rozptyl Elektromagnetický mechanismus Chemický (molekulární) mechanismus Povrchem zesílený rezonanční Ramanův rozptyl Celkové SERS zesílení SERS-aktivní povrchy Vlastnosti SERS spektroskopie a její využití ke studiu biomolekul Porfyriny Konfokální mikroskop Další použitá technika - DCDR 26 2 Cíle práce 28 3 Experimentální část Aparatury Konfokální Ramanův mikrospektrometr UV-VIS absorpční spektrometr Příprava SERS-aktivních povrchů Chemikálie Mytí skleněného nádobí Příprava koloidů Příprava koloidních částic silanem imobilizovaných na skle Příprava roztoků TMPyP 35 4 Výsledky a diskuze Zlaté povrchy Úvodní měření Měření časové závislosti Měření koncentrační závislosti Mapování povrchů Stříbrné imobilizované nanočástice Borohydridové povrchy Úvodní měření Koncentrační závislost Parazitní pásy v SERS spektrech Hydroxylaminové povrchy Nanočástice imobilizované vyschnutím Úvodní měření Koncentrační závislost Vznik prstence Mapy z kapek 83 5 Závěr 90 6 Literatura 92 3

4 Název práce: Studium biomolekul pomocí povrchem zesílené Ramanovy mikrospektroskopie Autor: Petra Šimáková Katedra (ústav): Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: Doc. RNDr. Marek Procházka, Dr. vedoucího: Abstrakt: Práce se zabývá studiem biomolekul pomocí mikrospektroskopie povrchem zesíleného Ramanova rozptylu (SERS). K tomuto účelu byly testovány povrchy na bázi zlatých a stříbrných koloidních nanočástic imobilizovaných buď pomocí silanu, nebo vyschnutím na skleněné podložce. Jako modelová molekula byl vybrán kladně nabitý freebase 5,10,15,20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)porfyrin. Cílem bylo především zvýšit citlivost a spektrální reprodukovatelnost uvedených SERS-aktivních systémů s využitím integrovaného Ramanova mikrospektrometru, který má oproti klasickému Ramanovu spektrometru řadu výhod (lepší poměr signál/šum, kratší akumulační čas, mapování, konfokalita). Dosažené výsledky ukazují, že zlaté a stříbrné nanočástice imobilizované pomocí silanu poskytují detekční limity porfyrinu ~ M, navíc v neporušené freebase formě. Zatímco zlaté povrchy vykazují i výbornou spektrální reprodukovatelnost, u stříbrných je velkým problémem častý výskyt parazitních pásů vznikajících zřejmě kontaminací uhlíkatými sloučeninami a rozkladem silanu či samotného porfyrinu. V případě stříbrných nanočástic se ukázaly vhodnější kapky, které po zaschnutí na skle vytvářejí prstence agregátů s extrémně velkým SERS zesílením. Klíčová slova: SERS, porfyrin, nanočástice, Ramanova mikrospektroskopie Title: Author: Department: Supervisor: Supervisor s address: Study of biomolecules by surface-enhanced Raman microspectroscopy Petra Šimáková Institute of Physics, Charles University Doc. RNDr. Marek Procházka, Dr. prochaz@karlov.mff.cuni.cz Abstract: This work deals with study of biomolecules using surface-enhanced Raman scattering (SERS) microspectroscopy. For that purpose surfaces based on gold and silver colloidal nanoparticles immobilized either by silane or by drying on glass plate were tested. As a model molecule cationic free-base 5,10,15,20-tetrakis(1-methyl-4- pyridyl)porphyrin was chosen. The aim was primarily to improve sensitivity and spectral reproducibility of the mentioned SERS-active systems using an integrated Raman microspectrometer which has several advantages (better signal-to-noise ratio, shorter collection time, mapping, confocality) over a classical Raman spectrometer. The obtained results show that gold and silver nanoparticles immobilized by silane give the limits of detection of porphyrin ~ M, moreover in the intact free-base form. While gold surfaces also show excellent spectral reproducibility, in the case of silver surfaces there is a great problem of frequent presence of spurious bands originating apparently from contamination by carbonaceous compounds and decomposition of silane or porphyrin itself. In the case of silver nanoparticles, drops that form a ring of aggregates with extremely high SERS enhancement after drying on glass proved more suitable. Keywords: SERS, porphyrin, nanoparticle, Raman microspectroscopy 4

5 1 Teoretická část 1.1 Ramanův rozptyl Ramanův rozptyl byl objeven v roce 1928 Chandrasekharou Venkatou Ramanem [1, 2], který za tento objev získal o dva roky později Nobelovu cenu. Jedná se o neelastický rozptyl, což znamená, že rozptýlené záření má jinou frekvenci než dopadající. Frekvenční posun rozptýleného záření vůči dopadajícímu odpovídá energetickému rozdílu mezi dvěma vibračními hladinami molekuly. Ramanův rozptyl tedy obsahuje informace o struktuře molekuly. Je to velmi slabý jev ramanovsky se rozptýlí asi 1 foton z rozptýlených fotonů. Velký rozvoj a rozšíření Ramanovy spektroskopie nastal s vývojem výkonných laserů a CCD detektorů. Zdrojem rozptýleného záření jsou oscilující elektrické a magnetické multipóly indukované v molekule dopadajícím elektromagnetickým zářením. Nejvýznamnější je indukovaný elektrický dipól, popsaný indukovaným elektrickým dipólovým momentem. Elektrický dipól emituje elektromagnetické záření s frekvencí, na které kmitá. Vztah mezi dopadajícím zářením E a elektrickým dipólovým momentem p je p E, (1) kde je tenzor polarizovatelnosti molekuly. Polarizovatelnost molekuly je funkcí jaderných souřadnic, protože poloha elektronů, interagujících s dopadajícím zářením, závisí na poloze jader. Přibližně můžeme polarizovatelnost molekuly psát jako 0 Qk, (2) k Qk kde Q k je k-tá normální jaderná souřadnice, 0 je Rayleighův tenzor polarizovatelnosti a zbylé členy jsou součástí Ramanova tenzoru polarizovatelnosti R. Indukovaný dipólový moment p se tak rozpadne na složky lišící se frekvencí. Obsahuje složku se stejnou frekvencí 0 jako dopadající záření, která vysvětluje Rayleighův rozptyl. V dalších složkách je původní frekvence 0 modulována frekvencemi vibračních módů. Jsou to jak složky s nižšími frekvencemi f, vysvětlující Stokesův 1 Ramanův rozptyl, tak s 0 k vyššími frekvencemi 0 f k, vysvětlující anti-stokesův Ramanův rozptyl. Stokesův 1 Názvy Stokesův a anti-stokesův souvisí se Stokesovým zákonem, který říká, že vlnová délka záření emitovaného látkou je větší nebo rovna vlnové délce budícího záření. 5

6 rozptyl přísluší dvoufotonovému přechodu molekuly na vyšší vibrační energetickou hladinu, anti-stokesův na nižší (viz obr. 1.1). Téměř vždy se jedná o vibrační hladiny základního elektronového stavu. Zpravidla se měří Stokesova větev Ramanova rozptylu, protože má vyšší intenzitu. Za pokojové teploty je totiž pravděpodobnost obsazení stacionárních stavů, která se řídí Boltzmannovým rozdělením, nejvyšší pro základní vibrační stav a s rostoucí energií stavů klesá. Obrázek 1.1: Schematické znázornění vibračního přechodu při rozptylu na molekule. Ramanův rozptyl je nejčastěji buzen frekvencí 0, která je podstatně větší než odpovídá energetickému rozdílu mezi výchozím a koncovým stavem, ale zároveň podstatně menší, než odpovídá energetickému rozdílu mezi základním a nejnižším excitovaným elektronovým stavem v porovnání s velikostí vibračních energií. Ramanův rozptyl za těchto podmínek se označuje jako nerezonanční (NRS). Pokud budící frekvence 0 odpovídá energii elektronového absorpčního přechodu, nastává tzv. rezonanční Ramanův rozptyl (RRS), který je krát intenzivnější než nerezonanční, takže signál molekul v rezonanci překrývá signál ostatních molekul. Toho se někdy využívá k selektivní excitaci určité látky. Kromě rozptylu záření dochází i k jeho absorpci vzorek se může zahřívat nebo vyzařovat fluorescenci, která ztěžuje měření RRS. Pro nerezonanční a rezonanční Ramanův rozptyl platí jiná výběrová pravidla, proto jsou rezonančně zesíleny pouze některé z čar vyskytujících se v nerezonančním spektru. V aproximaci malých výchylek jsou v nerezonančním Ramanově rozptylu povolené jen fundamentální přechody, kdežto u rezonančního Ramanova rozptylu se uplatňují také vyšší harmonické a kombinační vibrační přechody. 6

7 1.2 Povrchem zesílený Ramanův rozptyl Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS z angl. surface-enhanced Raman scattering) je jev, při kterém dochází k zesílení intenzity Ramanova rozptylu na nanostruktuře kovu. Byl objeven díky experimentu M. Fleischmanna, který v roce 1974 pozoroval intenzivní Ramanovo spektrum pyridinu adsorbovaného na elektrolyticky zdrsněné stříbrné elektrodě [3]. Fleischmann se domníval, že zesílení signálu je dáno přítomností většího množství pyridinu na povrchu elektrody zvětšeném zdrsněním. V roce 1977 ale dvě vědecké skupiny nezávisle na sobě upozornily, že pouhé zvětšení plochy povrchu elektrody nemůže tak velké zesílení Ramanova signálu vysvětlit. Vědci Jeanmaire a Van Duyne navrhli jako vysvětlení elektromagnetický mechanismus [4], který později teoreticky popsal Moskovits [5], zatímco Albrecht a Creighton efekt přenosu náboje mezi kovem a adsorbovanou molekulou [6]. Dnes víme, že oba tyto mechanismy se na zesílení Ramanova rozptylu i dalších vlastnostech SERS podílejí. Intenzita rozptýleného záření je úměrná druhé mocnině indukovaného elektrického dipólového momentu I ~ p 2, (3) přičemž už víme, že pro indukovaný dipólový moment platí vztah (1) p E. Záření rozptýlené molekulou může být tedy v principu zesílené dvěma mechanismy: zvýšením intenzity lokálního elektromagnetického pole E, což nazýváme elektromagnetickým mechanismem, změnou polarizovatelnosti, což se označuje jako chemický (molekulární) mechanismus Elektromagnetický mechanismus Podstatou elektromagnetického mechanismu je zesílení lokálního elektromagnetického pole v důsledku rezonanční excitace povrchových plazmonů v povrchu kovu. Povrchové plazmony jsou kolektivní oscilace vodivostních elektronů v povrchu kovu, vznikající působením vnějšího elektromagnetického pole. Pokud se kovový povrch nachází v elektromagnetickém poli s určitou frekvencí, amplituda oscilací povrchových plazmonů se zvětšuje - dochází k rezonanci. V okolí nanometrických 7

8 nerovností dochází k zvýšení intenzity lokálního pole vůči intenzitě vnějšího pole. Pokud se v takovém místě nachází molekula (obr. 1.2), bude mít její Ramanův rozptyl větší intenzitu než bez přítomnosti kovové částice. Navíc toto ramanovsky rozptýlené záření může být také ještě zesíleno rezonanční excitací plazmonů. Právě skutečnost, že může být zesíleno dopadající i ramanovsky rozptýlené záření, stojí za velkými zesilujícími faktory SERS. molekula a r kovová částice i Obrázek 1.2: Molekula v blízkosti kovové částice. Nyní si stručně nastíníme odvození podmínek plazmonové rezonance v rámci klasické fyziky. Uvažujme kovovou kouli o rozměrech mnohem menších než vlnová délka excitačního záření, tj. použijme Rayleighovo přiblížení, předpokládající, že poloměr kuličky a / 20. Kovová částice je charakterizována komplexní permitivitou ( ) závisející na vlnové délce záření a je obklopena homogenním prostředím s konstantní permitivitou 0. Excitační záření můžeme v tomto přiblížení považovat za elektrostatické pole ve směru osy z, které označíme E 0. Zajímá nás, jaký vliv má přítomnost částice na vnější pole. Jedná se o základní úlohu elektrostatiky, kdy hledáme elektrostatický potenciál, který řeší Laplaceovu rovnici 0 (4) a vyhovuje okrajovým podmínkám. Z elektrostatického potenciálu dopočítáme elektrickou intenzitu a zjistíme, že se rovná superpozici původního pole E 0 a pole dipólu E d umístěného ve středu koule ve směru osy z E E 0. (5) M E d i 8

9 Pro zesílení budícího záření s vlnovou délkou L ve vzdálenosti r od středu kovové koule, které určíme jako podíl velikostí vektorů elektrické intenzity výsledného a původního pole, dostaneme [7] 0 3 EM a A L ~ g L, (6) E r kde i L 0 L 2 0 g L. (7) i Takto jsme určili zesílení budícího záření v místě molekuly. Obdobně jako pro budící záření vypočítáme podle vztahu (6) zesílení záření ramanovsky rozptýleného molekulou, které má vlnovou délku potom můžeme popsat faktorem zesílení EF S. Celkové zesílení dané elektromagnetickým mechanismem 2 A i 0 i ~ L 0 S 0 a EF A L S. (8) 2 2 r i L K rezonanční excitaci povrchových plazmonů dojde, když faktory g budou co největší. To nastane, pokud reálná část permitivity kovové koule je a imaginární část je blízká nule 2 0 i S 0 Re i (9) 0 Im i. (10) Pro každý materiál s permitivitou i a okolní prostředí s permitivitou 0 nastává rezonance pro jinou oblast vlnových délek. Prostředím, ve kterém probíhá měření, je zpravidla vzduch nebo voda. Pro viditelné záření splňují podmínky plazmonové rezonance (9) a (10) v těchto prostředích zlato, stříbro, měď a některé alkalické kovy. Jejich faktor zesílení g je mnohem větší než jedna [8]. Pokud, lze dosáhnout plazmonové rezonance zároveň pro záření excitační i rozptýlené molekulou. V takovém případě získáme nejvyšší možné SERS zesílení. Znamená to (za předpokladu, že budící záření je v plazmonové rezonanci), že nejvíce jsou zesíleny vibrační spektrální pásy s malým Ramanovým posunem a zesílení klesá s rostoucí energií vibračních módů. Nanočástice schopné plazmonové rezonance musí mít velikost přibližně v rozmezí nm [8]. Menší částice nejsou schopné vytvořit plazmony, horní hranice velikosti závisí na vlnové délce dopadajícího záření (přibližně a / 20 ). Pro větší částice se totiž uplatňují kromě elektrického dipólu i vyšší multipóly, které nevyzařují a zmenšují tím zesílení. L S 9

10 V elektromagnetickém mechanismu SERS není nutný přímý kontakt molekuly 12 s kovovou nanočásticí, ale s rostoucí vzdáleností intenzita záření rychle klesá jako 1/ r. Obrázek 1.3: Rozložení náboje na dimeru kovových částic v závislosti na směru dopadajícího záření. Převzato z [8]. Zesílení lokálního elektrického pole i rezonanční vlnová délka závisejí na tvaru nanonerovností kovového povrchu. Izolovaná kulová částice je pouze modelem pro základní odvození. Zesílení elektromagnetického pole v její blízkosti je [5]. Větší zesílení mají tvary s velkým zakřivením, například pro tvar hrotu dosahuje zesílení až Nejvýznamnější pro SERS jsou ale interagující (např. dvojice nanočástic, neboli dimer), popř. prorůstající částice. Interagující částice se vyskytují ve všech SERS-aktivních površích a mají na zesílení největší podíl. Pokud přiblížíme dvě kulaté nanočástice na vzdálenost menší než 1 nm, může zesílení pro prostor mezi částicemi při použití vhodné excitace dosáhnout až To však jen za předpokladu, že vektor polarizace elektrické intenzity dopadajícího záření je rovnoběžný se spojnicí středů částic (viz obr. 1.3). Pokud je polarizace na tuto spojnici kolmá, zesílení se výrazně neliší od zesílení pro izolované částice [8]. Z toho plyne, že zesílení je také závislé na polarizaci záření (orientaci struktury a vektoru elektrické intenzity). S rostoucí vzdáleností d mezi částicemi klesá zesílení jako 8 1/ d. Místo s podobně velkým zesílením se v SERS spektroskopii běžně označuje jako hot spot. Seskupení více částic dává příležitost pro vznik více takových míst. Zajímavými z hlediska SERS jsou nanočástice uspořádané do struktur podobajících se fraktálům, které vznikají například při agregaci koloidních částic nebo u ostrůvkových filmů. Fraktály jsou objekty, které při změně měřítka vypadají stále stejně. 10

11 Elektromagnetické pole však tuto vlastnost nemá. Tato nesymetričnost mezi rozptylující strukturou a polem vede k lokalizaci energie v určitých místech [8]. Intenzita pole může dosáhnout stejné velikosti jako u dvojice interagujících částic. Důležitou vlastností je, že fraktální struktury mají širokou oblast plazmonové rezonance (každá rezonanční frekvence odpovídá jinému souboru hot spotů) Chemický (molekulární) mechanismus Chemický mechanismus vysvětluje vlastnosti SERS, které nelze vysvětlit elektromagnetickým mechanismem, pomocí změny polarizovatelnosti molekuly. Molekula musí být na povrch chemisorbovaná 2, to znamená, že energie její interakce s kovem je srovnatelná s energií chemické vazby. Lze říci, že vzniká komplex molekuly a kovu. Nerovnosti v nanoškále nejsou podmínkou. Při vysvětlení chemického mechanismu SERS se přidržím interpretace, kterou ve své knize o povrchem zesílené vibrační spektroskopii uvádí R. Aroca [9]. Podle této interpretace je chemický mechanismus speciálním případem rezonančního Ramanova rozptylu. Zesílení dané chemickým mechanismem se nejčastěji vysvětluje přenosem náboje (CT z angl. charge transfer) mezi molekulou a kovem [9, 10]. Přenos náboje nefunguje pro všechny molekuly. Molekula musí být nejen schopná chemisorpce, ale její vnější orbitaly musí mít podobnou energii jako Fermiho hladina kovu, aby u komplexu vznikl elektronový absorpční přechod. Pokud na komplex dopadá záření s vlnovou délkou odpovídající absorpčnímu přechodu, přejde elektron z Fermiho hladiny do nejnižšího neobsazeného molekulového orbitalu (LUMO). Pokud komplex setrvá v excitovaném stavu dostatečně dlouho, molekulární vibrace se přizpůsobí změně elektronové konfigurace a zaujmou novou rovnovážnou polohu. Když pak dojde k rekombinaci elektron-díra, vyzáří se foton s frekvencí posunutou o frekvenci vibrace. Podstatné je, že vzhledem k rozložení energetických hladin (viz obr. 1.4) postačují k excitaci komplexu nižší frekvence než k excitaci volné molekuly (například viditelné záření namísto UV záření). Komplex molekuly s kovem má jinou polarizovatelnost, bodovou grupu symetrie i energetické hladiny než samotná molekula, a proto se SERS spektrum adsorbované 2 Adsorpci molekuly na povrch dělíme podle její energie na fyzisorpci a chemisorpci. Aroca [9] uvádí, že za fyzisorbci se obvykle považuje interakce s energií větší než -25 kj/mol, za chemisorpci s energií nižší než -40 kj/mol. Samozřejmě mezi nimi neexistuje přesná hranice, takže v rozmezí mezi uvedenými hodnotami se užívání termínů různí. 11

12 molekuly liší od Ramanova spektra volné molekuly. Kromě zesílení signálu v důsledku větší polarizovatelnosti komplexu oproti molekule, obvykle se uvádí [11], ale např. podle [9] může být i vyšší, může dojít k posunu spektrálních pásů či změně jejich šířky. Také se může objevit pás příslušející vazbě molekuly s kovem. E 0 LUMO 0 IP E F HOMO kov molekula Obrázek 1.4: Chemický mechanismus - poloha elektronových hladin adsorbované molekuly vzhledem k Fermiho energii E F kovu. HOMO nejvyšší obsazený molekulový orbital, LUMO nejnižší neobsazený molekulový orbital, E energie, výstupní práce kovu, IP ionizační energie molekuly Povrchem zesílený rezonanční Ramanův rozptyl Pokud se energie budícího záření shoduje zároveň s energií plazmonové rezonance kovu a energií elektronového absorpčního přechodu adsorbované molekuly, dochází k tzv. povrchem zesílenému rezonančnímu Ramanovu rozptylu (SERRS). Od chemického mechanismu SERS se liší tím, že jde o absorpční přechod volné molekuly, nikoli o absorpční přechod komplexu molekuly s kovem. Na celkovém SERRS zesílení se podílí povrchové zesílení elektromagnetickým mechanismem a zesílení molekulární rezonancí Celkové SERS zesílení Ramanův signál bez přítomnosti kovového povrchu je úměrný Ramanovu účinnému průřezu volné molekuly R0, intenzitě budícího záření I 0 ( v měřeném objemu N P RS I R0 0 I 2 0 ~ E 0 ) a počtu molekul N. (11) 12

13 Celkový signál SERS můžeme napsat jako P SERS 2 2 L A S I 0 N R 0 N SERS I 0 N R A EFI, (12) kde SERS je účinný průřez SERS, R účinný průřez Ramanova rozptylu adsorbované molekuly a N je počet molekul účastnících se SERS, který může být menší než počet molekul N v měřeném objemu [7]. Celkové zesílení SERS signálu vůči Ramanovu signálu volné molekuly popíšeme faktorem G, který je součinem faktoru zesílení elektromagnetickým mechanismem EF a chemickým mechanismem, který je vyjádřený poměrem účinného průřezu adsorbované a volné molekuly R R 0 : SERS R G EF. (13) R0 R0 Maximální experimentálně zjištěná SERS zesílení dosahují Jde o experimenty, v nichž se docílí, že signál pochází pouze z oblasti hot spotu, a tak je nejvyšší možný. Takto je dokonce možné získat Ramanův signál jediné molekuly [12-14]. Uvádí se, že elektromagnetický mechanismus se na tomto zesílení podílí faktorem a chemické zesílení faktorem 10 2 [7], i když to vždy nelze jednoznačně určit, protože není snadné oba mechanismy odlišit. V experimentech, kde se SERS signál sbírá z makroskopické oblasti kovového nanopovrchu, dochází k zprůměrování signálu z hot spotů a míst s menším zesílením. Zprůměrované SERS zesílení dosahuje přibližně Většina signálu přitom pochází z omezeného počtu hot spotů. Po obsazení silně zesilujících míst molekulami se signál přidáním dalších molekul významně nezvýší. SERS zesílení není pro všechny molekuly stejné, za což může jejich různá schopnost přiblížit se a adsorbovat se ke kovovému nanopovrchu a změna vlastností molekuly adsorpcí SERS-aktivní povrchy SERS-aktivní povrch musí splňovat dvě podmínky. Musí být tvořen nanonerovnostmi správné velikosti, které umožní rezonanci povrchových plazmonů, a zkoumaná látka se na něj musí adsorbovat. Nejčastěji se pro jejich výrobu používají zlato, stříbro a měď, které pro excitační záření ve viditelné oblasti splňují podmínky plazmonové rezonance. Základními a zároveň nejrozšířenějšími typy SERS-aktivních povrchů jsou zdrsněné kovové elektrody, kovové filmy a kovové koloidy, resp. koloidní částice. Všechny jmenované povrchy se používají od samých počátků SERS spektroskopie. 13

14 Dosažení hranice detekčního limitu naměřením SERS signálu jediné molekuly v druhé polovině devadesátých let a pokrok v technologiích výroby nanopovrchů odstartovaly nový zájem o SERS spektroskopii, který vedl k přípravě sofistikovanějších SERS-aktivních povrchů. Většinou se jedná o modifikace základních typů povrchů. Původní varianty nejsou dobře definované, jsou nehomogenní a většinou špatně reprodukovatelné. Snahou je získat dobře definované povrchy - mít pod kontrolou velikost, tvar a uspořádání nanočástic v povrchu, to znamená parametry, které ovlivňují plazmonovou rezonanci, a tedy oblast vlnových délek vhodných k jejich excitaci a velikost zesílení elektromagnetickým mechanismem. Cílenou změnou těchto parametrů by bylo možné plazmonovou rezonanci ladit. Z hlediska adsorpce analytu jsou důležité chemické vlastnosti povrchu. Ty lze měnit například navázáním vhodných molekul, neboli funkcionalizací. Ideální by bylo vyrobit povrch s co největším množstvím zesilujících míst, která by vytvářela co nejvyšší zesílení elektromagnetického pole. Takový povrch by byl vhodný pro téměř všechny aplikace. Otázkou je, zda je to možné. Například proto, že čím větší je zesílení elektrického pole, tím větší je jeho lokalizace. V současnosti je nutné zvolit si povrch vhodný pro zamýšlený experiment. Povrch je třeba volit také s ohledem na vlastnosti molekuly, především její náboj, aby došlo k adsorpci. Stejně jako Ramanova spektroskopie je SERS považován za analytickou metodu. A to i přesto, že jeho použití k chemické analýze má několik úskalí. Zesílení elektromagnetického pole není na SERS-aktivním povrchu rozloženo homogenně, což se projeví zejména při vyšším prostorovém rozlišení měření, SERS zesílení povrchu se pro různé molekuly liší, protože závisí na interakci molekuly s povrchem, a signál obecně nemusí odpovídat množství látky, jelikož zesílení nastává pouze pro molekuly adsorbované do SERS-aktivních míst. Povrch pro kvantitativní chemickou analýzu musí být co nejvíce homogenní a reprodukovatelný. Zcela spolehlivé povrchy pro rutinní chemickou analýzu nejsou zatím k dispozici. Vyrobit takový povrch je jedním z cílů současné SERS spektroskopie. Některé povrchy, například vyrobené metodou litograficky připravovaných pravidelných nanostruktur (nanosphere lithography) [16], se tomu přiblížily. K zobrazení a charakterizaci SERS-aktivních povrchů se používají různé mikroskopické a spektroskopické metody. Patří mezi ně mikroskopie atomárních sil (AFM), skenovací a transmisní elektronová mikroskopie (SEM, TEM), UV-VIS absorpční 14

15 spektroskopie, případně také spektroskopie fotoelektronů buzených rentgenovým zářením (XPS), která určuje chemické složení povrchu. SERS-aktivní povrchy můžeme dělit na pevné povrchy a koloidy. Nyní si podrobněji popíšeme vlastnosti jednotlivých typů povrchů. Zdrsněné kovové elektrody Tento povrch byl použit k úplně prvním SERS experimentům. Připravuje se zdrsněním kovové elektrody několika oxidačně-redukčními cykly elektrolýzy. Do elektrolytu se přidá sůl kovu, ze kterého je vyrobena elektroda. Nejčastěji se používají stříbrné elektrody. Povrch elektrody se nejprve vyhladí, aby byl výsledný SERS-aktivní povrch reprodukovatelný. V oxidační polovině cyklu se z elektrody uvolňují kationty kovu a reagují s anionty elektrolytu v okolí elektrody za vzniku kovové soli. V redukční polovině cyklu se sůl v okolí elektrody redukuje na kov. K aktivaci povrchu je nutné provést obě části cyklu. Tím vznikají na povrchu elektrody nerovnosti o velikosti nm. Hlavními faktory ovlivňujícími strukturu povrchu a tím SERS zesílení jsou náboj prošlý soustavou během oxidační a redukční části cyklu, počet oxidačně-redukčních cyklů, potenciál elektrody, koncentrace a vlastnosti elektrolytu. Výhodou elektrod je, že při měření SERS můžeme nastavením elektrodového potenciálu upravovat povrchový potenciál a tím ovlivnit adsorpci analytu. Kromě stříbrných elektrod se používají zlaté, měděné a platinové, méně často i jiné, např. paladiové nebo iridiové [17]. Kovové filmy Kovové filmy vznikají napařováním kovu na pevný substrát. Původním typem tohoto SERS-aktivního povrchu byly kovové ostrůvkové filmy. Dnes se používají různé modifikace vylepšující jejich vlastnosti, ať už napaření kovu na substrát s určitou strukturou nebo funkcionalizace povrchu. Zmiňme se nejprve o kovových ostrůvkových filmech. Substrátem pro jejich přípravu je nejčastěji sklo. Napařování probíhá ve vakuu. Většinou se kov deponuje na zahřátý substrát, ale někdy se používá naopak snížená teplota. Tloušťka napařované vrstvy kovu bývá 5-10 nm [15]. Na substrátu vznikají nepravidelné ostrůvky kovu o velikosti nm. Hlavními parametry ovlivňujícími strukturu povrchu jsou rychlost napařování, teplota substrátu během napařování a tloušťka filmu. Nejčastěji používanými kovy jsou stříbro a zlato. Vyrábějí se také dvoukovové filmy, kdy 15

16 se nejprve napaří tenká vrstva jednoho a potom druhého kovu. Výhodou kovových ostrůvkových filmů je jejich stabilita a vysoká chemická čistota. Protože struktura ostrůvkových filmů je nepravidelná a možnosti ovlivnit polohu maxima plazmonové rezonance omezené, byla zde snaha o jiné morfologie povrchu, které by měly definovanou, reprodukovatelnou strukturu a umožňovaly plazmonovou rezonanci v dalších oblastech. Možností je napaření kovu na substrát s určitou strukturou. Typů takových povrchů je dnes celá řada. Příkladem poměrně slibné techniky umožňující vytvořit SERS-aktivní povrch s definovanou strukturou je nanosphere lithography [16]. Na substrát jsou přidány polymerové nanokuličky, které na něm vytvoří uspořádanou monovrstvu. Na ně je napařena vrstva kovu. Jednou variantou je napařit tenkou vrstvu ( nm), následným odstraněním kuliček získáme periodickou strukturu z kovových trojúhelníků, které se vytvořily v mezerách mezi kuličkami. Změnou velikosti kuliček lze systematicky posouvat rezonanci povrchových plazmonů v oblasti nm. Jinou možností je napaření silnější vrstvy kovu (okolo 200 nm) a kuličky již neodstraňovat. Výsledkem je stabilní povrch s velkou hustotou SERS-aktivních míst. Kovové koloidy Kovový koloid je suspenze kovových nanočástic ve vodě. Nejčastěji se používají zlaté, stříbrné a měděné koloidy. Lze je připravit chemickou redukcí, laserovou ablací nebo fotoredukcí. Zdaleka nejpoužívanější je chemická redukce, kdy se sůl kovu redukuje vhodným redukčním činidlem (např. borohydrid sodný, citronan sodný). V závislosti na podmínkách přípravy vznikají nanočástice různé velikosti a tvaru, tedy i plazmonové rezonance. Nejvýznamnějšími faktory jsou použitý kov, redukční činidlo, teplota, stabilizační činidla a koncentrace kovových iontů. Velikost částic koloidů používaných v SERS spektroskopii se většinou pohybuje mezi nm [9]. Vhodným postupem je možné připravit koloid s úzkou distribucí velikosti částic, dokonce koloidy, které lze považovat za monodisperzní, tj. mající částice jedné velikosti. Koloid charakterizujeme jeho extinkčním spektrem (SPE, Surface Plasmon Extinction), zahrnujícím absorpci a rozptyl záření povrchovými plazmony, které se měří UV-VIS absorpčním spektrometrem. Z něj je přímo vidět, které excitační vlnové délky jsou použitelné pro SERS. Šířka extinkčního pásu odpovídá distribuci velikostí nanočástic. 16

17 Chemicky připravený koloid je tvořen kladně nabitými kovovými nanočásticemi, které jsou obalené vrstvou aniontů redukčního činidla. Kolem ní se vytvoří difúzní obálka z aniontů a kationtů tak, aby celkový náboj byl nulový. Toto rozložení náboje určuje schopnost koloidu adsorbovat analyt a jeho stabilitu, tj. odolnost vůči agregaci. Charakterizuje se tzv. zeta potenciálem, což je hodnota elektrického potenciálu na rozhraní k nanočástici pevně a volně vázané části difúzní obálky. Čím větší je jeho velikost, tím je koloid stabilnější a tím hůře se adsorbují záporně nabité molekuly. Pokud se jeho velikost naopak blíží nule, zmenšuje se elektrické odpuzování mezi nanočásticemi a koloid má tendenci agregovat. Když jsou agregáty velké, tak sedimentují na dno nádoby. Nevýhodou agregace je špatná reprodukovatelnost SERS měření z koloidů, protože stav agregace závisí na mnoha parametrech jako jsou příprava, teplota, ph, přidaný analyt a jeho koncentrace. To znamená, že koloidy nejsou vhodné pro kvantitativní měření. Agregaci také způsobují nečistoty, proto je důležité při přípravě pečlivě dodržovat čistotu. Výhodou naopak je, že agregovaný koloid vykazuje díky interakci nanočástic (viz kapitola 1.2.1) větší SERS zesílení než neagregovaný. Stav agregace lze ovlivnit přidáním stabilizačního, nebo agregačního činidla. Jako agregační činidlo se používají elektrolyty (např. NaCl, KI), protože ionty odstíní náboj na povrchu koloidních částic, které se pak mohou k sobě přiblížit. Stabilizačním činidlem jsou například molekuly s velkou molekulovou hmotností (např. polyethylenglykol), které stericky brání agregaci koloidních nanočástic. Takto lze do jisté míry optimalizovat koloid pro měření SERS, problémem je ale možný výskyt pásů přidaných látek v SERS spektru analytu. V extinkčním spektru se vznik agregátů projeví posunem maxima extinkce k větším vlnovým délkám a vznikem nového extinkčního maxima na větší vlnové délce. Koloid tedy mění při agregaci barvu, což lze vidět i pouhým okem. Druhým způsobem přípravy kovového koloidu je laserová ablace [18, 19]. Kovová folie ve vodě (případně roztoku) je ozařována pulzním laserem. Působením laseru se z folie odpařují nanočástice kovu. Takto připravený koloid je chemicky čistý, což je pro měření SERS spektra výhodné, jelikož ve spektru nejsou interferující pásy, ale zároveň je kvůli chybějící elektrostatické repulzi méně stabilní. Fotoredukce se k přípravě kovových koloidů používá spíše ojediněle. Jedná se o redukci kovu z vodného roztoku kovové sloučeniny pomocí elektromagnetického záření [20, 21]. Hlavními přednostmi kovových koloidů jako SERS-aktivních povrchů jsou jednoduchá a levná příprava, snadná charakterizace pomocí UV-VIS absorpční 17

18 spektroskopie a velké SERS zesílení. Nevýhodou je ale jejich nekontrolovatelná agregace, která vede ke špatné reprodukovatelnosti SERS spekter. Kovové koloidní částice imobilizované na pevném substrátu Spojit výhody kovových koloidů se stabilitou a reprodukovatelností pevných povrchů se snaží kovové koloidní částice imobilizované na pevném substrátu. Tento typ SERS-aktivního povrchu se poprvé objevil v 90. letech [22]. Obrázek 1.5: Příprava imobilizovaných kovových koloidních částic (A) vazba silanu na substrát, (B) jednotlivé kroky přípravy. Převzato z [24]. Postup přípravy [23] je znázorněn na obr Skleněný substrát, který nese hydroxylovou nebo oxidovou funkční skupinu, je ponořen do roztoku organosilanu. Molekuly organosilanu se vážou siloxanovou vazbou na substrát a vytvářejí na něm samouspořádané struktury, na jejichž koncové funkční skupiny ( NH 2, SH, CN) se po ponoření do kovového koloidu vážou kovové částice. Nejčastěji se používá zlato a stříbro. Pokud použijeme koloid s úzkou distribucí částic, vznikne dobře definovaný povrch. Volbou velikosti částic lze měnit oblast plazmonové rezonance. Získá se tak homogenní a reprodukovatelný SERS-aktivní povrch, který je na rozdíl od koloidu stabilní, a proto je možné jej použít ke kvantitativním měřením. Kromě skla lze jako substrát použít i jiné materiály, přičemž silan je pak nutné nahradit nějakou vhodnou molekulou. 18

19 Koloidní částice imobilizované na průhledném substrátu lze stejně jako koloidy charakterizovat extinkčními spektry měřenými UV-VIS absorpční spektroskopií. Přípravou zlatých povrchů, spolu s popisem termodynamiky a kinetiky jejich vzniku, se podrobně zabývá článek Keatingové a kol. [23]. Nalezením nejlepších podmínek přípravy se zabývali ve svých diplomových pracích N. Hajduková pro zlaté povrchy [24-26] a P. Molnár pro stříbrné povrchy [27]. Parametry ovlivňující výsledný povrch jsou kromě použitého koloidu, funkční skupina silanu, koncentrace silanu a doby ponoření substrátu do silanu a koloidu. V této práci byly použity povrchy připravené způsobem, který určili jako nejlepší. Substrátem pro výrobu byla podložní sklíčka. Zlaté povrchy byly připraveny pomocí citrátového koloidu. K silanizaci byl použit APTMS s NH 2 skupinou. Přípravou vznikají dva typy povrchů, přičemž první vykazovaly jedno maximum extinkce cca nm, které odpovídá extinkčnímu maximu výchozího neagregovaného koloidu, a druhé vykazovaly dva extinkční pásy cca nm a nm. První typ povrchů byl nestabilní po několika hodinách až dnech přešel na druhý typ, který se jevil stabilním. Aby byla zajištěna reprodukovatelnost, byly povrchy po imobilizaci částic tepelně upraveny (10 min ve 100 C), čímž vznikl druhý, stabilní typ povrchu. Pomocí AFM a SEM (viz obr. 1.6) bylo zjištěno, že povrchy připravené z citrátového koloidu jsou tvořeny více vrstvami částic a malých agregátů kulovitého tvaru o průměru nm. Druhý extinkční pás na vyšších vlnových délkách souvisí s malou vzájemnou vzdáleností částic. Au Obrázek 1.6: Typické SEM obrázky zlatého a stříbrného povrchu. Převzato z [26]. Ag Stříbrné povrchy byly připraveny pomocí borohydridového koloidu. Citrátový koloid nelze použít, protože excitací laserem dochází k tepelnému rozkladu citrátových aniontů 19

20 přítomných na povrchu stříbrných částic na grafitický uhlík, který má silný SERS signál. Sklíčka byla silanizována pomocí APTMS. Extinkční spektrum vyrobených povrchů má maximum kolem 400 nm. SEM ukázala, že stříbrné částice nepokrývají zcela plochu sklíčka. Jsou to izolované částice o velikosti 6-20 nm a malé agregáty o velikosti nm (viz obr. 1.6). Na stříbrných površích překvapivě nedochází k metalaci free-base porfyrinů, což je nejspíše způsobeno vlivem silanu (více viz kapitola 1.3 o porfyrinech). Další SERS-aktivní povrchy Novou skupinou SERS-aktivních povrchů jsou tenké pokovené hroty, jimiž lze pohybovat po vzorku. Špička kovového hrotu hraje roli bodového zdroje záření. Jelikož má rozměr desítky nanometrů, je možné získat prostorové rozlišení pod difrakčním limitem světla, který omezuje běžnou optickou mikroskopii. Jedním příkladem takového povrchu je optické vlákno se zašpičatělým koncem o průměru nm, na nějž je napařen kovový film. Optické vlákno slouží k excitaci i sběru rozptýleného záření. Prostorové rozlišení je v nejlepších případech 50 nm [28]. Větší prostorové rozlišení a rychlejší měření poskytují metody využívající hroty a zařízení pro skenovací mikroskopii. Toto odvětví SERS spektroskopie se nazývá TERS (z angl. tip-enhanced Raman Spectroscopy - hrotem zesílená Ramanova spektroskopie). Teoretický koncept metody TERS navrhl Wessel v roce 1985 [29], ale poprvé byl aplikován až v roce 2000 [30]. Výhodou je přesné polohování hrotu. Nejčastěji se používají AFM hroty, na které se napaří zlatý nebo stříbrný film. Průměr hrotu je nm. Rozhraní hrotu a vzorku osvětlujeme laserovým zářením fokusovaným objektivem mikroskopu, kterým také sbíráme rozptýlené záření. Kovový hrot zesiluje záření a lokalizuje ho do objemu ~ 20 cm 3. Teoreticky předpovídané zesílení je 10 10, ale zatím se pohybuje v rozmezí [31]. Principy a využití TERS spektroskopie jsou shrnuty v [28-33] Vlastnosti SERS spektroskopie a její využití ke studiu biomolekul Ramanova spektroskopie je významná metoda optické vibrační spektroskopie. To znamená, že Ramanovo spektrum obsahuje informace o struktuře molekuly. Jednou z mnoha jejích aplikací je proto chemická analýza. Lze ji využít i ke studiu biochemických procesů. Protože se Ramanův rozptyl odehrává v časové škále s, umožňuje studovat 20

21 dynamiku procesů, které probíhají tak rychle, že je nelze sledovat pomocí fluorescence či NMR. Ramanova spektroskopie je nedestruktivní, a proto ji lze využít také ke studiu živých buněk. Na rozdíl od infračervené absorpční spektroskopie je pro ni voda ideální rozpouštědlo, protože má malý Ramanův účinný průřez v oblasti, ve které se nejčastěji měří (pás 1640 cm -1 je slabý). To je pro zkoumání biomolekul velmi důležité, jelikož se z velké části v organismech nacházejí v formě vodného roztoku. Zajímavé možnosti přináší využití rezonančního Ramanova rozptylu. Jednak je intenzivnější než nerezonanční a také jej lze použít k selektivnímu měření spekter chromoforů v rezonanci s excitačním zářením, přičemž signál sousedních molekul, které nejsou v rezonanci, je mnohem slabší či nedetekovatelný. Jako příklad uveďme studium chlorofylů nebo porfyrinů nacházejících se v komplexech s proteiny. Největší nevýhodou Ramanovy spektroskopie je nízká citlivost, daná tím, že Ramanův rozptyl je slabý jev. Proto bývají potřeba velké koncentrace vzorku ( g/ l), což znamená velkou spotřebu vzorku a navíc nemusí odpovídat podmínkám, za jakých se biomolekuly obvykle vyskytují. Některé molekuly například ve vyšších koncentracích agregují. Nízkou citlivost pomáhá překonat SERS, přičemž zmiňované výhody Ramanovy spektroskopie zachovává. Jak jsme uvedli, zesílení Ramanova signálu z makroskopické oblasti SERS-aktivního povrchu se pohybuje kolem Díky SERS spektroskopii tedy můžeme používat mnohem nižší koncentrace než dovoluje Ramanova spektroskopie, což umožňuje studovat biomolekuly ve fyziologických koncentracích. Pro speciální systémy nanočástic bylo dokonce dosaženo zesílení Ramanova signálu 10 14, které odpovídá účinnému průřezu nejméně cm 2 na molekulu, což je srovnatelné s účinnými průřezy fluorescenčních barviv [7]. Takové SERS-aktivní systémy umožňují detekci velmi nízkých koncentrací látek, až k jednotkám molekul, ale nejsou vhodné pro kvantitativní měření, jelikož kvůli spontánní i fotoindukované dynamice kovového povrchu, analytu a dalších molekul adsorbovaných na povrch se ve spektru objevují výrazné fluktuace. Dalším přínosem zesílení Ramanova signálu je zkrácení akumulačního času jednoho spektra z minut na sekundy či zlomky sekund. Kratší akumulační časy zkracují dobu potřebnou pro experiment, ale hlavně umožňují měření různých biofyzikálních a biochemických procesů v reálném čase. Protože se zesílení týká pouze molekul v těsné blízkosti povrchu, může SERS poskytnout velké prostorové rozlišení až jednotky nanometrů, což je lepší než difrakční limit. Schopnost využít toto prostorové rozlišení má hlavně TERS spektroskopie. Stejně jako u normálního Ramanova rozptylu lze měřit rezonanční rozptyl. U SERRS 21

22 navíc dochází nezářivým přenosem energie na kov k potlačení fluorescence vzorku, která je problémem u rezonančního Ramanova rozptylu. Další předností SERS je možnost měřit na pevných SERS-aktivních substrátech po odpaření rozpouštědla látky nerozpustné ve vodě, jejichž měření Ramanovou spektroskopií není možné kvůli signálu rozpouštědla. SERS poskytují všechny molekuly schopné adsorpce na daný SERS-aktivní povrch. Velmi dobrý signál mají molekuly s delokalizovanými π-elektrony, což je vlastnost mnoha biomolekul. Největší nevýhodou SERS spektroskopie je, že adsorpcí na kovový povrch může dojít ke změně konformace či struktury molekuly. Příkladem je metalace free-base porfyrinů nebo denaturace nukleových kyselin a proteinů. SERS je vhodný pro teoretický výzkum i praktické aplikace v mnoha oborech včetně medicíny. Z biomolekul se v SERS experimentech často objevují barviva, proteiny a nukleové kyseliny. Jako SERS-aktivní kovy se nejčastěji používají stříbro a zlato, přičemž stříbro poskytuje při ideální excitaci větší zesílení elektromagnetického pole, zlato je zase chemicky stabilnější, a proto pro některé experimenty vhodnější. Novější aplikace v biofyzice, biochemii a medicíně představuje [7]. Jsou mezi nimi detekce neurotransmiterů, identifikace mikroorganismů, imunoeseje využívající SERS značení, experimenty s nukleovými kyselinami bez i s použitím SERS značení a měření SERS zevnitř živých buněk využívající skenovací mikroskopii. Problematika vnitrobuněčného měření je shrnuta v [31]. Využitím SERS značení pro specifickou detekci DNA a RNA se zabývá [34]. Přítomnost kovového povrchu SERS spektroskopii limituje, ale zároveň přináší nové aplikace. Jejich příkladem je studium biologických procesů založených na přenosu náboje pomocí kovových elektrod nebo studium katalytických reakcí. 22

23 1.3 Porfyriny Porfyriny jsou deriváty porfinu, což je planární heterocyklický aromatický kruh složený ze čtyř pyrolů spojených metinovými můstky (obr. 1.7). Porfin může být substituován na pyrolových kruzích nebo na metinových můstcích. Biologicky nejvýznamnější jsou porfyriny s centrálním atomem kovu vázaným koordinační vazbou na dusíky, tzv. metaloporfyriny. Jako příklad uveďme hem obsahující centrální atom železa a chlorofyl obsahující hořčík. Metaloporfyriny se často vyskytují v komplexu s proteiny (např. hemoglobiny, myoglobiny, katalasy). Nemetalované porfyriny se nazývají freebase porfyriny. Syntetické deriváty porfyrinů nacházejí široké uplatnění v molekulární biologii a medicíně. Aplikace zahrnují nádorovou fototerapii, protivirovou léčbu, transport oligonukleotidů přes cytoplazmatickou membránu, specifickou detekci sekvencí DNA či Obrázek 1.7: Porfin, základní stavební jednotka porfyrinů. Převzato z [35]. selektivní štěpení nukleových kyselin. Ve všech těchto aplikacích je důležitá schopnost porfyrinů, zejména kladně nabitých, vytvářet komplexy s nukleovými kyselinami. Komplexy porfyrinů a nukleových kyselin jsou proto v současnosti intenzivně zkoumány. Porfyriny absorbují záření téměř přes celou viditelnou oblast a v blízké ultrafialové oblasti. V absorpčním spektru se vyskytuje výrazný tzv. Soretův pás kolem 400 nm a několik slabších tzv. Q-pásů v oblasti nm. Free-base porfyriny silně fluoreskují, což je výhodné pro jejich detekci fluorescenční spektroskopií, ale ztěžuje jejich studium pomocí rezonanční Ramanovy spektroskopie. Řada porfyrinů ve vyšších koncentracích v důsledku interakce svých postranních řetězců agreguje. Studium porfyrinů při vyšších koncentracích tedy neodpovídá podmínkám jejich přirozeného výskytu a použití v medicíně. Z těchto příčin je SERS 23

24 spektroskopie jako citlivá analytická metoda, která navíc zháší případnou fluorescenci, vhodná ke studiu porfyrinů. Problém se vyskytuje u měření free-base porfyrinů, které se na stříbrných či měděných SERS-aktivních površích mohou metalovat, tedy navázat do porfyrinového makrocyklu atom kovu. SERS spektrum je tvořeno příspěvkem nemetalované a metalované formy porfyrinu, jejíž podíl v čase narůstá, což způsobuje nereprodukovatelnost spekter. Metalaci je možné zamezit použitím molekulárních spacerů, což se podařilo u záporně nabitých porfyrinů [36, 37], ale u kladně nabitých se ukázalo, že je to velmi obtížné [38-40]. Na druhou stranu měření kinetiky metalace lze využít k charakterizaci SERS-aktivního povrchu [41], agregaci porfyrinů či jejich interakci s velkými biomolekulami, např. nukleovými kyselinami [42]. Molnár dospěl ve své diplomové práci k překvapivému zjištění, že na silanem imobilizovaných stříbrných koloidních částicích na pevném substrátu na rozdíl od koloidu k metalaci nedochází [26, 27, 43]. Vysvětlil to tím, že silan naváže kladně nabité koloidní nanočástice, které se proto nemohou zabudovat do porfyrinového makrocyklu. Dalším možným vysvětlením uvedeným v [26] je, že silan funguje jako molekulární spacer. U zlatých povrchů problém s metalací nenastává - atom zlata se do porfyrinového makrocyklu neváže, protože je příliš velký. Obrázek 1.8: Free-base (A) a stříbrným atomem metalovaná (B) molekula TMPyP. Převzato z [24]. Mezi deriváty porfinu, které vznikly substitucí na metinových můstcích, patří 5,10,15,20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)porfyrin (TMPyP) (obr. 1.8 A). N- methylpyridylové skupiny jsou svými rovinami orientované přibližně kolmo na rovinu porfyrinového makrocyklu. Na jejich dusících je přítomen kladný parciální náboj, díky 24

25 němuž je TMPyP rozpustný ve vodě. TMPyP je relativně odolný k samoagregaci při vyšších koncentracích. Na obr. 1.8 B je znázorněn TMPyP metalovaný stříbrem. 1.4 Konfokální mikroskop Tato kapitola je věnována konfokálnímu mikroskopu, který je nedílnou součástí konfokálního Ramanova mikrospektrometru, přístroje použitého k naměření této práce. Konfokální optický mikroskop umožňuje získat větší prostorové rozlišení než standardní optický mikroskop. Je to dáno tím, že zobrazuje pouze rovinu vzorku, do které je právě zaostřen, kdežto standardní mikroskop vytváří i neostré obrazy rovin nad a pod touto rovinou, což je problém u vzorků tlustších než hloubka ostrosti objektivu mikroskopu. První konfokální mikroskop si v roce 1957 patentoval M. Minsky. V té době ale neměl k dispozici vhodný zdroj světla. Konfokální mikroskopie se začala rozvíjet až na konci 70. let, kdy byl vyroben první spolehlivý konfokální mikroskop s laserovým zdrojem světla. Obrázek 1.9: Schéma konfokálního mikroskopu. Podle [44]. 25

26 Princip konfokálního mikroskopu zachycuje obr Bodovým zdrojem světla je laserový paprsek zaostřený na bodovou clonku, která je objektivem zobrazena na vzorek. Průměr obrazu clonky se rovná rozlišovací schopnosti objektivu dané difrakcí. Tímtéž objektivem je sbíráno světlo vzorkem rozptýlené, odražené, případně fluorescence vzorku a pomocí děliče svazku je vedeno směrem k detektoru. Před ním je vytvořen další obraz vstupní bodové clonky. V tomto bodě je umístěna konfokální bodová clonka. Ta zabraňuje paprskům z míst mimo ohniskovou rovinu dopadnout na detektor. Příčným skenováním získáme postupně obraz celé ohniskové roviny vzorku optický řez vzorkem, skenováním ve směru optické osy dostaneme vertikální optické řezy. Konfokální mikroskop tak přinesl možnost nedestruktivního získání obrazu zevnitř tkání či buněk. Skenování se provádí třemi základními způsoby: rozmítáním laserového paprsku, posouváním vzorku pod objektivem, nebo posouváním objektivu nad vzorkem. Pomocí počítačového zpracování je možné vytvořit trojrozměrný obraz vzorku. Malým průměrem konfokální clonky se dosáhne rozlišovací schopnosti pod Rayleighovým kritériem udávajícím rozlišovací schopnost standardního mikroskopu. Konfokální Ramanův mikrospektrometr slouží k detekci Ramanových spekter. Kromě popsaného konfokálního mikroskopu proto obsahuje další součásti. Ty nejdůležitější jsou notch filtr sloužící k odstranění elastického rozptylu, mřížka pro spektrální rozklad záření a detektor. 1.5 Další použitá technika - DCDR Měření biomolekul pomocí Ramanovy spektroskopie je často omezeno množstvím a koncentrací vzorku. Zajímavou novou technikou pro překonání tohoto problému je Ramanova spektroskopie kapkově nanášených povlaků (Drop coating deposition Raman, DCDR) [45] založená na tzv. efektu kávové kapky [46]. Na destičku z nerez oceli pokrytou teflonem, která nemá téměř žádný Ramanův signál, se nanese malá kapka - řádově mikrolitrová roztoku vzorku. Díky hydrofobnímu povrchu destičky vysychá kapka tak, že tekutina vypařovaná z jejího okraje je doplňována z vnitřku kapky, čímž vzniká tok přinášející další molekuly vzorku k okraji, až se nakonec vytvoří tenký kroužek obsahující většinu vzorku. To znamená, že dojde k zahuštění vzorku do koncentrace, kterou již lze měřit. K měření se používá Ramanův mikrospektrometr. Pokud je ve vzorku přítomno více 26

27 látek, není kroužek v průřezu homogenní. Takto často dojde k separaci nečistot, které by mohly způsobovat nežádoucí fluorescenci, čímž se získají kvalitnější spektra. Experimenty ukazují, že některé biomolekuly si po vyschnutí kapky zachovávají formu, kterou mají v roztoku, takže spektra z DCDR destičky jsou téměř totožná se spektry z roztoku. DCDR technika se používá zejména pro studium proteinů. Vzniku a struktuře kroužku, jakož i omezením týkajícím se měření biomolekul touto technikou se věnuje například článek [47]. 27

28 2 Cíle práce Náplní práce bylo zjistit, zda jsou SERS-aktivní povrchy připravené imobilizací koloidních částic na silanizovaný skleněný substrát vhodné pro měření povrchem zesíleného Ramanova rozptylu biomolekul pomocí Ramanova mikrospektrometru. Práce navazuje na předchozí výzkum na Oddělení fyziky biomolekul FÚ UK včetně studentských prací. Především na diplomovou práci N. Hajdukové [24] zabývající se zlepšením metodiky přípravy imobilizovaných zlatých koloidních nanočástic, tak aby výsledkem byly stabilní, homogenní povrchy poskytující kvalitní reprodukovatelná SERS spektra vybraných biomolekul, a na diplomovou práci P. Molnára [27], která se zabývá stejným problémem pro stříbrné povrchy. V obou pracích byla SERS spektra měřena klasickým Ramanovým spektrometrem, neboli v makromódu. Testovacími molekulami byly hlavně free-base porfyriny, významné biomolekuly, pro které je SERS vhodnou spektroskopickou metodou. Dále tato práce navazuje na bakalářskou práci H. Šípové [48], která se věnuje použití Ramanova mikrospektrometru k měření SERS spekter biomolekul. Imobilizované koloidní částice jsou jako SERS-aktivní povrch zajímavé, protože spojují výhody koloidů (definovaná velikost částic, velké zesílení Ramanova signálu) a pevných povrchů (stabilita a reprodukovatelnost povrchů, potažmo reprodukovatelnost spekter na nich měřených). Ramanův mikrospekrometr je přístroj skládající se z konfokálního mikroskopu a spektrometru a má pro měření SERS spekter z těchto povrchů oproti klasické aparatuře několik výhod. Jako první uveďme lepší poměr signál/šum a z toho plynoucí výrazně kratší akumulační časy. Dále větší prostorové rozlišení měření a možnost mapování vzorku. Nezanedbatelnou výhodou je potlačení silného signálu skla, který jinak může překrýt část spektra měřené molekuly. Je však potřeba dát pozor na možnou destrukci vzorku silně zfokusovaným laserovým svazkem. Jako testovací molekulu jsme zvolili 5,10,15,20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)porfyrin (TMPyP). Důvodem bylo, že se dobře adsorbuje na povrchy z imobilizovaných koloidních částic a byl používán při studiu vlastností těchto povrchů pomocí klasické Ramanovy aparatury v diplomových pracích zmíněných výše. Za předpokladu, že TMPyP půjde na zlatých a stříbrných površích Ramanovým mikrospektrometrem studovat, bylo cílem práce zjistit detekční limity, porovnat je s detekčními limity v makromódu publikovanými v [26] a charakterizovat povrchy pomocí spektrálních map. V průběhu práce se nám ale potvrdilo zjištění z diplomové práce P. Molnára, že úspěšnost přípravy stříbrných povrchů není ani 28

29 při přesném dodržení postupu zaručena. Potíže s přípravou stříbrných povrchů z borohydridového koloidu nás přivedly k vyzkoušení hydroxylaminového koloidu. Přestože povrchy z něj vyrobené také nebyly příliš dobré, zjistili jsme, že koloid poskytuje velmi vysoké SERS zesílení. Proto jsme se rozhodli zkoumat vlastnosti tohoto koloidu v porovnání s borohydridovým pomocí vyschlých kapek koloidu s porfyrinem na skleněné podložce. 29

30 3 Experimentální část 3.1 Aparatury Konfokální Ramanův mikrospektrometr K naměření této práce byl použit Ramanův mikrospektrometr LabRAM HR s mikroskopem Olympus BX40 od firmy Horiba Jobin Yvon, který používá uspořádání pro měření zpětného rozptylu. V současné době má k dispozici dva excitační zdroje vestavěný diodový He-Ne laser (632,8 nm, výkon na výstupu 20 mw, maximální výkon na vzorku 6,4 mw) a argonový laser (používána vlnová délka 514,5 nm, výkon na výstupu 40 mw, maximální výkon na vzorku 15 mw). Popišme stručně dráhu svazku (obr. 3.1). Prvním důležitým prvkem je interferenční filtr, který je pro každou excitační vlnovou délku jiný a slouží k odstranění vedlejších plazmových linií laseru. Pokud používáme k excitaci argonový laser, je svazek přiveden pomocí dvou zrcadel. Dále svazek prochází přes karusel s šedými filtry o optických hustotách 0,3; 0,6; 1; 2; 3 a 4, které se nastavují pomocí ovládacího programu, a pomocí čočky je zaostřen na bodovou clonku H1. Dále je laserový svazek odražen notch filtrem do objektivu, který vytváří obraz clonky H1 na vzorku. K dispozici jsou objektivy 5 NA 0,1, 10 NA 0,25, 50 NA 0,7, 100 NA 0,9 a dva (olejový a vodní) imerzní objektivy. Záření od vzorku je objektivem přivedeno zpět na notch filtr. Ten odrazí záření s excitační vlnovou délkou, zatímco záření s posunutou vlnovou délkou jím projde a je čočkou fokusováno na konfokální bodovou clonku. Před ní mohou být umístěny polarizační filtry, nebo druhý notch filtr. Zvětšení obrazu mezi vzorkem a konfokální clonkou je dané zvětšením objektivu vynásobeným faktorem 1,4, (poměr ohniskové vzdálenosti čočky a délky tubusu objektivu 250 mm /180 mm). Pro sledování vzorku kamerou jsou v dráze paprsku vystupujícího z mikroskopu umístěny dva děliče svazku 50/50. Jeden přivádí bílé světlo z optického vlákna na vzorek a druhý ze vzorku do kamery. Obraz z kamery slouží k manuálnímu zaostřování. Obraz konfokální clonky je zobrazen v pětinásobném zmenšení na vstupní štěrbinu spektrografu S1, která je nastavitelná. Její doporučená šířka je μm. Spektrograf HR 800 má Czerny Turnerovo uspořádání s ohniskovou dálkou 800 mm. Obsahuje dvě měnitelné mřížky (600, 1800 vrypů/mm). Součástí spektrografu je laserová dioda sloužící k nastavení konfokální štěrbiny, které je možné v rozmezí μm. Spektrum je detekováno dusíkem chlazeným CCD detektorem o velikosti pixelů. 30

31 Skenování vzorku je zajištěno pohyblivým stolkem mikroskopu s krokem 1 μm. Ovládací software umožňuje automatické měření spekter z předem vybraných míst vzorku mapování vzorku. Obrázek 3.1: Schéma Ramanova mikrospektrometru LabRAM HR. Lasery byly nastaveny na maximální výkon. Intenzita záření byla regulována šedými filtry. Používali jsme mřížku s 1800 vrypy/mm. Konfokální clonka byla pro všechna měření (kromě kontroly kalibrace, kdy byla otevřena na maximum) nastavena na velikost 400 μm, vstupní štěrbina monochromátoru na 100 μm. Spektrální rozlišení spektrometru je 3-4 nm. Pro většinu měření byl použit objektiv 100. Kvůli teplotnímu ustálení jsme nechali před měřením laserový svazek procházet optickými prvky aparatury. Těsně před začátkem měření byla kontrolována kalibrace podle polohy nejsilnější čáry 520,7 cm -1 v Ramanově spektru křemíku. SERS-aktivní povrchy byly pokládány na čisté podložní sklo, které jsme přichytili svorkami ke stolku mikroskopu, protože jejich malé rozměry neumožňují umístit je přímo na stolek. Při měření SERS spekter jsme postupovali tak, že jsme našli v režimu zobrazení v reálném čase (RTD z angl. real time display), ve kterém se automaticky vykreslují spektra po nastavené době měření (obvykle jsme používali 1 či 2 sekundy), místo s dobrým signálem TMPyP, který jsme potom akumulovali. Pro měření metodou DCDR byl použit substrát SpectRIM TM od firmy Tienta Sciences tvořený destičkou z leštěné nerez oceli pokryté tenkou vrstvou teflonu. 31

32 3.1.2 UV-VIS absorpční spektrometr Extinkční spektra byla měřena za pokojové teploty absorpčním UV-VIS spektrometrem Perkin Elmer Lambda 12. Jeho schéma je na obr Zdrojem záření je pro viditelnou oblast halogenová lampa, pro ultrafialovou oblast deuteriová výbojka. Záření prochází přes filtr, který propustí pouze určitou část spektra. Konkrétní vlnová délka je vybrána difrakční mřížkou, za níž je svazek rozdělen děličem na dva, z nichž jeden prochází referencí a druhý vzorkem do detektoru. Spektrální rozsah přístroje je nm. Obrázek 3.2: Schéma absorpčního spektrometru Lambda 12. Převzato z [24]. Extinkční spektra povrchů i koloidů jsme měřili v oblasti nm, rychlostí 240 nm/min s krokem 1 nm. Spektra koloidů byla měřena v 2mm křemenné kyvetě bez reference. Před měřením každého dalšího vzorku byla kyveta vypláchnuta deionizovanou vodou a ethanolem a vysušena. Spektra zlatých a stříbrných povrchů jsme měřili tak, že jsme destičku postavili do držáku pro kyvety. Nebyla použita reference. 32

33 3.2 Příprava SERS-aktivních povrchů Chemikálie Při měření diplomové práce byly použity tyto chemikálie: deionizovaná voda o specifickém odporu 18 MΩ cm 65% HNO 3, 96% H 2 SO 4, 30% H 2 O 2 a 35% HCl (vše Lachema p.a.) na mytí skleněného nádobí 5,10,15,20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)porfyrin (TMPyP) (Sigma-Aldrich) AgNO 3, citronan sodný C 6 H 5 O 7 Na 3 2H 2 O, borohydrid sodný NaBH 4, hydroxylamin hydrochlorid NH 2 OH HCl (vše Sigma-Aldrich), NaOH (Lachema p.a.) na přípravu zlatého a stříbrných koloidů 97% 3-aminopropyltrimethoxysilan (APTMS), 99,8% methanol (vše Sigma- Aldrich) na silanizaci Mytí skleněného nádobí Nádobí na přípravu koloidů i povrchů musí být pečlivě umyto a opláchnuto. Organické nečistoty se odstraní ponořením do piraně směsi H 2 O 2 a H 2 SO 4 v poměru 1:4 (objemově). Zlatých částic se zbavíme ponořením do lučavky královské směsi HCl a HNO 3 v poměru 3:1 (objemově) a stříbrných částic ponořením do HNO 3 zředěné vodou v poměru 1:1 (objemově). Na závěr nádobí opláchneme deionizovanou vodou Příprava koloidů Zlatý koloid Zlaté povrchy byly připravené N. Hajdukovou použitím citrátového koloidu připraveného podle [23]. V topném hnízdě se k varu přivede 250 ml 1mM roztoku kyseliny tetrachlorzlatité HAuCl 4, do kterého se poté přidá 25 ml 38,8 mm roztoku citronanu sodného C 6 H 5 O 7 Na 3 2H 2 O. Původně žlutá barva roztoku se změní na tmavě modrou, která postupně přejde v tmavě červenofialovou. Po 15 minutách varu se koloid nechá vychladnout. Extinkční maximum koloidu se nachází kolem 525 nm. 33

34 Stříbrné koloidy Stříbrné povrchy jsme neměli k dispozici hotové, a proto jsme museli připravit stříbrné koloidy. Příprava borohydridového koloidu při nízké teplotě vychází z [49-51]. 6,67 mg AgNO 3 se rozpustí v 18 ml deionizované vody, vznikne tak 2, M roztok, který se nechá ochladit v ledničce. 3,5 mg borohydridu sodného NaBH 4 se rozpustí v 75 ml deionizované vody, čímž vznikne 1, M roztok. Roztok se ochladí v ledové lázni na teplotu 2 C. Kádinka s roztokem NaBH 4 se umístí na magnetickou míchačku a za stálého míchání se přikapává 9 ml roztoku AgNO 3. Koloid se míchá ještě asi 45 minut, dokud nedosáhne pokojové teploty. V prvních přípravách jsme postupovali přesně podle tohoto návodu. I při dodržení celého postupu se ale často stalo, že se příprava nezdařila. Naopak někdy se zdařila, přestože roztoky nebyly ochlazeny. K úspěchu vedl i opačný postup, kdy naopak na míchačce necháme míchat roztok AgNO 3, do kterého přidáme NaBH 4, který byl ve formě roztoku, granule nebo prášku. Každý koloid byl při přípravě neustále míchán na magnetické míchačce. Po smíchání AgNO 3 a NaBH 4 roztok nejprve světle zežloutl, ale v zápětí náhle zčernal (u některých koloidů proběhlo zčernání dvakrát), až nakonec získal žlutohnědou barvu. Extinkční maximum se nachází okolo 390 nm. Několik koloidů bylo vybráno a použito k přípravě stříbrných SERS-aktivních povrchů, mezi nimi také koloid, který byl po přípravě zahřátý na ºC. Stříbrný hydroxylaminový koloid byl vyroben postupem uvedeným v [52], který je jedním ze způsobů přípravy tohoto koloidu popsaných v [53]. K 5 ml M roztoku hydroxylaminu hydrochloridu NH 2 OH HCl v deionizované vodě se přídá 4,5 ml 0,1M roztoku NaOH v deionizované vodě, protože redukce AgNO 3 hydroxylaminem vyžaduje zásadité ph. Tento roztok přídáme k 90 ml 1, M roztoku AgNO 3 v deionizované vodě. Výslednou směs protřepáváme, dokud nezískáme homogenní směs mléčně šedé barvy. Extinkční maximum se nachází okolo 410 nm Příprava koloidních částic silanem imobilizovaných na skle Zlaté i stříbrné povrchy lze připravit stejným způsobem, jemuž jsme se obecně věnovali v kapitole Příprava koloidů, které jsme používali, byla popsána v předchozí kapitole. Jako pevný substrát slouží mikroskopická podložní sklíčka nařezaná na velikost 34

35 přibližně 1 2 cm. Zlaté povrchy použité v této diplomové práci byly připraveny N. Hajdukovou z citrátového koloidu. Stříbrné povrchy jsme připravili následovně. Kádinku pro silanizaci skleněných substrátů jsme nechali přibližně 30 minut silanizovat 10% roztokem APTMS v methanolu, čímž předejdeme snížení koncentrace APTMS při silanizaci sklíček navázáním na stěny kádinky. Sklíčka umístěná v teflonovém držáku, umožňujícím silanizaci až 20 sklíček najednou, jsme ponořili do 10% roztoku APTMS v methanolu také na 30 minut a poté přemístili do kádinky s methanolem. Každé sklíčko jsme ponořili do kádinky s methanolem a opláchli střičkou methanolem, abychom sklíčka zbavili přebytečného silanu, který by mohl způsobit agregaci koloidu. Totéž jsme opakovali deionizovanou vodou. Nakonec jsme sklíčka umístili do umytých skleněných lahviček s 1 ml koloidu, kde jsme je ponechali několik hodin. Sklíčka umisťujeme do jednotlivých lahviček a ne najednou jako při silanizaci, protože hrozí agregace a sedimentace částic koloidu, které by znehodnotily všechna přítomná sklíčka. Většina úspěšně připravených sklíček byla vyrobena pomocí koloidu, který byl po přípravě zahřátý na ºC. Sklíčka mají SERS-aktivní povrch z obou stran. Skladujeme je jednotlivě ve vzduchu nebo v deionizované vodě v uzavřených skleněných lahvičkách na tmavém místě Příprava roztoků TMPyP Všechny roztoky TMPyP v deionizované vodě použité v této práci jsme připravovali ředěním M zásobního roztoku. Zásobní roztok jsme připravili rozpuštěním práškového TMPyP v deionizované vodě a skladovali v lednici při teplotě 2 ºC. 35

36 4 Výsledky a diskuze 4.1 Zlaté povrchy Úvodní měření Účelem prvních měření bylo seznámit se s Ramanovým mikrospektrometrem a nalézt vhodné parametry měření ze zlatých povrchů, především excitační vlnovou délku, výkon laseru, akumulační časy. Vybrali jsme dva zlaté povrchy. Jejich extinkční spektra jsou na obr První byl červenofialový, tedy typ povrchu, který jsme označili jako povrch s jedním extinkčním maximem (viz část 1.2.5). Druhý byl šedý, tedy se jednalo o typ povrchu se dvěma extinkčními maximy, která v tomto případě splývají do širokého pásu ,5 632, a) povrch 1 b) povrch Extinkce b a Vlnová délka (nm) Obrázek 4.1: Extinkční spektra zlatých povrchů použitých k úvodním měřením. Každý povrch jsme ponořili na 20 minut do roztoku TMPyP v deionizované vodě o koncentraci M. Poté jsme měřili SERS spektra pomocí excitačních vlnových délek 514,5 nm a 632,8 nm. Pro tato zkušební měření jsme zvolili objektiv 100, který fokusuje laserový svazek do průměru asi 1,2 μm, a proto poskytuje největší prostorové rozlišení. S dobou osvětlení vzorku docházelo k poklesu signálu TMPyP a nárůstu pozadí. Patrné to bylo zejména při excitaci 514,5 nm. Pravděpodobnou příčinou je fotorozklad TMPyP způsobený tím, že tato excitace spadá do jeho absorpčního Q-pásu. Zjistili jsme, že 36

37 nejvhodnější pro měření je šedý filtr s optickou hustotou 2 (D2, výkon na vzorku 0,19 mw, resp. 0,065 mw pro excitaci 514,5 nm, resp. 632,8 nm), protože při vyšších výkonech laseru dochází výraznějšímu poklesu signálu TMPyP a nárůstu pozadí s dobou osvětlení vzorku a při nižším výkonu laseru na vzorku zanikal signál TMPyP v šumu. Jako příklad zhoršení signálu při zvýšení výkonu laseru na vzorku uvádíme spektra naměřená z povrchu 2 pomocí excitace 514,5 nm (viz obr. 4.2). Spektrum měřené s filtrem D1 (výkon na vzorku 1,3 mw, resp. 0,48 mw pro excitaci 514,5 nm, resp. 632,8 nm) bylo akumulováno 1 60 s, spektrum bez filtru bylo měřeno 1 s. a) plný výkon laseru b) šedý filtr D1 Relativní intenzita a b Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.2: SERS spektra z povrchu 2 při vysokém výkonu laseru, excitace 514,5 nm. Nejlepší spektra jsou na obr Jedná se o spektrum free-base formy TMPyP, charakterizovanou pásy 333, , cm -1 [54]. To jsme předpokládali, protože zlato porfyriny nemetaluje. Spektra byla akumulována 1 60 s a u všech byl použit filtr D2 (kromě spektra bez signálu TMPyP, které bylo naměřeno s filtrem D1). Na vlnové délce 514,5 nm jsme naměřili spektrum z obou zlatých povrchů. Naproti tomu na vlnové délce 632,8 nm se podařilo naměřit spektrum pouze z povrchu 2. Pro povrch 1 jsme nenalezli žádný signál TMPyP, i když jsme zkoušeli různá místa a různou intenzitu laserového paprsku. Snadno to vysvětlíme pomocí extinkčních spekter povrchů. K rezonanční excitaci povrchových plazmonů v povrchu dojde, pokud excitační vlnová délka leží v oblasti kolem extinkčního maxima. U povrchu 2 leží v oblasti extinkčního 37

38 pásu obě vlnové délky, ale u povrchu 1 leží v oblasti extinkčního pásu pouze vlnová délka 514,5 nm, kdežto velikost extinkce pro vlnovou délku 632,8 nm je velmi nízká a) povrch 1 b) povrch SERRS intenzita b a Vlnočet (cm -1 ) SERS intenzita b a a) povrch 1 b) povrch Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.3: SER(R)S spektra TMPyP o molární koncentraci M, excitace 514,5 nm (nahoře) a excitace 632,8 nm (dole). Na první pohled je zřejmé, že charakter spekter naměřených pomocí vlnové délky 514,5 nm a 632,8 nm se liší (různý průběh pozadí a poměrů porfyrinových pásů). Důvodem je, že v případě 514,5 nm se jedná o SERRS spektrum, protože excitace 514,5 nm spadá do jednoho z Q-pásů TMPyP, jak je vidět z absorpčního spektra (obr. 4.4). To 38

39 způsobuje nejen změny v poměrech porfyrinových pásů, ale i nárůst pozadí typického pro free-base TMPyP ,5 632, Absorbance Vlnová délka (nm) Obrázek 4.4: Absorpční spektrum TMPyP Měření časové závislosti Dále jsme měřili závislost SERS signálu na době ponoření zlatého povrchu do roztoku TMPyP. Jelikož různé povrchy nejsou zcela reprodukovatelné, bylo nutné k měření použít jediný povrch. Postupovali jsme tak, že jsme po změření SERS spektra v daném čase povrch ponořili zpět do lahvičky s roztokem porfyrinu na dobu zbývající do dalšího měřeného bodu. Měření probíhalo v rozmezí 1 až 50 minut, molární koncentrace TMPyP byla M. K měření byla použita excitace 514,5 nm, takže se jedná o SERRS spektra (viz předchozí kapitola), filtr D2 a objektiv 100. V režimu zobrazení v reálném čase s nastavením měření 1 s, jsme hledali místo s co nejlepším signálem TMPyP, který jsme potom akumulovali 1 60 s. Pro vyhodnocení časové závislosti jsme použili pro každý časový bod to nejlepší spektrum. 39

40 Relativní intenzita 1 min 3 min 5 min 8 min 10 min 13 min 17 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min 50 min čas Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.5: Časová závislost SERRS spekter TMPyP po korekci pozadí ( TMPyP), spektra jsou pro přehlednost posunuta. M Časovou závislost signálu TMPyP jsme určili jako závislost integrální intenzity pásu 1556 cm -1, který je nejsilnějším pásem ve spektru, na čase. Kvůli tomu bylo nutné spektra zbavit pozadí. K tomu byla použita metoda ortogonálních diferencí, kdy se nejprve zvolí vhodný ortonormální systém bázových funkcí. Nové spektrum získáme tak, že od původního spektra odečteme lineární kombinaci vektorů báze. Koeficienty lineární kombinace jsou skalárním součinem vektorů báze a vektoru spektra. Bázovými funkcemi mohou být například polynomy. Jaký zvolit počet prvků báze závisí na charakteru pozadí, nebo obecněji nežádoucích spektrálních příspěvků. V praxi se často postupuje tak, že se zvolí nejmenší počet funkcí, který na pohled dobře odstraňuje nežádoucí pozadí. Na celou spektrální sérii nebo více sérií, které chceme porovnávat, je nutné aplikovat stejnou bázi. K úpravě našich spekter jsme použili bázi složenou ze tří polynomů nultého až druhého stupně. Spektra po korekci pozadí jsou na obr Integrální intenzita pásu 1556 cm -1 spekter s upraveným pozadím byla určena v programu Fityk jako plocha pod Voigtovou křivkou nafitovanou na data v oblasti cm -1. Časová závislost je na obr Velikost SERRS signálu by teoreticky měla být úměrná množství adsorbovaného porfyrinu, které by se mělo s časem zvyšovat a nakonec dosáhnout konstantní hodnoty (saturační kinetika). Na počátku intenzita SERRS signálu TMPyP s časem přibližně lineárně narůstá. Pro delší časy intenzita kolísá. Předpokládáme, že je to způsobeno tím, že 40

41 spektrum bylo pro různé časy měřeno z různých míst povrchu. Různá místa téhož povrchu totiž poskytují jinak velké SERS zesílení a jelikož Ramanův mikrospektrometr sbírá světlo z malé oblasti povrchu, tyto rozdíly se projeví Integrální intezita Čas (min) Obrázek 4.6: Časová závislost integrální intenzity pásu 1556 cm -1 ( M TMPyP). Srovnejme náš výsledek s jinými měřeními. Časová závislost SERRS signálu TMPyP ze zlatých povrchů připravených stejným způsobem byla měřena také v [24, 25] a v [55] byla měřena časová závislost množství TMPyP adsorbovaného na stejný povrch pomocí měření změn absorbance roztoku TMPyP, do kterého byl povrch ponořován. SERRS spektra byla získána za stejných podmínek jako v této práci. Jediný rozdíl byl, že byla měřena v makromódu (pomocí klasické Ramanovy aparatury). V tomto případě dojde ke zprůměrování SERRS signálu z makroskopické oblasti, a tedy se méně než při měření mikrospektrometrem projeví, že zesílení není na zlatém povrchu rozloženo homogenně. Proto lze předpokládat, že časová závislost lépe odpovídá průběhu adsorpce porfyrinu. Časová závislost intenzity SERRS do doby ponoření přibližně 15 minut narůstala, poté mírně klesla a dále se už výrazně neměnila. Časová závislost získaná pomocí absorpčních měření by měla přímo odpovídat průběhu adsorpce TMPyP na zlatý povrch. Závislost měla charakter rostoucí závislosti, která se saturuje. K nasycení došlo v rozmezí 8-25 minut. Z těchto výsledků můžeme soudit, že časová závislost SERRS signálu, kterou jsme naměřili pomocí Ramanova mikrospektrometru, svým charakterem odpovídá průběhu adsorpce, ale že toto měření není zcela přesné. 41

42 Pro koncentrační závislosti jsme na základě měření v makromódu a absorpčních měření používali dobu ponoření 15 minut, kdy by měla adsorpce přibližně dosahovat nasycení Měření koncentrační závislosti Pro měření koncentrační závislosti intenzity SERS signálu TMPyP jsme také používali pouze jeden SERS-aktivní zlatý povrch, který jsme postupně ponořovali do roztoků TMPyP v pořadí od nejnižší po nevyšší koncentraci. Dobu ponoření jsme zvolili 15 minut z důvodu, že je to dostatečně krátká doba, aby měření bylo proveditelné v rozumném čase a dostatečně dlouhá, aby přibližně došlo k nasycení, jak bylo popsáno v předcházející kapitole. Naším cílem bylo zjistit, jaký je detekční limit, neboli jakou nejnižší koncentraci jsme schopni detekovat. Z měření časové závislosti jsme věděli, že pro molární koncentraci M byl signál dobrý, proto jsme zvolili měřené koncentrace v rozsahu až M. K měření koncentrační závislosti pomocí excitace 514,5 nm jsme použili filtr D2 a objektiv 100. Pro každou koncentraci jsme v režimu RTD hledali místo s co nejlepším signálem TMPyP, který jsme poté akumulovali 1 60 s. Pro vytvoření koncentrační závislosti bylo vybráno pro každou koncentraci to nejlepší spektrum (viz obr. 4.7). Relativní intenzita x 10-8 M 9 x 10-8 M 1,2 x 10-7 M 1,5 x 10-7 M 3 x 10-7 M 6 x 10-7 M 9 x 10-7 M 1 x 10-6 M koncentrace Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.7: Koncentrační závislost SERRS spekter TMPyP po korekci pozadí, excitace 514,5 nm, spektra jsou pro přehlednost posunuta. 42

43 Koncentrační závislost jsme určovali jako závislost výšky pásu 1556 cm -1 koncentraci. Výšku pásu místo jeho integrální intenzity jsme jako vynášenou hodnotu zvolili proto, že jsme ji dále potřebovali pro výpočet detekčního limitu. Naměřená spektra jsme zbavili pozadí metodou ortogonálních diferencí. Použili jsme polynomiální bázi tvořenou 4 vektory. Spektra po korekci pozadí jsou na obr Výšku pásu 1556 cm -1 jsme určili v programu Spectra Calc: v oblasti cm -1 jsme nejprve odečetli lineární pozadí a potom na tento úsek spektra nafitovali Lorentzovu křivku a zjistili její výšku. Koncentrační závislost výšky pásu 1556 cm -1 zobrazuje obr V této práci používáme definici detekčního limitu (LOD) uvedenou v [56]. Podle této definice lze detekční limit vyjádřený jako koncentrace vypočítat jako trojnásobek standardní odchylky signálu prázdného vzorku vynásobený citlivostí S (sklon kalibrační křivky): c L 3 S. Standardní odchylku prázdného vzorku jsme vypočítali následovně. Každé spektrum jsme vyhladili Savitzkeho-Golayovým filtrem a odečetli od původního spektra. Tím jsme získali rozdílové spektrum tvořené šumem. Vypočítali jsme standardní odchylku šumu od jeho střední hodnoty a vynásobili ji třemi. Trojnásobek standardní odchylky šumu v závislosti na koncentraci je na obr Extrapolací do nuly získáme hodnotu 3 pro prázdný vzorek. Jaké molární koncentraci TMPyP tato hodnota odpovídá, zjistíme z koncentrační závislosti tak, že ji proložíme vhodnou křivkou a odečteme hodnotu koncentrace pro relativní intenzitu rovnou 3. Pro excitaci 514,5 nm jsme závislost 3 proložili přímkou y = ax + b, kde a = (2,5 ± 13) 10-3 l/mol a b = 1,13 ± 0,63, což je hodnota 3 pro prázdný vzorek. Koncentrační závislost jsme proložili křivkou y = c(1 exp(-dx)), kde c = 29 ± 20 a d = (6,1 ± 5,6) 10-3 l/mol. Detekční limit je c L = 6, M. Detekční limit měřený na stejné excitaci ze stejného typu zlatého povrchu v makromódu je M [26], tedy srovnatelný s naším výsledkem. na 43

44 14 12 SERRS intenzita Koncentrace (10-8 M) Obrázek 4.8: Koncentrační závislost výšky pásu TMPyP 1556 cm -1 (excitace 514,5 nm) SERRS intenzita Koncentrace (10-8 M) Obrázek 4.9: Závislost trojnásobku standardní odchylky šumu na koncentraci (excitace 514,5 nm). Koncentrační závislost jsme měřili také pro excitaci 632,8 nm. Doba ponoření byla 15 minut, pro měření jsme použili filtr D2 a objektiv 100. Spektra byla akumulována 1 60 s. Nejlepší naměřená spektra pro každou koncentraci po korekci pozadí jsou na obr Při určení koncentrační závislosti a limitu detekce jsme postupovali stejně jako pro 44

45 excitaci 514,5 nm, až na to, že velikost SERS signálu TMPyP jsme vyjadřovali pomocí výšky pásu 976 cm -1, který je na excitaci 632,8 nm nejsilnější či stejně silný jako pás 1556 cm -1. Spektrum bylo v oblasti cm -1 proloženo Gaussovou či Lorentzovou křivkou, případně kombinací obou. Závislost trojnásobku standardní odchylky šumu byla proložena přímkou y = ax + b, kde a = (1,4 ± 4,3) 10-3 l/mol a b = 1,44 ± 0,74 Koncentrační závislost jsme proložili křivkou y = c(1 exp(-dx)) ), kde c = 10,13 ± 0,35 a d = (3,78 ± 0,44) 10-2 l/mol. Detekční limit je c L = 4, s hodnotou zjištěnou pro excitaci 514,5 nm. M, což je srovnatelné Relativní intenzita Vlnočet (cm -1 ) koncentrace 1 x 10-8 M 3 x 10-8 M 6 x 10-8 M 9 x 10-8 M 3 x 10-7 M 6 x 10-7 M 1 x 10-6 M 5 x 10-6 M Obrázek 4.10: Koncentrační závislost SERRS spekter TMPyP po korekci pozadí, excitace 632,8 nm, spektra jsou pro přehlednost posunuta. 45

46 12 10 SERS intenzita Koncentrace (10-8 M) Obrázek 4.11: Koncentrační závislost výšky pásu TMPyP 976 cm -1 (excitace 632,8 nm) SERS intenzita Koncentrace (10-8 M) Obrázek 4.12: Závislost trojnásobku standardní odchylky šumu na koncentraci (excitace 632,8 nm) Mapování povrchů Ramanův mikrospektrometr umožňuje díky přesnému posunu stolku mikroskopu měření spektrálních map, kterými charakterizujeme homogenitu povrchu z hlediska 46

47 velikosti SERS zesílení. Nejprve se nastaví parametry detekce a body, ze kterých má být spektrum snímáno. Samotné měření potom probíhá automaticky. Naměřená spektra byla zpracována v uživatelském programu Cell Viewer vytvořeném v prostředí Matlab Mgr. Janem Palackým. Tento program slouží k vyhodnocování 2D skenovacích experimentů pomocí faktorové analýzy založené na algoritmu singulárního rozkladu (Singular Value Decomposition, SVD) [57]. Před spuštěním faktorové analýzy je nutné provést korekci pozadí spekter. Program Cell Viewer to dělá metodou ortogonálních diferencí. Opět jsme používali polynomiální bázi. V Cell Vieweru lze zobrazit mapu pro každé subspektrum. Mapa se tvoří na základě normovaných koeficientů daného subspektra. Jejich velikosti je přiřazena barevná škála. Mapy jsme vytvořili pro 1. subspektrum, které odpovídá průměrné intenzitě signálu. Měřili jsme z obdélníkových oblastí s pravidelně rozmístěnými body. Nejmenší posun stolku je 1 μm. SERS spektra ze zlatých povrchů byla měřena s filtrem D2, objektivem 100, jehož stopa na vzorku má průměr 1,2 μm. Akumulována byla 5 12 s. V Cell Vieweru jsme pro vytvoření map použili spektrální oblast cm -1, tedy kolem pásu 1000 cm -1, kde pozadí není moc významné a u jednotlivých spekter se příliš neliší. Pro korekci pozadí proto postačil polynom prvního stupně. Pro excitaci 514,5 nm jsme změřili dvě mapy s menším rozlišením (krok 20 μm, bodů), která charakterizuje větší oblast zlatého povrchu a s větším rozlišením (krok 2 μm, bodů). Mapy spolu s 1. subspektry jsou na obr Pro excitaci 632,8 nm jsme postupovali podobně. Mapa s menším rozlišením (krok 20 μm, bodů) a s větším rozlišením (krok 2 μm, bodů). Mapy spolu s 1. subspektry jsou na obr Při excitaci 632,8 nm se povrch jeví do značné míry homogenní, místa bez signálu jsou ojedinělá. Vyskytují se místa s vyšší relativní intenzitou. Mapy měřené excitací 514,5 nm nevypadají příliš homogenně, relativní intenzita signálu klesá směrem od shora mapy dolů. Pravděpodobně to způsobilo mírné rozostřování během skenování, které probíhalo po řádcích směrem od levého horního rohu mapy. Při excitaci 514,5 nm se místa s tak vysokou relativní intenzitou jako u 632,8 nm nevyskytují. Pravděpodobně je to způsobeno tím, že excitační vlnová délka 632,8 nm leží v oblasti rezonance povrchových plazmonů agregátů a ne samostatných částic, body mapy s vysokou relativní intenzitou jsou dány těmito agregáty přítomnými na zlatých površích v menší míře. 47

48 Obrázek 4.13: Mapy intenzity SERRS signálu TMPyP ze zlatého povrchu, excitace 514,5 nm, krok 20 μm (vlevo), krok 2 μm (vpravo). 48

49 Obrázek 4.14: Mapy intenzity SERS signálu TMPyP ze zlatého povrchu, excitace 632,8 nm, krok 20 μm (vlevo), krok 2 μm (vpravo). 49

50 4.2 Stříbrné imobilizované nanočástice Borohydridové povrchy Úvodní měření Úvodní měření ze stříbrných borohydridových povrchů sloužila jako příprava na měření koncentrační závislosti. Extinkční spektra použitých povrchů jsou na obr Podobně vypadala i spektra ostatních připravených povrchů. Excitační vlnová délka 632, ,5 Extinkce c a b d a) povrch A b) povrch B c) povrch C d) povrch D Vlnová délka (nm) Obrázek 4.15: Extinkční spektra stříbrných borohydridových povrchů použitých pro úvodní měření a měření koncentrační závislosti. nm leží mimo extinkční maxima stříbrných povrchů, a proto ji nelze použít k měření SERS spekter. Naopak excitační vlnová délka 514,5 nm leží v náběhu extinkčního pásu. Pro všechna měření ze stříbrných borohydridových povrchů jsme proto používali jen excitaci 514,5 nm. Jelikož stříbro poskytuje větší SERS zesílení dané elektromagnetickým mechanismem než zlato [8], zkusili jsme použít nižší koncentrace TMPyP než při úvodních měření na zlatých površích. Podobně jako u zlatých povrchů není příprava stříbrných povrchů zcela reprodukovatelná, jednotlivé povrchy se liší svou strukturou, a tedy i SERS zesílením. V rámci jednoho povrchu je reprodukovatelnost spekter o něco lepší, a proto pokud chceme porovnávat spektra, je nezbytné měřit z jednoho povrchu. Při měření různých koncentrací TMPyP z jednoho povrchu postupujeme od nejnižší koncentrace k nejvyšší. Měření časové závislosti jsme pro stříbrné povrchy neprováděli a 50

51 dobu ponoření povrchu do roztoku TMPyP jsme zvolili stejnou jako u zlatých povrchů, tedy 15 minut. Používali jsme objektiv 100 a nejčastěji filtr D2 (výkon na vzorku 0,19 mw), ale vyzkoušeli jsme také filtry s jinou optickou hustotou SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.16: SERRS spektra TMPyP z povrchu A, koncentrace TMPyP M SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.17: SERS spektrum s parazitními pásy naměřené z povrchu A. 51

52 Z povrchů A a B jsme měřili molární koncentrace TMPyP M a M. Ačkoli měly oba povrchy velmi podobná extinkční spektra, neposkytovaly stejné SERS zesílení. Na povrchu A jsme nalezli SERRS signál TMPyP jen pro koncentraci M, který byl poměrně slabý (viz obr. 4.16). Problémem bylo nejen signál TMPyP nalézt, ale i akumulovat. Ukázalo se, že signál TMPyP v průběhu akumulace klesá. To jsme pozorovali už pro zlaté povrchy. Kromě toho se v mnohem větší míře než u zlatých povrchů objevovaly ve spektru pásy nepatřící TMPyP (viz obr. 4.17), pro které v této práci používáme označení parazitní pásy. Byly to jednak úzké pásy, jejichž poloha i intenzita se sice měnily v čase, ale vyskytovaly se často a byly často mnohem intenzivnější než signál TMPyP, a proto nebylo možné se jich zbavit akumulací. Na některých místech jsme také naměřili spektrum tvořené dvěma širokými pásy s maximy okolo 1350 a 1580 cm -1, příslušející pravděpodobně amorfnímu uhlíku, který vzniká tepelným rozkladem uhlíkatých sloučenin přítomných ve vzorku vlivem intenzivního laserového záření. Tyto překážky akumulace signálu provázely všechna měření ze stříbrných povrchů. Podrobněji se jim budeme věnovat v kapitole Z povrchu B jsme naměřili dobrá SERRS spektra pro obě koncentrace. I když se při intenzitě svazku 0,19 mw občas objevily parazitní pásy ztěžující měření, tak při snížení intenzity filtrem D3 na 0,02 mw nebyl na tomto povrchu signál TMPyP vůbec detekovatelný. Zkusili jsme objektiv 50, kdy je stopa laseru na vzorku širší, a tedy se energie záření rozdělí na větší plochu vzorku, který by se proto měl méně zahřívat. Situace se ale nezlepšila: s filtrem D2 se objevovaly parazitní pásy a spektrum amorfního uhlíku, s filtrem D3 byl problém signál TMPyP najít. Proto jsme i nadále pro měření z povrchů používali objektiv 100. Nejlepší nalezená spektra TMPyP pro koncentraci M (akumulace 5 12 s) jsou na obr Pro koncentraci M (akumulace 5 12 s, nebo 2 60 s) jsou spektra na obr Na tomto obrázku jsou jednotlivým pásům TMPyP přiřazeny vlnočty. Jedná se o spektrum free-base formy TMPyP, protože nejsou přítomny metalační markery, jako například silnější pás cm -1 než pás cm -1 a velmi silný pás 1340 cm -1 [54]. To je v souladu s výsledky Molnára, které ukazují, že na stříbrných površích z koloidních částic imobilizovaných prostřednictvím silanu na skle nedochází na rozdíl od koloidu k metalaci [27, 43]. 52

53 45 40 SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.18: Nejlepší SERRS spektra M TMPyP naměřená z povrchu B SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.19: Nejlepší SERRS spektra M TMPyP naměřená z povrchu B. Z povrchu D jsme chtěli měřit koncentrační závislost. V rozmezí koncentrací M byl však signál TMPyP pozorován a naměřen pouze pro koncentraci M, byl velmi slabý a navíc se objevily všechny výše zmíněné problémy (pokles signálu TMPyP 53

54 v průběhu akumulace, parazitní pásy, amorfní uhlík), které způsobovaly, že jen někdy vedla akumulace z místa, kde jsme v RTD pozorovali signál TMPyP, k dobrému spektru Koncentrační závislost Pro měření koncentrační závislosti jsme použili povrch C, jehož extinkční spektrum má v oblasti kolem 514,5 nm i celkově nejvyšší extinkci ze všech připravených stříbrných borohydridových povrchů (viz obr. 4.15). Při měření a zpracování koncentrační závislosti jsme postupovali stejně jako u zlatých povrchů. Parametry měření byly tyto: objektiv 100, výkon na vzorku 0,02 mw, akumulace 1 minuta (3 20 s, nebo 5 12 s), doba ponoření 15 minut, koncentrace TMPyP M. Měřili jsme také s výkonem na vzorku 0,19 mw, ale docházelo k příliš častému výskytu parazitních pásů. Parazitní pásy a mírný pokles signálu během akumulace se ale občas objevovaly i při výkonu 0,02 mw. Nejlepší naměřená SERRS spektra TMPyP pro každou koncentraci, na níž byl signál porfyrinu nalezen, jsou na obr Spektra mají upravené pozadí metodou ortogonálních diferencí, použili jsme polynomiální bázi o třech prvcích. Koncentrační závislost intenzity SERRS signálu TMPyP je na obr Intenzitu SERRS signálu jsme vyjádřili výškou nejvyššího pásu 1556 cm -1, kterou jsme určili v programu Spectra Calc. V oblasti cm -1 jsme nejprve odečetli lineární pozadí a poté jsme pásem proložili Lorentzovu křivku a zjistili její výšku. Kvůli určení detekčního limitu byla koncentrační závislost intenzity SERRS signálu TMPyP proložena křivkou y = c(1 exp(-dx)) s koeficienty c = 28,3 ± 8,5 a d = (7,6 ± 8,1) 10-2 l/mol a vynesena koncentrační závislost trojnásobku standardní odchylky šumu, která byla proložena přímkou y = ax + b, kde a = (1,2 ± 3,0) 10-2 l/mol a b = 2,1 ± 1,2 (viz obr. 4.22). Koeficient b odpovídá trojnásobku standardní odchylky signálu prázdného vzorku 3. Detekčním limitem je koncentrace, při které dosáhne intenzita SERRS signálu TMPyP (výška pásu 1556 cm -1 ) hodnoty 3. Detekční limit je roven 1, M, což je 4-6krát nižší hodnota než pro zlaté povrchy. To je v souladu s tím, že stříbro poskytuje vyšší SERS zesílení než zlato. Detekční limit měřený na stejné excitaci ze stejného typu stříbrného povrchu v makromódu je M [26], tedy téměř o jeden řád nižší. Předpokládáme, že kdybychom dokázali zamezit vzniku parazitních pásů a problémům s tepelným rozkladem, byl by detekční limit v mikromódu lepší než při měření v makromódu. I přesto, že jsme navzdory původním očekáváním zjistili vyšší detekční limit a spektra se zdají být méně kvalitní než spektra 54

55 měřená v makromódu [26], zůstává na straně mikroskopu několik výhod. Ve spektrech se neobjevuje pás skla (1095 cm -1 ), který je v makromódu silný a překrývá část spektra TMPyP, získáme vyšší prostorové rozlišení s možností mapování vzorku a manipulace s tímto typem SERS-aktivního povrchu je u mikroskopu mnohem snazší než u klasické Ramanovy aparatury. Relativní intenzita 140 a) M b) M c) M 120 d) M e) M f f) M e d c b a koncentrace Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.20: Koncentrační závislost SERRS spekter TMPyP SERRS intenzita Koncentrace (10-8 M) Obrázek 4.21: Závislost výšky pásu 1556 cm -1 SERRS spektra TMPyP na koncentraci. 55

56 4 SERRS intenzita Koncentrace (10-8 M) Obrázek 4.22: Závislost trojnásobku standardní odchylky šumu na koncentraci Parazitní pásy v SERS spektrech U stříbrných borohydridových povrchů se parazitní pásy, tedy pásy nepatřící TMPyP, objevovaly častěji než u zlatých povrchů a jejich intenzita byla vyšší. Proto tvořily velkou překážku naměření kvalitních SERRS spekter TMPyP a určení limitu detekce. Kvůli nim také nemělo význam provádět mapování povrchu. Většinou se jednalo o úzké pásy vyšší intenzity než intenzita signálu TMPyP. Počet pásů, jejich poloha i intenzita se měnily v čase. Nejčastěji se parazitní pásy vyskytovaly v oblasti cm -1, u většiny z nich předpokládáme souvislost s amorfním uhlíkem, ale objevovaly se i v oblasti pod 1200 cm -1. Vyskytovaly se jak spolu se signálem TMPyP, tak v místech stříbrného povrchu, kde jsme signál TMPyP nedetekovali. Tyto parazitní pásy se většinou objevily až po chvíli (zhruba 15 sekundách) ozáření povrchu. Při vyšším výkonu světla na vzorku se objevily rychleji a jejich výskyt byl častější. Proto je pravděpodobné, že alespoň část z nich vzniká fotodekompozicí nebo tepelnou dekompozicí látek adsorbovaných na povrchu stříbrných částic. Tyto pásy znemožňovaly delší akumulaci signálu TMPyP, protože parazitní pás se mohl objevit prakticky kdykoli a výsledkem pak bylo deformované spektrum. Příklad těchto pásů naměřených na povrchu A byl uveden na obr

57 Druhým typem parazitních pásů bylo spektrum tvořené dvěma širokými pásy v oblasti cm -1 s maximy kolem 1350 cm -1 a 1580 cm -1, které je typickým spektrem tzv. amorfního uhlíku [58-60]. Amorfní uhlík je neuspořádaná struktura tvořená uhlíkovými klastry s vazbami uhlík uhlík či uhlík - vodík. Pás ~ 1350 cm -1 je zřejmě tvořen příspěvky deformačních módů δ(ch n ) uhlovodíků a módů vyskytujících se v neuspořádaném grafitu [62] a nazývá se pás D. Pás ~ 1580 cm -1 se přiřazuje E 2g vibraci grafitu [62] a nazývá se pás G. Při krátké době měření z těchto širokých pásů vybíhaly úzké pásy. Díky tomu, že spektrum s úzkými pásy fluktuovalo, byly v oblasti cm -1 výsledkem delší akumulace jen široké pásy. V pracích zabývajících se SERS amorfního uhlíku [58-60] byly tyto fluktuující pásy také pozorovány, takže pravděpodobně také souvisí s amorfním uhlíkem. Spektra amorfního uhlíku naměřená ze stejného místa povrchu D jsou na obr a) 2 s b) 2 x 60 s SERRS intenzita a Vlnočet (cm -1 ) b Obrázek 4.23: SERS spektra amorfního uhlíku. Amorfní uhlík vzniká tepelnou dekompozicí nebo fotodekompozicí organických látek přítomných na stříbrném povrchu. Může to být analyt (TMPyP), molekuly, které jsou přítomny po přípravě koloidu a povrchu (např. organosilan), nebo nečistoty z přípravy či z okolního prostředí. Pásy, které nesouvisí s amorfním uhlíkem, mohou pocházet od neuhlíkatých molekul vzniklých při přípravě koloidu (např. nitrát, hydroboráty, boráty). Vysoká intenzita parazitních pásů nutně neznamená, že látky, kterým náleží, jsou přítomné 57

58 ve velkém množství. Amorfní uhlík má velmi velký SERS účinný průřez, a proto je snadno pozorovatelné i malé množství. Výskyt širokých i fluktuujících spekter amorfního uhlíku je proto velmi běžný. Dalším možným vysvětlením vysoké intenzity parazitních pásů je, že molekuly vytvářející parazitní pásy jsou adsorbované v místech s velkým zesílením elektromagnetického pole. To by mohl být případ molekul přítomných na povrchu po přípravě koloidu a silanu. Fluktuace mohou být vysvětleny dvěma způsoby. Za prvé probíhající dekompozicí a chemickými reakcemi (např. oxidace kyslíkem). Za druhé může přispět kombinace nehomogenního SERS-aktivního povrchu a Ramanova mikroskopu s použitím krátkých akumulačních dob, kdy pozorujeme signál z omezeného počtu míst, a proto i omezeného počtu molekul. Princip fluktuací je v tomto případě podobný jako v SERS jedné molekuly (single-molecule SERS). Příklady parazitních pásů, které jsme zatím uvedli, byly naměřeny v rámci měření, kdy nám šlo v první řadě o získání co nejlepších spekter TMPyP. Abychom odhalili původ parazitních pásů či jejich vzájemnou korelaci a případně našli způsob, jak jejich výskyt omezit, rozhodli jsme se provést další měření, tentokrát zaměřená na parazitní spektra. Nejprve jsme změřili SERS spektra ještě z povrchů s TMPyP, dále z povrchů bez analytu, čímž vyloučíme vliv porfyrinu, a z koloidu ve formě vyschlých kapek, čímž vyloučíme vliv silanu na vznik parazitních pásů. Volili jsme vyšší výkon na vzorku (0,19 mw nebo 1,3 mw), protože v tom případě byl výskyt parazitních pásů častější. Spektra jsme pozorovali v zobrazení RTD a podle potřeby vybrané spektrum uložili. Abychom zachytili vývoj pásů v čase, používali jsme krátkou dobu měření (1 s či 2 s) a obvykle měřili více spekter z jednoho místa vzorku při nepřetržitém osvětlení laserem. Pokud není uvedeno jinak, byl použit objektiv 100, který přináší nejvyšší prostorové rozlišení a zároveň nejvyšší intenzitu záření. Z povrchu A s TMPyP (koncentrace M) jsme naměřili série spekter z několika různých míst povrchu, přičemž dané místo bylo nepřetržitě osvětleno. Při výkonu na vzorku 0,19 mw byla spektra většinou tvořena úzkými pásy v oblasti cm -1 na širokém pozadí, o kterých předpokládáme, že přísluší vazbám v klastrech amorfního uhlíku. Polohy i intenzity pásů rychle fluktuovaly, takže při pozorování po 1 s v RTD bylo každé spektrum jiné. Příklad šesti spekter z jednoho místa je na obr (spektra byla měřena 2 s, mezi spektry nebyly definované časové odstupy, ale jednalo se přibližně o 1 min). Na jiném místě jsme pozorovali velmi intenzivní (přibližně 10 oproti spektrům s fluktuujícími pásy) spektrum amorfního uhlíku (viz obr. 4.25). Jedná se o typické spektrum ze dvou širokých pásů, i když bylo měřeno jen 2 sekundy. Kromě spekter 58

59 podobných těm na obr. 4.24, jsme pozorovali i spektra s menším počtem pásů, které nevytvářely typické široké pásy. Jejich příklady jsou na obr (spektra byla měřena 1 nebo 2 s). Tato spektra ale také nebyla stabilní. Pravděpodobně patří nějakým konkrétním molekulám adsorbovaným v místě s velkým zesílením elektromagnetického pole Relativní intenzita čas Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.24: Přiklad série SERS spekter měřených z jednoho místa povrchu A SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.25: SERS spektrum amorfního uhlíku z povrchu A (akumulace 2 s). 59

60 Relativní intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.26: Parazitní pásy bez pozadí amorfního uhlíku naměřené z povrchu A. Protože jsme se domnívali, že amorfní uhlík by se měl projevit i valenčními vibracemi ν(c-h) (může jít o různé hybridizace atomu uhlíku) nacházející se v oblasti kolem 3000 cm -1, rozhodli jsme se v této oblasti měřit. Použili jsme k tomu povrch C s TMPyP ( M), který byl použit už k měření koncentrační závislosti. Když jsme v určitém místě pozorovali pásy amorfního uhlíku, změnili jsme spektrální oblast na cm -1. Pás valenčních vibrací ν(c-h) jsme pozorovali až při výkonu 1,3 mw. Příklad tohoto spektra je na obr Pás je poměrně slabý. Není to ale v rozporu s tvrzením, že parazitní pásy v oblasti cm -1 souvisí s amorfním uhlíkem, protože v [58] zabývající se SERS amorfního uhlíku nebyl pozorován vůbec. 60

61 SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.27: SERS spektrum s pásem příslušejícím vibraci ν(c-h) naměřené z povrchu C. Dále jsme měřili SERS spektra z povrchu bez TMPyP. Extinkční spektrum tohoto povrchu se podobalo spektru povrchu A. Opět jsme provedli měření z několika míst při stálém osvětlení daného místa laserem (výkon na vzorku 0,19 mw). Doba akumulace byla 2 s. Stejně jako na površích s porfyrinem jsme pozorovali parazitní spektra, která připisujeme amorfnímu uhlíku. Bylo to spektrum složené jen z širokých pásů ~ 1350 cm -1 a ~ 1580 cm -1 o velmi vysoké intenzitě. Ale častěji to byla spektra s vybíhajícími úzkými pásy, která fluktuovala. Kromě spekter amorfního uhlíku bylo časté spektrum, ve kterém byl patrný pouze pás s maximem kolem ~ 215 cm -1 (obr. 4.28). Jedná se o valenční vibraci ν(ag - N). Toto spektrum, nazvěme jej spektrum pozadí, jsme nalezli na několika místech a bylo i při nepřetržitém osvětlení laserem stabilní. Pouze v jednom případě se na okamžik objevilo spektrum s mnoha úzkými pásy v téměř celém spektrálním rozsahu (zobrazeno také na obr. 4.28), ale bylo opět nahrazeno spektrem pozadí. Ve spektrech z povrchů (s i bez TMPyP) se často vyskytuje pás ~ 970 cm -1. Jako příklad uvádíme spektrum na obr. 4.29, ve kterém je tento pás velmi silný. Ve spektrech z koloidní kapky se tento pás vyskytl jen výjimečně. Ale vzhledem k tomu, že měření probíhala z poměrně malého počtu míst (obvykle kolem 5 10), může být řídké pozorování tohoto pásu u kapky pouze náhoda. 61

62 SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.28: Příklad spekter z jednoho místa povrchu bez TMPyP SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.29: Parazitní spektrum s pásem ~ 970 cm -1 z povrchu bez TMPyP (akumulace 2 s). Dále jsme chtěli ověřit, jaký podíl na vzniku parazitních pásů má silan. Abychom se přiblížili podmínkám na površích tvořených silanem imobilizovanými koloidními částicemi bez použití silanu, měřili jsme z vyschlých koloidních kapek nanesených na podložní sklo. Na podložní sklo očištěné ethanolem byla pipetou nakápnuta 1μl kapka borohydridového koloidu. Jednalo se o stejný koloid, ze kterého byly vyrobeny všechny 62

63 povrchy použité ve výše popsaných měřeních. Vyschlé koloidní kapky nejsou homogenní. Většina koloidních částic se shlukuje na jejím okraji, kdežto uvnitř kapky je jejich hustota menší. Parazitní spektra z kapek jsme měřili stejně jako z povrchů, jen jsme kromě výkonu laseru na vzorku 0,19 mw, používali i vyšší výkon 1,3 mw. Při výkonu 0,19 mw, bylo totiž méně parazitních pásů než u povrchů. To sice ukazuje na to, že na površích dochází snadněji k dekompozici vlivem laserového záření (tepelné či fotoindukované), ale nemohli bychom dobře prozkoumat, zda se některá spektra či pásy svými polohami shodují se spektry z povrchů. Všechna spektra byla akumulována 2 s. Měřili jsme z koloidní kapky ihned po jejím vyschnutí a ze stejné kapky po jednom týdnu (podložní sklo s kapkou bylo skladováno na suchém tmavém místě), abychom zjistili vliv kontaminace z okolního prostředí na vznik parazitních pásů. Většina spekter naměřených z různých míst čerstvé kapky se podobala spektru a na obr Toto spektrum bylo i při nepřetržitém osvětlení stabilní. Podobá se tvarem spektru z povrchů, které jsme nazvali spektrum pozadí, protože neobsahuje téměř žádné pásy. Je zde ale vidět pás ~ 1055 cm -1, který ve spektrech z kapky vyskytoval často, ale u povrchů jsme jej nepozorovali. Naopak není přítomen pás ~ 970 cm -1. I u kapky se vyskytla spektra příslušející amorfnímu uhlíku, byla však mnohem méně častá. Jednalo se spíše o dvojici širokých pásů, než o fluktuující úzké pásy, ale to by mohlo být způsobeno použitím vyššího výkonu laseru. Při měření po týdnu jsme nejprve k měření použili výkon na vzorku 0,19 mw. Většina spekter z různých míst se stejně jako u měření ihned po přípravě podobala spektrům pozadí na obr Opět se vyskytoval pás ~ 1055 cm -1. Při tomto výkonu laseru na vzorku jsme vůbec nepozorovali pásy amorfního uhlíku. Srovnání intenzit spekter ze stejného místa při nižším a vyšším výkonu na vzorku je na obr Toto spektrum bylo i při vyšším výkonu stabilní. Spektrum s parazitními pásy mimo oblast amorfního uhlíku jsme nalezli jediné (viz obr. 4.32). Objevilo se jen na okamžik mezi spektry pozadí. Vzhledem k tomu, že se skládá z malého počtu úzkých pásů, mohlo by patřit jediné látce. Zajímavé je, že se zde opět vyskytuje pás ~ 1055 cm -1. Při výkonu 1,3 mw už se občas vyskytly široké pásy amorfního uhlíku. 63

64 a) čerstvá kapka b) kapka po týdnu c) povrch bez TMPyP SERRS intenzita a 100 b 50 c Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.30: Spektra pozadí z kapky koloidu a povrchu bez TMPyP a) 0,19 mw b) 1,3 mw SERRS intenzita b 200 a Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.31: Spektra pozadí z kapky koloidu po týdnu. 64

65 SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.32: Parazitní pásy mimo oblast amorfního uhlíku naměřené z kapky koloidu po týdnu. Nezjistili jsme rozdíl v typu ani četnosti parazitních spekter mezi čerstvě připravenou kapkou a kapkou po týdnu. To ale neznamená, že kontaminace nečistotami z prostředí nehraje při vzniku amorfního uhlíku roli, spíš je pravděpodobné, že kontaminace probíhá rychle, a proto je přítomná už u čerstvé kapky. Zjistili jsme však, že u kapek byl menší výskyt parazitních pásů než na površích, i když výkon na vzorku byl vyšší. To svědčí o tom, že hlavní příčinou parazitních pásů v oblasti cm -1 je dekompozice silanu. Jelikož je silan organická molekula, může být jeho dekompozice zdrojem amorfního uhlíku. Uvedli jsme zde typická parazitní spektra, která brání naměření kvalitních SERS spekter TMPyP ze stříbrných borohydridových povrchů. Parazitní pásy jsme ale pozorovali také u stříbrných hydroxylaminových povrchů. U zlatých povrchů se parazitní pásy také občas vyskytly, ale jednalo se o jednotlivé a méně intenzivní pásy. Důvodů, proč se u stříbrných povrchů vyskytují parazitní pásy ve vyšší míře než u zlatých, je několik. Stříbro má vyšší SERS zesílení než zlato, tedy více zesiluje intenzitu elektromagnetického záření, a proto na něm může více docházet k tepelné či fotoindukované dekompozici látek přítomných na povrchu. Stříbrné částice a hotové povrchy jsou náchylnější ke kontaminaci při přípravě a z okolního prostředí, protože stříbro je reaktivnější než zlato. Navíc pokrytí kovovými částicemi není u stříbrných povrchů úplné, kdežto zlaté povrchy jsou tvořeny několika vrstvami částic. 65

66 Obvyklými způsoby, jak zabránit vzniku parazitních spekter, způsobených tepelnou dekompozicí či rezonanční excitací molekul přítomných na povrchu (ať už přirozeně přípravou povrchu nebo všudypřítomnou kontaminací), jsou užití objektivů s malou numerickou aperturou (energie laserového záření se rozloží na větší plochu vzorku, proto by mělo méně docházet k dekompozici), volba optimálního výkonu laserového záření (s vyšším výkonem se zlepšuje poměr signál/šum, ale zároveň přibývá parazitních pásů vlivem dekompozice) a případně nerezonanční Ramanova spektroskopie. Volbu optimálního výkonu laseru na vzorku jsme prováděli. Zda se situace nezlepší při použití objektivů 50 či 10, které mají menší numerické apertury než objektiv 100, jsme také zkusili. Zjistili jsme, že výskyt parazitních pásů je sice nižší, ale také je nižší intenzita signálu TMPyP, a proto celková kvalita akumulovaných spekter není příliš dobrá. Nejvhodnější je proto objektiv 100, který navíc umožňuje získat nejvyšší prostorové rozlišení. Aby se omezila kontaminace během přípravy, je nutné dbát při přípravě SERSaktivních povrchů na čistotu chemikálií, chemického nádobí a substrátu, což jsme dělali. Také jsme zkusili uchovávat povrchy po přípravě v deionizované vodě, abychom omezili možnost kontaminace nečistotami z prostředí, ale zjistili jsme, že na takovém povrchu se parazitní pásy vyskytovaly ve stejné míře jako u povrchů skladovaných na vzduchu. V literatuře byly popsány také další způsoby omezení výskytu parazitních spekter. Robustnější kovové povrchy, jako jsou například kovové elektrody, lze chemicky čistit [63], ale efekt vyčištění není trvalý a pro naše povrchy není tato cesta použitelná. Dekompozici vlivem laserového záření účinně omezuje například metoda měření z mnoha bodů (multiple point collection, MPC) navržená v [64], která ale vyžaduje speciální měřicí zařízení. Zmiňme se ještě o ubývání signálu TMPyP s dobou ozáření vzorku, které stejně jako parazitní pásy patří k překážkám získání kvalitních reprodukovatelných spekter. Docházelo k němu u zlatých i stříbrných povrchů. Po ukončení akumulace trvající nejčastěji 1 minutu se občas stalo, že místo signálu TMPyP zůstal pouze šum. Mizení signálu lze vysvětlit dekompozicí TMPyP, nebo také předpokladem, že signál pochází z hot spotů, pro něž je charakteristické, že signál s časem úplně vymizí. Dekompozice TMPyP vlivem laserového záření (tepelná či fotoindukovaná) by se projevila vznikem amorfního uhlíku. Problematika hot spotů úzce souvisí se SERS jediné molekuly a stejně jako fluktuace, tak ani mizení signálu v těchto experimentech nebylo zcela vysvětleno. Mezi možnými příčinami jsou změny geometrie SERS-aktivního místa vlivem laserového záření a tepelný pohyb adsorbovaných molekul, který vyvolává sérii desorpčních a readsorpčních kroků, až 66

67 celkově převládne desorpce [65]. U zlatých povrchů jsme parazitní pásy amorfního uhlíku nepozorovali, proto předpokládáme, že zde se jedná o druhý případ. U stříbra dochází k většímu zesílení laserového záření, a tak je možné, že je zde úbytek signálu způsoben také dekompozicí TMPyP Hydroxylaminové povrchy Kvůli parazitním pásům ztěžujícím měření SERS spekter, jsme se rozhodli připravit povrchy z dalšího stříbrného koloidu. Zvolili jsme koloid redukovaný hydroxylaminem hydrochloridem, který není v SERS experimentech používán tak často jako borohydridový koloid. Na Oddělení fyziky biomolekul FÚ UK byl k přípravě SERS-aktivních povrchů i SERS měřením použit poprvé. Dalším důvodem, proč vyzkoušet nový koloid, byla nízká úspěšnost přípravy borohydridových povrchů kvůli malé stabilitě koloidů. Neúspěch se projeví tím, že koloid začne po ponoření silanizovaného skla silně agregovat (poznáme to podle změny jeho barvy), až se agregáty nakonec usadí na dně. Díky tomu se jich méně naváže na silanizovaný substrát. K tomu bohužel došlo i při přípravě hydroxylaminových povrchů. Úbytku částic jsme se pokusili bránit tím, že jsme sklo vyjmuli a ponořili jej do nové dávky hydroxylaminového koloidu. Hydroxylaminové povrchy jsme připravovali pouze jednou ve várce s borohydridovými povrchy, a tak jsme získali jen dva hydroxylaminové povrchy. Jejich extinkční spektra jsou na obr Oproti extinkčnímu spektru samotného hydroxylaminového koloidu (viz obr. 4.34) tvořenému širokým pásem s maximem na ~ 425 nm jsou pásy povrchů užší a posunuty do oblasti kratších vlnových délek. Znamená to, že koloid je tvořen částicemi s širší distribucí velikostí a že na skleněný substrát se z něj navázaly menší částice. Z extinkčních spekter vidíme, že stejně jako u stříbrných borohydridových povrchů je zde pro SERS vhodnější excitace 514,5 nm. Z povrchu H1 jsme změřili SERRS spektra TMPyP (excitace 514,5 nm). Doba ponoření povrchu do roztoku TMPyP byla 20 minut. Výkon laseru na vzorku jsme zvolili 0,02 mw. Pro koncentraci TMPyP M byl přítomen pouze šum, nebo naopak parazitní pásy podobné těm popsaným v předchozí kapitole pro borohydridové povrchy. Pro koncentraci TMPyP M byla situace na většině míst povrchu podobná. Signál TMPyP se nám podařilo nalézt pouze z velkých agregátů, které se ojediněle na povrchu vytvořily (viz obr. 4.35). Z těchto agregátů jsme získali velmi intenzivní spektra již při akumulaci 1 s. Příklad takového spektra je na obr SERRS spektrum TMPyP leží na 67

68 pozadí dvou širokých pásů amorfního uhlíku (maxima ~ 1350 cm -1 a ~ 1580 cm -1 ). Nejvýznamnějším pásům příslušícím TMPyP jsou na obr přiřazeny vlnočty. Na rozdíl od borohydridových povrchů se nejedná o čisté spektrum free-base formy TMPyP (označována také jako forma I) charakterizované pásy 334, , a 1556 cm -1 [54], ale došlo k částečné metalaci. Běžně dochází v stříbrných koloidech i na jiných SERS-aktivních površích k rychlé metalaci porfyrinu kationtem Ag + (forma II). V tomto spektru se však objevují pásy méně obvyklé metalační formy TMPyP (forma III), kdy se do porfinového jádra váže neutrální atom stříbra Ag(0) [66-68]. Pro metalaci porfyrinu je charakteristická nepřítomnost pásů 334 a 971 cm -1. Markery metalace jsou potom pásy 395, 1340 a 1545 cm -1 (forma II) [54] a 386, 1365 a 1566 cm -1 (forma III) [67]. Forma porfyrinu III stabilizuje aktivní místa, jejichž vznik indukuje například přidání aniontů. V případě hydroxylaminového koloidu dochází k vzniku redukovaného stříbra Ag(0) vlivem chloridů, které jsou na povrchu částic po redukci dusičnanu stříbrného hydroxylaminem hydrochloridem. Přítomnost chloridových aniontů se projevuje pásem ~ 230 cm -1, příslušejícím vibraci ν(ag-cl), který částečně překrývá pás vibrace ν(ag-n) na 215 cm -1. Dále jsme zkusili měřit z tohoto povrchu na excitaci 632,8 nm (objektiv 100, výkon na vzorku 0,065 mw nebo 0,48 mw), ale signál TMPyP jsme nenalezli. Parazitní spektra se však objevovala i na této excitaci. Extinkce b c b a ,5 632,8 a) H1 b) H Vlnová délka (nm) Obrázek 4.33: Extinkční spektra stříbrných hydroxylaminových povrchů. 68

69 ,5 632, Extinkce Vlnová délka (nm) Obrázek 4.34: Extinkční spektra stříbrného hydroxylaminového koloidu. Obrázek 4.35: Velké agregáty stříbrných částic na hydroxylaminovém povrchu (fotografie z kamery mikroskopu, objektiv 100 ). 69

70 SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.36: SERRS spektrum TMPyP z agregátu na hydroxylaminovém povrchu H1 (akumulace 1 s, výkon na vzorku 0,02 mw) Nanočástice imobilizované vyschnutím Úvodní měření Povrch s takovými agregáty rozhodně nesplňuje požadavky homogenity a reprodukovatelnosti. Navíc docházelo stejně jako u borohydridových povrchů ke vzniku parazitních pásů. Abychom zjistili, zda jsou vlastnosti hydroxylaminových koloidních částic vhodné pro SERS, zkusili jsme změřit SERRS spektrum TMPyP z hydroxylaminového koloidu ve formě vyschlé kapky na podložním skle. Do hydroxylaminového koloidu jsme přidali roztok TMPyP tak, aby jeho koncentrace ve směsi byla M. Kapku této směsi o objemu 1 μl jsme pipetou nakápli na podložní sklo očištěné ethanolem a nechali přibližně 45 minut vyschnout. Potom jsme měřili na excitaci 514,5 nm. Použili jsme objektiv 100 a výkon na vzorku 0,19 mw. Koloidní kapka není homogenní SERS-aktivní povrch. Po nanesení na sklo tvoří styčná plocha kapky a skla kruh. Na obrazu z kamery mikroskopu jsme viděli, že po vyschnutí se většina koloidních částic nachází při okraji kapky, kde se z agregátů vytváří část obvodové kružnice (obr. 4.37) a větší nepravidelný shluk částic. Agregáty se v menší míře vyskytly i jinde uvnitř plochy vyschlé kapky. SERRS signál TMPyP jsme nalezli jen v takovýchto místech s velkou hustotou stříbrných částic. Morfologii kapek směsi hydroxylaminu a TMPyP pro různé koncentrace TMPyP se budeme věnovat podrobněji níže. SERRS signál 70

71 z kapky byl už při akumulaci 1 s velmi silný a byl stabilní. Parazitní pásy se nevyskytovaly, což si vysvětlujeme nepřítomností silanu. Přidáním TMPyP došlo k agregaci koloidu, která zvyšuje SERS zesílení. Příklad naměřeného SERRS spektra TMPyP s označením pásů je na obr Vyskytovala se také SERRS spektra TMPyP s přibližně 10 vyšší intenzitou, která měla vyšší pozadí amorfního uhlíku a pásy TMPyP byly méně rozlišené. Překvapivě se jednalo o spektrum free-base formy, ale další měření ukázala, že dochází k metalaci porfyrinu na formu III a podíl obou forem závisí na místě měření. Obrázek 4.37: Část okraje hydroxylaminové kapky s M TMPyP (fotografie z kamery mikroskopu, objektiv 100 ). SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.38: SERRS spektrum TMPyP z kapky hydroxylaminového koloidu (akumulace 1 s, výkon na vzorku 0,19 mw). 71

72 Stejně jako u hydroxylaminového povrchu jsme i zde zkusili měřit na excitaci 632,8 nm. Tentokrát jsme naměřili už při akumulaci 1 s velmi intenzivní SERS spektra TMPyP, která byla při výkonech na vzorku 0,016 mw a 0,065 mw stabilní. Příklad takového spektra je na obr Jen ojediněle se stalo, že spektrum bylo mírně deformované výskytem parazitních pásů. Při vyšším výkonu bylo SERS spektrum TMPyP ještě částečně patrné, ale byl přítomen amorfní uhlík (viz obr. 4.40, měřena jiná spektrální oblast než u spekter na obr. 4.39), vznikající pravděpodobně dekompozicí uhlíkatých nečistot i TMPyP. Vzhledem k tomu, že se ve spektrech naměřených z kapky hydroxylaminového koloidu parazitní pásy na rozdíl od hydroxylaminového povrchu nevyskytují a že příprava povrchů je časově náročná a její úspěšnost není zaručena, jsme se rozhodli dále se zabývat jen nanočásticemi imobilizovanými vyschnutím. Všechna následující spektra byla změřena na excitaci 514,5 nm a vzhledem k velké intenzitě spekter většinou postačovala akumulace 1 s či kratší SERS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.39: SERS spektra TMPyP z hydroxylaminové kapky, excitace 632,8 nm (1 s, výkon na vzorku 0,065 mw). 72

73 SERS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.40: SERS spektrum z hydroxylaminové kapky, excitace 632,8 nm při vyšším výkonu laseru na vzorku (1 s, výkon na vzorku 0,48 mw, jiný spektrální rozsah než na obr. 4.39) Koncentrační závislost Zatím jsme zjistili, že hydroxylaminový koloid má dobré vlastnosti pro SERS spektroskopii, protože z vyschlých kapek tohoto koloidu jsme s krátkou dobou akumulace naměřili kvalitní spektra TMPyP bez přítomnosti parazitních pásů. Cílem následujícího měření bylo zjistit, jak nízké koncentrace TMPyP je možné naměřit. Opět jsme postupovali tak, že jsme do hydroxylaminového koloidu přidali roztok TMPyP tak, abychom získali požadovanou výslednou koncentraci TMPyP, a ihned po smíchání pipetou jsme nanesli 1μl kapku na ethanolem očitěné podložní sklo. Měřili jsme v koncentračním rozsahu M TMPyP. Vzhled jednotlivých kapek se po vyschnutí lišil (viz obr. 4.42), u některých se většina koloidních částic soustředila do jednoho shluku, ale také je vidět, že se vytváří částečný obvodový prstenec. Úplný prstenec z agregovaných koloidních nanočástic se vytvořil jen u kapky s koncentrací TMPyP M. To by mohlo souviset s agregačním stavem koloidu, protože koncentrace TMPyP M je podle extinkčních spekter (viz obr. 4.41) blízká pokryvové koncentraci (koncentrace, při které dojde k úplnému pokrytí koloidních částic porfyrinem a koloid začíná silně agregovat). Nejlepší naměřená spektra pro jednotlivé koncentrace jsou na obr Spektra byla měřena z míst s velkou hustotou koloidních částic (většinou z velkého shluku či prstence) a akumulována 73

74 1 s (objektiv 100, výkon na vzorku 0,19 mw). U vyšších koncentrací, kde jsou pásy TMPyP dobře rozlišitelné, jsou vyznačeny pásy charakteristické pro jeho jednotlivé formy. Ve spektrech z kapky s koncentrací a M se objevují znaky metalace mizí pásy 332 a 970 cm -1 a objevují se metalační markery. Podle pásu 385 a 1363 cm -1 vidíme, že je přítomna forma III a náznak pásu 1340 cm -1 znamená, že je přítomna také forma II. Výskyt formy III je vázán na přítomnost chloridů, která se ve spektru projevuje pásem vibrace ν(ag-cl) na 230 cm -1. S rostoucí koncentrací TMPyP tento pás klesá, protože TMPyP postupně nahrazuje ionty přítomné na povrchu koloidních částic. Stejně tak ubývá s narůstající koncentrací TMPyP formy III a přibývá free-base formy. Toto je obecná tendence, ale poměr free-base formy a formy III se lišil pro různá místa kapky. SERRS spektrum TMPyP jsme nalezli pro všechny měřené koncentrace, tedy i M. Určovat u kapek detekční limit jako u zlatých a stříbrných borohydridových povrchů nemělo smysl, protože kapky nejsou homogenní ani dobře reprodukovatelný SERS-aktivní systém. Extinkce c a d b e f a) bez TMPyP b) 1 x M c) 1 x 10-9 M d) 1 x 10-8 M e) 1 x 10-7 M f) 1 x 10-6 M Vlnová délka (nm) Obrázek 4.41: Extinkční spektra hydroxylaminového koloidu s různými koncentracemi TMPyP. 74

75 a b c d e Obrázek 4.42: Fotografie vyschlých kapek směsi hydroxylaminového koloidu s TMPyP o koncentraci (a) M, (b) M a (c) M, (d) M, (e) M (objektiv 5 ). 75

76 x10-10 M TMPyP 1x10-9 M TMPyP 1000 SERRS intenzita SERRS intenzita x10-8 M TMPyP 385 III II 1363 III FB 390 1x10-7 M TMPyP FB 1340 II 1363 III 1555 FB SERRS intenzita FB 401 1x10-6 M TMPyP 967 FB FB 1555 FB Vlnočet (cm -1 ) Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.43: Nejlepší SERRS spektra TMPyP o různých koncentracích naměřená z hydroxylaminových kapek. Při nízkých koncentracích se vyskytovaly pásy nepatřící TMPyP. Jako příklad uvádíme spektra na obr pro kapky s koncentrací TMPyP a M. Některé pásy se vyskytují v obou spektrech. Opět byl v některých spektrech pozorován pás 1055 cm -1, často se vyskytující v parazitních spektrech z borohydridových kapek. 76

77 a) 1x10-10 M b) 1x10-9 M SERRS intenzita b a Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.44: Parazitní spektra při měření z kapek hydroxylaminového koloidu Vznik prstence Částečný nebo úplný prstenec, který vytvoří vyschlá hydroxylaminová kapka, připomíná prstenec vyschlých kapek v metodě DCDR (viz kapitola 1.5). Zkusili jsme proto nanést hydroxylamové kapky na DCDR destičku. Prvním vzorkem byl neředěný koloid s M TMPyP. Pro další vzorky jsme hydroxylaminový koloid 10krát a 100krát zředili a přidali TMPyP tak, aby poměr TMPyP:Ag zůstal stejný jako u neředěného koloidu, tj. aby byl stejný agregační stav koloidu. Ředění jsme prováděli proto, že jsme předpokládali, že se bude snadněji vytvářet prstenec. Kapky (objem 2 μl) jsme nanesli na DCDR destičku a nechali přibližně 30 minut vyschnout. Na DCDR destičce se však prstenec vůbec netvořil. Většina částic se shromáždila v kompaktním shluku (viz obr. 4.45), takže podobný efekt jako v DCDR spektroskopii proteinů pro porfyrin nefunguje. 77

78 neředěný 100 zředěný Obrázek 4.45: Fotografie hydroxylaminových kapek s TMPyP na DCDR destičce (konstantní poměr Ag:TMPyP odpovídající koncentraci M v neředěném koloidu) (objektiv 5 ). Stejným postupem jsme připravili sérii kapek (objem 2 nebo 4 μl) 10krát až 100krát zředěného koloidu na podložním skle. Na skle se prstenec tvořil. I u ředěných kapek se obvykle vyskytoval kromě částečného prstence také velký shluk (viz obr. 4.46), který byl ale méně kompaktní než u neředěných kapek. U kapky 100krát zředěného koloidu se částice rozložily téměř rovnoměrně a vznikly jakési soustředné prstence s různou hustotou částic. Při opakovaném pokusu (koloid byl znovu naředěn a znovu přidán TMPyP), se ale tyto soustředné prstence nevytvořily a nepozorovali jsme je ani jindy. Kromě tohoto efektu jsme nepozorovali významné rozdíly mezi schopností různě zředěného koloidu tvořit po vyschnutí prstenec. Z několika kapek různého zředění jsme také změřili SERRS spektra TMPyP. Opět byly přítomny znaky free-base porfyrinu a metalované formy III. Čím více byl koloid zředěný, tím byla SERRS spektra TMPyP méně intenzivní s horším poměrem signál/šum. Důvodem je menší počet stříbrných částic, a proto menší pravděpodobnost vzniku SERS-aktivních stavů. 78

79 nové ředění Obrázek 4.46: Fotografie ředěných hydroxylaminových kapek s TMPyP na skle (konstantní poměr Ag:TMPyP odpovídající koncentraci M v neředěném koloidu) (objektiv 5 ). V hydroxylaminových kapkách jsou kromě agregátů stříbrných koloidních částic viditelné krystaly (viz obr. 4.47). Těchto krystalů je možné se zbavit krátkým ponořením skla s kapkou do deionizované vody (my jsme ponořili 2krát na přibližně 3 sekundy). Pravděpodobně se jedná o krystaly soli nejspíše chloridu sodného (v koloidu je přítomen sodný kationt z hydroxidu sodného a chloridový aniont z hydroxylaminu hydrochloridu). Přítomnost krystalků však nemá na kvalitu SERS spekter vliv, a proto není jejich odstranění nutné. 79

80 Obrázek 4.47: Fotografie hydroxylaminové kapky s M TMPyP před a po umytí v deionizované vodě (objektiv 5, resp. 50 ). Vlevo před umytím, vpravo po umytí. Po několika přípravách kapek jsme došli k závěru, že prstenec se vytvoří u koloidní kapky pro různé agregační stavy koloidu. Vytvořil se totiž u hydroxylaminové kapky s , i M TMPyP (viz obr. 4.48), přičemž koncentrace TMPyP M nevede k pozorovatelné agregaci koloidu, při koncentraci TMPyP M dochází k mírné agregaci a při koncentraci M koloid silně agreguje (viz extinkční spektra na obr. 4.41). Přesto se kapky z koloidu s různým stupněm agregace mírně liší pro méně agregovaný koloid je prstenec širší s rovnoměrněji rozloženými částicemi. Pro srovnání jsme připravili kapky také ze stříbrného borohydridového koloidu. Použili jsme koncentraci TMPyP a M, přičemž první vede k mírné a druhá k silné agregaci koloidu (viz obr. 4.50). Obě kapky také vytvořily prstenec, takže se nejedná o vlastnost pouze hydroxylaminového koloidu. Borohydridové kapky se od hydroxylaminových vzhledově liší (viz obr. 4.49). Mají celistvější, většinou tenký okraj a neobsahují krystalky soli. Pro vytvoření prstence je důležité, aby podložní sklo bylo čisté a nakapávání probíhalo opatrně. 80

81 M TMPyP M TMPyP M TMPyP Obrázek 4.48: Fotografie hydroxylaminových kapek (2 μl) s různými koncentracemi TMPyP (1 10-6, , M). Vpravo část levého okraje kapky, vlevo celá kapka (počítačově složená z jednotlivých částí) (objektiv 5 ). 81

82 M M Obrázek 4.49: Fotografie borohydridových kapek (2 μl) s koncentracemi TMPyP a M). Vpravo část kapky, vlevo celá kapka (počítačově složená z jednotlivých částí) (objektiv 5 ). 82

83 a b a) bez TMPyP b) 1 x 10-7 M c) 3 x 10-7 M Extinkce 0.3 c Vlnová délka (nm) Obrázek 4.50: Extinkční spektra borohydridového koloidu s různými koncentracemi TMPyP Mapy z kapek Z hydroxylaminových a borohydridových kapek na obr a 4.49 jsme změřili SERRS spektra a spektrální mapy. Z borohydridových kapek jsme také získali dobrá SERRS spektra TMPyP. Příklad intenzivního spektra z kapky s M TMPyP je na obr Oproti hydroxylaminovým kapkám se jedná o spektrum metalační formy II (metalace kationtem Ag + ) s charakteristickými pásy 395, 1011, 1340 a 1545 cm -1 [54]. Toto spektrum patří mezi nejintenzivnější spektra naměřená z borohydridové kapky. 83

84 SERRS intenzita Vlnočet (cm -1 ) Obrázek 4.51: SERRS spektrum M TMPyP z borohydridové kapky (0,19 mw, objektiv 100, 1s). Jako příklad map uvádíme mapy z hydroxylaminových a borohydridových kapek s M TMPyP (viz obr a 4.54). Mapy ilustrují, že signál z různých míst se liší intenzitou i podílem metalované a free-base formy TMPyP. Dále je dobře vidět, že signál pochází jen z velých agregátů, které se nacházejí především v prstenci, popř. ve velkém shluku částic, pokud se prstenec dokonale nevytvoří. Body měření jsou vyznačeny na fotografiích kapky (pořízeny pomocí stejného objektivu, který byl použit pro měření). K měřením byl použit výkon na vzorku 0,19 mw a akumulace 1 s. Mapy z kapek jsme stejně jako u povrchů zpracovali v programu Cell Viewer. Mapa vytvořená z normovaných koeficientů 1. subspektra odpovídá intenzitě SERRS signálu. Mapa z 2. subspektra odpovídá nejvýznamnějším změnám. V našem případě obsahuje změny příslušející metalaci. Velikosti koeficientů jsou na mapě vyjádřeny barevnou škálou. Pro vytvoření map jsme používali faktorovou analýzu ve spektrální oblasti cm -1, kde se pozadí jednotlivých spekter příliš neliší a lze jej snadno odečíst (bylo korigováno polynomem prvního stupně). To je důležité pro dobrý výsledek faktorové analýzy, tedy i mapy. V této oblasti jsou také patrné projevy metalace mizí pás 971 cm -1 a dochází ke změnám pásu ~ 1000 cm -1. Avšak nelze jednoznačně určit, o jaký typ metalace se jedná. Proto uvádíme také subspektra faktorové analýzy z širší spektrální oblasti, podle nichž lze formu metalace stanovit (forma II: 395, 1340 a 1545 cm -1, forma III: 386, 1365 a 1566 cm - 1 ). 84

85 Mapy z hydroxylaminové kapky byly měřeny objektivem 50 s krokem 10 μm (12 9 bodů). V 1. subspektru se kolem 1000 cm -1 vyskytuje dvojice pásů ~ cm -1, přičemž první je markerem free-base formy TMPyP. 2. subspektrum vyjadřuje pokles pásu 971 cm -1 a posun druhého pásu, tedy úbytek free-base formy a nárůst metalované formy. Na mapě příslušící 2. subspektru vidíme barevně odlišena místa s rozdílným poměrem free-base a metalované formy TMPyP. Podle 1. subspektra faktorové analýzy z celé spektrální oblasti se jedná o metalační formu III (viz obr. 4.53). Mapy z borohydridové kapky byly měřeny objektivem 100 s krokem 4 μm (13 8 bodů). V 1. subspektru kolem 1000 cm -1, kromě pásů příslušejících free-base formě, vystupuje silný pás ~ 1011 cm -1 příslušející pravděpodobně metalační formě II. Stejně jako u hydroxylaminové kapky vyjadřuje 2. subpektrum úbytek pásu 971 cm -1, posun druhého pásu není tak významný. Mapa z koeficientů 2. subspektra opět vypovídá o tom, že se jednotlivá místa liší podílem free-base a metalované formy. Z 1. subspektra z širší spektrální oblasti podle silného úzkého pásu poznáme, že jde o metalační formu II (viz obr. 4.55). 85

86 1. subspektrum - oblast cm subspektrum oblast cm -1 Reziduální chyby Singulární hodnoty Obrázek 4.52: Mapy SERRS intenzity z hydroxylaminové kapky s M TMPyP. 86

87 1. subspektrum celá spektrální oblast 2. subspektrum celá spektrální oblast Obrázek 4.53: První dvě subspektra faktorové analýzy v celé spektrální oblasti SERRS spekter TMPyP z hydroxylaminové kapky. 87

88 1. subspektrum oblast cm subspektrum oblast cm -1 Reziduální chyby Singulární hodnoty Obrázek 4.54: Mapy SERRS intenzity z borohydridové kapky s M TMPyP. 88