Elektroforesa proteinů séra Vlastnosti proteinů

Elektroforesa proteinů séra Vlastnosti proteinů Praktikum z Lékařské Chemie a Biochemie Všeobecné lékařství Jan Pláteník 2010/2011 1

1 Elektroforesa proteinů séra v 0,5% agarose Nativní elektroforesa sérových bílkovin v agarosovém gelu je stále jedním ze základních vyšetření v klinické biochemii a v tomto praktickém cvičení slouží i jako obecný příklad elektroforetického dělení proteinů. Proteiny jsou v tomto uspořádání elektroforesy nativní (tedy nedenaturované), v alkalickém pufru (ph 8,5-9) získávají záporný náboj a putují od záporné elektrody ke kladné. Nosičem je agarosový gel, jehož póry jsou na rozdíl od polyakrylamidu poměrně velké a podstatně pohyb proteinů neomezují, takže dělení proteinů probíhá podle jejich povrchové hustoty náboje. Bílkoviny lidského séra se takto rozdělí do několika klasických frakcí: nejrychleji putuje albumin, za ním pak následují globulinové frakce označené postupně jako α1, α2, β (zpravidla rozdělené na β1 a β2) a konečně γ globuliny. + Albumin α1-globuliny α2-globuliny β1-globuliny β2-globuliny γ-globuliny Typický výsledek nativní elektroforesy bílkovin fyziologického lidského séra na agarose, včetně densitometrického vyhodnocení (sestaveno z obrázků dostupných na www.sebia.com). Celý experiment sestává z několika kroků: Odlévání agarosového gelu: agarosa je polysacharid galaktan získávaný z mořských řas. Pro rozpuštění agarosy ve vodě je třeba směs zahřívat až k varu, během chladnutí roztoku se rozpuštěná vlákna agarosy nekovalentně splétají dohromady a vytvoří gel. Práci s agarosou usnadňuje zajímavý fenomén hystereze teplota při které se roztok stává gelem je výrazně nižší než teplota nutná k rozpuštění gelu. Sérum, které chceme dělit se ředí 10x, zároveň se k němu přidává glycerol pro zvýšení hustoty což usnadňuje aplikaci vzorku a bromfenolová modř, což je anionické barvivo které putuje při elektroforese před proteiny a s její pomocí se postup elektroforesy zviditelňuje. Aplikace vzorků séra do jamek v agarose pod hladinu elektroforetického pufru a vlastní elektroforetické dělení. Fixace ve směsi metanolu a kyseliny octové denaturuje bílkovinné molekuly a zabrání difusi proteinových frakcí po elektroforese. Barvení: proteinové frakce v gelu se vizualizují pomocí vhodného organického barviva, které se na proteiny nekovalentně váže. Nejčastěji se používá Coommassie Brilliant Blue anebo (jako v našem experimentu) amidočerň. Odbarvení: odmyje se přebytek barviva z gelu k získání bezbarvého pozadí, na kterém jsou proužky obarvených proteinů dobře vidět. 2

Vyhodnocení výsledného elektroforeogramu může být buď vizuální (kvalitativní) anebo též densitometrické (kvantitativní). V našem pokuse budeme výsledek hodnotit pouze vizuálně. Pokud ale se tato elektroforesa provádí v klinické biochemii, intenzita získaných proteinových frakcí se měří pomocí densitometru. Jde v podstatně o fotometrii, přístroj kontinuálně proměří absorbanci v dráze vzorku, plocha pod vrcholy densitometrické křivky je úměrná množství proteinů v jednotlivých frakcích (viz obr. výše). Chemikálie a pomůcky: 1. Agarosa pro elektroforesu 2. Elektroforetický pufr: barbital sodný 5,5 g/l kyselina citrónová 0,25 g/l, ph 8,7-9,0. 3. Lidské sérum ředěné 10x s 0,5 % bromfenolovou modří v 30 % glycerolu 4. Fixační/odbarvovací roztok: kyselina octová-metanol 1:9 5. Barvicí roztok: 0,5% amidočerň 10B v kyselině octové-metanolu 1:9 6. Elektroforetický zdroj 7. Horizontální elektroforetická vana 8. Misky na fixaci, barvení a odbarvování UPOZORNĚNÍ: Elektrické napětí a proud, jaké se používají při elektroforese jsou pro způsobení závažného úrazu elektrickým proudem více než dostatečné!!! Dbejte nezbytné opatrnosti, především zabraňte rozlití kapalin v okolí elektroforetické vany pod proudem, před jakoukoliv manipulací s vanou je vždy nezbytné nejdříve vypnout elektroforetický zdroj! Provedení (demonstrace): 1. Do Erlenmeyerovy baňky navážit 0,25 g agarosy, přidat 50 ml elektroforetického pufru a magnetické míchadlo. Zavřít alobalem a na topné ploténce zahřívat a míchat až k varu. Toto množství agarosy je na dva gely. 2. Jakmile se agarosa začíná vařit, odstavit z ploténky a počkat až zchladne asi na 60 C (dá se udržet v ruce). 3. Sestavit elektroforetickou vanu na odlévání: vnitřní plastová část napříč, s gumovým těsněním. Do vnitřní části nalít přibližně 25 ml rozpuštěné agarosy a do krajních drážek nasadit jeden hřeben. 4. Nechat tuhnout nejméně hodinu. Během této doby s vanou nehýbat. 5. Elektroforetický pufr a vany s odlitými agarosovými gely nechat před vlastní elektroforézou vychladit v lednici. 6. Přestavit vanu na elektroforézu: vyjmout vnitřní plastovou část se ztuhlou agarosou, odstranit gumová těsnění a znovu umístit do vany otočené o 90 C tak, aby jamky byly nad barevným pruhem na dně vany. 7. Přelít gel 250 ml vychlazeného pufru, velmi opatrně odstranit hřeben (jamky se nesmí poškodit) a nechat gel ekvilibrovat asi 5 minut. 8. Aplikace vzorků do jamek: pod hladinu pufru, pipetou se žlutou špičkou, 10 µl na jamku. 9. Zavřít vanu a připojit ke zdroji. Nastavit 100 V a nechat elektroforézu běžet dokud bromfenolová modř nedosáhne asi 0,5 cm od okraje gelu (trvá asi 30 minut). 3

10. Vypnout zdroj, odpojit vanu od zdroje a vyjmout plastovou část s gelem. 11. Gel sesunout z plastové podložky do fixačního roztoku. Fixace 3 x 5 minut, pokaždé v čerstvé porci fixačního roztoku. Použitý fixační roztok je lépe opatrně odsát než slít (gel se snadno mechanicky poškodí). 12. Barvení v roztoku amidočerni asi 30 minut. 13. Odbarvování v odbarvovacím roztoku asi 1-2 hodiny (sledovat postup odbarvení). Po odbarvení uchovávat v destilované vodě při 4 C. 14. Vizuální vyhodnocení výsledného elektroforeogramu. 2 Barevné reakce proteinů: Biuretová reakce Bílkoviny dávají s měďnatými ionty v alkalickém prostředí fialové zbarvení. Příčinou této barevné změny je vznik komplexu měďnatých iontů s dusíky sousedních peptidových vazeb: Tato reakce závisí na přítomnosti peptidových vazeb, nikoliv na vlastnostech postranních aminokyselinových zbytků a poskytují ji tedy všechny proteiny bez rozdílu. Obecně takto reagují všechny látky, která mají v molekule alespoň dvě sousedící amidové skupiny -CO-NH 2 anebo alespoň dvě peptidové vazby -CO-NH-. Nejjednodušší sloučenina, která může reagovat je tedy oxamid H 2 N- CO-CO-NH 2, nebo biuret (bis-urea, dimer močoviny) po němž je tato reakce pojmenována: Biuretová reakce se stále používá pro fotometrické stanovení proteinů v biologickém materiálu, např. v séru. Zdůrazňujeme: Tato reakce se nazývá biuretová protože biuret je látka, která ji též poskytuje. Pokud se ale biuretová reakce použije pro měření proteinu, což je zdaleka nejčastěji, biuret jako takový není vůbec přítomen, není ani ve vzorku ani se nepoužívá jako reagens. 4

Chemikálie: 1. Hydroxid sodný, 2 mol/l (ze základní sady) 2. Síran měďnatý 70 g/l (ze základní sady) 3. Roztok vaječné bílkoviny (2 vaječné bílky oddělené od žloutků a roztřepané v 1 l fyziologického roztoku) a. Roztok síranu měďnatého ze základní sady je třeba nejdříve naředit: k asi 2 ml destilované vody ve zkumavce přikapávejte roztok CuSO 4 do slabě modrého zbarvení. b. K asi 1 ml vaječné bílkoviny přidejte asi 1 ml hydroxidu sodného a několik kapek naředěného síranu měďnatého. Zaznamenejte změnu zbarvení (lépe viditelné proti bílému pozadí). 3 Dialýza Bílkoviny v roztoku je možné oddělit od anorganických solí a jiných nízkomolekulárních látek pomocí přirozených nebo umělých membrán, které dovolují difusi malých molekul, ale ne už velkých molekul proteinů. Tento proces diferenciální difuse se nazývá dialýza. Membrány vhodné pro tento účel jsou tak zvaně semipermeabilní, nejčastěji se v laboratoři pro tento účel používá celofán dovolující prostup molekul do relativní molekulové hmotnosti 10 000 (tzv. hodnota cut-off). V živém organismu lze vlastně všechny membrány buněk nebo jejich organel také označit za semipermeabilní, neboť do jisté míry dovolují přestup vody a nízkomolekulárních látek, ale ne proteinů. Ve výzkumné laboratoři představuje dialýza jednoduchou alternativu je-li třeba například odstranit přebytek solí z roztoku proteinů, nebo proteiny převést do jiného pufru. V klinické medicíně se jedna z metod léčby selhání ledvin nazývá hemodialýza, neboť je založena na zcela stejném principu: krev pacienta proudí kolem semipermeabilních membrán, které dovolují vyrovnání koncentrací nízkomolekulárních látek s dialyzačním roztokem na druhé straně membrány (a tedy odstranění odpadních produktů metabolismu), zatímco plasmatické proteiny a krevní buňky přes dialyzační membránu neprocházejí a neztrácejí se. Tento rychlý a jednoduchý experiment demonstruje jev omezené propustnosti dialyzační membrány: trubička z celofánu je naplněna roztokem albuminu s malým množstvím síranu měďnatého. Po uzavření je dialyzační jitrnice ponořena do roztoku hydroxidu sodného. Koncentrace malých iontů na obou stranách membrány se postupně vyrovnávají, ale albumin (a na něj vázané měďnaté ionty) zůstává uvnitř. Viditelnou barevnou změnu způsobí hydroxylové ionty difundující dovnitř k albuminu a Cu 2+, kde nastávají podmínky pro biuretovou reakci (komplex Cu 2+ s proteinem, který vyžaduje alkalické prostředí). Naopak z obsahu jitrnice vystupují ionty síranové do dialyzačního roztoku, kde je lze (po určité době trvání dialýzy) prokázat detekčním činidlem na sírany - barnatými ionty. 5

Chemikálie a pomůcky: 1. Roztok albuminu pro dialýzu obsahující: Albumin z hovězího sera 20 g/l KI 90 mmol/l Vinan sodno draselný 95 mmol/l Na 2 SO 4 250 mmol/l 2. Síran měďnatý 70 g/l (ze základní sady) 3. Hydroxid sodný 1 mol/l (Nezaměňovat s roztokem ze základní sady!!) 4. Dusičnan barnatý 60 g/l (ze základní sady) 5. Nastříhaná dialyzační střívka 6. Miska s vodou na namáčení celofánu 7. Jehla na otevření střívka a. Naplňte menší kádinku dialyzačním roztokem NaOH 1 mol/l (nezaměňovat s hydroxidem ze základní sady!). Malé množství dialyzačního roztoku ponechte odlité stranou jako kontrolu pro pozdější průkaz sulfátu. b. Namočte celofán v misce s destilovanou vodou aby změkl, s pomocí jehly na jedné straně rozevřete, následně na tomto konci zavažte na uzel a pevně zatáhněte. c. Rozevřete celofán na druhém konci a automatickou pipetou dovnitř vpravte 8 ml roztoku albuminu pro dialýzu, a přidejte 4 kapky síranu měďnatého ze základní sady. d. Uzavřete celofánovou trubici pevným uzlem i na druhém konci. e. Volné konce celofánu za zauzlením krátce opláchněte destilovanou vodou ze střičky (mohou být kontaminované albuminem), a umístěte do připravené kádinky s 1 M NaOH. f. Od pokusu neodcházejte vzhled celofánové jitrnice se v důsledku přestupu OH iontů dovnitř mění již během prvních 3 minut. Všechny pozorované změny pečlivě zaznamenejte a vysvětlete. g. Dialyzační roztok v kádince zůstává bezbarvý, ale jeho složení se mění též z jitrnice se do něho dostávají ionty SO 4 2-. Jejich přítomnost lze dokázat reakcí s dusičnanem barnatým, který se síranovými ionty tvoří nerozpustnou bílou sraženinu BaSO 4. O tento průkaz se ale pokuste až po nejméně 15 minutách dialýzy, případně na konci praktika. Je při něm třeba rozlišit sraženinu BaSO 4 od Ba(OH) 2, který je též bílý a nerozpustný, ale na rozdíl od síranu barnatého se rozpouští po přidání HCl nebo HNO 3. Odlejte trochu dialyzačního roztoku do zkumavky a zároveň do druhé zkumavky vezměte stejně velké množství výchozího 1 M NaOH jako negativní kontrolu. K oběma zkumavkám přidejte stejné množství Ba(NO 3 ) 2 a porovnejte výsledek. Pokud se vám zdají obě sraženiny stejné, zkuste k oběma přidávat po kapkách HCl. Zaznamenejte všechny pozorované změny a pokuste se je vysvětlit. 6

4 Reversibilní srážení proteinů Zastoupení polárních aminokyselinových zbytků v primární struktuře proteinu determinuje rozpustnost dané bílkoviny ve vodě. Některé proteiny jsou ve vodě rozpustné výborně (např. albumin), jiné vůbec (např. kolagen). U proteinů, které v zásadě ve vodě rozpustné jsou, je stabilita vodného roztoku závislá na intenzitě povrchového náboje proteinu. Ten mimo jiné závisí na ph, v isoelektrickém bodě se ztrácí a rozpustnost proteinů při tomto ph je nejmenší (podrobněji o náboji proteinů a isoelektrickém bodě v samostatné stati o elektroforese). Vyšší koncentrace anorganických solí (hlavně amonných, alkalických kovů a kovů alkalických zemin) vedou k vysrážení bílkovin z roztoku. Vysvětluje se to jednak tím, že anorganické ionty neutralizují povrchový náboj proteinu, a jednak tím, že soli soutěží s bílkovinou o molekuly rozpouštědla a odnímají bílkovinám hydratační plášť, nutný pro jejich udržení v roztoku. Obdobně ethanol v přítomnosti malého množství solí proteiny sráží, protože je dehydratuje a zároveň snižuje dielektrickou konstantu prostředí (dipóly se více přitahují). Ethanol může ale proteiny i denaturovat (viz dále) a k vyloučení tohoto vlivu je třeba snížit teplotu pod 0 C. Protože proteiny se liší v náchylnosti k precipitaci solemi, změnami ph a/nebo alkoholem, vhodným postupem tak lze směs proteinů rozdělit na více frakcí. Klasickým příkladem je frakcionace bílkovin séra síranem amonným: globuliny precipitují při poloviční saturaci (NH 4 ) 2 SO 4, zatímco albumin až při úplném nasycení roztoku. Frakcionací ethanolem za nízkých teplot dle Cohna se bílkoviny lidské krevní plazmy dají rozdělit až do 5 frakcí. Ve všech těchto případech jde o reversibilní srážení, tedy po odstranění precipitujícího faktoru se proteiny opět rozpouštějí a jejich biologická aktivita zůstává zachována. Chemikálie: 1. Roztok vaječné bílkoviny (stejný jako pro úlohu 2) 2. Krystalický chlorid sodný, s odměrkou 3. Ethanol 4. Kyselina octová ředěná 12 g/l (ze základní sady) 5. Hydroxid sodný 2 mol/l (ze základní sady) 6. Parafilm 4.1 Srážení proteinů alkoholem K 1-2 ml vaječné bílkoviny ve zkumavce přidejte několik krystalků chloridu sodného, uzavřete parafilmem a protřepte. Následně přidejte asi 0,5 ml ethanolu. Během několika minut se protein vysráží. 4.2 Srážení vaječného proteinu chloridem sodným a jeho opětné rozpuštění K asi 2 ml vaječné bílkoviny ve zkumavce přidejte tři odměrky chloridu sodného a 5 kapek ředěné kyseliny octové (ze základní sady), uzavřete parafilmem a protřepte. Objeví se bílá sraženina proteinu. V dalším kroku se pokuste dokázat, že precipitace proteinu je reversibilní: přidejte asi 2 ml deionizované vody ze střičky a několik kapek hydroxidu sodného (ze základní sady). Uzavřete parafilmem, důkladně protřepte a počkejte až vyprchají bubliny a opadne pěna. Je nyní roztok vaječné bílkoviny opět čirý? 7

5 Srážení proteinů spojené s denaturací Různá chemická činidla stejně jako fyzikální faktory (vysoká teplota) mohou narušit konformaci proteinů. Vedlejší vazebné interakce, které drží pohromadě sekundární, terciární, případně kvartérní strukturu bílkoviny, jsou porušeny, zatímco mnohem pevnější peptidové vazby (a tedy primární struktura proteinu) zůstávají zachovány. Tomuto procesu říkáme denaturace a ve většině případů je nevratný. Biologická aktivita proteinu je závislá na jeho nativní konformaci a s denaturací mizí. Denaturace je zpravidla (ale ne vždy) doprovázena i změnou rozpustnosti proteinu, tedy jeho precipitací. Chemikálie: 1. Roztok vaječné bílkoviny (stejný jako pro úlohu 2) 2. Dusičnan olovnatý 5 g/l 3. Síran měďnatý 70 g/l (ze základní sady) 4. Koncentrovaná kyselina dusičná (ze základní sady) 5. Kyselina trichloroctová, CCl 3 COOH 30 g/l 6. Kyselina sulfosalicylová (2-hydroxy-5-sulfobenzoová) HO 3 SC 6 H 3-2-(OH)COOH, 200 g/l 7. Kyselina octová 12 g/l (ze základní sady) 8. Kyselina octová 100 g/l 5.1 Srážení solemi těžkých kovů Ionty těžkých kovů (olovo, měď, stříbro, rtuť) s proteiny reagují za vzniku komplexních solí a již v malém množství vedou k jejich denaturaci a precipitaci. Přebytek těžkého kovu bílkovině propůjčí náboj a precipitát se může znovu rozpustit, protein ale zůstává denaturovaný. Vazba těžkých kovů na bílkoviny je důvodem, proč mohou bílkoviny při otravách těžkými kovy působit jako antidota (například mléko při otravách chloridem rtuťnatým sublimátem). Do dvou zkumavek odlijte po asi 1 ml roztoku vaječné bílkoviny. Do první zkumavky přidejte 1 kapku dusičnanu olovnatého, do druhé 1 kapku síranu měďnatého. Pozorujte zdali se proteiny srážejí. Přidáním nadbytku solí těžkých kovů zkuste precipitované bílkoviny zase rozpustit. 5.2 Srážení minerálními kyselinami Koncentrované minerální (anorganické) kyseliny proteiny denaturují a precipitují, protože je dehydratují a tvoří s nimi nerozpustné soli. Precipitace proteinů kyselinou dusičnou byla dříve používána jako test na bílkovinu v moči (Hellerova zkouška). 8

1 ml koncentrované kyseliny dusičné ve zkumavce se opatrně (skleněnou pipetou, po stěně zkumavky) převrství roztokem vaječné bílkoviny tak, aby se oba roztoky nesmísily. Srážení proteinů se projeví jako bílý prstenec na rozhraní obou roztoků. 5.3 Srážení organickými kyselinami Účinek organických kyselin na bílkoviny je analogický působení kyselin minerálních. V klinické biochemii se kyselina trichloroctová používá k deproteinaci séra před analýzami, kde by proteiny rušily. Kyselina sulfosalicylová je klasické činidlo pro průkaz bílkoviny v moči. Do dvou zkumavek dejte po 1-2 ml vaječné bílkoviny. Do první zkumavky přidejte několik kapek kyseliny trichloroctové a do druhé několik kapek kyseliny sulfosalicylové. Pozorujte zdali se proteiny srážejí. 5.4 Srážení bílkovin vysokou teplotou (varem) Ačkoliv známe i extremofilní bakterie prospívající v hlubokomořských pramenech při teplotách nad 100 C, obecně platí, že většina běžných proteinů za vyšších teplot snadno podléhá denaturaci. V odolnosti jednotlivých proteinů k vyšším teplotám jsou značné rozdíly zatímco některé ztrácejí nativní konformaci a precipitují již při 50-60 C, u jiných je třeba kratší či delší povaření. Ne vždy je denaturace následována precipitací srovnejte například výsledek vaření vejce a mléka. Bude-li se protein denaturovaný varem srážet nebo ne, záleží na řadě faktorů, mimo jiné na koncentraci solí a ph roztoku. Obecně čím je ph blíže k isoelektrickému bodu daného proteinu, tím snadněji bude protein precipitovat. a. Odlijte asi 2 ml roztoku vaječné bílkoviny a ve vodní lázni zahřejte k varu. Protein se srazí. b. Do jiné zkumavky dejte 2 ml roztoku vaječné bílkoviny a přidejte jednu kapku kyseliny octové 12 g/l (ze základní sady), a opět zahřejte k varu. Srovnejte průběh precipitace s předchozí zkumavkou slabě kyselé ph je blíže isoelektrickému bodu vaječné bíkoviny a protein by se měl srážet rychleji. c. Do třetí zkumavky dejte opět 2 ml roztoku vaječné bílkoviny a tentokrát přidejte asi 0,5 ml kyseliny octové 100 g/l. Opět zahřejte k varu. Nyní je prostředí silně kyselé, dá se čekat, že protein i po denaturaci zůstane ionizovaný a srážet se nebude. Literatura: J. Kraml a kol. Návody k praktickým cvičením z lékařské chemie a biochemie, skripta FVL UK v Praze, SPN Praha 1987. Materiál MUDr. Jana Krtila k praktickému cvičení Bílkoviny ve školním roce 2009/2010. Návod MUDr. Martina Vejražky, PhD. na elektroforesu proteinů na agarose pro praktická cvičení v roce 2005/2006. http://en.wikipedia.org/wiki/. Autorem uspořádání experimentu s dialýzou je MUDr. Martin Vejražka, PhD. 9