Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 50

Červen 2012 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 50 Verze 2 Pro diagnostické účely in vitro 61104 1071108CS QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D-40724 Hilden Tel: +49-2103-29-0 R2 1071108CS Sample & Assay Technologies

Technologie přípravy vzorku a analýzy QIAGEN QIAGEN je vedoucím poskytovatelem inovativních technologií přípravy vzorků a analýz, které umožňují izolaci a detekci obsahu jakéhokoliv biologického vzorku. Naše pokročilé, vysoce kvalitní produkty a služby Vám zajistí spolehlivý výsledek. QIAGEN určuje standardy: v purifikaci DNA, RNA a proteinů v analýzách nukleových kyselin a proteinů ve výzkumu microrna a RNAi v automatizaci technologií pro přípravu vzorků a jejich analýz. Naší misí je umožnit Vám dosáhnout vynikajících výsledků a technických úspěchů. Další informace získáte na stránkách www.qiagen.com.

Obsah Použití 4 Souhrn a vysvětlení 4 Lýza krevních buněk 5 Vázání genomové DNA k membráně kolony QIAamp Mini Spin 5 Automatizovaná purifikace 6 Dodávané materiály 8 Obsah soupravy 8 Požadované materiály, které nejsou součástí dodávky 9 Bezpečnostní informace 10 Uchovávání a nakládání s reagenciemi 12 Uchovávání a manipulace se vzorky 12 Důležité poznámky 14 Důležité body před zahájením protokolu 14 Příprava reagencií a pufrů 14 Manipulace s kolonami QIAamp Mini Spin 15 Eluce genomové DNA 16 Výtěžek a kvalita genomové DNA 16 Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus 16 Protokoly Izolace a purifikace genomové DNA z krevních vzorků pomocí vakuového systému 19 Izolace a purifikace genomové DNA z krevních vzorků pomocí mikrocentrifugace 23 Řízení jakosti 26 Výkonnostní charakteristiky 26 Výkonnost v následných testech 27 Symboly 32 Literatura 33 Kontaktní informace 34 Informace o způsobu objednávání 35 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 3

Použití Souprava QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit je systém, který využívá technologii silikátové membrány (technologie QIAamp) k izolaci a purifikaci genomové DNA z biologických vzorků. Produkt je určen pro použití profesionálními uživateli, např. techniky a lékaři školenými v technikách molekulární biologie. Souprava QIAamp DSP DNA Blood Mini Ki je určena pro diagnostické účely in vitro. Souhrn a vysvětlení Souprava QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit využívá zavedenou technologii k rychlé a jednoduché izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorku plné krve o objemu 200 μl. Metoda QIAamp DSP DNA Blood Mini, která je určena pro simultánní zpracování několika krevních vzorků, umožňuje získat čistou DNA pro další použití. Metoda je vhodná k použití s čerstvou nebo zmraženou plnou krví a s krví ošetřenou citrátem nebo EDTA. Jednoduchá centrifugační a vakuová metoda QIAamp DSP je vhodná pro simultánní zpracování několika vzorků. Některé centrifugační metody QIAamp lze plně automatizovat pomocí QIAcube za účelem zvýšené standardizace a snazšího použití (viz str. 6). Předchozí separace leukocytů není nutná. Metoda nevyžaduje fenol/chloroformovou extrakci ani precipitaci alkoholem. Metoda vyžaduje pouze minimální interakci ze strany uživatele a umožňuje tak bezpečné zacházení s potenciálně infekčními vzorky. Metody jsou navrženy tak, aby nedocházelo ke zkřížené kontaminaci vzorků. Purifikovanou DNA lze použít v PCR nebo v jiných aplikacích, příp. ji lze uchovávat při teplotách 25 C až 15 C pro pozdější použití. 4 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Principy metody Každá metoda QIAamp DSP DNA Blood Mini zahrnuje 4 kroky: Lýza buněk v krevním vzorku Vázání genomové DNA v buněčném lyzátu k membráně kolony QIAamp Mini Spin Promytí membrány Eluce genomové DNA z membrány Tato příručka obsahuje protokoly pro 2 alternativní metody QIAamp DSP DNA Blood Mini: centrifugační (spin) metodu, který vyžaduje centrifugu, a vakuovou metodu s využitím vakuového systému, která vyžaduje použití centrifugy a vakuového systému (viz schéma na str. 7). Lýza krevních buněk Vzorky jsou lýzovány (rozloženy) za denaturačních podmínek při zvýšených teplotách. Lýza se provádí za přítomnosti proteázy QIAGEN (QP) a lyzačního pufru (AL). Vázání genomové DNA k membráně kolony QIAamp Mini Spin Pro optimalizaci vázání genomové DNA k membráně kolony QIAamp Mini Spin se nejprve přidá k lyzátům ethanol. Poté se každý lyzát nanese na kolonu QIAamp Mini Spin a genomová DNA je adsorbována na silikagelovou membránu při průchodu lyzátu indukovaném podtlakem nebo odstředivou silou. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 5

Automatizovaná purifikace Purifikaci DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit lze u QIAcube plně automatizovat. Inovativní QIAcube využívá pokročilou technologii pro zpracování centrifugačních kolon QIAGEN, které umožňují bezproblémovou integraci automatizované přípravy vzorku s nízkou propustností do pracovního procesu laboratoře. Příprava vzorku pomocí QIAcube dodržuje stejný postup jako manuální proces (tj. lýza, vázání, promytí a eluce), což Vám umožní použít soupravu QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit k purifikaci vysoce kvalitní DNA. Další informace o automatizovaném postupu získáte na příslušném listu protokolu, který je k dispozici na adrese www.qiagen.com/myqiacube. Aktualizované protokolové listy lze zdarma stáhnout, případně je lze získat od oddělení technických služeb QIAGEN (viz str. 34). Při automatizovaném zpracování soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit na přístroji QIAcube může přístroj zpracovat méně než 50 vzorků z důvodu mrtvých objemů, odpařování a další spotřeby reagencií automatizovaným pipetováním. Při manuálním použití soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit společnost QIAGEN garantuje pouze 50 stanovení vzorků. Obrázek 1. Přístroj QIAcube. 6 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Centrifugační metoda QIAamp DSP DNA Blood Mini Spin a vakuová metoda QIAamp Centrifugační metoda QIAamp Vzorek Lýza Vakuová metoda QIAamp Vzorek Před zahájením si pečlivě pročtěte protokoly (str. 18 a 22) Do LT přidejte 20 μl QP, 200 μl vzorku a 200 μl AL Promíchejte na třepačce vortex po dobu 15 sekund Inkubujte po dobu 10 minut (±1 minuta) při teplotě 56 C (±1 C). Přidejte 200 μl ethanolu Promíchejte na třepačce vortex po dobu 15 sekund Vázání Přeneste lyzát na kolonu QIAamp Mini Spin Centrifugační metoda: centrifugujte 1 minutu při 6000 x g Podtlak Vakuová metoda: vytvořte podtlak Promytí (Pufr AW1) Podtlak Centrifugační metoda: vložte kolonu QIAamp Mini Spin do nové zkumavky WT, přidejte 500 μl AW1 a centrifugujte 1 minutu při 6000 x g Vakuová metoda: přidejte 750 μl AW1 a vytvořte podtlak Promytí (Pufr AW2) Podtlak Centrifugační metoda: vložte kolonu QIAamp Mini Spin do nové zkumavky WT, přidejte 500 μl AW2 a centrifugujte 1 minutu při plné rychlosti (přibližně 20000 x g nebo 14000 ot./min) Vakuová metoda: přidejte 750 μl AW2 a vytvořte podtlak Vložte kolonu QIAamp Mini Spin do zkumavky WT Eluce Centrifugujte 3 minuty při plné rychlosti (přibližně 20000 x g nebo 14000 ot./min) Vložte kolonu QIAamp Mini Spin do zkumavky ET Přidejte 50 200 μl AE a inkubujte 1 minutu Centrifugujte 1 minutu při 6000 x g Čisté genomová nebo virová DNA Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 7

Dodávané materiály Obsah soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Katalogové č. 61104 Počet stanovení 50* QIAamp Mini Spin QIAamp Mini Spin Columns with Wash Tubes Kolony QIAamp Mini Spin s promývacími zkumavkami (WT) (2 ml) 50 ET VC LT WT Elution Tubes (Eluční zkumavky) (1,5 ml) VacConnectors (Vakuové konektory) Lysis Tubes (Lyzační zkumavky) (1,5 ml) Wash Tubes (Promývací zkumavky) (2 ml) 50 50 50 3 x 50 AL Lysis Buffer (Lyzační pufr) 12 ml AW1 AW2 Wash Buffer 1 (concentrate) (Promývací pufr 1 [koncentrát]) Wash Buffer 2 (concentrate) (Promývací pufr 2 [koncentrát]) 19 ml 13 ml AE Elution Buffer (Eluční pufr) 25 ml PS QP Protease Solvent (Proteázové rozpouštědlo) QIAGEN Protease (Proteáza QIAGEN) 2 ml 1 lahvička CD 1 Příručka 1 * Při automatizovaném zpracování soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit na přístroji QIAcube může přístroj zpracovat méně než 50 vzorků z důvodu mrtvých objemů, odpařování a další spotřeby reagencií automatizovaným pipetováním. Při manuálním použití soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit společnost QIAGEN garantuje pouze 50 stanovení vzorků. 8 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Obsahuje guanidin hydrochlorid. Není kompatibilní s dezinfekčními přípravky obsahujícími bělící prostředky. Další informace získáte na str. 11. Obsahuje azid sodný jako konzervační látku. Rozpouštěcí objem 1,2 ml. Viz "Příprava proteázy QIAGEN" na str. 14. Požadované materiály, které nejsou součástí dodávky Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Více informací naleznete v příslušných bezpečnostních listech (BL), které jsou k dispozici u dodavatele produktu. Pro centrifugační metodu a vakuovou metodu Ethanol (96 100 %) Pipety* a pipetovací špičky (pro zamezení zkřížené kontaminace doporučujeme používat pipetovací špičky s aerosolovými bariérami) Rukavice na jedno použití Termoblok* pro lýzu vzorků při teplotě 56 C (doporučujeme Eppendorf Thermomixer comfort s termoblokem pro 1,5 ml mikrozkumavky ) Mikrocentrifuga* Odměrný válec (50 ml) Třepačka vortex Pouze pro vakuovou metodu Vakuový systém QIAvac 24 Plus (QIAvac 24 Plus, kat. č. 19413, připojovací systém QIAvac, kat. č. 19419, a vakuová pumpa kat. č. 84020) nebo ekvivalentní standardní laboratorní vakuový systém * Pro zajištění správného zpracování vzorků při metodách QIAamp DSP DNA Blood Mini doporučujeme použití nástrojů (tj. pipet a termobloků) kalibrovaných podle doporučení výrobce. Uvedený výčet není úplný a nezahrnuje řadu důležitých materiálů a pomůcek používaných v biologické laboratoři. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 9

Bezpečnostní informace Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní plášť, rukavice na jedno použití a ochranné brýle. Další informace jsou uvedeny v odpovídajících bezpečnostních listech (BL). Bezpečnostní listy k dispozici na internetu v pohodlném a kompaktním formátu PDF na stránkách www.qiagen.com/support/msds.aspx, kde můžete nalézt, zobrazit a vytisknout BL pro každou soupravu QIAGEN a pro každou komponentu těchto souprav. UPOZORNĚNÍ: NEPŘIDÁVEJTE roztoky bělících prostředků nebo kyselin přímo do odpadních materiálů z přípravy vzorků. Lyzační pufr (AL) a promývací pufr 1 (AW1) obsahují guanidin hydrochlorid, který může v kombinaci s bělícími prostředky vytvářet vysoce reaktivní látky. V případě rozlití tekutin obsahujících tyto pufry vyčistěte kontaminované místo vhodným laboratorním detergentem a vodou. Pokud rozlitá tekutina obsahuje potenciálně infekční látky, vyčistěte zasaženou oblast nejprve laboratorním detergentem a vodou a poté 1 % (obj.) roztokem chlornanu sodného. Jestliže jsou lahve s pufrem poškozeny nebo prosakují, použijte při likvidaci těchto lahví rukavice a ochranné brýle, abyste zabránili poškození vlastního zdraví nebo zdraví jiných osob. Společnost QIAGEN netestovala tekutý odpad vzniklý použitím metody QIAamp DSP DNA Blood Mini na přítomnost reziduálních infekčních materiálů. Kontaminace odpadní tekutiny reziduálními infekčními materiály je nepravděpodobná, nelze ji však zcela vyloučit. Tekutý odpad je proto nutné považovat za infekční a je nutné s ním zacházet a likvidovat jej v souladu s místními bezpečnostními předpisy. 10 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Pro komponenty soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit platí následující R-věty a S-věty. Lyzační pufr (AL) a promývací pufr 1 (AW1) Obsahuje guanidin hydrochlorid: zdraví škodlivý, dráždivý. R-věty a S-věty:* R22-36/38, S13-26-36-46. Proteáza QIAGEN (QP) Obsahuje subtilisin: senzibilizátor, dráždivý R-věty a S-věty:* R37/38-41-42, S22-24-26-36/37/39-46. 24hodinová nouzová linka Nouzové zdravotnické informace je možné získat v anglickém, francouzském a německém jazyce 24 hodin denně na telefonním čísle: Poison Information Center Mainz, Německo Tel: +49-6131-19240 * R22: Zdraví škodlivý při požití; R36/38: Dráždí oči a dýchací orgány; R37/38 Dráždí dýchací orgány a kůži; R41: Nebezpečí vážného poškození očí; R42: Může vyvolat senzibilizaci při vdechování; S13: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv; S22: Nevdechujte prach; S24: Zamezte styku s kůží; S26: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc; S36: Používejte vhodný ochranný oděv; S36/37/39: Používejte vhodný ochranný oděv; S46: Při požití okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc a ukažte tento obal nebo označení. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 11

Uchovávání a nakládání s reagenciemi Kolony QIAamp Mini Spin by se měly po doručení uchovávat při teplotě 2 8 C a lze je použít do doby použitelnosti uvedené na krabici soupravy. Všechny pufry se mohou uchovávat při laboratorní teplotě (15 25 C) do doby použitelnosti uvedené na krabici soupravy. Lyofilizovanou proteázu QIAGEN (QP) lze uchovávat při laboratorní teplotě (15 25 C) do doby použitelnosti uvedené na krabici soupravy, aniž by to ovlivnilo účinnost. Rekonstituovaná proteáza QIAGEN je stabilní až 1 rok, pokud se uchovává při teplotě 2 8 C, ale pouze do doby použitelnosti soupravy. Rekonstituovaný promývací pufr 1 (AW1) a rekonstituovaný promývací pufr 2 (AW2) jsou stabilní po dobu 1 roku, pokud jsou uchovávaný při laboratorní teplotě (15 25 C), ale pouze do doby použitelnosti soupravy. Uchovávání a manipulace se vzorky Kryoprecipitáty vznikající při rozmrazování zmrazených vzorků mohou ucpat membránu kolony QIAamp Mini Spin. Pokud jsou patrné kryoprecipitáty, dbejte na to, aby nedošlo k jejich nasátí při nasávání vzorku. Byl prokázán vliv zmrazování a rozmrazování krevních vzorků na purifikaci DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (viz obr. 2). Výtěžek vztažen na čistý vzorek (%) Čerstvý Počet cyklů zmrazování/rozmrazování Obrázek 2. Vliv zmrazování a rozmrazování krevních vzorků. Krev ošetřená EDTA byla zamrazena a rozmražena celkem třikrát, poté byla použita k purifikaci DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Vypočítané výtěžky DNA jsou vztaženy na výtěžek z čistého vzorku (100 %). Každý sloupec grafu představuje výsledky ze 32 opakování (průměr ± směrodatná odchylka). 12 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Množství DNA purifikované metodami QIAamp DSP DNA Blood Mini závisí na obsahu bílých krvinek v jednotlivých krevních vzorcích. Pomocí centrifugační nebo vakuové metody se provádí purifikace genomové DNA ze vzorků krve o objemu 200 μl získaných od zdravých dárců. K odběru vzorků krve pro metody QIAamp DSP DNA Blood Mini (Tabulka 1) je možné použít různé odběrové zkumavky a antikoagulační přípravky. Tabulka 1. Průměrné relativní výtěžky DNA z krevních vzorků odebraných pomocí různých odběrových zkumavek a antikoagulačních přípravků Odběrová zkumavka Výrobce Kat. č. BD Vacutainer 9NC Nominální objem Průměrný výtěžek* BD 366007 9 ml 6,4 µg BD Vacutainer K3E BD 36847 10 ml 6,6 µg BD Vacutainer K2E BD 367864 6 ml 6,4 µg S-Monovette EDTA Sarstedt 02.1066.001 9 ml 6,5 µg S-Monovette CPDA1 Sarstedt 01.1610.001 8,5 ml 6,3 µg Vacuette K3E Greiner Bio- 455036 9 ml 6,5 µg One Vacuette 9NC Greiner Bio-One 454382 2 ml 6,3 µg Genomová DNA byla purifikována z 200 µl krevních vzorků od zdravých dárců (4,0 x 10 6 buněk/ml - 9,0 x 10 6 buněk/ml). * Pro každou odběrovou zkumavku byl stanoven průměrný výtěžek z 11 vzorků měřených ve třech opakováních. Odstranění reziduálních kontaminant Zatímco genomová DNA zůstává vázána na membránu kolony QIAamp Mini Spin, kontaminanty se účinně vymývají nejprve promývacím pufrem 1 (AW1) a poté promývacím pufrem 2 (AW2). Eluce čisté genomové DNA Genomová DNA je eluována z membrány kolony QIAamp Mini Spin pomocí 50 200 μl elučního pufru (AE). Eluovaná DNA je připravena k použití v různých následných testech, včetně řady následných testů pro diagnostické účely in vitro. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 13

Důležité poznámky Důležité body před zahájením protokolu Po obdržení soupravy zkontrolujte, zda nejsou její komponenty poškozeny. V případě poškození blistrových obalů nebo láhví s pufrem kontaktujte oddělení technických služeb QIAGEN nebo místního distributora. V případě rozlití postupujte podle pokynů uvedených v části Bezpečnostní informace (str. 10). Nepoužívejte poškozené komponenty soupravy, protože použití poškozených komponent by mohlo negativně ovlivnit účinnost soupravy. Před každým přenosem kapalných materiálů vyměňte pipetovací špičky. Pro zamezení zkřížené kontaminace doporučujeme použít pipetovací špičky s aerosolovou bariérou. Všechny kroky centrifugace se provádějí při laboratorní teplotě (15 25 C). Používejte vždy rukavice na jedno použití a pravidelně kontrolujte, zde nedošlo k jejich kontaminaci testovaným vzorkem. Pokud dojde ke kontaminaci rukavic, vyhoďte rukavice do odpadu. Pro minimalizaci zkřížené kontaminace neotevírejte více zkumavek současně. Při práci se soupravou nepoužívejte komponenty jiných souprav, pokud nemají stejné číslo šarže. Zamezte mikrobiální kontaminaci reagencií soupravy. Pro zajištění ochrany před potenciálně infekčními materiály doporučujeme pracovat za podmínek laminárního proudění až do lýzy vzorků. Tuto soupravu smí používat pouze personál školený v in vitro laboratorních metodách. Příprava reagencií a pufrů Příprava proteázy QIAGEN Do lahvičky s lyofilizovanou proteázou QIAGEN (QP) přidejte 1,2 ml roztoku proteázového rozpouštědla (PS) a důkladně promíchejte. Pro zamezení tvorby pěny míchejte několikanásobným převrácením lahvičky. Ujistěte se, že je proteáza QIAGEN (QP) zcela rozpuštěná. Nepřidávejte proteázu QIAGEN (QP) přímo do lyzačního pufru (AL). 14 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Příprava promývacího pufru 1 Pomocí odměrného válce přidejte 25 ml ethanolu (96 100 %) do lahve obsahující 19 ml koncentrátu promývacího pufru 1 (AW1). Rozpuštěný promývací pufr 1 (AW1) uchovávejte při laboratorní teplotě (15 25 C). Před zahájením postupu vždy promíchejte rekonstituovaný promývací pufr 1 (AW1) několikanásobným převrácením lahve. Příprava promývacího pufru 2 Pomocí odměrného válce přidejte 30 ml ethanolu (96 100 %) do lahve obsahující 13 ml koncentrátu promývacího pufru 2 (AW2). Rozpuštěný promývací pufr 2 (AW2) uchovávejte při laboratorní teplotě (15 25 C). Před zahájením metody vždy promíchejte rekonstituovaný promývací pufr 2 (AW2) několikanásobným obrácením lahve. Příprava elučního pufru Jedna lahev elučního pufru (AE) je součástí soupravy. Protože je nutné zamezit kontaminaci elučního pufru (AE), doporučujeme k pipetování elučního pufru (AE) z lahve používat pipetovací špičky s aerosolovou bariérou a okamžitě po odpipetování pufru vyměnit uzávěr lahve. Eluční pufr (AE) obsahuje jako konzervační látku azid sodný, který vykazuje absorbanci při 260 nm. Při kvantifikaci DNA v eluátu měřením absorbance při 260 nm, při stanovení čistoty DNA v eluátu měřením absorbance při 260 nm a 280 nm, nebo při skenování absorbance v rozmezí vlnových délek 220 nm až 350 nm proto vždy dbejte na to, aby blank obsahoval stejnou koncentraci azidu sodného jako eluát. Například při přípravě eluátu pro měření absorbance ředěním 50 μl eluátu ve 100 μl vody je nutné připravit blank ředěním 50 μl elučního pufru (AE) ve 100 μl vody. Pro ředění používejte čerstvou destilovanou vodu. Manipulace s kolonami QIAamp Mini Spin Kvůli citlivosti amplifikačních technologií nukleových kyselin jsou následující bezpečnostní opatření nezbytná při manipulaci s kolonami QIAamp Mini Spin, aby nedošlo ke zkřížené kontaminaci během příprav vzorků: Vzorek nebo roztok opatrně vložte do kolony QIAamp Mini Spin. Odpipetujte vzorek do kolony QIAamp Mini Spin, aniž byste navlhčili okraj kolony. Před každým přenosem kapalných materiálů vyměňte pipetovací špičky. Doporučujeme použít pipetovací špičky s aerosolovou bariérou. Nedotýkejte se membrány kolony QIAamp Mini Spin pipetovací špičkou. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 15

Po všech krocích protřepávání na pulzní třepačce mikrocentrifugační zkumavky krátce odstřeďujte, aby se odstranily kapky z vnitřní strany uzávěrů. Otevírejte kolony QIAamp Mini Spin jednu podruhé a dbejte na to, aby nevznikaly aerosoly. Během celého procesu používejte rukavice. V případě kontaktu mezi rukavicemi a vzorkem rukavice okamžitě vyměňte. Eluce genomové DNA Objem DNA eluované z kolony QIAamp Mini Spin může být až o 20 µl nižší než objem elučního pufru (AE) naneseného na kolonu. Objem získaného eluátu závisí na povaze vzorku. Eluční pufr (AE) je nutné před aplikací na kolonu vytemperovat na laboratorní teplotu (15 25 C). Eluovaná DNA se odebírá do elučních zkumavek (ET). V případě skladování DNA po dobu do 4 týdnů doporučujeme uchovávat při teplotě 2 8 C. Pro dlouhodobé skladování doporučujeme uchovávat při teplotě 20 C. Výtěžek a kvalita genomové DNA Výtěžkem a kvalitou je izolovaná genomová DNA vhodná pro všechny typy následných detekčních metod v molekulární diagnostice. Diagnostické testy musí být prováděny podle pokynů výrobce. Nastavení vakuového systému QIAvac 24 Plus Dbejte na správné nastavení kolony QIAamp Mini Spin, vakuového konektoru (VC) a vakuového ventilku (VacValve) (viz obr. 3). Obrázek 3. Sestavení komponent soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit pro vakuové zpracování vzorků. 1. Vakuový ventilek (VacValve) (dodává se s vakuovým systémem) 2. Vakuový konektor (VC) 3. Kolona QIAamp Mini Spin 16 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

V případě použití vakuové metody se systémem QIAvac 24 Plus doporučujeme označit lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolony QIAamp Mini Spin podle schématu na obrázku 4 (viz další strana), aby se zamezilo záměně vzorků. Je možné udělat fotokopii vzorku a označit názvy vzorků. Doporučujeme použít obdobné schéma i v případě použití jiných vakuových systémů nebo centrifugačních metod. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 17

Datum: Uživatel: Pracovní ID číslo: 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Obrázek 4. Schéma značení pro lyzační zkumavky (LT), eluční zkumavky (ET) a kolony QIAamp Mini Spin pro použití s vakuovým systémem QIAvac 24 Plus. 18 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Protokol: Izolace a purifikace genomové DNA z krevních vzorků pomocí vakuového systému Pro izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorku 200 μl plné krve ošetřené EDTA nebo citrátem pomocí vakuového systému, např. QIAvac 24 Plus. Důležité pokyny před zahájením Níže uvedený postup obsahuje pokyny pro zpracování jednoho krevního vzorku. Pomocí vakuového systému QIAvac 24 Plus je však možné zpracovat až 24 vzorků současně. Co je nutné provést před zahájením Vytemperujte krevní vzorky na laboratorní teplotu (15 25 C) a důkladně je promíchejte. Pokud se v lyzačním pufru (AL) vytvořil precipitát, rozpusťte jej inkubací při teplotě 56 C. Promývací roztok 1 (AW1), promývací roztok 2 (AW2) a proteáza QIAGEN (QP) musí být připraveny podle pokynů uvedených v části Příprava reagencií a pufrů na str. 14 a 15. Pro použití v kroku 14 vytemperujte eluční pufr (AE) na laboratorní teplotu (14 25 C). Nastavte termoblok na teplotu 56 C pro použití v kroku 4. Pro zamezení zkřížené kontaminace vložte vakuový konektor (VC) do každého luer adaptéru vakuového systému. Postupy kontroly jakosti ve společnosti QIAGEN popisují funkční testování soupravy před vydáním pro každou jednotlivou šarži soupravy. Nemíchejte proto reagencie z různých šarží, ani nekombinujte jednotlivé reagencie z různých šarží reagencií. Zkontrolujte, zda je nádoba na odpadní materiály vakuového systému prázdná a zda jsou všechny spoje řádně propojeny. Podrobné informace o provozu vakuového systému, zejména informace o údržbě, jsou uvedeny v příručce přiložené k tomuto systému. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 19

Postup 1. Do lyzační zkumavky (LT) napipetujte 20 µl proteázy QIAGEN (QP). Před použitím zkontrolujte datum použitelnosti rekonstituované proteázy. 2. Do lyzační zkumavky (LT) přidejte 200 μl krevního vzorku. 3. Do lyzační zkumavky (LT) přidejte 200 μl lyzačního pufru (AL), uzavřete víčko a míchejte 15 sekund na pulzní třepačce. Pro zajištění účinné lýzy je nezbytné důkladně promíchat vzorek a lyzační pufr, dokud nezískáte homogenní roztok. Vzhledem k vysoké viskozitě lyzačního pufru (AL) dbejte na přidání správného množství lyzačního pufru (AL) pečlivým odpipetováním nebo použitím vhodné pipety. Nepřidávejte proteázu QIAGEN (QP) přímo do lyzačního pufru (AL). 4. Inkubujte po dobu 10 minut (±1 minuta) při teplotě 56 C (±1 C). 5. Centrifugujte lyzační zkumavku (LT) po dobu minimálně 5 sekund při plné rychlosti. Tímto krokem se odstraní kapky z vnitřní strany uzávěru. 6. Do lyzační zkumavky (LT) přidejte 200 μl ethanolu (96 100 %), uzavřete víčko a promíchejte důkladně po dobu minimálně 15 sekund na pulzní třepačce. 7. Centrifugujte lyzační zkumavku (LT) po dobu minimálně 5 sekund při plné rychlosti. Tímto krokem se odstraní kapky z vnitřní strany uzávěru. 8. Kolonu QIAamp Mini Spin vložte do vakuového konektoru (VC) vakuového systému. Ujistěte se, že jsou hlavní vakuový ventilek (mezi vakuovým systémem a vedením) a ventilek se šroubovým uzávěrem (na vakuovém vedení) uzavřené. Zapněte vakuovou pumpu. Promývací zkumavku (WT) (2 ml), ve které je umístěna kolona QIAamp Mini Spin v blistru, vyhoďte do odpadu. Podtlak se použije pouze u spojovacího systému (pokud se použije), nikoli u vakuového vedení. 9. Opatrně naneste celý lyzát z kroku 7 na kolonu QIAamp Mini Spin, aniž by došlo k navlhčení jejího okraje. Nedotýkejte se membrány kolony QIAamp Mini Spin pipetovací špičkou. V případě souběžného zpracování několika vzorků mějte vždy otevřenou pouze jednu lyzační zkumavku (LT). 10. Otevřete hlavní vakuový ventilek. Po průchodu lyzátu přes kolonu QIAamp Mini Spin zavřete hlavní vakuový ventilek a otevřete ventilek 20 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

se šroubovým uzávěrem na vakuovém vedení, aby došlo k odvětrání vedení. Poté, co se podtlak z vedení uvolní, zavřete ventilek se šroubovým uzávěrem. Po uzavření hlavního vakuového ventilku se podtlak se použije pouze u spojovacího systému (pokud se použije), nikoli u vakuového vedení. Ventilek se šroubovým uzávěrem vakuového vedení použijte pro rychlé uvolnění podtlaku. Při souběžném zpracování několika kolon QIAamp Mini Spin doporučujeme po průchodu lyzátu uzavřít vakuový ventilek (VacValve) každé kolony. Tímto postupem se sníží doba potřebná k uskutečnění tohoto kroku. Pokud lyzát neprojde zcela membránou do 10 minut, vložte kolonu QIAamp Mini Spin do čisté promývací zkumavky (WT), uzavřete víčko a centrifugujte při 6000 x g (8000 ot./min) po dobu 3 minut nebo až do úplného průchodu lyzátu. Vložte kolonu QIAamp Mini Spin do další čisté promývací zkumavky (WT) a pokračujte krokem 10 protokolu na str. 24. Pokud lyzát během centrifugace neprojde zcela membránou, vzorek zlikvidujte a opakujte izolaci a purifikaci s novým testovaným vzorkem, počínaje krokem 1 na str. 20. 11. Na kolonu QIAamp Mini Spin naneste 750 μl promývacího pufru 1 (AW1), aniž by došlo k navlhčení okraje kolony. Nedotýkejte se membrány kolony QIAamp Mini Spin pipetovací špičkou. Víčko kolony nechejte otevřené a otevřete hlavní vakuový ventilek. Po průchodu promývacího pufru 1 (AW1) přes kolonu QIAamp Mini Spin zavřete hlavní vakuový ventilek a otevřete ventilek se šroubovým uzávěrem na vakuovém vedení, aby došlo k odvětrání vedení. Poté, co se podtlak z vedení uvolní, zavřete ventilek se šroubovým uzávěrem. 12. Na kolonu QIAamp Mini Spin naneste 750 μl promývacího pufru 2 (AW2), aniž by došlo k navlhčení okraje kolony. Nedotýkejte se membrány kolony QIAamp Mini Spin pipetovací špičkou. Víčko kolony nechejte otevřené a otevřete hlavní vakuový ventilek. Po průchodu promývacího pufru 2 (AW2) přes kolonu QIAamp Mini Spin zavřete hlavní vakuový ventilek a otevřete ventilek se šroubovým uzávěrem na vakuovém vedení, aby došlo k odvětrání vedení. Poté, co se podtlak z vedení uvolní, zavřete ventilek se šroubovým uzávěrem. 13. Zavřete víčko kolony QIAamp Mini Spin, odpojte ji od vakuového systému a vyhod'te vakuový konektor (VC) do odpadu. Vložte kolonu QIAamp Mini Spin do čisté promývací zkumavky (WT) a centrifugujte Píručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 21

při plné rychlosti (přibližně 20000 x g, nebo 14000 ot./min) po dobu 3 minut, aby došlo k úplnému vysušení šambrány. Vynechání této centrifugace, při niž dochází k vysušení kolony, může vést k inhibici následné analýzy. 14. Vložte kolonu QIAamp Mini Spin do čisté eluční zkumavky (ET) a vyhod'te promývací zkumavku (WT) obsahující filtrát do odpadu. Opatrně otevřete víčko kolony QIAamp Mini Spin a naneste 50 až 200 μl elučního pufru (AE) na střed membrány. Uzavřete víčko a inkubujte při laboratorní teplotě (15 25 C) po dobu 1 minuty. Centrifugujte při 6000 x g (8000 ot./min) po dobu 1 minuty, aby došlo k eluci DNA. Po provedení tohoto protokolu proveďte údržbu vakuového systému (pro bližší informace viz příručka dodávaná s vakuovým systémem). 22 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Protokol: Izolace a purifikace genomové DNA z krevních vzorků pomocí mikrocentrifugace Pro izolaci a purifikaci genomové DNA ze vzorku 200 μl plné krve ošetřené EDTA nebo citrátem sodným pomocí mikrocentrifugace. Důležité pokyny před zahájením Níže uvedený postup obsahuje pokyny pro zpracování jednoho krevního vzorku. Souběžně je však možné zpracovat několik krevních vzorků; jejich počet závisí na kapacitě použité mikrocentrifugy. Co je nutné provést před zahájením Vytemperujte krevní vzorky na laboratorní teplotu (15 25 C) a důkladně je promíchejte. Pokud se v lyzačním pufru (AL) vytvořil precipitát, rozpusťte jej inkubací při teplotě 56 C. Promývací roztok 1 (AW1), promývací roztok 2 (AW2) a proteáza QIAGEN (QP) musí být připraveny podle pokynů uvedených v části Příprava reagencií a pufrů na str. 14 a 15. Pro použití v kroku 15 vytemperujte eluční pufr (AE) na laboratorní teplotu (15 25 C). Nastavte termoblok na teplotu 56 C pro použití v kroku 4. Postupy kontroly jakosti ve společnosti QIAGEN popisují funkční testování soupravy před vydáním pro každou jednotlivou šarži soupravy. Nemíchejte proto reagencie z různých šarží, ani nekombinujte jednotlivé reagencie z různých šarží reagencií. Postup 1. Do lyzační zkumavky (LT) napipetujte 20 µl proteázy QIAGEN (QP). Před použitím zkontrolujte datum použitelnosti rekonstituované proteázy. 2. Do lyzační zkumavky (LT) přidejte 200 μl krevního vzorku. 3. Do lyzační zkumavky (LT) přidejte 200 μl lyzačního pufru (AL), uzavřete víčko a míchejte 15 sekund na pulzní třepačce. Pro zajištění účinné lýzy je nezbytné důkladně promíchat vzorek a lyzační pufr (AL), dokud nezískáte homogenní roztok. Vzhledem k vysoké viskozitě lyzačního pufru (AL) dbejte na přidání správného množství lyzačního pufru (AL) pečlivým odpipetováním nebo použitím vhodné pipety. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 23

Nepřidávejte proteázu QIAGEN (QP) přímo do lyzačního pufru (AL). 4. Inkubujte po dobu 10 minut (±1 minuta) při teplotě 56 C (±1 C). 5. Centrifugujte lyzační zkumavku (LT) po dobu minimálně 5 sekund při plné rychlosti. Tímto krokem se odstraní kapky z vnitřní strany uzávěru. 6. Do lyzační zkumavky (LT) přidejte 200 μl ethanolu (96 100 %), uzavřete víčko a promíchejte důkladně po dobu minimálně 15 sekund na pulzní třepačce. 7. Centrifugujte lyzační zkumavku (LT) po dobu minimálně 5 sekund při plné rychlosti. Tímto krokem se odstraní kapky z vnitřní strany uzávěru. 8. Opatrně naneste celý lyzát z kroku 7 na kolonu QIAamp Mini Spin, aniž by došlo k navlhčení jejího okraje. Nedotýkejte se membrány kolony QIAamp Mini Spin pipetovací špičkou. V případě souběžného zpracování několika vzorků mějte vždy otevřenou pouze jednu lyzační zkumavku (LT). 9. Zavřete víčko kolony QIAamp Mini Spin a centrifugujte při 6000 x g přibližně 1 minutu. Vložte kolonu QIAamp Mini Spin do čisté promývací zkumavky (WT) a vyhod'te zkumavku obsahující filtrát do odpadu. Pokud veškerý lyzát neprojde přes membránu po centrifugaci při 6000 x g (8000 ot./min), centrifugujte znovu při plné rychlosti (přibližně 20800 x g) po dobu 1 minuty. Pokud lyzát během centrifugace neprojde zcela membránou, vzorek zlikvidujte a opakujte izolaci a purifikaci s novým testovaným vzorkem, počínaje krokem 1 na str. 23. 10. Opatrně otevřete kolonu QIAamp Mini Spin a přidejte 500 μl promývacího pufru 1 (AW1), aniž by došlo k navlhčení okraje kolony. Nedotýkejte se membrány kolony QIAamp Mini Spin pipetovací špičkou. 11. Zavřete víčko kolony QIAamp Mini Spin a centrifugujte při 6000 x g přibližně 1 minutu. Vložte kolonu QIAamp Mini Spin do čisté promývací zkumavky (WT) a vyhod'te zkumavku obsahující filtrát do odpadu. 12. Opatrné otevřete kolonu QIAamp Mini Spin a přidejte 500 μl promývacího pufru 2 (AW2), aniž by došlo k navlhčení okraje kolony. Nedotýkejte se membrány kolony QIAamp Mini Spin pipetovací špičkou. 13. Zavřete víčko kolony QIAamp Mini Spin a centrifugujte při plné rychlosti (při 20000 x g, nebo 14000 ot./min) přibližně 1 minutu. Vložte 24 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

kolonu QIAamp Mini Spin do čisté promývací zkumavky (WT) a vyhod'te zkumavku obsahující filtrát do odpadu. 14. Centrifugujte při plné rychlosti (přibližně 20000 x g, nebo 14000 ot./min) po dobu 3 minuty, aby došlo k úplnému vysušení membrány. Vynechání této centrifugace, při niž dochází k vysušení kolony, může vést k inhibici následné analýzy. 15. Vložte kolonu QIAamp Mini Spin do čisté eluční zkumavky (ET) a vyhod'te promývací zkumavku (WT) obsahující filtrát do odpadu. Opatrně otevřete víčko kolony QIAamp Mini Spin a naneste 50 až 200 μl elučního pufru (AE) na střed membrány. Uzavřete víčko a inkubujte při laboratorní teplotě (15 25 C) po dobu 1 minuty. Centrifugujte při 6000 x g (8000 ot./min) přibližně po dobu 1 minuty, aby došlo k eluci DNA. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 25

Řízení jakosti V souladu s ISO certifikovaným systémem řízení jakosti společnosti QIAGEN (Quality Management System) je každá šarže soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit podrobena testům předem definovaných parametrů, které zajišťují odpovídající jakost produktů. Omezení Účinnost systému byla stanovena použitím plné krve pro izolaci genomové DNA. Uživatel odpovídá za validaci chování systému v souvislosti s jakýmikoliv postupy použitými v jeho laboratoři, které nejsou zahrnuty do studií chování QIAGEN. Pro minimalizaci rizika negativního dopadu na diagnostické výsledky je zapotřebí používat pro aplikace v dalších stupních analýzy odpovídající kontroly. Pro další validaci se doporučují pokyny Mezinárodní konference o harmonizaci technických požadavků (ICH) uvedené v dokumentu Validace analytických postupů ICH Q2(R1): Text a metodologie (ICH Q2(R1) Validation Of Analytical Procedures: Text And Methodology). Jakékoliv získané diagnostické výsledy se musí interpretovat v kontextu ostatních klinických nebo laboratorních nálezů. Výkonnostní charakteristiky Výtěžek purifikované DNA Lineární rozsah výtěžku DNA získaného pomocí vakuové metody QIAamp DSP DNA Blood Mini byl stanoven pro krev od zdravých dárců s počtem leukocytů 3,8 x 10 6 1,34 x 10 7 buněk/ml (viz obr. 5, str. 27). 26 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Výtěžek (µg/vzorek) Počet leukocytů (x 10 6 buněk/ml) Obr. 5. Lineární rozsah výtěžku DNA získaného pomocí vakuové metody QIAamp DSP DNA Blood Mini DNA z 200 μl elučního objemu. Stanovené počty leukocytů u zdravých dárců se pohybovaly v rozmezí 3,8 x 10 6 1,34 x 10 7 buněk/ml. DNA byla purifikována z krevních vzorků pomocí vakuové metody QIAamp DSP DNA Blood Mini z 200 μl elučního objemu. Bylo zpracováno osmdesát sedm vzorků, každý ve třech opakováních. Výkonnost v následných testech Eluovaná genomická DNA je připravena k použití v různých následných testech včetně řady následných testů pro diagnostické účely in vitro (tabulky 2 6). Byl prokázán vliv elučního objemu a objemu eluátu používaného při PCR na účinnost PCR (viz tabulka 7). Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 27

Tabulka 2. Typizace HLA pomocí soupravy Dynal AllSet + SSP Assays HLA-A Low Resolution, HLA-B Low Resolution, DR Low Resolution a DQ Low Resolution HLA lokus A HLA lokus B HLA lokus DR HLA lokus DQ Genotyp Č. Genotyp Č. Genotyp Č. Genotyp Č. A2/A3 2 B51, B51/ B13 nebo B51/B27 1 DR1/DR3 1 DQ2 1 A3/A1 1 B13/B35 1 DR3 nebo 1 DQ2/DQ3 2 DR3/DR13 A3/A25 1 B8/B27 1 DR3/DR7 1 DQ6 1 A2/A24 2 B7/B13 nebo B7/B15 1 DR7/DR15 2 DQ2/DQ5 1 A1/A2 2 B7/B18 1 DR4/DR15 1 DQ2/DQ5 2 A30/A68 1 B7/B44 1 DR4/DR7 1 DQ3 1 A2/A32 1 Jiné 0 DR4 1 DQ3/DQ6 2 Jiné 0 DR15 1 Jiné 0 DR1/DR7 1 Jiné 0 Od jednotlivých dárců byla odebrána plná krev a z 200 µl plné krve byla purifikována genomická DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Pomocí soupravy Dynal AllSet + SSP Assays (Dynal Biotech) byly identifikovány alely a indikovány lokusy u daného počtu jedinců. Č.: počet jedinců. 28 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Tabulka 3. Faktor genotypizace V Leiden (FV) využívající soupravu LightCycler Factor V Leiden Mutation Detection Kit Genotyp Počet Wildtype 17 FV G16191 A heterozygotní 13 FV G16191 A homozygotní 0 Od 30 jednotlivých dárců byla odebrána plná krev a z 200 µl plné krve byla purifikována genomická DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Alelický stav u lokusu FV G1691 A byl určen pomocí soupravy LightCycler Factor V Leiden Mutation Detection Kit (Roche Group). Tabulka 4. Faktor genotypizace V Leiden (FV) využívající koncový bod PCR a analýzu Pyrosequencing se soupravou PSQ-96 SNP-Reagent Kit u pyrosekvenace PSQ 96MA Genotyp Počet Wildtype 17 FV G16191 A heterozygotní 13 FV G16191 A homozygotní 0 Od 30 jednotlivých dárců byla odebrána plná krev a z 200 µl plné krve byla purifikována genomická DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Alelický stav u lokusu FV G1691 byl určen pomocí koncového bodu PCR a analýzy pyrosekvenace se soupravou PSQ-96 SNP-Reagent Kit u pyrosekvenace PSQ 96MA (Biotage). Píručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 29

Tabulka 5. Protrombinová (PT) genotypizace využívající koncový bod PCR a analýzu pyrosekvenace se soupravou PSQ-96 SNP-Reagent Kit u pyrosekvenace PSQ 96MA Genotyp Počet Wildtype 30 PT G20210A heterozygotní 0 PT G20210A homozygotní 0 Od 30 jednotlivých dárců byla odebrána plná krev a z 200 µl plné krve byla purifikována genomická DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Alelický stav u lokusu PT G20210A byl určen pomocí koncového bodu PCR a analýzy pyrosekvenace se soupravou PSQ-96 SNP-Reagent Kit u pyrosekvenace PSQ 96MA (Biotage). Tabulka 6. Analýza ApoE polymorfizmu T112C a C158T pomocí koncového bodu PCR se sekvenováním amplikonu pomocí soupravy BigDye v1.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit a separace na genetickém analyzátoru ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer Genotyp Počet ApoE*3/*3 5 ApoE*3/*4 5 Jiné 0 Od 10 jednotlivých dárců byla odebrána plná krev a z 200 µl plné krve byla purifikována genomická DNA pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit. Analýza ApoE polymorfizmu T112C a C158T byla provedena pomocí koncového bodu PCR se sekvenováním amplikonu pomocí soupravy BigDye v1.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit a separace na genetickém analyzátoru ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Life Technologies Corporation). 30 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Tabulka 7. Vliv elučního objemu a objemu eluátu používaného při PCR na účinnost PCR Objem eluátu pro 50 μl PCR* Eluční objem 2 µl 5 µl 10 µl 50 µl 100 % 100 % 100 % 100 µl 100 % 100 % 97 % 200 µl 100 % 100 % 100 % * Hodnoty ukazují úspěšnost PCR a představují průměr ze 48 vzorků. Stabilita eluátů Při testech vlivu skladování na eluáty získané pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Mini Kit, tj. soupravy pro běžné laboratorní použití využívající identickou technologii, bylo prokázáno, že DNA eluovaná z kolon QIAamp Mini Spin v pufru AE je stabilní po dobu 8 let, pokud je uchovávána při teplotě buď 5 C nebo 20 C (Obrázek 6). Dlouhodobé studie stability eluátů získaných pomocí soupravy QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit probíhají a dosud nebyly dokončeny. M 2 8 C 20 C M Obrázek 6. Dlouhodobá stabilita DNA izolované a purifikované na kolonách QIAamp Mini Spin. DNA byla purifikována pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Mini Kit, eluována ve 200 μl pufru AE a uchovávána buď při teplotě 2 8 C nebo při 20 C po dobu 8 let. Vzorky DNA byly analyzovány na agarózovém gelu po obarvení ethidium bromidem. M: marker. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 31

Symboly <N> Obsahuje reagencie pro <N> příprav vzorků Použitelné do Prostředky zdravotnické techniky pro in vitro diagnostiku Při doručení Otevřít při převzetí; kolony QIAamp Mini Spin uchovávejte při teplotě 2 8 C Katalogové číslo Číslo šarže Číslo materiálu Komponenty Obsahuje Počet Objem Teplotní rozmezí Výrobce Zapište datum přidání ethanolu do lahve Přidání 32 Píručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Lyofilizováno Rekonstitujte v Ethanol Guanidin hydrochlorid Subtilisin Pokračujte směrem k Viz návod k použití Důležitá poznámka Literatura QIAGEN udržuje rozsáhlou aktuální online databázi vědeckých publikací, které hodnotí produkty QIAGEN. Podrobné volby hledání umožňují nalezení potřebných článků, buďto jednoduchým zadáním klíčových slov nebo upřesněním druhu aplikace, oboru výzkumu, názvu, atd. Úplný seznam literatury naleznete v Referenční databázi QIAGEN, která je dostupná online na adrese www.qiagen.com/refdb/search.asp, případně se obracejte na technické služby QIAGEN či svého lokálního distributora. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 33

Kontaktní informace Společnost QIAGEN se pyšní kvalitou a dostupností technické podpory. V našich odděleních technické podpory pracují zkušení vědci s rozsáhlými praktickými a teoretickými zkušenostmi s technologiemi pro přípravu vzorků a jejich analýzu a s použitím produktů QIAGEN. Pokud budete mít jakékoliv dotazy či narazíte na jakékoliv obtíže v souvislosti se soupravou QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit nebo výrobky QIAGEN obecně, neváhejte a kontaktujte nás. Zákazníci společnosti QIAGEN jsou hlavním zdrojem informací pro pokročilé a specializované použití našich produktů. Tyto informace jsou velmi užitečné pro ostatní vědce i výzkumníky u společnosti QIAGEN. Proto bychom Vás rádi vyzvali k tomu, abyste nás kontaktovali, pokud máte připomínky k účinnosti produktu nebo návrhy pro nové aplikace a techniky. S žádostmi o technickou pomoc a další informace se prosím obracejte na naše centrum technické podpory www.qiagen.com/support, případě zavolejte jedno z oddělení technických služeb QIAGEN či lokální distributory (seznam naleznete na zadní straně nebo na adrese www.qiagen.com). QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D-40724 Hilden, Německo 34 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Informace o způsobu objednávání Produkt Obsah Kat. č. QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (50) Příslušenství Vakuové vedení systému QIAvac 24 Plus* Na 50 stanovení DNA: Kolony QIAamp Mini Spin, vakuové konektory (VC) proteáza QIAGEN, reagencie, pufry a odběrové zkumavky Vakuové vedení pro zpracování kolon 1 24 Spin: Vakuové vedení systému QIAvac 24 Plus, luerové konektory, rychlospojky 61104 19413 Vakuová pumpa* Univerzální vakuová pumpa 84020 Informace o aktuálních licenčních podmínkách a specifických licencích k produktům získáte v odpovídající příručce k produktu QIAGEN. Příručky k produktům QIAGEN jsou dostupné na www.qiagen.com nebo na požádání u technického servisu QIAGEN nebo místního distributora. * Pro použití s vakuovými protokoly. Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012 35

Tato stránka je úmyslně ponechána prázdná 36 Příručka QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit 06/2012

Ochranné známky: QIAGEN, QIAamp, QIAcube, artus, Pyrosequencing (QIAGEN Group); ABI PRISM, BigDye (Life Technologies Corporation); BD, Vacutainer (Becton, Dickinson and Company); Bio-One, Vacuette (Greiner Bio-One); Dynal, AllSet + (Dynal Biotech); Eppendorf (Eppendorf AG); LightCycler (Roche Group); Monovette, Sarstedt (Sarstedt AG & Co.). Registrované názvy, ochranné známky, atd. používané v tomto dokumentu, dokonce ani pokud nejsou jako takové označeny, nelze považovat za nechráněné právními předpisy. Omezené licenční ujednání pro soupravu QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit Použitím produktu vyjadřuje kupující nebo uživatel tohoto produktu souhlas s následujícími podmínkami: 1. Tento produkt může být používán pouze v souladu s protokoly, které jsou součástí produktu a této příručky a pouze pro použití s komponenty obsaženými v soupravě. QIAGEN neuděluje žádnou licenci podle žádného svého práva k duševnímu majetku na používání přiložených komponent této sady s jakýmikoliv komponenty, které nejsou součástí této soupravy, s výjimkami popsanými v protokolech dodávaných s produktem, v této příručce a v dalších protokolech dostupných na adrese www.qiagen.com. Některé z těchto dalších protokolů byly poskytnuty uživateli společnosti QIAGEN dalším uživatelům QIAGEN. Tyto protokoly nebyly společností QIAGEN podrobně testovány ani optimalizovány. Společnost QIAGEN za ně neručí ani neposkytuje záruky za to, že nebudou porušovat práva třetích stran. 2. Mimo výslovně uvedené licence QIAGEN neposkytuje žádnou záruku, že tato souprava a/nebo její použití neporušuje práva třetích stran. 3. Tato souprava a její komponenty jsou licencovány pro jedno použití a nesmí být znovu použity, obnoveny či znovu prodány. 4. QIAGEN zvláště vylučuje odpovědnost za jakékoliv jiné licence, vyjádřené či implikované, než výslovně uvedené. 5. Kupující a uživatel soupravy souhlasí s tím, že nepodnikne nebo nikomu neumožní podniknout kroky, které by mohly vést nebo usnadnit zakázané úkony uvedené výše. QIAGEN může zákazy tohoto Omezeného licenčního ujednání prosadit u každého soudu a vyžadovat úhradu všech vyšetřovacích a soudních poplatků, vč. poplatků za advokáta, v rámci jakéhokoliv postupu k prosazení tohoto Omezeného licenčního ujednání nebo jakýchkoliv jiných práv duševního vlastnictví vztahujících se na tuto soupravu a/nebo její komponenty. Další upřesněné licenční podmínky získáte na stránkách www.qiagen.com. 2012 QIAGEN, všechna práva vyhrazena.

www.qiagen.com www.qiagen.com Australia techservice-au@qiagen.com Austria techservice-at@qiagen.com Belgium techservice-bnl@qiagen.com Brazil suportetecnico.brasil@qiagen.com China techservice-cn@qiagen.com Denmark techservice-nordic@qiagen.com Finland techservice-nordic@qiagen.com France techservice-fr@qiagen.com Germany techservice-de@qiagen.com Hong Kong techservice-hk@qiagen.com India techservice-india@qiagen.com Ireland techservice-uk@qiagen.com Italy techservice-it@qiagen.com Japan techservice-jp@qiagen.com Korea (South) techservice-kr@qiagen.com Luxembourg techservice-bnl@qiagen.com Mexico techservice-mx@qiagen.com The Netherlands techservice-bnl@qiagen.com Norway techservice-nordic@qiagen.com Singapore techservice-sg@qiagen.com Sweden techservice-nordic@qiagen.com Switzerland techservice-ch@qiagen.com UK techservice-uk@qiagen.com 1071108CS 142323133 Sample & Assay Technologies