MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2013 Bc. JANA HULÍKOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Vliv bakteriálních komponent na produkci cytokinů leukocyty mléčné žlázy skotu Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Petr Sláma, Ph.D. Vypracovala: Bc. Jana Hulíková Brno 2013

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma VLIV BAKTERIÁLNÍCH KOMPONENT NA PRODUKCI CYTOKINŮ LEUKOCYTY MLÉČNÉ ŽLÁZY SKOTU vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne podpis.

PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych poděkovat svému vedoucímu diplomové práce Ing. Petru Slámovi, Ph.D., za ochotu, poskytování cenných rad, trpělivost a obrovskou pomoc při zpracování diplomové práce.

ABSTRAKT Cílem této diplomové práce bylo studium prozánětlivých (IL-1β, IFN-γ) a protizánětlivých cytokinů (IL-4, TGFβ1), které jsou produkovány bílými krvinkami mléčné žlázy skotu, a to v in vitro podmínkách. Pokusy byly provedeny na 8 klinicky zdravých jalovicích. Jednalo se o kříženky holštýnského a českého strakatého plemene. Jalovice byly ustájeny ve vazné, stelivové stáji a krmeny standartní krmnou dávkou. Leukocyty získané výplachem mléčné žlázy byly inkubovány 1, 2 a 18 hodin s LPS (lipopolysacharid bakterie Escherichia coli; koncentrace 50 µg/ml) nebo MDP (muramyldipeptid; koncentrace 500 µg/ml) v in vitro prostředí (5 % CO 2 a 37 C). Produkce uvedených cytokinů byla zjišťována metodou ELISA. Byl zvolen LPS jako toxin Gram-negativních bakterií a muramyldipeptid je naopak strukturální jednotkou peptidoglykanu Gram-pozitivních bakterií. Produkce cytokinu IL-1β byla intenzivnější při kokultivaci s LPS než MDP. Při kokultivaci s LPS byla produkce zaznamenána již po 2 hodinách, při použití MDP byla produkce cytokinu zjištěna až po 18 hodinách. Produkce IL-4 byla zaznamenána při všech sledovaných inkubačních dobách u obou bakteriálních komponent. Ale vyšší koncentrace tohoto cytokinu byla naměřena při kokultivaci s LPS. IFN-γ byl produkován až po 18 hodinách kokultivace jak u LPS, tak u MDP. U tohoto cytokinu nebyl zaznamenán statisticky průkazný rozdíl v produkci v závislosti na typ bakteriálního komponentu, avšak byl zaznamenán mírný rozdíl ve prospěch LPS. TGF-β1 byl více produkovaný při kokultivaci s LPS ve všech sledovaných časech. Při kokultivaci s MDP byla po první hodině naměřena nulová hodnota cytokinu a až po 2 hodinách kokultivace byly naměřeny první hodnoty. Klíčová slova: cytokin, mastitida, imunita, zánět, mléčná žláza

ABSTRACT The aim of this thesis was the studies of inflammatory (IL-1β, IFN-γ) and antiinflammatory cytokines (IL-4, IGF-ß1), which are produced by leukocytes of bovine mammary gland. Leukocytes were incubated in vitro. The experiment was conducted on eight clinically healthy heifers. Heifers were crossbred Holstein and Czech Pied. They were in tie stable with bedding and fed standard diet. Leukocytes were obtained by lavage of mammary gland and they were incubated 1, 2 and 18 hours with LPS (lipopolysaccharide Escherichia coli; concentration 50 µg/ml) or MDP (muramyldipeptid; concentration 500 µg/ml) in vitro (5% CO 2 and 37 C). Production of these cytokines were analyzed by ELISA. LPS was chosen as the toxin of Gram-negative bacterias. Muramyldipeptid was a structural unit of the peptidoglycan of Gram-positive bacterias. Production of IL-1β was higher with LPS coculture than with MDP coculture. The coculture with LPS produced cytokines after 2 hours, while using MDP were cytokines produced after 18 hours. Production of IL-4 was detected in all studied incubation times both bacterial components. Higher concentrations of this cytokine was measured in coculture with LPS. IFN-γ was produced after 18 hours of coculture with LPS and with MDP too. For this cytokine wasn t statistically significant difference in the production depending of bacterial component, but there was a minor difference in favor of LPS. TGF-β1 was more produced in coculture with LPS all the times. The coculture with MDP wasn t analyzed cytokine after the first hour and after 2 hours of coculture were measured first value. Keywords: cytokines, mastitis, immunity, inflammation, mammary gland

OBSAH 1 ÚVOD... 9 2 CÍL PRÁCE... 10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 11 3.1 Zánět... 11 3.2 Zánět mléčné žlázy... 15 3.2.1 Diagnostická kategorizace mastitid... 18 3.3 Cytokiny... 20 3.3.1 Interleukin-1 (IL-1)... 22 3.3.2 Interferon-γ (IFN-γ)... 24 3.3.3 Interleukin-4 (IL-4)... 26 3.3.4 Transformační růstový faktor-β (TGF-β)... 28 4 MATERIÁL A METODIKA... 29 4.1 Pokusná zvířata a experimentální zásah... 29 4.2 Odběr vzorků... 29 4.3 ELISA... 30 4.4 Statistické vyhodnocení... 30 5 VÝSLEDKY... 31 5.1 Počet leukocytů... 31 5.2 Diferenciální počet leukocytů... 31 5.3 Produkce IL-1β... 32

5.4 Produkce IL-4... 33 5.5 Produkce IFN-γ... 34 5.6 Produkce TGF-β1... 35 6 DISKUSE... 36 6.1 Počty leukocytů... 36 6.2 Produkce IL-1β... 36 6.3 Produkce IL-4... 37 6.4 Produkce IFN-γ... 37 6.5 Produkce TGF-β1... 38 7 ZÁVĚR... 39 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 41 9 SEZNAM TABULEK... 51 10 SEZNAM ZKRATEK... 52

1 ÚVOD Mléčná žláza skotu je důležitý orgán, který je velice atraktivní pro výzkum, a to hlavně díky svojí funkci produkovat mléko, což je prioritní hlavně v chovech mléčných plemen skotu. Zánět mléčné žlázy patří mezi nejčastější onemocnění u mléčných chovů skotu. Způsobuje obrovské ekonomické ztráty, snižuje produkci, kvalitu, technologickou zpracovatelnost mléka a způsobuje finanční ztráty až 300 na krávu a rok. Po diagnostikování mastitidy následuje léčba antibiotiky, dále pak vyřazení krávy z chovu. Nejdůležitější prevence mastitid je udržování hygienického prostředí ve stáji a hlavně dodržovaní hygienických zásad a postupů při dojení. Důležitou roli v prevenci a léčbě mastitid může hrát imunitní systém. Proto je mléčná žláza podnětem pro zkoumání. Po dostatečném pochopení její patofyziologie může být nalezen způsob, jak zvýšit její odolnost vůči zánětům mléčné žlázy pomocí imunoreakce. Cytokiny mobilizují přirozenou i získanou imunitu a mohou tak předcházet infekci a zlepšovat baktericidní efektivitu použitých antibiotik. Téměř všechny buňky savců cytokiny produkují a jsou nepostradatelné při reakci hostitele na infekci. Uplatnění cytokinů najdeme i v humánní medicíně. Byly použity při léčbě některých virových a nádorových onemocnění, anemií a významně se podílely na rozvoji imunologie. 9

2 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo vypracování literární rešerše na zadané téma, vybrání vhodné metodiky detekce zánětlivých cytokinů, detekce vybraných zánětlivých cytokinů produkovaných leukocyty mléčné žlázy skotu, statistické zpracování získaných výsledků a jejich porovnání s dostupnou literaturou. 10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Zánět Zánět je soubor obranných homeostatických pochodů, jimiž organismus reaguje na porušení své integrity spojené s poškozením buněk. Je to jeden z prvních patofyziologických dějů, které kdy byly popsány. Zánět byl původně považován za patologický děj, což překonalo až tvrzení zdůrazňující obranný charakter tohoto procesu. Je to jeden z nejstarších fylogenetických obranných mechanismů mnohobuněčných živočichů. Při rychlém a účinném průběhu nevyvolává patrné změny. Nepodaří-li se škodlivou látku brzy odstranit, může se stát rozsah změn vyvolaný zánětem klinicky zřetelný a sám zapříčiní tkáňové poškození. Nejčastější příčinou zánětu jsou exogenní nebo endogenní podněty. Mezi exogenní patří například infekce, fyzikální, chemické nebo traumatické poškození tkání. U endogenních podnětů hrají nejvýznamnější roli některé typy imunitních reakcí. Zánětlivé změny a jejich mediátory: zarudnutí (rubor) IL-1, histamin, prostaglandin E 2, NO otok (tumor) histamin, C3a, C5a, bradykinin, PAF, NO, IL-6, IFN-γ teplo (calor) TNF, PAF bolest (dolor) prostaglandin E 2, bradykinin, IL-1 Horečka vyvolaná endogenními pyrogeny (IL-1, TNF-α, IL-6) přes regulační centrum v hypotalamu a prostaglandin E 2 patří také k těmto projevům. Slavný řecký lékař Galenos z Pergamu z 2. století přidal ještě pátý znak - functio laesa, což znamená porucha funkce a regresivní změny parenchymových buněk. Receptory přirozené imunity musí na začátku zánětu rozpoznat škodlivou látku a přenášet dál prozánětové signály. Aktivují prozánětové transkripční faktory a enzymy, 11

z nichž caspáza-1 vytvoří z prekurzorů biologicky aktivní interleukiny (IL-1β, IL-18). Cytokiny a jiné molekuly zánětu jsou připraveny v granulích trombocytů, granulocytů, žírných buněk a v endotelu a jsou připravené k okamžitému uvolnění. Proto se musí zánět neustále tlumit, například kontaktem s endogenní mikroflórou, která o jeden řád přesahuje počet T-buněk hostitele. Až když organismus zjistí poškození vlastních buněk, je zánět amplifikován. Účelem zánětlivé reakce je minimalizace poškození tkání, nespecifická obrana během uvedení specifické imunitní reakce a funkční i strukturální obnova poškozené tkáně. Dochází k tomu díky těmto mechanismům: zvýšený průtok krve (vazodilatace rubor a calor) cévní stěny mají větší propustnost, krevní plazma prochází do místa zánětu (edém tumor), což má za důsledek přísun důležitých látek hrajících roli v obranných mechanismech a snížení hladiny škodlivých látek (exsudace) leukocyty se přesouvají z oběhu na místo poškození (infiltrace) (Toman et al., 2009) Fáze zánětu 1. Akutní cévní reakce Již v prvních sekundách dochází k aktivaci endotelu a dalších buněk. Poškozené žírné buňky jsou významným mediátorem. Z membránových fosfolipidů těchto buněk vznikají vazoaktivní metabolity kyseliny arachidonové (prostaglandiny a leukotrieny) a z jejich granulí se uvolňuje histamin. Zvýšená propustnost cévních stěn a vznik otoku je výsledek těchto metabolických aktivit. 2. Akutní buněčná reakce Objevuje se po několika hodinách při infekcích, těžším či déletrvajícím poškození tkání. Je charakterizována postupem leukocytů (zejména neutrofilů) do centra zánětu. Tato fáze trvá několik hodin až dní. Poškození endotelu je doprovázeno tvorbou fibrinu, někdy i krevními výrony. Podaří li se fibrinový exsudát odstranit zkapalněním a fagocytózou v této fázi zánětu, dojde k regeneraci původní struktury tkáně. 12

3. Chronická buněčná reakce K této fázi dochází, když indukující podnět (infekce) trvá několik dnů. V této fázi se zvyšuje počet lymfocytů a makrofágů. 4. Reparační fáze V této fázi je poškozená nebo zničená tkáň nahrazena méně hodnotnou pojivovou tkání, pokud není noxa odstraněna do několika týdnů. Pokud se nepodaří odstranit vyvolávajícího činitele, může vzniknout granulom, což je opouzdření tohoto činitele buňkami imunitního systému. Klinickému obrazu akutního zánětu odpovídají první dvě fáze, zbylé dvě odpovídají obrazu zánětu chronického. Akutní zánět bývá nespecifická obranná reakce, zatímco zánět chronický bývá spojován s narušením tkání (Toman et al., 2009). Cévní změny zánětu Za normálního stavu zabraňuje cévní výstelka agregaci a degranulaci trombocytů. Jakékoliv poškození endotelu je doprovázeno srážením krve a aktivací komplementu a kininového systému. Dojde-li k uvolněné vazoaktivních látek (histamin, serotonin) z trombocytů, poškozených tkání, rozpadlých buněk, kininového a koagulačního systému a metabolitů kyseliny arachidonové, dochází k zvýšení propustnosti cévní stěny. IL-1 aktivující stresovou osu začne být produkovaný poškozeným endotelem a makrofágy, což navodí stresovou reakci. Endotelové poškození vede i k syntéze PAF z membránového fosfolipidu. Je to faktor aktivující krevní destičky, neutrofily a eozinofily k odpoutání granulí a způsobí snížení krevního tlaku a bronchokonstrikci. Některé cytokiny a adheziny jsou produkovány aktivovaným endotelem a dále rozvíjejí zánět (Toman et al., 2009). 13

Regulace zánětu cytokiny Sekrece některých cytokinů doprovází časné změny při indukci zánětu. V dalších fázích se tyto cytokiny stávají mediátory pozitivní zpětné vazby urychlující rozvoj zánětu, ale také regulátory a inhibitory. TGF β je chemoatraktantem makrofágů a je produkován aktivovanými trombocyty. Cytokiny působí lokálně i systémově a jejich zdrojem jsou aktivované makrofágy. Významné cytokiny zánětu jsou: Endogenní pyrogeny: IL 1, IL 6 a TNF α; odpovídají za většinu lokálních i systémových klinicky patrných změn při zánětlivých onemocněních Induktory proteinů akutní fáze: IL 1, IL 5, IL-6, IL 11, IL 18, LIF (faktor inhibující leukémii), TNF-α, IFN-γ, TGF-β, onkostatin M a ciliární neurotrofní faktor Chemokiny: IL 8, MCP 1 a MIP 1; významné chemotaktické účinky, regulátoři leukocytární aktivace (Toman et al., 2009) Systémová reakce na zánět Pokud jsou lokálně probíhající záněty intenzivní a trvají dostatečně dlouhou dobu, mohou být doprovázeny řadou systémových změn. Mezi nejvýznamnější systémové změny patří horečka, aktivace osy hypofýza nadledvina, leukocytóza, zvýšená tvorba proteinů akutní fáze a solubilních imunokomplexů. Působením prozánětlivých cytokinů bývá vyvoláno nechutenství a úbytek na váze, což je také řazeno k těmto změnám (Toman et al., 2009). 14

Ukončení zánětu K ukončení zánětu dochází po odstranění škodlivé látky a vyčištění prostoru fagocyty. Pokud se zánět nestal chronickým, vstupuje do reparační fáze. Imunitní hyperaktivita je potlačena transformačními růstovými faktory TGF α a TGF β a protizánětovým cytokinem IL 10. Vznik nové tkáně a prorůstání cév do granulační tkáně zajišťují angiogenetické faktory. Za účasti cytokinů IGF, FGF, TGF je nová mezibuněčná hmota syntetizována fibroblasty. Zánět může být ukončen reparací, kolagenní jizvou, fibrózou nebo granulomem. Jestliže vznikne nefunkční fibrózní tkáň, mohou být ohroženy životně důležité orgány a někdy i celý organismus (Toman et al., 2009). 3.2 Zánět mléčné žlázy Mastitidy, nebo-li záněty mléčné žlázy jsou polyfaktorová onemocnění. Podílí se na nich mnoho činitelů z vnějšího prostředí, ale velký vliv má i úroveň obranyschopnosti dojnice. Většina zánětů je způsobena mikrobiálními patogeny. V naprosté většině dochází k zavlečení infekce strukovým kanálkem. Je důležité rozlišit, zda byla infekce zavlečena při dojení, mezi dojeními, nebo při stání na sucho. Z devadesáti procent jsou mastitidy způsobené těmito mikroby: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalastiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis. Dále jsou způsobeny enterokoky a koliformními bakteriemi. Tyto patogeny žijí v dutině ústní, na mulci, v nozdrách, v genitáliích, na kůži struků, ve hnoji, ve vlhké podestýlce a v sekretu mastitidou nemocných žláz (Ryšánek, 2007). Jsou to hromadná onemocnění skotu s vysokým výskytem po celém světě. V důsledku snížení kvality a množství produkce mléka, zvýšení nákladů na veterinární péči, prevenci a živočišný odpad, způsobují obrovské ekonomické ztráty. Technologické vlastnosti mléka a jeho nutriční hodnota se rovněž snižují při onemocnění mastitidou (Oviedo-Boyso et al., 2007; Ryšánek, 2007). 15

Zánět mléčné žlázy je spojen se zvýšením počtu somatických buněk, což jsou z 99 % bílé krvinky. Po proniknutí mikroorganismu do vemene se fagocyty přemístí na místo infekce a snaží se mikroorganismy zabíjet. Činnost fagocytů aktivuje lymfocyty, které produkují protilátky proti mikroorganismům. Produkují také cytokiny, které lákají další buňky do místa zánětu, kde mikroorganismy zabíjejí. Důležitá je prevence vzniku mastitid. Správný postup při dojení, seřízené dojící zařízení, hygiena, prostředí bez stresu, vyvážená krmná dávka, čisté a suché stájové prostředí a pravidelná výměna podestýlky jsou důležité faktory, které mohou omezit vznik mastitid (Kubeková, 2007). Záněty mléčné žlázy jsou onemocnění, která mají největší ekonomický dopad na chovy dojného skotu, snižují produkci mléka o 10-12 %, jeho kvalitu, způsobují znehodnocení mléka, předčasné vyřazování dojnic z chovu a finanční ztráty až 300 na krávu a rok (Haas a Hofírek, 1999). 16

Tab. 1: Kategorizace patogenních mikroorganismů mléčné žlázy skotu Patogeny Kontagiózní Environmentální Zdroj Mléčná žláza Vnější prostředí Hlavní Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae (Streptococcus dysgalactiae) Mycoplasma bovis Vedlejší Koaguláza negativní stafylokoky Corynebacterium bovis (Ryšánek, 2007) Environmentální streptokoky: Streptococcus uberis Streptococcus equinus ( bovis ) (Streptococcus dysgalactiae) Enterococcus spp.: Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus durans Koliformní: Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Enterobacter aerogenes Nekoliformní: Proteus spp. Serratia spp. Yersinia spp. Jiné: Pseudomonas aeroginosa Arcanobacterium pyogenes plísně houby 17

3.2.1 Diagnostická kategorizace mastitid Zdravá mléčná žláza Normální sekrece, kdy má sekret normální chemické složení i fyzikální vlastnosti, nebyl v něm nalezen žádný mikrobiální patogen mléčné žlázy. Počet somatických buněk je pod kritickou hodnotou. Latentní infekce - Sekret má normální chemické složení i fyzikální vlastnosti, ale byl v něm identifikován mikrobiální patogen mléčné žlázy. Počet somatických buněk je pod kritickou hodnotou. Aseptická (nespecifická) mastitida Sekret má změněné chemické složení i fyzikální vlastnosti, nebyl v něm ale diagnostikován mikrobiální patogen mléčné žlázy. Počet somatických buněk dosáhl kritické hodnoty nebo leží nad kritickou hodnotou. Subklinická mastitida - Sekret má změněné chemické složení i fyzikální vlastnosti a byl v něm nalezen mikrobiální patogen mléčné žlázy. Počet somatických buněk dosáhl kritické hodnoty nebo leží nad kritickou hodnotou. Klinická mastitida Sekret je výrazně změněný. Byl zde nalezen mikrobiální patogen a podle jeho druhu se rozlišuje klinická mastitida nespecifická (negativní nález) a klinická mastitida infekční (pozitivní nález). Mléčná žláza vykazuje klinické příznaky zánětu (Ryšánek, 2007). Tab. 2: Limitní hodnoty počtu somatických buněk Vzorek Počet somatických buněk x10 3 /ml 100 200 400 Čtvrťový Zdravá functiolaesa Pravděpodobná Exsudativní infekce proces Individuální Přijatelný stav Má být méně Nepřijatelný než 10% krav stav (Ryšánek, 2007) 18

Druhy vzorků mléka Čtvrťový vzorek z prvních střiků mléka směsný čtvrťový vzorek Individuální Bazénový V jednotlivých druzích vzorků mléka je odlišný počet somatických buněk. Bylo dokázáno, že počet buněk ve frakčních vzorcích mléka odebraných v průběhu dojení se výrazně liší. V prvních střicích je vyšší, pak následně klesá a v dodojkové části a v reziduálním mléce zase výrazně roste. U směsných vzorků se uplatňuje ředící fenomén. Nemůže tedy existovat jedna obecně platná limitní hodnota počtu pro odlišení normálního sekretu, jelikož existují různé limity příslušného druhu vzorku mléka. Metody stanovení počtu somatických buněk Laboratorní přímé - mikroskopické: přímá mikroskopická metoda - elektonické: počítání částic fluorescenční mikroskopie průtoková cytometrie nepřímé - stanovení DNA - viskozimetrie Stájové whiteside test colifornia mastitis test mastitis test-nk direct cell counter (Ryšánek, 2007) 19

3.3 Cytokiny Studie použití cytokinů byla inspirována nedostatečnou účinnosti klasické léčby pro zachování zdraví vemene. Použití rekombinantních cytokinů skotu, jako jsou IL-2, IFN a TNF-α, ve zdravé mléčné žláze mobilizuje přirozenou a získanou imunitu. Stimulovaná imunita nemůže předcházet infekci, ani ji zcela vymýtit, obzvlášť u mastitid způsobených bakteriemi Staphylococcus aureus. Baktericidní efektivita použitých antibiotik je zlepšována použitím sítí cytokinů. I jen malé změny v cytokinové síti u zdravé a u mastitidou nakažené mléčné žlázy, podněcuje užití cytokinů v diagnóze a prognóze zdraví vemene. Mnohé studie podporují tuto myšlenku a pozorování cytokinů se může stát velice důležité pro alternativní management zdraví mléčné žlázy. Použití cytokinů v imunoterapii, v diagnóze a prognóze mastitid poroste se znalostmi cytokinové sítě v mléčné žláze skotu a budou vyvinuty efektivní technologie diagnostiky cytokinů (Alluwaimi, 2004). Cytokiny jsou malé proteiny, které zprostředkovávají mezibuněčnou komunikaci signálů v hematopoéze, stresu, zánětu, imunitě a při hojení tkání (Rouveix, 1997; Wood a Rothel, 1997; Belardelli a Ferrantini, 2002). Identifikace velkého množství cytokinů a objevení jejich patofyziologického mechanismu otevřelo nové možnosti v diagnóze a terapii. Terapeutické strategie jsou představovány ve využití klinicko-patologických rolí cytokinů v lidských onemocněních: zastavení produkce cytokinů stimulace a znemožnění přenosu přemístění cytokinů z oběhu zabránění připojení cytokinů k receptorům zabraňování signalizačním mechanismům (Gheezzi, 1997) 20

Mléčná žláza skotu je velice důležitý orgán pro produktivitu chovu skotu mléčných plemen, proto je i velice atraktivní pro výzkum. Některé cytokiny nalezneme i ve zdravém vemeni, avšak jejich biologická aktivita zůstala dlouho neobjevena (Leutenegger et al., 2000; Alluwaimi a Cullor, 2002). Výzkum patofyziologické role cytokinů u koliformních mastitid a u mastitid způsobených bakteriemi Staphylococcus aureus je již prováděn poměrně dlouhou dobu (Sordillo et al., 1997) a rekombinantní cytokiny jsou používány za účelem zvýšení rezistence nebo zlepšení imunitního systému mléčné žlázy nakažené bakteriemi Escherichia coli nebo Staphylococcus aureus (Daley et al., 1991b; Kehrli et al., 1991a, b; Quiroga et al., 1993a, b; Sanchez et al., 1994; Pighetti a Sordillo, 1996; Erskine et al., 1998). Stále zůstává nedoceněna pozice cytokinů jako nástrojů pro alternativní metody diagnózy a léčby mastitid. Cytokiny jsou rozpustné proteiny, které mají vliv na řadu biologických procesů, týkajících se zánětů a imunity. Téměř všechny buňky savců produkují cytokiny (Dinarello, 2007). Většina cytokinů je vylučována, ale některé mohou být vázány na buněčnou membránu. Většina z nich je polyfunkční (Taniguchi, 1995). Protože jsou si jejich receptory podobné, je jejich účinek velice silný a mohou vyvolat biologické reakce již v malých koncentracích (Wahl et al., 1988; Hall et al., 1989). Jsou nepostradatelné při reakci hostitele na infekci, ale mohou mít na svého hostitele i vliv škodlivý. Musí tedy být správná bilance mezi pozitivními a negativními účinky cytokinů na hostitele. Je to dáno délkou, množstvím a lokalizací jejich účinku (Bennerman, 2009). Jsou to velice účinné krátkověké faktory, které modulují aktivitu buněk. Bez nějakého podnětu jsou produkovány jen ve velice malých koncentracích, tvorba těchto látek je časově a místně regulována. Ale díky vazebným membránovým receptorům předávají svůj signál již v pikomolárních koncentracích. Signál cytokinů vede ke změně genové exprese u cílových buněk. Výsledek jejich aktivity závisí na synergii nebo antagonismu s účinkem ostatních cytokinů a regulačních faktorů. V průběhu času mají v jedné cílové buňce více různých aktivit nebo i více různých cytokinů zajišťuje jednu stejnou aktivitu. 21

Cytokiny patří do heterologní skupiny, která obsahuje stovky nízkomolekulárních proteinů. Jejich molekulová hmotnost je většinou do 30 kilodaltonů (kda). Většina cytokinů byla popsána v posledních dvaceti letech, což byl velký převrat ve zjištění, jakým způsobem jsou regulovány vývoj a funkce imunitního systému. První cytokin, který kdy byl popsán, byl v roce 1957 interferon. V roce 1979 se k němu přidal další cytokin interleukin-1. Dnes už je popsáno mnoho desítek cytokinů, ale celá tato cytokinová síť ještě není zdaleka prozkoumána. Velice se uplatnily i v humánní medicíně. První cytokiny byly označovány jako produkty lymfocytů lymfokiny. Avšak později se ukázalo, že mnoho cytokinů je produkováno více buněčnými typy, a proto bylo od těchto názvů upuštěno. Každý cytokin se váže na specifický receptor, jehož exprese je na membráně buněk přesně regulována. Mimo těchto receptorů existují i receptory rozpustné, které slouží pouze k přenosu, nikoliv k příjmu cytokinového signálu. Cytokiny se na své receptory váží s vysokou afinitou. Tyto receptory jsou složeny z více proteinových řetězců, přičemž některé podjednotky jsou společné a mají konzervativní strukturu (Toman et al., 2009). 3.3.1 Interleukin-1 (IL-1) Pomocí metody PCR byl ve zdravé mléčné žláze nalezen IL-1α a IL-1β (Ito a Kodama, 1996; Okada et al., 1997). IL-1 je zásadní v zánětlivém procesu mléčné žlázy, a to jak při přirozené, tak při experimentální koliformní mastitidě v epiteliálních buňkách (Shuster a Kehrli, 1995; Persson Waller, 1997; Okada et al., 1999; Riollet et al., 2000b; Persson Waller et al., 2003). Při infekci způsobené bakteriemi Escherichia coli dochází k výraznému vzestupu koncentrace IL-1 spojovanému s přítokem neutrofilů (Shuster a Kehrli, 1995; Shuster et al., 1995, 1997; Riollet et al., 2000b). Při srovnání odpovědi monocytů a mléčných makrofágů na stimulaci lipopolysacharidy má IL-1 hlubší vztah k monocytům než k makrofágům mléka. Limitovaná sekrece IL-1 v mléce má vliv na výkonnost aktivace lymfocytů (Politis et al., 1991). Příspěvek IL-1 v odpovědi při mastitidách 22

způsobených bakteriemi Staphylococcus aureus je zanedbatelný nebo přechodný, což znamená, že u těchto typů mastitid hraje minoritní roli (Riollet et al., 2000b, c, 2001). V raném stádiu stání na sucho ve zdravé mléčné žláze byla zaznamenána pomocná aktivita IL-1 (Nickerson et al., 1993). Když se do takovéto mléčné žlázy přidal IL-1, zvýšila se značně tělesná teplota, což bylo způsobeno nárůstem velkého množství somatických buněk. Nicméně zlepšení involučního procesu v oblastech aplikovaného IL-1 je méně výrazné (Nickerson et al., 1993). Ačkoli IL-1 přitahuje výrazné množství neutrofilů do vemene, imunitní modulace IL-1 má velice malou funkci (Nickerson et al., 1993). U koliformních mastitid jsou imunoterapeutické vlastnosti IL-1 maskovány dominující prozánětlivou vlastností IL-1. U koliformních mastitid je důležitým prognostickým kritériem. IL-1 a ostatní prozánětlivé cytokiny zprostředkovávají příznaky akutního septického šoku (Shuster et al., 1993; Shuster a Kehrli, 1995; Ohtsuka et al., 2001). Z tohoto důvodu je důležité sledování hladiny IL-1. Může to být velice užitečné k určení stádia koliformní mastitidy. IL-1 slouží i jako vhodná léčba při mastitidách způsobených bakteriemi Staphylococcus aureus (Daley et al., 1991b, 1993; Sanchez et al., 1994). Infuze IL-1β do mléčné žlázy chronicky infikované bakteriemi Staphylococcus aureus zlepšuje influx neutrofilů a způsobí zvýšený odtok kyslíku, ale na fagocyty nemá vliv. Léčba infikované mléčné žlázy pomocí IL-1β rozšiřuje vnitrobuněčnou potenci určitých antibiotik, ale ne v takové míře, aby tím bylo předcházeno opakování infekce (Daley et al., 1991b, 1993). Studium funkce antagonistických receptorů IL-1 u koliformní mastitidy slibuje zajímavý terapeutický a diagnostický potenciál (Shuster a Kehrli, 1995; Persson Waller, 1997; Yamanaka et al., 2000). IL-1ra (receptor antagonist) ruší bioaktivitu IL-1 při endotoxinové mastitidě, ale má jednoduchý vliv na fáze mastitidy a na mamární zánět (Shuster a Kehrli, 1995). Účinnost IL-1ra na bioaktivitu IL-1 je větší, když je IL-1ra aplikován před interakcí receptorů IL-1ra/IL-1 (Persson Waller, 1997). 23

V prevenci endotoxiny vyvolané akumulace neutrofilů nemá IL-1ra pozitivní účinek. Když je podán zároveň s rekombinantním IL-1, může vyvolat výraznou inhibici neutrofilů (Persson Waller, 1997). Proto má IL-1 v mastitidách vyvolaných endotoxiny buď jen roli okrajovou, nebo efektivita IL-1ra závisí na jeho přítomnosti před naakumulováním IL-1 (Shuster a Kehrli, 1995). Jako velice užitečný nástroj pro detekci Gram-negativních mastitid a monitoring efektivity léčby se jeví vývoj diagnostiky bovinního IL-ra metodou ELISA. (Yamanaka et al., 2000). 3.3.2 Interferon-γ (IFN-γ) IFN-γ skotu byl detekován v normální mléčné žláze metodou RT-PCR (Ito a Kodama, 1996; Alluwaimi, 2000). Ačkoli není výrazné zvýšení transkripce mrna IFN-γ, je mezi její transkripcí v pozdní laktaci a expresí IL-12 v normální mléčné žláze významný vztah (Alluwaimi a Cullor, 2002). mrna IFN-γ je také detekovatelná v buňkách mastitidní žlázy (Taylor et al., 1997), ale Persson Waller et al. (2003) tvrdí, že koncentrace IFN-γ je pod hranicí odhalení testy ELISA. Stafylokokové enterotoxiny stimulují syntézu IFN-γ a dalších cytokinů. Předpokládá se, že buňky CD8 + a CD4 + T uvolňují velké množství IFN-γ díky superantigenové aktivitě těchto enterotoxinů (Yokomizo et al., 1995). Ovšem u experimentálně vyvolané mastitidy způsobené bakteriemi Staphylococcus aureus se transkripční aktivita IFN-γ signifikantně nemění (Alluwaimi et al., 2003a). Znalosti o biologické aktivitě IFN-γ v mléčné žláze skotu jsou především odvozeny od pomocné aktivity rekombinantního bovinního interferonu-γ (rboifn-γ) ve zdravé a infikované mléčné žláze. Infuze rboifn-γ do zdravé mléčné žlázy má velký vliv na mobilizaci specifické imunitní odpovědi, hlavně na aktivaci T buněk a produkci IL-2. Závažnost zvýšení klonální a antigenní specifické paměti buněk se navíc značně zvýší (Pighetti a Sordillo, 1996). IFN-γ je proti ostatním zánětlivým cytosinům důležitým zprostředkovatelem aktivace rekrutovaných neutrofilů a zvýšení jejich fagocytózy (Riollet et al., 2000a; Wedlock et al., 2000). Neutrofily stimulované in vitro pomocí rboifn-γ vykazovaly 24

zvýšené usmrcování bakteriemi Staphylococcus aureus, zatímco in vivo aktivace nevykazuje signifikantní efekt v baktericidní aktivitě neutrofilů (Wedlock et al., 2000). Také bylo zjištěno, že experimentálně vyvolaná mastitida bakteriemi Staphylococcus aureus oslabuje transkripční aktivitu IFN-γ (Alluwaimi et al., 2003a). Na druhou stranu je při koliformní mastitidě hladina IFN-γ výrazně zvýšena po celou dobu trvání infekce a IFN-γ se nachází v syrovátce a v séru nakažených zvířat (Hisaeda et al., 2001). Byl veden výzkum o imunoprofylaktických vlastnostech IFN-γ ve zdravé bovinní mléčné žláze (Sordillo a Babiuk, 1991a; Pighetti a Sordillo, 1996). Infikované oblasti vykazovaly širokou a významnou modulaci imunitní odpovědi. Rekombinantní rboifn-γ stimuluje a podporuje aktivaci lymfocytů a klonální expanzi. Aktivované lymfocyty vykazují vysokou afinitu IL-2 receptorů a molekulární adhezi, podobně jako lymfocyty funkčně spojené s antigenem-1 (LFA-1). Rekombinantní rboifn-γ také ukazuje výraznou modulaci pohybu lymfocytů, což značně zlepšuje sekundární imunitní odpověď. Proto je role rboifn-γ v modulaci a zpomalení zánětlivé odpovědi jednoznačná. Exprese a regulace adheze molekul nebo leukocytů a endoteliálních buněk odráží důležitost IFN-γ v pohybu leukocytů. U dojnic zvyšují cytokiny specifickou imunitní reakci zvýšením titru protilátek v mléce a séru (Pighetti a Sordillo, 1996). Rekombinantní rboifn-γ také pozitivně ovlivňuje neutrofily získané z mléčné žlázy v období před porodem (Sordillo a Babiuk, 1991a). Toto období je spojováno s evidentním potlačením imunitní reakce v mléčné žláze. Jeden z několika za toto odpovědných faktorů je zvýšení glukokortikoidů, důležitého stimulátoru tvorby mléka, který má výrazný imunosupresivní efekt (Guidry et al., 1976). Použití BoIFN-γ k ošetření namáhaných neutrofilů, které trpí oslabením bakteriální fagocytózy, jejich bakteriální fagocytózu zvýší (Sordillo a Babiuk, 1991a). Imunoterapie IFN-γ u koliformní mastitidy a mastitidy způsobené bakteriemi Staphylococcus aureus se může srovnávat s léčbou IL-2 (Sordillo a Babiuk, 1991b; Quiroga et al., 1993a, b). Ošetřením oblastí experimentálně nakažených bakteriemi Escherichia coli pomocí rekombinantního BoIFN-γ klesá závažnost infekce při omezení bakteriálního růstu a oslabení zánětlivé odpovědi inhibicí endogenních zánětlivých mediátorů, speciálního TNF-α v infikovaných oblastech (Sordillo a Babiuk, 1991a; Sordillo a Peel, 1992; Moore, 1996). 25

Výsledky ošetření oblastí infikovaných bakteriemi Staphylococcus aureus pomocí rboifn-γ byly méně příznivé, průběh onemocnění v infikované oblasti se téměř nezměnil. Ačkoli léčba pomocí rboifn-γ omezila výskyt MHC třídy II a vyvolala tvorbu protilátek, již probíhající infekce nemohla být zastavena zvýšením imunity (Alluwaimi, 2004). 3.3.3 Interleukin-4 (IL-4) Interleukin-4 je cytokin který reguluje mnohé biologické funkce. Může ovlivňovat proliferaci, diferenciaci a programovanou buněčnou smrt (apoptózu) několika typů buněk hematopoetického i nehematopoetického původu. Má rozhodující funkci v regulaci diferenciace buněk Th0 při imunitní odpovědi a IL-4 řídí i většinu odpovědí buněk Th2 proti parazitické infekci. Signální mechanismy IL-4 jsou zodpovědné za vývoj chorob způsobených poruchou imunity, včetně alergie, autoimunitních chorob a rakoviny. Četné důkazy naznačují, že IL-4 a buňky Th2 mohou vyvolávat astma. Buněčná odpověď na IL-4 je zprostředkována komplexem povrchových buněčných receptorů vyjádřených u většiny typů buněk. Tento receptor vzniká z řetězce IL-4Rα a běžného řetězce γ (γc). Řetězec γc může být nahrazen řetězcem IL-13Rα1 formující řetězec typu II. Receptor typu II je také receptor pro IL-13, cytokin, který sdílí s IL-4 četné biologické funkce. Navázání IL-4 na jeho receptor vyvolá aktivaci JAK tyrosinkinázy, což způsobuje fosforylaci některých intracelulárních proteinů. Mezi nimi hraje hlavní roli v signalizaci IL-4 transkripční faktor STAT 6. Důležitost STAT 6 se odráží ve skutečnosti, že nedostatek tohoto transkripčního faktoru a IL-4Rα vykazuje u myší podobný fenotyp. Navíc je role IL-4 při onemocnění značně ovlivňována aktivací STAT 6. Zdůrazníme-li důležitost těchto proteinů u alergie, autoimunitních chorob a rakoviny, molekulární mechanismy zahrnují aktivaci STAT 6 interleukinem IL-4, což může být dobrou cestou pro vytvoření nových možností léčby těchto nemocí. 26

IL-4 je cytokin, který se účastní regulace imunitního systému na několika úrovních. IL-4 je faktor zajišťující růst a další přežívání lymfocytů. Ačkoliv byl zjištěn u diferenciace B buněk a stimulačního faktoru, jeho role v regulaci diferenciace T buněk je během imunitní odpovědi kritická. Po výzvě antigenu se stávající T buňky diferencují na buňky Th1 nebo Th2. Mechanismy zahrnuté v tomto procesu jsou závislé na cytokinech. IL-4 hraje hlavní roli v podpoře diferenciace buněk Th2, kdežto diferenciaci buněk Th1 inhibuje. IL-4 je také schopný chránit lymfocyty před apoptózou, ale není schopen podporovat proliferaci malých stávajících lymfocytů bez současného stimulačního signálu podmíněného obsazením receptoru antigenem. Účinky IL-4 nejsou omezeny na lymfoidní buňky, takže IL-4 může regulovat proliferaci, diferenciaci a apoptózu několika buněčných typů ať krvetvorného nebo nekrvetvorného původu včetně myeloidů, žírných buněk, dendrických, endoteliálních, svalových a nervových buněk. Pleiotropní účinek IL-4 prozrazuje důležitou roli, kterou cytokin hraje během imunitní odpovědi. Ze stejného důvodu může mít za následek imunitní chorobu anomální regulace cytokinem IL-4. Řízená diferenciace buněk Th2 interleukinem IL-4 je zásadním krokem během imunitní odpovědi proti parazitické infekci. To je demonstrováno závažností helmintické infekce u myší, kterým chybí receptor IL-4 a STAT 6. Na druhou stranu se IL-4 a jeho signální mechanismy mohou podílet na vývoji alergických a autoimunitních chorob. To bylo jasně dokázáno na zvířecím modelu, kdy alergické astma je nemoc závislá na Th2 a produkci Th2 cytokinů, hlavně IL-4 a IL-13, cytokinu, který sdílí receptory s IL-4. Na rozdíl od alergických chorob se vědci domnívají, že autoimunitní choroby jsou závislé na Th1 a monocytických cytokinech. IL-4 proto může působit jako protizánětlivý cytokin u těchto nemocí jako třeba jeho protektivní účinek u myšího modelu revmatoidní artritidy a diabetu. Proto IL-4 můžeme považovat za cíl u léčby alergických reakcí a za možný nástroj u léčby autoimunitních chorob. Účinek IL-4 u rakoviny je komplexnější. Zjistilo se, že může být účinný při léčbě experimentálních glioblastomových nádorů, ale může také udržovat progresi nádorů. Signální mechanismus IL-4 může podporovat resistenci na protitumorózní léčbu, pravděpodobně svou antiapoptolickou funkcí. Tyto argumenty jasně ukazují na důležitost IL-4 v progresi některých onemocnění. 27

Proto by mělo být v našem zájmu určit molekulární mechanismy týkající se buněčné odpovědi na IL-4, což se může stát cennou informací pro vytvoření nových léčebných postupů u již zmíněných nemocí (Zamorano, 2003). 3.3.4 Transformační růstový faktor-β (TGF-β) Transformační růstový faktor-β se vyskytuje minimálně ve třech formách a to TGF-β1, TGF-β2 a TGF-β3. Všechny tyto formy se vážou na shodný receptor, který má vysokou vazebnou aktivitu a je exprimován na mnoha buňkách v různém počtu. Produkují ho různé buňky, včetně aktivovaných T lymfocytů a makrofágů. TGF-β působí i jako negativní regulátor imunity a hematopoézy. Pro fibroblasty je růstovým faktorem, podporuje tudíž i hojení ran (Oppenheim et al., 1994). Lokálně působí protizánětlivě a brání produkci dalších cytokinů (Ferenčík et al., 2004). TGF-β1 je důležitý auto-parakrinní regulátor mléčné žlázy během jejího vzniku. Nebyl prokázán jeho apoptotický a inhibiční vliv na růst epiteliálních buněk mléčné žlázy (Kolek et al., 2003). V laktující mléčné žláze i v období mimo laktaci byla hybridizací in situ zjištěna genová exprese TGF-β1, TGF-β2 a TGF-β3 (Maier et al., 1991). Hlavními faktory růstu v mlezivu jsou TGF-β1 a TGF-β2, jejichž koncentrace byla naměřena pomocí ELISA testu (Ginjala a Pakkanen, 1998; Pakkanen, 1998). 32 hodin po stimulaci Escherichia coli, byly zjištěny v mléce infikovaných čtvrtí zvýšené koncentrace TGF-β1 a TGF-β2 (Chockalingam et al., 2005). 40 hodin po infuzi infekce Staphylococcus aureus do mléčné žlázy, byla opět zjištěna zvýšená produkce TGF-β1 a TGF-β2. Díky tomuto zjištění by se mohli TGF-β1 a TGF-β2 uplatnit pří získávání vrozené imunitní odpovědi mléčné žlázy na infekci Staphylococcus aureus (Bannerman et al., 2006). 28

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Pokusná zvířata a experimentální zásah Experimenty byly zaměřeny na analýzu prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů, a to IL-1β, IL-4, IFN-γ a TGF-β1. Detekce uvedených cytokinů byla provedena metodou ELISA. Pokusy byly provedeny na 8 klinicky zdravých jalovicích. Jednalo se o kříženky holštýnského a českého strakatého plemene. Jalovice byly ustájeny ve vazné, stelivové stáji a krmeny standardní krmnou dávkou. Leukocyty získané výplachem mléčné žlázy byly inkubovány 1, 2 a 18 hodin s LPS (lipopolysacharid bakterie Escherichia coli; koncentrace 50 µg/ml) nebo MDP (muramyldipeptid; koncentrace 500 µg/ml) v in vitro prostředí (5 % CO 2 a 37 C). Produkce uvedených cytokinů byla zjišťována sendvičovou metodou ELISA. Do pokusů byly vybrány 2 prozánětlivé (IL-1β a IFN-γ) a 2 protizánětlivé cytokiny (IL-4 a TGF-β1). LPS byl zvolen jako toxin Gram-negativních bakterií a muramyldipeptid je naopak strukturální jednotkou peptidoglykanu Gram-pozitivních bakterií. 4.2 Odběr vzorků Buňky mléčné žlázy byly získány tzv. laváží (výplachem) 24 hodin po stimulaci mléčné žlázy fyziologickým roztokem (PBS). Pro stimulaci i následný výplach (odběr) bylo použito 20 ml PBS. Takto získané leukocyty byly adjustovány na 5 x 10 6 /ml v mediu (RPMI). Počet buněk byl zjišťován pomocí Bűrkerovy komůrky, a to ve 20 velkých čtvercích. Byly vytvořeny nátěry těchto buněk na podložní sklo. Nátěry byly obarveny panoptickým barvením podle Pappenheima. Byl stanoven diferenciální počet leukocytů analýzou minimálně 200 leukocytů na jednom skle. 29

4.3 ELISA Pro stanovení koncentrace zvolených cytokinů bylo použito komerčně dostupných kitů: Bovine IL-1 beta ScreeningSset (Genetica, s.r.o.) BovineIFN-γ Screening Set (Genetica, s.r.o.) Bovine IL-4 Screening Set (Genetica, s.r.o.) Human/Mouse TGFbeta1 ELISA Ready-SET-Go! Kit (Exbio Praha, a.s.) 4.4 Statistické vyhodnocení Absolutní počty leukocytů, procentické zastoupení leukocytů a koncentrace cytokinů byly prezentovány aritmetickým průměrem a směrodatnou odchylkou. Statistické rozdíly byly testovány párovým t-testem. Data byla zpracována programem STATISTICA 8.0 (StatSoft ČR, s.r.o.). 30

5 VÝSLEDKY Tato práce je zaměřena na detekci cytokinů IL-1β, IL-4, IFN-γ a TGF-β1, které byly produkovány bílými krvinkami mléčné žlázy skotu v in vitro podmínkách po inkubaci s lipopolysacharidem (LPS) a muramyldipeptidem (MDP). Navíc byl zjišťován absolutní a diferenciální počet bílých krvinek. Experimenty byly provedeny na 8 jalovicích. 5.1 Počet leukocytů Absolutní počty leukocytů byly analyzovány v Bűrkerově komůrce. Ve výplachu mléčné žlázy 24 hodin po stimulaci pomocí PBS bylo zjištěno 2,5 x 10 9 /l (± 0,35) leukocytů. 5.2 Diferenciální počet leukocytů Diferenciální počet leukocytů byl zjišťován světelnou mikroskopii při počítání minimálně 200 leukocytů. Tab. 3: Diferenciální počet leukocytů mléčné žlázy (výplach 24 hodin po stimulaci PBS) Leukocyty Průměr (%) Směrodatná odchylka Lymfocyty 62,45 5,77 Neutrofily 31,23 3,15 Monocyty 4,12 0,45 Eozinofily 2,20 0,28 31

5.3 Produkce IL-1β Produkce IL-1β byla stanovena u mamárních leukocytů po inkubaci 1, 2 a 18 hodin s LPS a MDP in vitro. Tab. 4: Koncentrace IL-1β po inkubaci leukocytů mléčné žlázy s LPS a MDP (inkubace 1, 2 a 18 hodin) Bakteriální Inkubace Průměr Směrodatná komponent (hodiny) (pg/ml) odchylka 1 0 - LPS 2 223,95 35,12 18 837,20 78,23 1 0 - MDP 2 0-18 653,22 39,91 32

5.4 Produkce IL-4 Produkce IL-4 byla stanovena u mamárních leukocytů po inkubaci 1, 2 a 18 hodin s LPS a MDP in vitro. Tab. 5: Koncentrace IL-4 po inkubaci leukocytů mléčné žlázy s LPS a MDP (inkubace 1, 2 a 18 hodin) Bakteriální Inkubace Průměr Směrodatná komponent (hodiny) (pg/ml) odchylka 1 543,78 45,02 LPS 2 700,54 71,01 18 1865,87 123,25 1 432,33 37,89 MDP 2 649,02 44,41 18 1299,07 82,45 33

5.5 Produkce IFN-γ Produkce IFN-γ byla stanovena u mamárních leukocytů po inkubaci 1, 2 a 18 hodin s LPS a MDP in vitro. Tab. 6: Koncentrace IFN-γ po inkubaci leukocytů mléčné žlázy s LPS a MDP (inkubace 1, 2 a 18 hodin) Bakteriální Inkubace Průměr Směrodatná komponent (hodiny) (pg/ml) odchylka 1 0 - LPS 2 0-18 345,67 31,87 1 0 - MDP 2 0-18 305,21 38,89 34

5.6 Produkce TGF-β1 Produkce TGF-β1 byla stanovena u mamárních leukocytů po inkubaci 1, 2 a 18 hodin s LPS a MDP in vitro. Tab. 7: Koncentrace TGF-β1 po inkubaci leukocytů mléčné žlázy s LPS a MDP (inkubace 1, 2 a 18 hodin) Bakteriální Inkubace Průměr Směrodatná komponent (hodiny) (pg/ml) odchylka 1 184,82 32,11 LPS 2 1337,06 158,21 18 4223,58 342,77 1 0 - MDP 2 899,00 87,82 18 2167,78 101,65 35

6 DISKUSE Cílem této diplomové práce bylo studium prozánětlivých (IL-1β, IFN-γ) a protizánětlivých cytokinů (IL-4, TGF-β1), které jsou produkovány bílými krvinkami mléčné žlázy skotu, a to v in vitro podmínkách. 6.1 Počty leukocytů Absolutní a diferenciální počty leukocytů mléčné žlázy, které byly získány výplachem 24 hodin po stimulaci mléčné žlázy fyziologickým roztokem, odpovídaly dříve zaznamenaným výsledkům (Sladek et al., 2001). Tato skutečnost dává jistotu, že experimentální zásah do mléčné žlázy byl proveden správným způsobem. 6.2 Produkce IL-1β Při kokultivaci buněk mléčné žlázy s LPS byla zaznamenána produkce IL-1β až po dvou hodinách. Produkce tohoto cytokinu pak výrazně narostla po 18 hodinách kultivace, rozdíl mezi 2 a 18 hodinami kultivace byl statisticky vysoce významný (P<0,01). Při kokultivaci leukocytů mléčné žlázy s MDP byla zaznamenána produkce IL-1β až po 18 hodinách. Pokud srovnáme produkci tohoto cytokinu po 18 hodinách kultivace s LPS a MDP, tak můžeme konstatovat, že byl zaznamenán statisticky významný rozdíl (P<0,05) mezi použitím LPS a MDP, kdy byla zaznamenána vyšší koncentrace při použití LPS. 36

Z výše uvedeného lze konstatovat, že Gram-negativní bakterie pravděpodobně stimulují leukocyty mléčné žlázy k produkci IL-1β intenzivněji než Gram-pozitivní bakterie. Tuto skutečnost potvrzují také údaje, které uvádí další autoři: IL-1 je velmi důležitým cytokinem v zánětlivém procesu mléčné žlázy, a to jak při přirozené, tak při experimentální koliformní mastitidě (Shuster a Kehrli, 1995; PerssonWaller, 1997; Okada et al., 1999; Riollet et al., 2000b; PerssonWaller et al., 2003). Při infekci způsobené bakteriemi E.coli dochází k výraznému vzestupu koncentrace IL 1, který je spojován s přítokem vyplavením neutrofilů (Shuster a Kehrli, 1995; Shuster et al., 1995, 1997; Riollet et al., 2000b). 6.3 Produkce IL-4 V rámci studia tohoto cytokinu byla zaznamenána produkce při všech sledovaných inkubačních dobách (1, 2 a 18 hodin) u obou bakteriálních komponent. Vyšší koncentrace IL-4 byla zaznamenána při kokultivaci leukocytů s LPS, statisticky vysoce významný rozdíl (P<0,01) byl však zaznamenán pouze při inkubační době 18 hodin. Z uvedeného lze opět usuzovat, že Gram-negativní bakterie stimulují leukocyty mléčné žlázy intenzivněji než bakterie Gram-pozitivní. IL-4 může působit jako protizánětlivý cytokin (Zamorano, 2003), což naznačuje také jeho vysoká koncentrace zjištěná v experimentech této diplomové práce, a to především při nejdelší inkubační době, která by už mohla odpovídat protizánětlivé fázi zánětu. 6.4 Produkce IFN-γ Při kokultivaci leukocytů mléčné žlázy s LPS a MDP byla zaznamenána produkce IFN-γ až po 18 hodinách inkubace. Nebyl však zaznamenán statisticky průkazný rozdíl v produkci tohoto cytokinu v závislosti na typu bakteriální komponenty, ovšem mírný rozdíl ve prospěch LPS zaznamenán byl. Vzhledem k tomu, že se nejednalo o rozdíl statisticky průkazný, můžeme hovořit o přibližně stejné stimulaci buněk mléčné žlázy jak pomocí LPS, tak MDP. Naproti tomu jiní autoři 37

uvádějí významný rozdíl v produkci IFN-γ při porovnání mastitid, které jsou způsobeny Gram-pozitivními nebo Gram-negativními bakteriemi: Experimentálně vyvolaná mastitida bakteriemi S. aureus oslabuje transkripční aktivitu IFN γ (Alluwaimi et al., 2003a). Při koliformní mastitidě je naopak hladina IFN γ výrazně zvýšena po celou dobu trvání infekce mléčné žlázy skotu (Hisaeda et al., 2001). 6.5 Produkce TGF-β1 Kokultivace leukocytů mléčné žlázy s LPS vedla k vyšší produkci TGF-β1 než při kokultivaci s MDP, a to ve všech sledovaných časových bodech (1, 2 a 18 hodin kultivace). Produkce TGF-β1 po kokultivaci buněk mléčné žlázy s MDP byla zaznamenána nejdříve 2 hodiny od počátku působení MDP. Jako u předchozích cytokinů byla zaznamenána vyšší produkce po stimulaci buněk pomocí LPS, tedy endotoxinu E. coli. Kokultivaci leukocytů mléčné žlázy s LPS E. coli studovali také Slama et al. (2012). Během 4-hodinové inkubace zaznamenali nárůst TGF-β1, což odpovídalo kultivacím 1 a 2 hodiny, které byly použity v této diplomové práci. LPS zdá se být významným stimulant pro produkci TGF-β1, což potvrdila nejen tato práce, ale i výše zmínění autoři (Slama et al., 2012). Dalším cytokinem, který byl studován v in vitro podmínkách při kokultivaci s LPS a MDP, byl IL-10. V experimentech byla však zaznamenána vyšší koncentrace IL-10 při použití MDP, nižší koncentrace při použití LPS (Slama et al., 2011). V tomto ohledu můžeme konstatovat, že MDP má vyšší stimulační schopnost pro produkci IL-10 než LPS. V experimentech této diplomové práce byla zaznamenána vyšší koncentrace všech sledovaných cytokinů při použití LPS. Z toho lze odvodit, že produkce různých cytokinů bude stimulována odlišnými bakteriemi, případně jejich toxiny. 38

7 ZÁVĚR V této diplomové práci byl proveden experimentální pokus na osmi klinicky zdravých jalovicích, kříženkách holštýnského a českého strakatého plemene. Jalovice byly ustájeny ve vazné, stelivové stáji a krmeny standardní krmnou dávkou. Pokusy byly zaměřeny na detekci prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů produkovaných leukocyty mléčné žlázy skotu. Detekce byla provedena u cytokinů: IL-1β, IL-4, IFN-γ a TGF-β1. Výplachem mléčné žlázy byly získány leukocyty, které byly inkubovány s LPS nebo MDP v in vitro prostředí. Produkce detekovaných cytokinů byla zjišťována sendvičovou metodou ELISA. Produkce cytokinu IL-1β byla intenzivnější při kokultivaci s LPS než MDP. Při kokultivaci s LPS byla produkce zaznamenána již po 2 hodinách, při použití MDP byla produkce cytokinu zjištěna až po 18 hodinách. Produkce IL-4 byla zaznamenána při všech sledovaných inkubačních dobách u obou bakteriálních komponent. Ale vyšší koncentrace tohoto cytokinu byla naměřena při kokultivaci s LPS. IFN-γ byl produkován až po 18 hodinách kokultivace jak u LPS, tak u MDP. U tohoto cytokinu nebyl zaznamenán statisticky průkazný rozdíl v produkci v závislosti na typ bakteriálního komponentu, avšak byl zaznamenán mírný rozdíl ve prospěch LPS. TGF-β1 byl více produkovaný při kokultivaci s LPS ve všech sledovaných časech. Při kokultivaci s MDP byla po první hodině naměřena nulová hodnota cytokinu a až po 2 hodinách kokultivace byly naměřeny první hodnoty. U všech cytokinů byla zjištěna vyšší produkce při kokultivaci s LPS, z čehož můžeme usuzovat, že Gram-negativní bakterie stimulují leukocyty mléčné žlázy intenzivněji než bakterie Gram-pozitivní. 39

Pomocí prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů mezi sebou komunikují buňky imunitního systému. Znalost cytokinové sítě je velice důležitá pro jejich efektivní využití při léčbě mastitid, ale i dalších chorob jak ve veterinární, tak i v humánní medicíně. Pomocí cytokinů by se mohla detekovat mastitida již v raných stádiích, což by předcházelo velkým ekonomickým ztrátám v chovech mléčných plemen skotu. Zatím však neexistuje rychlá a hlavně levná metoda, která by zjišťovala koncentraci cytokinů a dala by se použít pro každodenní kontrolu zdraví mléčné žlázy. 40

8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. Alluwaimi, A.M. Detection of IL-2 and INF- gamma mrna expression in bovine milk cells at the late stage of the lactation period with RT-PCR. Res. Vet. Sci. 2000, 69: 185-187 2. Alluwaimi, A.M. The cytokines of bovine mammary gland: prospect for diagnosis and therapy. Res. Vet. Sci. 2004, 77: 211-222 3. Alluwaimi, A.M., Cullor, J.S. Cytokines gene expression patterns of bovine milk during mid and late stages of lactation. J. Vet. Med. B. 2002, 49: 105-110. 4. Alluwaimi, A.M., Rossito, P.V., Leutenegger, C.M., Farver, T.B., Smith, W.L., Cullor, J.S. The cytokines marker in the Staphylococcus aureus mastitis of bovine mammary gland. J. Vet. Med. 2003a, B50: 105-111. 5. Bannerman, D.D. Pathogen-dependent of cytokines and other soluble inflammatory mediators during intramammary infection of dairy cows. J. Anim. Sci. 2009, 87: 10-25. 6. Bannerman, D.D., Paape, M.J., Chockalingam, A. Staphylococcus aureus intramammary infection elicits increased production of transforming growth factor-α, β1 and β2. Veterinary immunology and immunopathology 2006, 112: 309-315 7. Bellardelli, F., Ferrantini, M. Cytokine as a link between innate and adaptive antitumor immunity. Trends Immunol. 2002, 23: 201-208. 41