IZOTACHOFORÉZA. Teoretická část

IZOTACHOFORÉZA Teoretická část Izotachoforéza se liší od ostatních elektroforetických metod tím, že vzorek je vnášen mezi dva různé elektrolyty - vedoucí (leading L) a koncový (terminating T). Ty musí být vybrány tak, aby pro jejich pohyblivosti (mobility) platilo: u L > u i,ef > u T V jednom experimentu mohou být separovány pouze ionty jediného znaménka, buď anionty nebo kationty. Po připojení elektrického pole na systém začne probíhat izotachoforetický proces. Izotachoforetický proces Průběh izotachoforézy můžeme rozdělit do dvou částí. V první z nich dochází k separaci složek vzorku, migrační rychlosti jednotlivých částic ve směsné zóně jsou různé. V druhé časti, kterou označujeme jako ustálený stav, jsou částice rozděleny a všechny se pohybují stejnou rychlostí. Dynamika separace směsi složek A a B, pro které platí u A > u B je ukázána na obr. 1. V průběhu separace se rychlejší částice vydělují z popředí směsné zóny a vytvářejí čistou zónu složky A mezi směsnou zónou a vedoucím elektrolytem. V zadní oblasti směsné zóny vzorku se oddělují pomalejší částice a formuje se čistá zóna složky B mezi zónou směsi a koncovým elektrolytem. V dalším průběhu se čisté zóny prodlužují, směsná zóna se zkracuje a po určité době dojde ke kompletní separaci častic A a B, kdy směsná zóna úplně vymizí. Ustáleného stavu je dosaženo, když oddělené zóny s ostrými rozhraními, následující jedna za druhou, představují čisté složky A a B. Od této doby se všechny zóny pohybují konstantní rychlostí v: Obr. 1 v = u L E L = u A E A = u B E B = u T E T = konst Je zřejmé, že od zóny k zóně se skokem mění napětový gradient, takže společný protiion R migruje v jednotlivých zónách postupně rostoucí rychlostí, přenáší tedy stále větší náboj. Protože celkový hnací proud musí být ve všech zónách stejný, dochází k přizpůsobení koncentrací v jednotlivých zónách vzhledem ke koncentraci vedoucího elektrolytu. Problém je možno objasnit na jednoduchém modelu: vedoucí elektrolyt je složen z iontů L a R, koncový elektrolyt z iontů T a R. Jde o silné uni-univalentní elektrolyty v neutrálním prostředí. Proud I v obou zónách je konstantní (I L = I T = I). Z podmínky elektroneutrality vyplývá, že koncentrace kladných a záporných iontů v jednotlivých zónách musí být stejná: c L = c R(L) c T = c R(T) kde c R(L) a c R(T) jsou koncentrace protiiontu v příslušných zónách. Jelikož v L = v T u L E L = u T E T a množství iontů za sekundu resp. náboj za sekundu (tj. proud), které projdou průřezem kapiláry je N = S Σ(ci vi) = S Σ(ci ui Ei) I = Q / t = F S Σ(ci ui Ei) kde F je Faradayova konstanta, platí pro hnací proud I I = E L S F c L (u L + u R ) = E T S F c T (u T + u R ) Úpravou dostáváme vztah mezi koncentracemi c T a c L, tzv. Kohlrauschovu regulační funkci: E L (u L + u R ) u T (u L + u R ) c T = c L = c L E T (u T + u R ) u L (u T + u R ) Analogické vztahy platí mezi koncentracemi stanovovaných iontů v jednotlivých zónách a koncentrací vedoucího elektrolytu. V ustáleném stavu koncentraci c i i-té částice (bez ohledu na počáteční koncentraci ve vzorku) odpovídá vždy jistá hodnota, která závisí jedině na koncentraci vedoucího elektrolytu c L a pohyblivosti i-té 1

částice u i a iontu vedoucího a koncového elektrolytu u L a u T. Z analytického hlediska se jedná o velmi důležitý rys izotachoforézy. Složky s vyšší koncentrací v původním vzorku se zředí během separace a složky s původně nižší koncentrací se koncentrují. Z předchozího vidíme, že rozložení potenciálového gradientu podél separační kolony není konstantní, ale závisí na rozložení specifické vodivosti κ, a tedy na koncentraci c i a na pohyblivosti (u i ) ef jednotlivých částic (obr. 2). S klesající efektivní pohyblivostí částic v jednotlivých zónách klesá elektrická vodivost (stoupá odpor), a tedy intenzita elektrického pole stoupá. S průchodem elektrického proudu zónou o vyšším odporu se uvolňuje více tepla a teplota příslušné zóny je tedy vyšší než teplota zóny předchozí. Obr. 2 Průběh intenzity elektrického pole podél kolony je schodový, výška a délka jednotlivých kroků je obecně různá. Jednotlivé zóny jsou ostré a stabilizované samozaostřujícím efektem. Opustí-li ion např. difuzí svou zónu a pronikne do následující zóny s vyšším potenciálovým gradientem, jeho rychlost vzroste a ion se vrátí opět do své zóny. Přejde-li do předchozí zóny s nižším gradientem, klesne jeho rychlost a ion se vrátí. Vlastní průběh separace lze demonstrovat na modelovém příkladu. Předpokládejme, že celková koncentrace vzorku daná součtem koncentrací vzorku A a B odpovídá adjustované koncentraci směsné zóny, to znamená, že celková délka zóny vzorku se v průběhu separace nebude měnit. Je zřejmé, že k úplné separaci dojde v okamžiku, kdy rychlejší ion A, nacházející se v okamžiku startu na rozhraní vzorek - teminátor předstihne pomalejší ion B, který se v okamžiku startu nacházel na rozhraní vzorek - vodící elektrolyt. K tomu dojde v čase t, který je dán vztahem t = l max / (v A - v B ) v A, v B... rychlosti migrace Pro celkovou minimální délku separační kapiláry l (vzdálenost mezi místem startu a detektorem) platí l sep = v B t = l max v B / (v A - v B ) Popsanou modelovou separaci vystihuje obr. 3. Obr. 3 2

Aby došlo k úplné separaci, musí kolonou projít určitý náboj. Lze dokázat, že tento tzv. separační náboj Q S je dán vztahem N A u A,ef (1 - u R /u A ) + N B u B,ef (1 - u R /u B ) Q S = F u A,ef - u B,ef kde N A,N B jsou absolutní látková množství látek A a B. Poznámka: u A, u B a u R jsou vektory, u R má vždy opačné znaménko, výrazy v závorkách jsou vždy větší než 1. Separační náboj tedy nezávisí na geometrii kapiláry a hnacím proudu, závisí na dávkovaném objemu vzorku (respektive na jeho koncentraci), na rozdílu mobilit separovaných látek, na teplotě a na hodnotě ph (vliv na efektivní mobility). Další charakteristickou veličinou je tzv. kolonová zádrž Q L, což je náboj, který musí projít kapilárou, aby zadní rozhraní vedoucího elektrolytu právě dorazilo do detektoru. Q L = I t L t L... doba průchodu proudu Jde o veličinu snadno experimentálně stanovitelnou. Jelikož k separaci dochází i při průchodu první čisté zóny detektorem, je požadovaná minimálni zádrž kolony pro dosažení úplné separace dána vztahem Q L,min = Q S - N A F (1 - u R /u A ) Tyto vztahy umožňují předběžnou orientaci při řešení daného separačního problému. Jelikož hodnota odečítaného výrazu je velmi malá, stačí pro posouzení možnosti úspěšné separace porovnání vypočteného separačního náboje s experimentálně stanovenou kolonovou zádrží (Q L Q S ). Modifikace izotachoforetického procesu Separační účinnost je možno zvýšit zvětšením zádrže kolony. Toho lze dosáhnout několika způsoby. Prodloužení kapiláry - při stejném hnacím proudu se prodlouží doba separace a tím i zádrž kolony. Je však nutno pracovat s vyšším napětím zdroje, což vede ke snížení stability hnacího proudu a tím ke zhoršení reprodukovatelnosti výsledků. Zvýšení koncentrace vedoucího elektrolytu - poklesne odpor systému, je možno volit větší proud (tzn. i větší náboj) při běžných hodnotách napětí i běžných dobách separace. Vytváří se však krátké separované zóny, čímž se zhoršují možnosti kvantitativního vyhodnocení. Tento nedostatek lze řešit vytvořením tzv. koncentrační kaskády. Do separační kapiláry se pomocným vtokem nadávkuje koncentrovanější nosný elektrolyt, do zbytku kapiláry tentýž zředěný elektrolyt. Protože v koncentrovanějším nosném elektrolytu je menší napětový gradient, jeho zóna migruje pomalu a v jejím čele se koncentrace postupně vyrovnává s koncentrací ve zředěnější části. Tím je bržděna i migrace vzorku, koncentrace separovaných zón se přizpůsobují koncentrovanějšímu elektrolytu. Prodloužením doby separace, způsobeným zpomalením migrace, získáme větší separační náboj. Po vymizení zóny koncentrovanějšího elektrolytu se migrace vzorku zrychlí a jeho separované zóny se koncentračně přizpůsobí zředěnému elektrolytu, takže jsou dobře detekovatelné. Zvýšení separační kapacity lze rovněž dosáhnout technikou spojování objemů. Jde o spojení dvou kapilár různých průměrů. V kapiláře většího průměru je menší napěťový spád, tedy i menší migrační rychlost, což vede ke zvětšení separačního náboje při prodloužení doby průchodu touto kapilárou. Potom separované zóny procházejí užší kapilárou, prodlouží se v obráceném poměru průřezů kapilár a vstupují do detektoru. Volbou vhodného průměru výměnné širší kapiláry je možno prakticky libovolně zvýšit separační kapacitu kolony, jelikož však hnací proud je limitován odporem užší kapiláry (nesmí v ní docházet k nadměrnému vývoji Jouleova tepla), vede tento postup ke značnému prodloužení doby analýzy (obr. 4). Obr. 4 3

Tuto nevýhodu eliminuje technika spojování kolon, která analogicky užívá dvou kapilár různého průměru, v každé kapiláře je však jiný hnací proud. Schematicky je tato modifikace znázorněna na obr. 5. V systému je zařazena další pomocná elektroda. V první fázi hnací proud prochází pouze širší kapilárou (separační). Protože vzhledem k dávkovanému množství vzorku a průměru kapiláry je zóna vzorku krátká a hnací proud veliký, dochází k rychlé separaci jednotlivých složek vzorku. Prakticky separované zóny pak vstupují do užší kapiláry (analytické) s menším hnacím proudem. Okamžik přepnutí napětí mezi elektrodou separační kapiláry a elektrodou analytické kapiláry je nutno vhodně volit. Je-li přepnutí provedeno předčasně, jsou zóny v separační kapiláře hnány malým proudem (malým napětovým spádem), čímž se prodlouží doba analýzy; je-li přepnutí provedeno opožděně, mizí část separovaných zón v kanálku pomocné elektrody. V analytické kapiláře se může dokončit separace, zóny se úměrně prodlužují, takže jsou dobře detekovatelné. Další výhodou této techniky je možnost odstranění balastní zóny do kanálku pomocné elektrody a možnost naplnit analytickou kolonu jiným (zředěnějším) vodicím elektrolytem než kolonu separační, čímž se dále zvyšuje citlivost analýzy (analogie s koncentrační kaskádou). Teoreticky by bylo možno dosáhnout neomezené separační kapacity použitím protiproudu vedoucího elektrolytu (viz obr. 6). Hydrodynamický tok vedoucího elektrolytu brzdí rychlost migrujících zón, případně může pohyb zón zcela zastavit. Po dokončení separace se protiproud zastaví a separované zóny normálně migrují do detektoru. Tím je možno dosáhnout v krátké kapiláře při relativně malém napětí vysokou separační kapacitu systému. Hydrodynamický tok vedoucího elektrolytu však výrazně narušuje ostrost rozhraní jednotlivých zón, takže tato technika není běžně používána. Výhodná je pouze v případě analýzy velmi zředěných Obr. 5 Obr. 6 vzorků, kdy je nutno k dosažení detekovatelných zón dávkovat velký objem. Vzorek se do systému zavádí kontinuálně, protiproud vedoucího elektrolytu udržuje rozhraní mezi zónou vedoucího elektrolytu a vzorku na stálém místě. Složky vzorku se migrací koncentrují u tohoto rozhraní, přebytek rozpouštědel vzorku i protiproudu vedoucího elektrolytu přechází do terminátoru. Přídavkem vhodného barviva do vzorku lze vizuálně kontrolovat polohu rozhraní. Protiproudem vodicího elektrolytu lze rovněž dosáhnout vyvedení zvolené separované zóny z kapiláry. V tomto případě musí být separační kapilára oddělena membránou i od komůrky koncového elektrolytu a kapilára je před koncem opatřena vývodem. Normální separace probíhá až do okamžiku, kdy čelo zóny dosáhne vývodu. Potom se zapojí protiproud vodicího elektrolytu tak, aby rychlost protiproudu byla o málo vyšší než rychlost migrace. Příslušná separovaná zóna je pak postupně proudem vodicího elektrolytu odváděna z kapiláry. Použitím barviv vhodných mobilit lze vymezit jednotlivé zóny tak, že okamžik spuštění a zastavení protiproudu lze vizuálně kontrolovat. Instrumentace Zdroj napětí. Podmínkou reprodukovatelnosti izotachoforetického stanovení je konstantní hnací proud. Napěťový zdroj je konstruován jako ampérostat, konstantní hodnota proudu je udržována regulací napětí. Celkový odpor systému v průběhu separace roste (separační kapilára se postupně zaplňuje málo vodivým koncovým elektrolytem). Při běžně užívaných koncentracích vodicího elektrolytu (0.01 M) bývá počáteční napětí kolem 2 kv a postupně vzrůstá na 4-6 kv podle typu použitého koncového elektrolytu. Hnací proudy se v závislosti na průřezu kapiláry pohybují mezi 20-500 µa. Napájecí zařízení bývá vybaveno napěťovou ochranou, která automaticky vypne obvod v případě, že odpor v separační kapiláře nadměrně vzroste (bublina v kapiláře). Separační kapilára. Z důvodu minimalizace elektroosmotického toku jsou používány výhradně kapiláry z plastu, zpravidla teflonové. Zcela nevhodné je sklo. Vzhledem k průměru kapiláry, která je nadto z jedné strany uzavřena membránou, projevuje se elektroosmóza v izotachoforéze jinak než v kapilární elektroforéze. Elektroos- 4

motický tok a protisměrný hydrodynamický tok působí rušivě na ostrost rozhraní jednotlivých zón. U kationtové izotachoforézy je vliv elektroosmózy menší, může dojít i ke zlepšení profilu rozhraní, protože zpětný hydrodynamický tok může kompenzovat vliv teplotního gradientu uvnitř kapiláry, který způsobuje větší rychlost migrace ve středu kapiláry. U aniontové izotachoforézy působí elektroosmóza naopak vysloveně rušivě (viz obr. 7). Obr. 7 U inertních materiálů (teflon) je elektroosmotický tok minimální, zdrojem nábojů fixovaných na povrchu kapiláry může být pouze adsorpce ionogenních látek. Adsorpcí vhodně zvoleného kationaktivního tenzidu na povrchu kapiláry je možno obrátit polaritu povrchové dvojvrstvy a tím zlepšit profil zón při aniontové izotachoforéze. K minimalizaci vlivu elektroosmózy jsou používány přídavky neionogenních tenzidů (např. polyvinylalkoholu, hydroxyethylcelulózy apod.) do vedoucího elektrolytu. Tenzid se adsorbuje na fázovém rozhraní, oddělí od sebe nábojové vrstvy a tím sníží hustotu náboje v povrchové vrstvě elektrolytu. Tenzid zároveň zvyšuje viskozitu elektrolytu, čímž rovněž přispíva ke stabilizaci zón. Na délce a průřezu kapiláry zavisí její separační kapacita. U některých typů přístrojů lze separační kapiláru měnit. Detektor. K detekci se využívá fyzikalně-chemických vlastností jednotlivých separovaných zón. Z výše popsaného principu izotachoforetické separace vyplývá, že v jednotlivých zónách se postupně skokem zvyšuje napěťový gradient, roste výkon a tím i teplota v jednotlivých zónách a klesá koncentrace. Toho je možno využít k univerzální detekci jednotlivých zón na konci separační kapiláry. Potenciometrický detektor je tvořen dvěma elektrodami umístěnými těsně za sebou ve směru migrace. Elektrody snímají potenciálový gradient v jednotlivých zónách. Výhodou je jednoduchost, nevýhodou je to, že zóny, jejichž délka je srovnatelná se vzdáleností elektrod, nejsou zřetelně detekovány. Teplotní detektor měří teplotu v jednotlivých zónách. Dnes se již prakticky neužívá, protože detekce není dostatečně ostrá. Nejběžnější je konduktometrický detektor, který měří vodivost v jednotlivých zónách. Elektrody jsou umístěny proti sobě a ostrost detekce je zajištěna tím, že jejich rozměr ve směru podélné osy kapiláry je velmi malý (viz obr. 2). Spektrofotometrický detektor (analogie fotometrického detektoru v kapalinové chromatografii) může být universální (nepřímá detekce pomocí vhodného absorbujícího protiiontu přidaného do vedoucího elektrolytu) nebo selektivní (přímá detekce zón látek absorbujících při zvolené vlnové délce). Fotometrická detekce usnadňuje identifikaci složek vzorku, zvláště v případě možnosti užití několika vlnových délek, případně záznamu absorpčního spektra. I selektivní fotometrický detektor zpravidla zaznamenává průchod dostatečně ostrých rozhraní jednotlivých zón (změna indexu lomu na rozhraní vyvolá malou změnu v intenzitě procházejícího paprsku). Neostré rozhraní se nezaznamená (obr. 8). Obr. 8 Kvalitativní analýza Kvalitativní vyhodnocení záznamů universálních detektorů je analogické s vyhodnocením chromatogramů. Určuje se relativní poloha (výška schodu) vzhledem k poloze vedoucího elektrolytu a koncového elektrolytu. h I - h L h rel(i) = h T - h L 5

Tato relativní výška (obr. 9) se porovnává s relativními výškami zón látek, jejichž přítomnost ve vzorku předpokládáme. Potvrzením identity je přídavek standardu stanovované složky do vzorku - identická zóna se vzhledem k ostatním zónám prodlouží. Identifikaci usnadňují selektivní spektrofotometrické detektory. Směsné zóny a jejich identifikace Zaznamenaná zóna nemusí vždy náležet jedné látce, může jít o zónu směsnou, zpravidla dvou, ale i více látek. Rozlišujeme dva typy směsných zón: nestacionární a stacionární. Nestacionární směsná zóna vzniká v důsledku překročení separační kapacity kolony, separační náboj je větší než zadrž kolony. Jde o případ neúplné Obr. 9 separace dvou látek, jejichž směsná zóna dorazí do detektoru dříve, než dojde k úplné separaci. Jak již bylo uvedeno, separační náboj závisí na absolutním množství separovaných látek a na rozdílu jejich mobilit, lze ho tedy jednoduše snížit dávkováním menšího množství vzorku nebo při konstantním dávkovaní jeho zředěním. Po nadávkování menšího množství pozorujeme nepoměrně větší zkrácení směsné zóny vzhledem k ostatním zónám, resp. její úplné vymizení (obr. 10). Obr. 10 Zejména v případě, že se na záznamu vyskytuje extrémně dlouhá zóna, je třeba se přesvědčit, že došlo k úplné separaci, a to nadávkováním menšího množství vzorku a následným porovnáním původního a nového záznamu. Stabilní směsná zóna je tvořena dvojicí látek, které samy sice mají různé efektivní mobility, ale jsou-li v systému přítomny společně, dochází ke vzniku zvláštní směsné zóny o určité hodnotě ph a koncentračním poměru obou látek. Změna dávkovaného množství vzorku nemá vliv na poměr délek zaznamenaných zón, směsná zóna se však projeví změnou poměru koncentrací těchto látek ve vzorku. Pokud se zvětšením koncentrace jedné ze složek jedna z vln prodlouží a zároveň druhá zkrátí či zcela vymizí, případně se na jejím místě objeví kvalitativně jiná vlna, jde o stabilní směsnou zónu (obr. 11). K úplné separaci je třeba použít jiný operační systém. Obr. 11 6

Kvantitativní analýza Při izotachoforetické separaci se nadávkovaný vzorek objemu V, v němž má stanovovaná látka koncentraci c x, rozdělí na jednotlivé složky - zóny. Zóna látky x zaujímá v separační kapiláře objem V x a koncentrace c x látky x v této zóně je dána Kohlrauschovou regulační funkcí. Absolutní látkové množství N x v zóně je dáno vztahem N x = c x V x = c x v x t x S kde v x... rychlost postupu zóny; t x... doba průchodu zóny detektorem S... průřez kapiláry S použitím vztahů v x = u x E x E x = U x / l x U = i R x 1 l x R x = κ x = c x F (u x + u u ) κ x S kde l x je délka zóny a u u mobilita protiiontu, dostaneme pro rychlost u x i v x = c x F S (u x + u u ) Po dosazení získáme u x i t x N x = = K Q x F (u x + u u ) Z posledního vztahu je zřejmé, že mezi nadávkovaným látkovým množstvím látky x a nábojem potřebným na průchod příslušné zóny detektorem existuje přímá úměra. Jelikož hnací proud je konstantní, je možno náboj snadno vypočítat z doby průchodu detektorem. Konstanta K je úměrná převodovému číslu látky x v příslušné zóně a je ji možno při znalosti mobilit patřičných iontů vypočítat; prakticky se však zjišťuje experimentálně, zpravidla pomocí několika standardních roztoků jako směrnice kalibračního grafu. V praxi se však většinou nestanovuje náboj, ale jemu úměrná délka zóny l x na zapisovači, pro kterou platí l x = t x v I kde v I je rychlost posunu papíru zapisovače. Pro kvantitativní vyhodnocení zejména sériových analýz je metoda kalibračního grafu nejpoužívanější. U jednotlivých analýz je též používána metoda standardního přídavku: délka zóny l x původního vzorku se srovnává s délkou zóny po přídavku standardu x do vzorku. Pro původní vzorek platí c x = k l x Přídavkem standardu o objemu V s a koncentraci c s ke vzorku o objemu V p a koncentraci c x vznikne roztok o koncentraci c x V p + c s V s c x,s = = k l x,s V p + V s Vydělením rovnic a úpravou získáme vztah pro koncentraci c x v původním vzorku l x c s V s c x = (V p + Vs) l x,s - V p l x Pro metodu standardního přídavku je možno použít i jinou látku než stanovovanou. Pro daný operační systém bude platit N x = k x Q x = k x i t x = k x i l x N s = k s Q s = k s i t s = k s i l s Vydělením a úpravou těchto vztahů získáme 7

k x l x l x N x = N s = N s K k s l s l s Konstantu K je možno vypočítat z poměru převodových čísel iontů x a s za daných podmínek, protože však zejména u slabých elektrolytů není znám disociační stupeň a není tedy možno stanovit efektivní mobilitu, stanovuje se tato konstanta experimentálně nadávkováním známých množství stanovované látky a standardu. Tato metoda je výhodná proto, že při již známé konstantě K pro daný operační systém je možno stanovení provést na jediném záznamu. Určitým problémem zůstává správné odečtení délek jednotlivých zón. Rozhraní nejsou absolutně ostrá, schodovitý záznam závislosti vodivosti nebo potenciálového gradientu na čase není přesně pravoúhlý, sestupné časti mají sigmoidní charakter. Proto se délka vlny určuje jako vzdálenost dvou sousedních inflexních bodů. S výhodou lze použít záznamu derivační křivky, kde poloha inflexu je vyznačena maximem na derivační křivce. Volba operačního systému Volba operačního systému vyžaduje určité předběžné znalosti o analyzovaném vzorku. Je totiž nutno zejména terminátor volit tak, aby žádná složka vzorku neměla menší mobilitu než je mobilita terminátoru. Naproti tomu volba vodicího iontu je poměrně jednoduchá. S výjimkou iontu OH - má největší pohyblivost chloridový ion, který se v aniontové izotachoforéze běžně používá, v kationtové izotachoforéze se jako vodicí ion používa K + (největší mobilita - s výjimkou H + ). Důležitá je rovněž úprava ph vodícího elektrolytu, tj. volba pufrujícího protiiontu, podle které se řídí i ph v jednotlivých separovaných zónách. V kationtové izotachoforéze ph jednotlivých zón od leadingu k terminátoru klesá, v aniontové izotachoforéze naopak stoupá. Pro dělení slabých elektrolytů je nutné takové ph, při kterém je elektrolyt disociován z 10-90%, tedy ph v rozmezí pk ± 1. Typické operační systémy pro aniontovou izotachoforézu: 1) L: 0.002 až 0.02 M HCl, protiion β-alanin, ph 3.1-4.1 T: kyselina glutamová nebo kapronová 2) L: 0.002 až 0.02 M HCl, protiion kyselina ε-aminokapronová, ph 4.1-5.1 T: kyselina glutamová, kapronová nebo morfolinethansulfonová 3) L: 0.002 až 0.02 M HCl, protiion histidin, ph 5.5-6.5 T: kyselina morfolinethansulfonová Do vedoucího elektrolytu se přidává povrchově aktivní látka (polyvinylalkohol, hydroxymethylcelulóza) k potlačení elektroosmózy. Výrazných změn mobility jednotlivých iontů lze dosáhnout použitím speciálních protiiontů. Příkladem je stanovení síranového a dusičnanového iontu, které se v normálním operačním systému nedaří. Přidáme-li do vodícího elektrolytu dvojmocný ion (optimální je bis-tris-propan, stačí však i vápenatý ion), zpomalí se síranový ion a zóny se oddělí. Přídavkem kademnatého iontu do vodicího dusičnanového elektrolytu se zpomalí ion Cl - tak, že vytvoří samostatnou zónu, přestože jeho normální mobilita je vyšší než u dusičnanového iontu. V tomto případě jde o tvorbu slabého komplexu chloridu s kademnatým iontem. Různé stability komplexů vhodných činidel s kovovými ionty lze použít v kationtové izotachoforéze k dosažení dobrého rozdělení i v případě, kdy se kationty jako takové nedělí. Příkladem může být separace kovů vzácných zemin s použitím kyseliny hydroxyizomáselné jako protiiontu. Mobility iontů vzácných zemin jsou velmi blízké. Stabilita komplexu s výše uvedenou kyselinou výrazně stoupá v pořadí rostoucích atomových čísel a tím se výrazně snižuje jejich mobilita, což vede k jejich dobrému rozdělení. Ing. Václav Říha, CSc. 8