Stanovení těkavých látek v nápojích metodou plynové chromatografie s hmotnostní detekcí Bakalářská práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie Stanovení těkavých látek v nápojích metodou plynové chromatografie s hmotnostní detekcí Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Valerie Helánová, Ph.D. Vypracoval: Tomáš Marvánek Brno 2012

ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE

PRHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Stanovení těkavých látek v nápojích metodou plynové chromatografie s hmotnostní detekcí vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. V Brně dne.. Podpis......

PDĚKVÁNÍ Tímto způsobem bych chtěl poděkovat vedoucí mé bakalářské práce Ing. Valerii Helánové, Ph.D. za odborné vedení, literaturu k tématu, poskytnuté konzultace a cenné připomínky, díky kterým jsem bakalářskou práci dokončil. Díky patří i mým rodičům, kteří mi poskytli zázemí pro studium na Mendelově univerzitě.

ABSTRAKT Cílem bakalářské práce bylo vyhledat a experimentálně ověřit metody pro kvalitativní i kvantitativní analýzu těkavých látek metodou GC MS. V teoretické části práce je popsáno víno, charakteristika, rozdělení, principy výroby a složení vína spolu s metodami stanovení těkavých látek. V praktické části práce je uvedena metoda pro stanovení těkavých látek ve víně. KLÍČVÁ SLVA Víno, SPME, kvantitativní analýza, plynová chromatografie ABSTRACT The aim of this bachelor thesis was to find and experimentally verify methods for qualitative and quantitative analysis of volatile substances by GC MS method. The theoretical part of the thesis includes description of wine, its characteristics, classification, principles of productions and its composition, as well as description of the methods used for determination of volatile substances. The practical part of the thesis contains a method which is used for determination of volatile substances in wine. KEYWRDS Wine, SPME, quantitative analysis, gas chromatography

BSAH 1 ÚVD... 8 2 CÍL PRÁCE... 9 3 TERETICKÁ ČÁST... 10 3.1 Víno... 10 3.1.1 Výroba vína... 10 3.1.2 Aromatizovaná vína... 15 3.1.2.1 Vermut... 15 3.1.2.2 Technologie extrakcí chuťových a vonných látek... 16 3.1.3 Aromatické látky ve víně... 17 3.1.3.1 Těkavé látky v hroznech... 18 3.1.3.2 Těkavé látky pocházející z prefermentačních procesů... 23 3.1.3.3 Těkavé látky pocházející z fermentace... 23 3.1.3.4 Vývoj těkavých látek během stárnutí... 24 3.2 Extrakční techniky... 25 3.2.1 Extrakce z kapaliny do kapaliny... 25 3.2.2 Statický headspace... 25 3.2.3 Dynamický headspace... 25 3.2.4 Mikroextrakce na pevnou fázi... 26 3.3 Plynová chromatografie... 26 3.3.1 Dávkovač... 26

3.3.2 Chromatografické kolony... 28 3.3.3 Detektory... 30 3.3.3.1 Plamenově ionizační detektor... 30 3.3.3.2 Hmotnostní spektrometr... 31 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 32 4.1 Laboratorní vybavení... 32 4.1.1 Standardy... 32 4.1.2 Vzorek vína... 32 4.1.3 Přístroje... 32 4.1.4 Plyny... 32 4.1.5 SPME analýza... 32 4.1.6 Pracovní pomůcky... 32 4.2 Chromatografická analýza... 32 5 VÝSLEDKY A DISKUZE... 34 6 ZÁVĚR... 37 7 SEZNAM PUŽITÉ LITERATURY... 38 8 SEZNAM ZKRATEK... 42 9 SEZNAM PŘÍLH... 44

1 ÚVD Těkavé látky jsou různorodé chemické sloučeniny udělující nápojům charakteristickou vůni a chuť. Jejich koncentrace nejsou často příliš velké a pro čichové receptory jsou postřehnutelné již od 10-19 molů nebo 10-12 g/l. Mezi hlavní těkavé látky můžeme zařadit alkoholy, karboxylové kyseliny, jejich estery, aldehydy, ketony, fenoly, thioly, dusíkaté látky a další. Na těkavé látky je hojně bohaté také víno. Jejich obsah je přibližně 1 g/l a můžeme v něm nalézt více než 1000 takovýchto sloučenin. Vzájemný poměr a množství udává jednotlivým odrůdám typický buket. Na zastoupení vonných látek v bobulích a následně ve víně se podílí zeměpisná poloha, klima a půdní typ. Pro analýzu těkavých látek ať už ve víně nebo jiných nápojích se používá nejčastěji metoda plynové chromatografie. Při použití jako detektoru hmotnostního spektrometru získáme vysoce účinnou a citlivou metodu i při stopovém množství aromatických látek ve vzorku. 8

2 CÍL PRÁCE a) Prostudování literárních zdrojů týkajících se mého tématu b) Vypracování literární rešerše c) Seznámení s obsluhou plynového chromatografu d) Stanovení těkavých látek ve víně e) Zpracování dosažených výsledků 9

3 TERETICKÁ ČÁST 3.1 Víno 3.1.1 Výroba vína Mezi sklizní hroznů a začátkem alkoholového kvašení proběhnou v průměru dva dny. Během tohoto období se musí uskutečnit řada opatření, která ovlivní hotové víno po léta nebo desetiletí. Způsob zpracování hroznů a získávání moštu ovlivňuje kvalitu výsledného produktu z 80 %. Z toho vyplývá odpovědnost získat z hroznů správným rozhodnutím co nejlepší víno. V současnosti je patrná snaha o získání moštu s nízkým podílem kalů a zatěžujících reziduí šetrným a rychlým zpracováním hroznů. Tím je dán základ pro víno bez vad a jsou vytvořeny vhodné podmínky pro další pracovní operace s vínem ve sklepě (STEIDL & SCHÖDL, 2002). Základním technologickým úkonem při zpracování bílých hroznů je získat z hroznů co největší množství moštu vyhovující jakosti bez zbytečné oxidace. Aby se cíl splnil, je nutné hrozny před lisováním rozdrtit, částečně scedit mošt a zbylý rmut vylisovat. Tyto pracovní procesy probíhají ve zvláštní místnosti lisovně. Velikost lisovny včetně přejímací linky, která je umístěna před lisovnou, závisí od množství zpracovávaných hroznů a od typů lisů, které se v závodě používají. K zařízení lisovny patří: přejímací linka (je umístěna před lisovnou), mlýnkoodzrnkovače, čerpadla, zásobníky na rmut včetně scezovačů a lisy. rganizačně je třeba sestavit pracovní linku tak, aby jednotlivé pracovní procesy na sebe plynule navazovaly. To znamená, že hrozny, které již měly změřenou cukernatost a byly zváženy, musí přejít přes odzrňovače, odkud je získaný rmut dopravován vhodnými čerpadly do zásobníků, kde dojde k samovolnému oddělení větší části moštu (40 až 60 %) od pevných částí rmutu (ŠVEJCAR, 1986). Přídavek S 2 má tři účinky: útlum (velmi aktivních) oxidačních enzymů, útlum divokých kvasinek a bakterií a vyvázání vzdušného kyslíku. Čím dříve se tento přídavek uskuteční, tím lépe bude rmut chráněn před účinky vzduchu, zabrání se hnědnutí a podpoří se vývoj buketu a čistých tónů. Siření se nejčastěji provádí pomocí prášku 10

pyrosulfitu draselného (disiřičitan draselný), nejjednodušeji přímo na hrozny, aby během odstopkování a drcení došlo k jeho promísení (STEIDL & SCHÖDL, 2002). Tabulka č. 1: Sklepní hospodářství (STEIDL & SCHÖDL, 2002) Dávky S 2 [mg/l] Vodný roztok S 2 [g/hl] Pyrosulfit draselný [g/hl] Zdravé hrozny 0-50 0-5 0-10 Nahnilé hrozny 50-75 5-7,5 10-15 Botrytické hrozny 75-100 7,5-10 15-20 Další předlisovací operací je nakvašení některých kultivarů. Délka nakvašení je závislá od druhu zpracované suroviny. Bílé aromatické kultivary Vitis vinifera (Muškát ttonel, Mopr, Sauvignon, Tramín, Irsay livér, Müller Thurgau, Pálava) se za účelem uvolnění aromatických látek nakvašují 12 až 48 hodin. Za tuto dobu zpravidla nedojde k nadměrné extrakci látek, které jsou v bílých vínech nežádoucí (třísloviny, chlorofyl) (ŠVEJCAR, 1986). Pektiny tvoří kostru bobulí, v suchých letech může být jejich obsah velmi vysoký. Štěpení pektinů probíhá prostřednictvím příslušných enzymů (pektináz), které jsou obsaženy v bobulích. Přídavkem pektolytických enzymů se může zvýšit rychlost štěpení pektinů. Důležitá je teplota přes 10 C, jinak je aktivita velmi nízká. Podporou štěpení pektinů lze zvýšit výlisnost, zkrátit dobu naležení rmutu a při nakvašení modrých hroznů se zvyšuje uvolňování červeného barviva (STEIDL & SCHÖDL, 2002). Větší podniky disponují zařízením pro scezování moštu. Tím, že mošt neprotéká přes lis, je vystaven nižší oxidaci. Scezování moštu by se mělo uskutečnit krátce před lisováním, aby ve zbylých prostorách rmutu nedocházelo zbytečně k předčasnému nárůstu mikroorganismů (STEIDL & SCHÖDL, 2002). Lisování je filtrační úkon, při kterém hroznový rmut sám tvoří filtrační médium. Je jako houba, ze které po vytlačení vytéká mošt. Při nevhodné úpravě hroznů, resp. rmutu před lisováním, nebo nevhodně voleným tlakem (neúměrné zvýšení tlaku) se houbovitá struktura zničí a šťáva se přestane odlučovat. Proto stupeň vylisování je závislý od 11

konzistence lisovaného média a použitého tlaku. Rychlost lisování je závislá na velikosti lisovaného materiálu, stupni a způsobu rozdrcení (odzrněný či neodzrněný rmut) a od typu použitého lisu. Nemalou roli hraje také kultivar a stupeň jeho vyzrálosti. Princip lisování si je možno představit takto: Na začátku lisování uniká z lisovacího systému vzduch, část šťávy a tuhá fáze se stmeluje. Zvyšování tlaku způsobuje zmenšování objemu a odtok kapalné fáze moštu. Lisovaný mošt prochází póry tuhé fáze a otvory v koši lisu odtéká ven. Všechny i plně automatické lisy jsou řešeny tak, že se tlak v lisu v určitých intervalech přerušuje a tím se zajistí rovnoměrný odtok moštu, rychlé a dokonalé vylisování. Lisů používaných ve vinařství je celá řada. Pro všechny však platí stejná zásada. Musí být jednoduché, snadno ovladatelné a dostatečně výkonné při zachování dobré kvality moštu. Máme lisy s pracovním postupem přerušovaným, nepřerušovaným, hydraulické, mechanické a pneumatické (ŠVEJCAR, 1986). Během kvašení nepřeměňují kvasinky jen cukr na alkohol a jiné vedlejší produkty, ale uvolňuje se i aroma a vytvářejí se nové sloučeniny vzniká kvasný buket. Hlavní reakcí během kvašení je přeměna cukru na etanol a oxid uhličitý. 1 mol glukózy 2 moly etanolu + 2 moly oxidu uhličitého 100 g glukózy 51,11 g ethanolu + 48,89 g oxidu uhličitého Pro zahájení kvašení je zapotřebí asi 10 milionů buněk/ml. Lisy a zařízení jsou nejdůležitějšími zdroji infekce, zde se zvyšuje přirozený počet buněk v moštu z 10 až 100 jedinců/ml deseti- až stonásobně. Aby se dosáhlo počtu kvasinek potřebného k zahájení kvašení, existují dvě možnosti: spontánní kvašení nebo kvašení pomocí čistých kultur kvasinek. Průběh kvasného procesu je ovlivňován teplotou, cukernatostí moštu, obsahem alkoholu, kyselinou siřičitou, obsahem kalů a ostatními nežádoucími látkami (STEIDL & SCHÖDL, 2002). První stočení vína. Tímto rozumíme první oddělení mladého vína od kvasnic a kalů. Zjistit z biologického hlediska správnou dobu pro první stočení vína z kalů kvasnic je dosti obtížné. Podle novějších poznatků by se mělo víno stočit tehdy, je-li dokvašené a má vhodný poměr kyselin k ostatním složkám vína. V každém případě se musí víno stočit v pravý čas, protože ponechá-li se delší dobu na kvasnicích, jeho kvalita se již nezlepšuje, ale spíše zhoršuje. Dodržujeme zásadu, že brzy po dokvašení musíme stočit 12

lehčí vína s menším obsahem kyselin a méně alkoholická. Bývá to v listopadu nebo v první polovině prosince, zpravidla za 30-50 dní po bouřlivém kvašení. Také vína, u nichž chceme mít výrazné odrůdové aroma, stáčíme dříve. drůdový buket by se mohl zakrýt tím, že by delším ležením na kvasnicích víno převzalo druhotné vůně a kvasničnou příchuť. Vína extraktivní s vyšším obsahem alkoholu stáčíme později, koncem prosince (KRAUS et al., 2004). Druhé stáčení vína. Po 6 až 10 týdnech po prvním stáčení následuje druhé. Stanovení doby stáčení určujeme chuťovou zkouškou, zjištěním čistoty vína a zkouškou na stálost ponecháním vína ve skleničce po dobu 24 hodin. Po druhé stáčíme zásadně bez přístupu vzduchu, velmi šetrně, aby nedošlo k úbytku aromatických látek. Slabší provzdušnění si můžeme dovolit u červených vín, protože se tím zlepšuje jejich buket i barva. Při druhém stáčení využijeme filtrace přes křemelinu a zároveň podle potřeby provedeme čiření a scelení vína. Scelením neboli smícháním vín v určitém poměru odstraňujeme nedostatky v jakosti, vyrovnáváme chuťové vlastnosti a zvyšujeme nebo snižujeme obsah některých látek (HUBÁČEK, 1996). Siření vína. Síra je ve svých různých formách prostředkem k ošetřování vína. xid siřičitý je bezbarvý, štiplavý plyn. Ve vodném roztoku z něj vzniká kyselina siřičitá. Ta, v případě konzumace nepřiměřených dávek, poškozuje zdraví. Veškeré pokusy vyloučit kyselinu siřičitou nevedly k uspokojivému výsledku bezchybnému vínu. Kyselina siřičitá působí biologickým účinkem, antioxidačním účinkem, účinkem deaktivujícím enzymy a aroma zlepšujícím účinkem. Přípravky k siření jsou sirné řezy, pyrosulfit draselný (disiřičitan draselný, K 2 S 2 5 ) a pod tlakem zkapalněný S 2 (STEIDL & SCHÖDL, 2002). Vlastní sedimentací nedosáhneme jiskrného vyčištění vína. Čirosti vína můžeme dosáhnout filtrací, ale obvykle není stálá. Proto musíme vyčištění napomáhat, a to školením vína, které spočívá v čiření, stabilizaci a filtraci (HUBÁČEK, 1996). Čiření vína znamená v praxi přidání absorpčního materiálu do moštu nebo vína s cílem odstranit nebo snížit obsah nežádoucích látek. Pomocí těchto absorpčních materiálů čiřidel získáme kvalitní čistotu vína, barvu, aromatický a chuťový projev a zabezpečíme stabilitu vína. Většina čiřicích materiálů obsahuje určitý elektrický 13

náboj. Na principu opačných elektrických nábojů se vážou jiné látky obsažené ve víně. Tyto látky se potom spojují ve větší částice, které sedimentují na dno nádoby. Čiření může být buď fyzikální, kdy víno opakovaně stáčíme, nebo chemické pomocí čiřicích prostředků. Bílá vína čiříme nejčastěji kaseinem, mlékem nebo bentonitem (PAVLUŠEK, 2006). Stabilizace vína je technologická operace, které bychom se neměli v zájmu dlouhodobého zachování kvality vína vyhýbat. Tradiční způsoby školení vína nezabezpečují jeho stabilitu. V stáčeném, siřeném a čiřeném víně i nadále probíhají fyzikálně chemické a biologické procesy, které mohou vést ke vzniku bílkovinných, kovových, krystalických a mikrobiologických zákalů. Stabilizačními prostředky na odstranění bílkovinných zákalů jsou želatina, tanin, bentonit aj. Hexakyanoželeznatan draselný se používá na stabilizaci proti kovovým zákalům. Víno můžeme také stabilizovat teplem a chladem (MALÍK, 1996). Filtrace je v podstatě umělé vyčištění vína přes pórovité filtrační desky. Jako filtrační hmota se používá filtrační papír, křemelina, celulózo křemelinové desky a membrány z různých plastových polymerů. Azbest byl ze zdravotních důvodů vyloučen. Při filtraci na jakémkoliv filtru se musí vždy řádně propláchnout filtrační hmota a zařízení udržovat v naprosté čistotě. Výkon je závislý na použitém zařízení, filtrační hmotě a zakalenosti vína. Norma připouští ztráty filtrací do 0,2 % (HUBÁČEK, 1996). Hroznové víno začne zrát po stočení z kalů. Charakterizují ho složité fyzikální, chemické a biochemické děje, které mají významný vliv na charakter vína. K látkám podléhajícím změnám patří především organické kyseliny a dusíkaté látky. Reakcí kyselin a alkoholů vznikají různé estery, které se významně podílejí na vzniku buketotvorných látek. Významnými představiteli sekundárního buketu vína jsou estery aminokyselin a vyšších alkoholů. V hroznovém víně jsou velmi cenné ethylestery kyseliny kapronové, kaprinové a kaprylové, které svými ovocnými vůněmi tvoří žádoucí složku zralých vín. Během zrání může docházet k denaturaci bílkovin až na jednotlivé aminokyseliny, které dále reagují se sacharidy a nebo se za katalytického působení těžkých kovů můžou štěpit na aldehydy. Aldehydy reakcí s aminokyselinami za nepřístupu kyslíku dávají vznik melanoidům, s alkoholy acetátům a oxidací poskytují 14

karboxylové kyseliny. Vznik aldehydů a návazných látek vede ke vzniku specifického aroma vína. Svou úlohu ve zrání plní i kyslík, ale jen do určité míry. Jeho nadbytek vede k předčasnému stárnutí vína. Bílá vína vyzrávají již za několik měsíců. Naproti tomu červená vína jsou zpravidla zralá za 2 až 3 roky (MALÍK, 1996). 3.1.2 Aromatizovaná vína Za aromatizované víno se považuje nápoj získaný z vína. Musí vykazovat skutečný obsah alkoholu nejméně 14,5 % obj., avšak méně než 22,0 % obj. a být aromatizován. Přídavek hroznového moštu, částečně prokvašeného hroznového moštu nebo cukru je možný, přídavek alkoholu je povinný. Podíl vína musí činit alespoň 75 % (STEIDL & SCHÖDL, 2002). 3.1.2.1 Vermut Kořeněné dezertní víno je známé pod názvem vermut. Vyrábí se rovněž z hotového vína přidáním cukru, alkoholu, různých směsí bylin a koření (KRAUS et al., 2004). První zmínky o přimíchávání bylin do vína pochází již ze Sumerské říše, když vědci rozluštili nápis na čtyři tisíce let staré hliněné tabulce nalezené ve starosumerském Nippuru. Dozvěděli se, že sumerský lékař předepisoval nemocným víno s rozpuštěným práškem z různých rostlin. Další zmínky o léčivých vínech najdeme v antice, ale i ve středověku. První, kdo z léčivých vín udělal běžný obchodní artikl, byl Ital Antonio Benedetto Carpano z Turína roku 1786. Prodával zvláštní suché víno, které zesílil přidáním vinného destilátu, v němž maceroval aromatické byliny. Dnes mají největší proslulost italské a samozřejmě také francouzské vermuty. Přesné složení a poměr jednotlivých částí je vždy přísně střeženým firemním tajemstvím jednotlivých výrobců. Vedle pelyňku se pro přípravu vermutů používá máta peprná, heřmánek, hřebíček, koriandr, hořec, majoránka, tymián, zázvor, muškátový oříšek, angelika, kardamom, pomerančová kůra a také okvětní lístky planých růží a mnoho dalších ingrediencí (ŠEVČÍK, 2000). Hlavní složky bylin a koření používaných při výrobě vermutů jsou podle Švejcara (1971): a) Uhlovodíky cymen, pinen, styren a jiné terpeny b) Aldehydy citral, citronelal, fural, vanilín, benzaldehyd atd. 15

c) Ketony karvon, luparon atd. d) Laktony - alantolakton e) xidy cineol, eukalyptol f) Fenoly a jejich deriváty luparol, tymol g) Alkoholy kalamenol, citronelol, borneol, augenol, safrol, terpineol, anetol h) Alkaloidy chinin, kusparin, absotin i) Glykosidy absintin, aloin atd. j) Sacharidy např. gentinόza k) Třísloviny l) Barviva m) Gumy n) Pryskyřice - humulon o) Estery p) Jednoduché organické kyseliny kyselina citronová, vinná, jablečná atd. q) Komplexní organické kyseliny 3.1.2.2 Technologie extrakcí chuťových a vonných látek Chuťové a vonné látky můžeme extrahovat 3 způsoby: a) Přímá extrakce vínem je to nejjednodušší způsob aromatizace. Přímo do vína se přidá odvážené množství bylin a nechá se luhovat, dokud víno neabsorbuje dostatečné množství aroma. Během extrakce se vínem míchá a celý proces můžeme urychlit zahřáním na 50-60 C. Extrahuje se dva týdny, ale i déle. b) Příprava koncentrátů připraví se malé množství koncentrátu v extrakčním tanku, do kterého je pomocí čerpadel přiváděno víno, které neustále cirkuluje až do doby, kdy se dosáhne potřebné chutě a vůně. Víno se během extrakce zahřívá. 16

c) Extrakce alkoholem výrobci esencí a vonných přísad připravují extrakci bylin a koření pomocí brandy nebo alkoholu. Tyto extrakty se mohou používat buď na okořenění základních vín k přípravě vermutu, a nebo se častěji používají v malých dávkách na vyvážení aroma a chuti základních vín, které před tím dostali koncentrovaný vinný extrakt (ŠVEJCAR, 1971). Přesný technologický postup, kterým bylo vyrobeno přímo naše aromatizované víno, nevíme. Protože je to výrobní tajemství firmy, která nám nabídla vzorek k analýze. 3.1.3 Aromatické látky ve víně Ve víně můžeme najít něco okolo 600-1000 různých těkavých látek (MANSFIELD, 2006). Jejich množství se pohybuje v rozmezí mezi 0,8-1,2 g/l a jejich složení je charakteristické pro danou odrůdu. Vznik jednotlivých těkavých látek se dá rozdělit do 4 etap: a) Produkce během zrání hroznu, vliv životního prostředí a způsob pěstovaní révy vinné b) Těkavé látky vznikající během lisování a macerace (včetně oxidace a hydrolýzy) c) Aroma vzniklé během fermentace d) Utváření konečného aroma během zrání vína (RIBÉREAU-GAYN et al., 2006) Všechny tyto 4 klíčové etapy nám ovlivňují konečné aroma vína. Nejvíce těkavých látek vzniká při fermentaci (RIBÉREAU-GAYN et al., 2006). Tyto látky jsou podobné všem vínům, a proto podle nich nemůžeme určit druhovou příslušnost. Klíčové těkavé látky, které nám udávají druhovou odlišnost, vznikají pravděpodobně právě v hroznu samém a do vína se dostávají tak, že přežijí fermentační proces. Takovýchto těkavých látek najdeme velice málo, a proto jsou tak důležité pro charakteristiku vína. Kotseridis et al. (2000) zjistili, že např. ve šťávě Cabernetu Sauvignon je obsaženo 18 těkavých látek a 16 z nich přechází do vinného aroma nezměněno. V několika případech můžeme odrůdový charakter přičíst pouze jedné těkavé sloučenině, a nebo jedné chemické rodině, což je případ 2-methoxy-3-isobutylpyrazinu, který je charakteristický pro Cabernet Sauvignon a nebo monoterpeny, které nalezneme v Muškátu a Gewürztraminer. Každá odrůda může mít různé podíly sloučenin, které 17

jsou společné mnoha vínům, což vede k rozdílům ve vnímání aroma. Konečné posouzení složek v těchto odrůdách je výrazně obtížné, a proto se využívá fingerprint patterns v plynové chromatografii, která je dobrým prostředkem pro detekci aromatických látek v mladých bílých vínech vyrobených z různých kultur (RAPP, 1990). 3.1.3.1 Těkavé látky v hroznech Jako většina ovoce, bobule hroznu začne produkovat těkavé látky ve fázi zrání, což je období poznamenané klimakterickým zvýšením dýchání. Tvorba produktů látkové výměny v hroznech je primárně určena odrůdou a kultivarem. Dále může být ovlivněn stupněm zralosti, stavem životního prostředí během zrání a především vodním stresem (tzn., když rostlina přijímá méně vody, než spotřebovává) (RAPP, 1990). Více než 1300 různých těkavých sloučenin bylo identifikováno v různých kultivarech V. vinifera (EBELER, 2001). Ty byly rozděleny do pěti hlavních skupin: monoterpeny, norisoprenoidy, benzenoidy, alifatické sloučeniny a methoxypyraziny. Monoterpeny byly identifikovány jako hlavní těkavé látky, které tvoří odrůdový charakter Gewürztraminer, Ryzlinku rýnského a Muškátu. Vedlejší roli hrají v květinových tόnech nalezených v Rulandském šedém, Viognier, Muscadelle a Albariño a Müller-Thurgau. Několik nearomatických odrůd včetně Chardonnay, Sauvignon blanc, Syrah, Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc a Merlot produkují sice monoterpeny, ale jejich hladiny jsou menší, než práh vnímavosti (RIBÉREAU-GAYN et al., 2006). Monoterpeny se obvykle nacházejí ve slupce bobulí. Její postupné žloutnutí koresponduje se zvyšujícím se obsahem monoterpenů. Většina z nich se nachází v hroznech ve vázané formě. Přesto dostatečné množství bývá také ve volné formě, kterou lze během zrání hroznu senzoricky v bobulích vyhodnotit. Hlavním klimatologickým faktorem ovlivňujícím jejich tvorbu je teplota a sluneční svit. Při příliš intenzivním odlistění hroznů může vlivem vysoké teploty bobulí docházet k degradaci monoterpenů a ztrátě jejich aromatického charakteru. Hrozny potom postrádají muškátovou, ovocnou i květinovou vůni a vyznačují se nahořklou chutí, která snižuje kvalitu hroznů a následně vína (PAVLUŠEK, 2011). Methoxypyraziny jsou aromatické sloučeniny hroznů odpovědné za odrůdový charakter v některých červených a bílých vínech. Zastupují dusíkaté látky, které 18

vznikají jako sekundární produkt při tvorbě a přeměně aminokyselin (PAVLUŠEK, 2011). Zásadní význam pro vůni vína mají deriváty 3-alkyl-2-methoxypyrazinů, a to ve formě isopropylu, sec-butylu a isobutylu (RIBÉREAU-GAYN et al., 2006; SALA et al., 2005). Práh vnímavosti těchto látek ve vínech je velmi nízký (KTSERIDIS et al., 1998). Methoxypyraziny jsou spojeny s charakteristickými bylinnými tόny nalezenými v Cabernet Sauvignon, Sauvignon Blanc, Cabernet Franc a Merlot (EBELER, 2001; RIBÉREAU-GAYN et al., 2006; SALA et al., 2005). Látky ze skupiny methoxypyrazinů se hlavně nacházejí ve slupce bobulí, ale i v dužině a v semenech. bsah v semenech bývá patrný zejména u odrůdy Cabernet Sauvignon. Pří výrobě červených vín může docházet k uvolňování methoxypyrazinů ze semen. Více jich uvolňují nevyzrálá semena. Tvorbu methoxypyrazinů v hroznech ovlivňuje odrůda, klimatické podmínky, stanoviště a agrotechnické zásahy ve vinici (PAVLUŠEK, 2011). Tabulka č. 2: Pěstování révy vinné: moderní vinohradnictví (PAVLUŠEK, 2011) Aromatická látka Aromatické a chuťové vlastnosti Prahová hodnota [ng/l] 2-methoxy-3-isobutylpyrazin (IBMP) Zelená paprika, chřest 2 2-methoxy-3-isopropylpyrazin (IPMP) Zelená paprika, zemitá příchuť, zelený hrášek, chřest 2 2-methoxy-3-sec-butylpyrazin (SBMP) Zelená paprika 1 2-methoxy-3-ethylpyrazin (ETMP) Zelená paprika, zemitá příchuť 425 V hroznech existuje také mnoho glykosylovaných C 13 -norisoprenoidů. Většinou se jedná o monoterpeny, které nejsou štěpeny glukosidázami hroznu ani kvasinek. Jejich odolnost vůči kyselým médiím není známa (RIBÉREAU-GAYN et al., 2006). C 13 -norisoprenoidy vznikají přeměnou karotenoidů za působení světla. Karotenoidy jsou v bobulích produkovány mezi kvetením a zaměkáním. Po jeho začátku obsah karotenoidů klesá. Díky chemickým a enzymatickým reakcím se změní na sloučeniny s vonnými vlastnostmi norisoprenoidy. Karotenoidy se proto označují jako prekurzory norisoprenoidů. Norisoprenoidy se vyznačují především květinovými a ovocnými tóny, které se objevují u Ryzlinku rýnského, Chardonnay, Rulandského bílého či Rulandského šedého. Mezi významné norisoprenoidy patří β-damascenon (jablko, 19

kdoule, květinové tóny), β-ionon (fialka, malina, dřevitá vůně) a vitispiran (kafr, eukalyptu). Mezi norisoprenoidy patří také sloučenina 1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaftalen (TDN). Nejčastěji bývá u starších vín z odrůdy Ryzlink rýnský a ve vůni připomíná petrolej. Vyskytuje se hlavně ve vínech z teplých oblastí nebo z nadměrně osluněných hroznů. V extrémních případech se projeví už šest měsíců po sklizni, což vede k negativnímu ovlivnění aromatického charakteru odrůdy. Tvorbu TDN v hroznech může podporovat nadměrné odlistění (PAVLUŠEK, 2011). Další významnou skupinou nositelů vůní jsou C 6 alkoholy, které vznikají z linolenové a linolové kyseliny působením lipoxygenázy a alkoholdehydrogenázy v pletivech hroznů. Mezi sloučeniny primárního významu zahrnujeme hexan-1-ol, (Z)-hexen-3-ol, hexan-2-ol, hexenal a (E)-hexen-2-al. Společně se svými aldehydy mohou ve vínech produkovat bylinnou pachuť, přestože poslední dva jsou redukovány kvasinkami během alkoholové fermentace (KTSERIDIS et al., 2000). V hroznech se mohou některé aromatické látky vázat na cukry za vzniku glykosidů. V této podobě nejsou v hroznech senzoricky vnímatelné. Jestliže se molekula cukru odštěpí, aromatické látky se uvolňují, a tím se stávají čichově aktivní. K odštěpení cukru dochází při hydrolýze v kyselém prostředí, v podmínkách nižšího ph nebo enzymatickou hydrolýzou. dštěpení cukrů může probíhat od počátku zpracování hroznů (odzrnění, mletí) a poté v dalších technologických procesech výroby vína. Kvasinky také ovlivňují uvolňování aromatických látek díky aktivitě β-glukosidázy. (PAVLUŠEK, 2011). Několik esterů je syntetizováno v ovoci z mastných kyselin, aminokyselin nebo metabolismu kyseliny skořicové (REINECCIUS, 2006). U většiny kultivarů jsou estery pocházející z hroznů nevýznamné z hlediska smyslového vnímání. Existují ale dvě výjimky. Jednou je isoamyl acetát, ester produkovaný během fermentace, který byl pokusně identifikován v jihoafrické vinné révě odrůdy Pinotage (MARAIS et al., 1979) a druhou je fenylester methylanthranilu ve vybraných kultivarech V. labrusco, který udává vínu charakteristický nakyslý tón (JACKSN, 2000). Zajímavou skupinu aromatických látek představují vonné thioly, které ovlivňují chuť a vůni především u odrůdy Sauvignon blanc. Thioly se však mohou vyskytovat 20

i u nesauvignonových odrůd, jako jsou např. Tramín, Ryzlink rýnský, Rulandské šedé, Rulandské bílé, Sylvánské zelené nebo Scheurebe. Vonné thioly nejsou v bobulích révy vinné přítomné v senzoricky aktivní formě, nýbrž ve formě nevonných prekurzorů konjugátů cysteinu a glutathionu-cys-4mmp, Cys-3MH a Cys-3MHA, G-3MH, G-4MMP. Sloučenina Cys-3MH se vyskytuje hlavně ve slupce, Cys-4MMP ve slupce i dužnině, G-3MH ve slupce i dužnině a G-4MMP více ve slupce. Pro vznik vonných thiolů je potřeba vyrovnaná výživa vinice dusíkem. Ten se podílí na tvorbě aminokyselin, které se následně účastní tvorby prekurzorů. Jako důležité se ukazuje i dobré hospodaření s vodou a vyvarování se stresů vyvolaných suchem. Enzymatická aktivita β-lyázy se podílí na uvolňování thiolů do vonné podoby. K tomuto procesu dochází v průběhu macerace hroznů nebo během kvašení. Délka macerace, teplota při ní, použitý kmen kvasinek, teplota kvašení, způsob výroby vína to vše rozhoduje o projevu vonných thiolů ve víně (PAVLUŠEK, 2011). Tabulka č. 3: Pěstování révy vinné: moderní vinohradnictví (PAVLUŠEK, 2011) Aromatická látka Aromatické a chuťové vlastnosti Prahová hodnota [ng/l] 4-merkapto-4-methylpentan-2-on (4-MMP) Černý rybíz, zimostráz 0,8 3-merkaptohexylacetát (3-MHA) Plod mučenky, ovocné tóny, angrešt, černý rybíz, exotické plody 4 3-merkaptohexan-1-ol (3-MH) Plod mučenky, grapefruit 60 4-merkapto-4-methylpentan-2-ol (4-MMPH) Citrusová kůra 55 3-merkapto-3-methylbutan-1-ol (3-MMB) Vařený pór 1500 U divokých Vitis spp., některých přímoplodících hybridů a interspecifických odrůd lze pozorovat příchuť po jahodách. Přímoplodící hybridy byly od počátku svého vzniku spojeny s aromatickým projevem jahod ve vůni a chuti. Za jeho výskyt v hroznech a vínech odpovídá 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2,3-dihydroxy-3-furanon (furaneol), který se hromadí v bobulích během zrání. Typickým příkladem odrůd s vyšším obsahem furaneolu je Isabella, Concord, Delaware, Noah nebo stolní odrůda Alden (PAVLUŠEK, 2011). 21

Tabulka č. 4: Pěstování révy vinné: moderní vinohradnictví (PAVLUŠEK, 2011) Ročník drůda Furaneol ppb Senzoricky poznatelné jahodové aroma 1992 Isabella (V. labrusca) 2340 + 1992 Noah (V. labrusca x V. riparia) 1350 + 1992 Bacchus x Gf.A 100-3 620 + 1992 Castor 325 + 1994 Regent 5 _ 1992 Ryzlink rýnský 7 _ Aromatický charakter vína může negativně ovlivňovat tvorba těkavých fenolů. Tento účinek se projevuje zejména u bílých odrůd, u nichž často hnědne slupka, objevuje se hořká a tříslovitá chuť a bývá ovlivněna i barva. Hnědnutí slupky u bílých odrůd poukazuje na vyšší obsah fenolických látek, zejména hydroxyskořicových kyselin. Kyselina ferulová, kumarová, fertarová a koutarová jsou hlavní prekurzory těkavých fenolů. Hydroxyskořicové kyseliny bývají uloženy především v dužnině a slupce. Mezi citlivé odrůdy patří Chardonnay, Ryzlink vlašský, Muškát moravský a Veltlínské zelené. Velkou roli zde sehrává kvalita odlistění. Intenzivní oslunění hroznů podporuje tvorbu prekurzorů těkavých fenolů (PAVLUŠEK, 2011). Při zrání jsou bobule někdy napadeny šedou hnilobou hroznů révy (Botrytis cinerea), která může pozměňovat složení aromatických látek v bobulích. Houba napadá slupku a způsobuje poškození kutikuly i voskovité vrstvy. Ve slupce vznikají poškození, kterými uniká cukr a odpařuje se voda. Hrozny s vyšším obsahem cukrů bývají také napadeny ušlechtilou formou šedé hniloby, která způsobuje rovněž změny aromatických látek. Vzniká sloučenina 1-okten-3-ol, vyvolávající typický houbový tón žampionů a lesní půdy, a sloučenina sotolon (4,5-dimethyl-3-hydroxy-2-furanon), jež vytváří nasládlou, karamelovou příchuť. Botrytis cinerea pozměňuje také složení monoterpenů v bobulích. Tato změna vede ke ztrátě odrůdového aroma a tvorbě aroma typického pro hrozny s ušlechtilou hnilobou. Díky těmto změnám aromatických profilů není možné z hroznů napadených ušlechtilou šedou hnilobou vyrábět vína s charakterem terroir (tzn. pojem, jímž se označuje stanoviště pro pěstování révy 22

vinné se všemi přírodními faktory, které na ni působí), ale spíše přírodně sladká vína (PAVLUŠEK, 2011). 3.1.3.2 Těkavé látky pocházející z prefermentačních procesů Prefermentační procesy jako je odzrnění, drcení a lisování zahrnují fyzické narušení struktury hroznů a umožňují tak interakce mezi sloučeninami, které byly předtím odděleny buněčnou strukturou. C 6 aldehydy a alkoholy, jako jsou trans-hexen-2-al, cis-hexan-2-ol a hexa-2,4-dienal vznikají během drcení a jsou pravděpodobně tvořeny interakcí lipoxygenázy a malého množství linolové a linoleové kyseliny uvolněné z hroznů a listů (SCHREIER et al., 1976). Na rozdíl od aldehydů pocházejících z hroznů nejsou tyto sloučeniny pravděpodobně redukovány na alkoholy během fermentace a mohou propůjčit travní a bylinnou vůni vínům jako jsou Savignon blanc, Grenache a vínům vyráběných z nezralých hroznů (JACKSN, 2000). 3.1.3.3 Těkavé látky pocházející z fermentace Primárním cílem fermentace je katabolismus hexóz na ethanol, ale také vznik mnoha klíčových těkavých látek vytvářených jako vedlejší produkty metabolických procesů kvasinek. V tomto procesu sice vzniká nejvíce těkavých látek, ale u většiny je koncentrace tak malá, že je pod chuťovým prahem vnímání a tím pádem mají zanedbatelný vliv na buket vína (EBELER, 2001). Je známo, že mnoho kyselých sloučenin je produkováno nebo modifikováno během fermentace. Mezi sloučeniny takto vzniklé můžeme zařadit těkavé mastné kyseliny až do C 12, zejména hexanová, oktanová a dekanová, které pravděpodobně vznikají jak katabolickými tak anabolickými cestami. K vůni vína přispívají i různé estery pocházející z procesu fermentace. Produkují širokou škálu ovocných, květinových a někdy i travních tónů. Alifatické estery, obzvláště estery monokarboxylových kyselin, tvoří velký podíl těchto látek nacházejících se ve víně. Nejdůležitější z nich jsou ty, které vznikají jako výsledek reakce ethanolu s nasycenými mastnými kyselinami, kyselinou octovou a přiboudlinami (JACKSN, 2000). Linalool, monoterpen nacházející se v hroznech a mladých vínech, může být přeměněn na α-terpineol, nerol, geraniol a hydroxy linalool během zpracování a procesu 23

zrání vína. Příbuzná sloučenina, vinný lakton se nachází v některých bílých vínech, v nichž přispívá ke kokosovým, dřevitým a sladkým tónům (EBELER, 2001). Sirné sloučeniny ve vínech jsou často zodpovědné za pachuť, ale některé jsou klíčové pro odrůdové vlastnosti některých kultivarů. Tyto sirné sloučeniny téměř úplně chybějí v hroznech, ale mohou být uvolněny ze svých konjugovaných prekurzorů s S-cysteinem kvasinkovou cystein-β-lyázou při fermentaci (TMINAGA et al., 2000). 3.1.3.4 Vývoj těkavých látek během stárnutí Rapp (1990) klasifikoval reakce vína během zrání v lahvích do čtyř základních typů: Změny v obsahu esterů. Ubývá acetátu a přibývají ethyl estery monoa dikarboxylových kyselin. Tvorba produktů degradace karotenů. Tvorba produktů rozkladu sacharidů. Reakce sloučenin monoterpenů katalyzovaných kyselinou. vocné nízkomolekulární estery octové kyseliny většinou přesáhnou svých vyvážených koncentrací, když se zpomaluje fermentace a hydrolyzují se zpětně na své původní alkoholy a kyselinu octovou. To se projeví ztrátou ovocného buketu (JACKSN, 2000). Dosažení vyvážené koncentrace kyseliny octové, acetátu a alkoholů bylo popsáno po šesti letech zrání v lahvích. Rovnováhy některých těchto sloučenin nebylo dosaženo ani po deseti letech stárnutí (RAPP, 1990). Monoterpeny pocházející z hroznů podstupují přestavby katalyzované kyselinami, jejichž výsledkem jsou změny v koncentraci těkavých látek a vznik nových sloučenin jako jsou cis- a trans-1,8-terpin (EBELER, 2001; JACKSN, 2000). Linalool může být degradován na geraniol, nerol a α-terpineol. Díky těmto látkám můžeme ve víně nalézt aroma po růžích, květinách, plísních a borovicích (JACKSN, 2000). 24

3.2 Extrakční techniky Různé extrakční techniky umožňují získat z původního vzorku hledanou látku. bvykle jsou spojeny s koncentrováním analytu. Jsou založeny na rozdělovacím koeficientu mezi původním vzorkem a cílovým prostředím. 3.2.1 Extrakce z kapaliny do kapaliny Při analýzách vína se běžně používá extrakce z kapaliny do kapaliny (LLE) pomocí organických rozpouštědel. Použitím azeotrponích směsí s více jak jedním rozpouštědlem je možné modifikovat polaritu extrahovaných sloučenin a vylepšit účinnost. Účinnost extrakce se obvykle zvyšuje po přidání soli. Nicméně tuto techniku je možné použít při analýzách s bodem varu, který není příliš nízký, jinak by došlo ke ztrátám během manipulace se vzorkem. Jako příklad je možné uvést extrakci volatilních látek z vína do Freonu 11 podle Zhou (1996). 3.2.2 Statický headspace Headspace je plynná fáze nad kapalnou nebo pevnou fází vzorku, která se nachází v septem uzavřené vialce. Po dosažení rovnováhy se těkavé látky rozptýlí v plynné fázi v koncentraci, která odpovídá jejich tlaku par nad hladinou vzorku. Tato technika vyžaduje minimální manipulaci se vzorkem a nepoužíváme při ní rozpouštědlo. Bohužel její účinnost je nízká. Mohou jí být analyzovány pouze sloučeniny, jejichž bod varu není příliš vysoký. V některých případech mohou být tyto problémy vyřešeny mírným zahřátím kapalného nebo pevného vzorku, a nebo zvýšením jeho iontové síly. Tato technika byla úspěšně uplatněna při analýzách různých těkavých sloučenin ve víně např. Guth (1997). 3.2.3 Dynamický headspace Tato technika je alternativou statického headspace a také se týká pevných či kapalných vzorků, které reagují s plynnou fází nad vzorkem. Prostor nad vzorkem je čištěn použitím toku plynu, který unáší těkavé látky do místa záchytu (purge a trap), kde jsou absorbovány a koncentrovány. Po tomto procesu je nutný krok desorpce, většinou jde o tepelnou desorpci (RSILL, 1999). 25

3.2.4 Mikroextrakce na pevnou fázi Extrakce na pevnou fázi (SPME) byla vyvinuta nedávno jako technika nevyžadující rozpouštědlo (KATAKA, 2000). Využívá k extrakci a zkoncentrování analyzované látky ze vzorku polymerem obalená vlákna. Vzorek je poté přímo přenesen do injektorového vstupu plynového chromatografu (GC), který je vybaven pro teplotní desorpci a analýzu. Vlákna používaná k analýze vína jsou obalena různými sorbenty: Carbowax-divinylbenzenem, polydimethylsiloxanem, polyacrylátem nebo Carboxen-polydimethylsiloxanem. Proměnné jako jsou iontová síla, teplota a čas extrakce, míchání a objem vzorku musí být optimalizovány. Měla by být vzata v úvahu interference matrice vína. Pokud jsou vlákna ponořena v tekutině při odebírání vzorku, jsou tyto interference větší (HWARD, 2005). 3.3 Plynová chromatografie Plynová chromatografie je rozšířená separační metoda, při které se ze vzorku oddělují jednotlivé složky. K separaci plynů a par se využívají dvě heterogenní fáze. Mobilní fází je zpravidla inertní plyn. Stacionární fází je nejčastěji kapalina zakotvená na inertním nosiči, méně často povrchově aktivní absorbent (PPL & KUBÁT, 1981). Vzorek se dávkuje do proudu plynu, který jej dále unáší kolonou. Proto se mobilní fáze nazývá nosný plyn. Aby vzorek mohl být transportován, musí se ihned přeměnit na plyn. V koloně se složky separují na základě různé schopnosti poutat se na stacionární fázi. Složky opouštějící kolonu indikuje detektor. Signál z detektoru se vyhodnocuje a z časového průběhu intenzity signálu se určí druh a kvantitativní zastoupení složek (KLUDA, 2003). 3.3.1 Dávkovač Úlohou dávkovače je rychle a reprodukovatelně dávkovat do kolony plynný, kapalný nebo tuhý vzorek. Separační účinnost kolon a přesnost výsledků závisí na způsobu dávkování a konstrukci dávkovacího systému. Při dávkování je třeba zajistit, aby: a) Vzorek v co možná nejkratším čase vnikl do kolony jako píst. b) Se nezměnily tepelné a tlakové podmínky v koloně. 26

c) Dávkování bylo reprodukovatelné, a aby po dobu dávkování nedocházelo ke změně složení vzorku (CHURÁČEK, 1990). Plyny je možno dávkovat injekčními mikrostříkačkami, obtokovými pipetami nebo dávkovacími kohouty. Kapaliny nebo roztoky se dávkují injekčními stříkačkami propíchnutím silikonové zátky a dávkováním vzorku do vyhřátého dávkovacího prostoru, z kterého se páry nosným plynem přivedou na začátek kolony. K dávkování tuhých vzorků se konstruují zvláštní dávkovače. Nejčastěji se však dávkují jako vzorky v těkavých rozpouštědlech injekčními mikrostříkačkami. Dávkování vzorků do plněných kolon se podstatně liší od dávkování do kapilárních kolon. Protože v plněných kolonách je dostatečné množství stacionární fáze, kolona se nezahltí ani po dávkování relativně velkého množství vzorku (při analytických aplikacích lze dávkovat až 10-4 g vzorku v objemu 1 až 10 μl). Do kapilárních kolon je nutno dávkovat velmi malá množství a ve velmi malých objemech (zpravidla méně než 10-6 g). Pro plněné kolony se v současnosti používají zvláště dávkovací systémy, které umožňují dávkovat vzorek přímo do kolony přímo mikrostříkačkou přes silikonovou zátku. Při dávkování vzorku do kapilárních kolon se zpravidla vzorek po zplynování v dávkovači rozdělí na dvě části. Hlavní část (např. 99 %) se nosným plynem vymyje do ovzduší. Zbytek vzorku se nosným plynem přivede do kapilární kolony (CHURÁČEK, 1990). Známe různé metody nastřikování: a) nástřik do kolony (on colum) je základní metodou u náplňových kolon. Dávkuje se 1 až 10 μl vzorku. Je preferován pro kapilární kolony větší světlosti (od průměru 0,25 mm) s použitím jemné nastřikovací jehly pro 0,2-2 μl vzorku. Horní část kolony je zahřívána na teplotu o 10-30 C nižší než je teplota varu rozpouštědla. Vzorek musí být rychle nastříknut a vytvořit kapalný film na stěně kolony. Po 30-60 s se teplota kolony prudce zvýší, aby nastalo odpaření. b) nástřik pomocí dělícího toku (split injection). Tenčí kapilární kolony mají malou kapacitu, proto se zejména u koncentrovaných vzorků musí pomocí děliče toku (splitter) jeho část s nosným plynem oddělit. Do kolony se dostává jen definovaný zlomek nastřikovaného množství (zpravidla 0,1-10 %), které bývá v intervalu 0,1-2 μl. 27

Skleněná vata v odpařovací trubici zajišťuje homogenní odpařování a účinné promíchání vzorku před vstupem do kolony. c) nástřik bez dělícího toku (splitless injection). Metoda je vhodná pro relativně velké objemy (0,5-5 μl), které je nutno použít pro stopovou analýzu. Používá se totéž zařízení jako s dělením toku, ale odvod děliče je uzavřen. Vzorek se dávkuje pomalu do odpařovací trubice a nechá se asi 60 s odpařovat. Poté se provede oplach septa. Dlouhá doba vstupu vzorku do kolony by vedla k rozšíření zón. Tomu se bráníme pomoci Grobovy metody. Tato metoda využívá rozpouštědla s vyšší teplotou varu (např. oktanu), které kondenzuje a vytvoří kapalný film v hlavě kolony. V něm jsou pohlceny všechny analyty. Jakmile jsou analyty zachyceny a je proveden oplach septa, je zvýšena teplota kolony a separace začne probíhat (KLUDA, 2003). 3.3.2 Chromatografické kolony Separační kolona je srdcem chromatografického přístroje, v ní dochází k chromatografickému dělení. Podle konstrukce se rozlišují kolony náplňové a kolony kapilární. Pro konstrukci kolon se používají trubice z různého materiálu, např. skla, nerezové oceli, polyethylenu, teflonu a dříve i mědi (MIKEŠ et al., 1980). Náplňové kolony lze rozdělit na klasické a mikronáplňové. Klasické náplňové kolony se nejčastěji vyrábějí z nerezové oceli, hliníku, Teflonu, polyethylénu a skla. Délka kolony se volí podle toho, jaký problém je třeba řešit, a zpravidla je v rozmezí 30 až 400 cm. Jsou však publikovány příklady, v nichž byly použity podstatně delší kolony. Vnitřní průměr analytických kolon je 2 až 4 mm. Na preparativní účely se používají větší průměry. Mikronáplňové kolony se nejčastěji zhotovují ze skla. Délka kolon je zpravidla větší než u klasických náplňových kolon. Vnitřní průměr je asi 1 mm. Náplní klasických a mikronáplňových kolon může být tuhý zrnitý adsorbent, a nebo kapalina zakotvená na vhodném nosiči (CHURÁČEK, 1990). Kapilární kolony využívají jako nosiče stacionární fáze své vnitřní stěny. Vyrábějí se obvykle z taveného křemene. Vnitřní průměr kolon je v intervalu 0,1-0,6 mm, tloušťka filmu stacionární fáze 0,25-5 μm, délka 15-60 m, kapacita 50 ng - 15 μg a účinnost 1000-3000 teoretických pater na 1 m. Pro většinu aplikací postačuje délka kapiláry 30 m. Větší průměr kolony dává možnost pojmout více vzorku. Použití 28

menších průměrů kolon vede k vyšší účinnosti, ale nižší kapacitě. Užší kolony nemohou být tak dlouhé, protože by byl prodloužen čas separace. becně tedy platí, že roste-li vnitřní průměr a tloušťka stacionární fáze, účinnost separace se snižuje. Kapilára je obalena polyimidovou vrstvou, která dává křehkému materiálu kolony pružnost a brání ho před zlomením. Kolonu chrání do teplot 350 C; termicky stabilnější hliníková vrstva může být použita do 425 C (maximální teplotu ale určuje stabilita zakotvené stacionární fáze a analytu). Podle uložení mobilní fáze rozlišujeme tři typy kapilárních kolon: V kolonách WCT (Wall Coated pen Tubular) tvoří kapalná stacionární fáze tenký film na vnitřní stěně kapiláry. Kolony musí být velmi úzké, aby byl zajištěn dostatečný styk mobilní fáze se stacionární fází. Kolony SCT (Support Coated pen Tubular) mají na vnitřní stěně vrstvu nosiče se zakotvenou kapalinou. Kolony PLT (Porous Layer pen Tubular) mají na vnitřní stěně tenkou vrstvičku pórovitého materiálu (např. aluminy) jako absorbentu (KLUDA, 2003). Pro výběr kapalné stacionární fáze nebo adsorbentu k separaci dané směsi neexistuje žádná objektivní metoda. Vhodná fáze se většinou volí podle zkušenosti a zkusmo. Kapalná stacionární fáze má dobře, ale nestejně rozpouštět jednotlivé komponenty vzorku, nemá být těkavá při pracovní teplotě (1-13 Pa), má být tepelně stálá (stálost může být zhoršována katalytickým vlivem nosiče apod.) a chemicky inertní pro chromatografovanou látku při teplotě měření. (MIKEŠ et al., 1980). Dále by měla pevně ulpívat na nosiči, aby nedocházelo k jejímu vymývání z kolony. Hojně využívaným řešením je chemické zesíťování stacionární kapaliny a případné navázání kovalentní vazbou na nosič (KLUDA, 2003). Výběr stacionární fáze také závisí na složení vzorku. Je proto vhodné mít o vzorku co nejvíce informací ještě před zahájením analýzy, znát očekávané komponenty, jejich body varu, strukturu apod. Pro úspěšnou analýzu platí, že stacionární fáze by měla mít podobnou chemickou strukturu jako složky směsi. Například uhlovodíky se nejlépe separují na uhlovodíkových zakotvených fázích, kdežto polární sloučeniny na polárních fázích (MIKEŠ et al., 1980). 29

3.3.3 Detektory Detektory jsou zařízení, jejichž úkolem je detekovat v nosném plynu složky, které opouštějí chromatografickou kolonu. d detektoru se vyžaduje rychlá odezva, velká citlivost a stabilita základního (nulového) signálu. Žádoucí je i vysoká selektivita pro stanovované složky vzorku. Podle dějů, které probíhají při detekci, je možno detektory rozdělit na nedestrukční a destrukční. V nedestrukčních detektorech látka prochází detektorem bez toho, aby se chemicky změnila. Mezi tento typ detektorů patří tepelně vodivostní detektor, detektor elektronového záchytu, argonový a heliový detektor, infračervený spektrometr a některé další. V destrukčních detektorech se látka ireverzibilně změní. Do této skupiny patří plamenový ionizační, termoionizační detektor a hmotnostní spektrometr (CHURÁČEK, 1990). 3.3.3.1 Plamenově ionizační detektor V plamenově ionizačním detektoru (FID) se molekuly plynu ionizují v kyslíkovodíkovém plameni a vedou ionizační proud mezi elektrodami. Nosný plyn se před vstupem do hořáku mísí s vodíkem, vzduch je přiváděn z vnějšku. Přítomnost složky zvýší ionizaci a elektrický proud se zvětší. Detektor je velmi citlivý. Detekční limity jsou v pikogramech analytu. Jako nosný plyn se hodí nejlépe dusík, ale použitelné jsou i ostatní nosné plyny. Detekuje prakticky vše, s výjimkou anorganických par a plynů (necitlivost na vodu sice nabízí možnost jejího použití jako rozpouštědla, ale voda snižuje odezvu detektoru a může až zhasnout hořák). rganické látky se teplem plamene štěpí na radikály, které s vodíkem v redukční části plamene dávají radikály CH. Ty se oxidují za vzniku iontů CH + a elektronů, což je rozhodující pro odezvu detektoru. Ionty zanikají rekombinačními reakcemi, např. s vodou (vznik iontu H 3 +, který posléze zachytí elektron za vzniku vody a radikálu H) a s heteroatomy molekul organických sloučenin. dezva detektoru roste s počtem uhlíkových atomů poskytujících ionty CH + a klesá s přítomností heteroatomů v molekule. Proto je detektor citlivý na uhlovodíky (KLUDA, 2003). Když se spojí GC s FID, sloučeniny mohou být detekovány v tak nízkých koncentracích jako je jeden nanogram (PMERANZ & MELAN, 2002). Poté může být provedena identifikace sloučenin s použitím vnitřního standardu srovnáním 30

s Kovatsovým indexem (KI) (KVÁTS, 1965). GC FID a KI srovnání jsou stále extenzivně používané k rutinní identifikaci malého počtu jasně oddělených píků (VERSINI et al., 2008). 3.3.3.2 Hmotnostní spektrometr Největší technický pokrok i úspěch zaznamenává spojení plynového chromatografu s hmotnostním spektrometrem (MS). Z analytického hlediska je v principu dvojí řešení. Buď se používá MS pouze pro rozlišení záznamu píků na chromatogramu, které odpovídají částicím se sledovanou hmotností a MS pracuje za těchto okolností jako vysoce selektivní detektor, nebo registruje spektra vybraných (popř. všech) píků chromatogramu. Tento způsob je dnes častější. Získává se při něm vlastně úplné spektrum jednotlivých složek analyzované směsi. Moderní MS (kvadrupólového typu) umožňují sejmout spektrum v dostatečně krátké době (např. 0,01 s) a v dostatečném rozsahu detekovaných hmotností. Nemusí se tedy přerušovat proud nosného plynu, aby účinnost kolony nebyla snížena (MIKEŠ et al., 1980). Při kombinaci metod GC MS vstupují sloučeniny rozdělené GC metodou do MS tekutým proudem a jsou bombardovány elektrony. Tím dojde k tvorbě iontů, které mohou být rozděleny dle hmotnosti a rychlosti a následně detekovány a měřeny (PMERANZ & MELAN, 2002). GC MS může detekovat těkavé látky o koncentracích 10-5 g/l a větších. Kombinace těchto metod je jedinečná pro svoji schopnost simultánního získání retenčního času a hmotnostního spektra (REINECCIUS 2006; EBELER 2001). Porovnání frakcí iontů s datovými knihovnami umožňuje jednoznačnou identifikaci i těch sloučenin, které jsou přítomny jen ve stopových množstvích (VERSINI et al., 2008). 31

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Laboratorní vybavení 4.1.1 Standardy Eukalyptol 99 %, Fluka 4.1.2 Vzorek vína Vzorek vína byl poskytnut z Ústavu technologie a mikrobiologie potravin Univerzity Tomáše Bati ve Zlíně se svolením prof. RNDr. Vlastimila Kubáně, DrSc. Jedná se o bílé víno, odrůda a původ nebyl sdělen. Víno bylo aromatizováno lihovým bylinným extraktem. 4.1.3 Přístroje Plynový chromatograf HP-6890 s hmotnostním detektorem HP-5673. 4.1.4 Plyny Helium: SIAD Czech, Czech Republic, čistota 5.5. 4.1.5 SPME analýza Vlákno s červeným označením PDMS. Toto vlákno má tloušťku 100 µm. Nejlépe pracuje při rozmezí ph 2-10. Maximální použitelná teplota je až 270 C a ideální od 200 do 270 C. Pro kondicionaci vlákna je doporučená teplota 250 C po dobu 30 minut. Vybráno podle Alves (2005). 4.1.6 Pracovní pomůcky Vialky 2 ml, vialky 20 ml, pipetky, rukavice, automatické pipety, analytická váha Precisa 240 A, termostat IKA RTC basic. 4.2 Chromatografická analýza Analýzy byly prováděny na plynovém chromatografu HP-6890 vybaveném hmotnostním detektorem HP-5673. Použitá kolona byla HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,5 µm, film z vázaného 5 % fenylu, 95 % dimethylsiloxanu, Hewlett-Packard, 32