Univerzita Palackého Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

Univerzita Palackého Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Zavedení nové úlohy Využití nativních a modifikovaných mikrobiálních buněk jako celobuněčných biokatalyzátorů do výuky Experimentální metody biochemie (KBC/EMB) FRVŠ projekt 2421/2012/G4

Sylabus inovovaného pokročilého cvičení z biochemie. 1) Spektroskopické stanovení interakce enzymu se substrátem. 2) Nativní elektroforéza proteinů, imunoblotting. 3) Stanovení molekulové hmotnosti proteinů metodou gelové chromatografie na FPLC a SDS elektroforézy. 4) Chromatofokusace. 5) Imunochemické metody - dvojitá radiální imunodifuze podle Ouchterlonyho, střetná (protisměrná) imunoelektroforéza, raketová imunoelektroforéza. 6) HPLC separace bioaktivních látek. 7) Nízkotlaká iontoměničová kapalinová chromatografie. 8) Proteolytické štěpení proteinového vzorku v gelu a peptide sequencing s použitím ESI-Q-TOF-MS. 9) Lokalizace proteinů a enzymů v tkáňových řezech (světelná mikroskopie). 10) Stanovení látek amperometrickým biosensorem. 11) Kovalentní imobilizace trypsinu na magnetické nosiče. 12) Využití nativních a modifikovaných mikrobiálních buněk jako celobuněčných biokatalyzátorů. 2

1. IMOBILIZACE MIKROBIÁLNÍCH BUNĚK A JEJICH VYUŽITÍ JAKO CELOBUNĚČNÉ BIOKATALYZÁTORY 1.1. TEORETICKÝ ÚVOD Mikrobiální buňky plní v potravinářském průmyslu a nejrůznějších biotechnologických aplikacích významné funkce, pro tyto účely je potřebná jejich imobilizace. Existuje několik základních postupů pro imobilizaci buněk /1/. Jednoduchá, levná a reverzibilní adsorpce probíhá za mírných podmínek, nedochází k chemickým změnám nosiče a buněk, proto si udržují poměrně vysokou aktivitu. Často v tomto případě však dochází k uvolňování z nosiče, neboť nespecifická interakce je tvořena slabými silami. Může také dojít ke kontaminaci produktu reakce uvolněnými buňkami. Kovalentní imobilizace je charakteristická stabilní vazbou mezi funkčními skupinami na povrchu pevného nosiče a buňky. Hlavní výhodou jsou především malé ztráty imobilizované složky a zvýšení její stability. Buňky však při této vazbě mohou ztratit část své aktivity a náklady na přípravu jsou vyšší. Buňky lze mezi sebou také vzájemně zesíťovat do většího komplexu pomocí fyzikálních nebo chemických metod. Zřídka se využívá jako samostatná metoda pro imobilizaci, nejčastěji slouží k vylepšení jiné metody. Zesítění stabilizuje pevnost vytvořené struktury, ale užitá činidla mohou negativně ovlivnit buňky /2/. Pro imobilizaci buněk je vhodná zejména metoda enkapsulace (zabudování) do struktury vhodné biokompatibilní (bio)polymerní porézní matrice (např. alginát), která umožňuje volný pohyb substrátu a produktu enzymové reakce, ale zároveň účinně zadržuje buňky (Obr. 1). Tato nosná matrice plní zároveň ochrannou funkci vůči negativním vlivům vnějšího prostředí. Při enkapsulaci může být zabudováno poměrně velké množství buněk a lze ji využít i pro koimobilizaci. Při méně vhodné volbě matrice může docházet k uvolňování imobilizované složky a k difúzním problémům /2/. V průmyslových aplikacích bývají buňky často zachycovány např. v dutých nosičích hollow fibres nebo v analogických membránových systémech. Pro imobilizaci buněk musí být splněno několik základních předpokladů. Pro kovalentní imobilizaci by vhodná matrice měla mít dostatečně velký povrch a obsahovat funkční skupiny, které se uplatní při adhezi buněk. Materiál nosiče a imobilizační proces nesmí narušit biologickou strukturu a metabolickou aktivitu vázaných buněk. Pro následnou aplikaci je důležitá snadná manipulace s nosičem a také možnost následné regenerace 3

materiálu pro případné opakované použití, např. v potravinářském průmyslu i jeho nezávadnost. Z ekonomického pohledu je podstatné, zda je zvolený imobilizační materiál i proces cenově výhodný /3b/. Výhoda imobilizovaných buněčných systémů /4/ spočívá především v možnosti jejich opakovaného použití a to i v kontinuálních procesech /5/. Vhodná matrice může částečně chránit imobilizované buňky vůči okolnímu prostředí a různým náhlým fyzikálně-chemickým změnám (ph, teplota), buňky a jejich enzymové systémy jsou stabilnější a jejich aktivita prodloužena. V těchto systémech je větší hustota buněk, reakce probíhají rychleji a zlepšuje se i tolerance vůči vyšším koncentracím substrátu a vznikajícímu produktu, který mnohdy enzymovou reakci inhibuje. S touto vyšší hustotou biokomponenty klesá i riziko možné mikrobiální kontaminace. Mnohé nosiče lze také regenerovat a opakovaně využít pro další imobilizace /3b/. Manipulace s nosičem může být usnadněna jeho magnetickou modifikací /6/. Takto modifikovanou matrici s imobilizovanou biokomponentou je možné po proběhnutí reakce rychle, snadno a selektivně oddělit z reakční směsi pomocí vhodného magnetického separátoru. Magnetickou modifikaci lze provést různými způsoby. Na povrch buněk je možné navázat magnetické nanočástice, mikročástice nebo paramagnetické kationty, další možností je kovalentní vazba buněk na magnetické nosiče, zesítění buněk v přítomnosti magnetických částic nebo enkapsulace buněk a magnetických částic do biokompatibilního polymeru. Pro tyto účely se často využívají magnetické mikročástice a nanočástice oxidů železa, např. magnetit (Fe 3 O 4 ) nebo maghemit (-Fe 2 O 3 ) /7/. Pro imobilizaci mikrobiálních buněk metodou enkapsulace s možným využitím v potravinářském průmyslu jsou vhodné biopolymery přírodního původu /3a/. Biokomponenta je v tomto případě zabudována v prostředí gelu. Mezi nejznámější rostlinné biopolymery patří škrob, celulosa a jejich deriváty, dále také rostlinné exsudáty jako např. arabská a karajská guma nebo rostlinné extrakty jako např. galaktomannany a jiné polysacharidy. Z mořských řas lze získat alginát a karagenan. Xanthan, gellan, dextran a chitosan jsou biopolymery mikrobiálního a živočišného původu. Alginát /8/ patří do skupiny lineárních aniontových polysacharidů, jedná se o kopolymer (1 4) spojených jednotek α-l guluronové (G) a β-d mannuronové (M) kyseliny. Lineární řetězec je složen jak z homopolymerních úseků těchto G- a M- jednotek, tak i ze smíšených částí obsahujících obě tyto jednotky. Rozpustnost 4

alginátu ve vodě závisí na stupni disociace a typu iontu přítomného ve struktuře, např. při ph>4 tvoří ve vodě rozpustnou formu alginátu sodného. V přítomnosti vápenatých iontů se vytváří nerozpustný gel alginátu vápenatého umožňující imobilizaci buněk. Nativní buňky Saccharomyces cerevisiae, obsažené v pekařském droždí, lze imobilizovat a následně využít pro přípravu invertního cukru /9/. Jedná se o ekvimolární směs D-glukosy a D-fruktosy vznikající hydrolýzou sacharosy enzymem invertasou (β-d-fruktofuranosidasa, E.C. 3.2.1.26), v potravinářství se uplatňuje jako sladidlo, tato směs monosacharidů je sladší než disacharid sacharosa. Při aplikacích v potravinářském průmyslu se do reakčních směsí často přidává peroxid vodíku jako účinné činidlo vůči celé řadě nežádoucích mikroorganismů (bakterie, kvasinky, plísně, viry a organismy produkující spory), využívá se i k bělení. Peroxid vodíku je vhodný díky nízké toxicitě a jeho přebytečné množství je rozloženo enzymem katalasou (H 2 O 2 :H 2 O 2 oxidoreduktasa, EC 1.11.1.6) na netoxické produkty kyslík a vodu. Katalasa je rovněž přítomna v buňkách Saccharomyces cerevisiae /10/. Obr. 1. Imobilizace buněk enkapsulací (převzato z /11/). 1.2. EXPERIMENTÁLNÍ VYBAVENÍ 1.2.1. Laboratorní materiál Pekařské droždí-kvasnice (buňky Saccharomyces cerevisiae) (místní obchod). 1.2.2. Chemikálie Alginát sodný (Sigma-Aldrich), hydroxid sodný (Lach-Ner), chlorid sodný (Lach-Ner), chlorid vápenatý (Penta), chlorid železitý hexahydrát (Roth), kyselina sírová 96% (Penta), manganistan draselný (Penta), peroxid vodíku 30% (Penta), Set na 5

stanovení glukosy (glukosaoxidasa / peroxidasa) (BioSystems), síran železnatý heptahydrát (Penta). 1.2.3. Přístroje a pomůcky Automatické pipety (Eppendorf), Krokový dávkovač HandyStep S (Brand) + Stříkačky Plastibrand PD-Tips (0,1 ml), Magnetický separátor (Invitrogen), Permanentní neodymový magnet (Nd-Fe-B) (Unimagnet), Rotátor Falc F205, Spektrofotometr VIS- 723G (Rayleigh), Mikrocentrifuga (Roth), Vařič (ETA), Vortex (Velp Scientifica); byrety s postranním kohoutem, kádinky, mikrozkumavky, titrační baňky, zkumavky. 1.3. PRACOVNÍ POSTUP a) Příprava kvasinkových buněk Saccharomyces cerevisiae před imobilizací: 1 g kvasnic rozsuspendujeme ve 4 ml roztoku 0,15 mol.l -1 chloridu sodného (fyziologický roztok), homogenní suspenzi kvasinkových buněk rovnoměrně rozdělíme do mikrozkumavek a centrifugujeme v mikrocentrifuze po dobu 5 minut. Po centrifugaci odpipetujeme supernatant, precipitát pelet buněk bude použit pro následující experimenty. b) Příprava magnetických mikročástic oxidů železa: Do skleněné zkumavky nepipetujeme 2 ml 0,1 mol.l -1 roztoku síranu železnatého + 4 ml 0,1 mol.l -1 roztoku chloridu železitého a 2 ml 1 mol.l -1 roztoku NaOH. Vzniklou sraženinu rozmícháme na vortexu a necháme vařit na vodní lázni po dobu 1 hodiny. Vzniklé mikročástice necháme zchladnout, poté magneticky ve zkumavce odseparujeme pomocí magnetického separátoru (Obr. 2) popř. permanentního magnetu a supernatant odlijeme. Následně přidáme destilovanou vodu a rozmícháme na vortexu. Takto promyjeme opakovaně třikrát. 6

Obr. 2. Magnetické separátory (Invitrogen). c) Příprava magnetického celobuněčného biokatalyzátoru imobilizace (enkapsulace) kvasinkových buněk do alginátové matrice s magnetickými mikročásticemi (alginátové kuličky) Do plastové zkumavky (50 ml) navážíme asi 50 mg magnetických mikročástic (vlhké váhy během vážení postupně separujeme částice pomocí magnetu a odsáváme přebytečnou vodu tak, abychom vážili vlhké částice s minimálním obsahem vody). Do zkumavky dále přidáme promyté kvasinkové buňky (1g, viz postup a) ) a 2 ml 2% roztoku alginátu sodného. Tyto tři složky opatrně a pečlivě rozmícháme na vortexu. Připravenou suspenzi buněk, alginátu sodného a magnetických částic pomalu nasajeme do krokového dávkovače se špičkou kapacity 0,1 ml (Obr. 3) (podrobné ovládání dávkovače na konci návodu kapitola 1.5. praktické rady a Obr. 10) a postupně kapeme do 5% roztoku chloridu vápenatého ve vyšší kádince (Obr. 4). Téměř ihned dojde k vytvrzení kapky do tvaru kuličky (vznik alginátu vápenatého). Připravené kuličky necháme alespoň 15 min vytvrzovat, poté kuličky magneticky separujeme ke stěně nádobky, roztok odlijeme a nahradíme ho 1% roztokem chloridu vápenatého, opět necháme působit po dobu asi 30 min. (Další možný postup: vytvrzování kuliček 30 min v 5% roztoku chloridu vápenatého a poté 5 min v roztoku 0,3 mol.l -1 dusičnanu hlinitého.) Kuličky poté několikrát promyjeme 0,15 mol.l -1 roztokem chloridu sodného a skladujeme v roztoku 0,15 mol.l -1 chloridu sodného s obsahem 0,05 mol.l -1 chloridu vápenatého při 4 C v lednici. 7

Obr. 3. Krokový dávkovač HandyStep S (Brand) + Stříkačka Plastibrand PD-Tips. 8

Obr. 4. Příprava magnetického celobuněčného biokatalyzátoru kapání směsi kvasinkových buněk a magnetických částic v alginátu sodném do roztoku chloridu vápenatého a jejich vytvrzení (alginát vápenatý), separace připravených kuliček pomocí permanentního magnetu. d) Hydrolýza sacharosy magnetickým celobuněčným biokatalyzátorem opakované použití (spektrofotometrické stanovení) Do zkumavky odvážíme asi 200 mg pečlivě promytých kuliček (vlhké váhy) a přidáme 5 ml 20% roztoku sacharosy. Zkumavku umístíme na rotátor (Obr. 6) a necháme reagovat při laboratorní teplotě po dobu 20 min při otáčkách 20 rpm. Poté vyjmeme z rotátoru a pomocí magnetu separujeme kuličky ke stěně zkumavky, odebereme do mikrozkumavky vzorek (asi 0,5 ml) a zbytek odlejeme. Kuličky několikrát promyjeme vodou a přidáme znovu substrát (20% sacharosu) a postup opakujeme dle časového prostoru (alespoň 3 reakční cykly). Stanovení množství glukosy vzniklé hydrolýzou sacharosy pomocí setu pro stanovení glukosy: Do malé plastové zkumavky napipetujeme 1 ml reakční směsi ze setu. Odebraný vzorek zředíme desetkrát, poté z něho odebereme 5 µl a napipetujeme do reakční směsi. Rozmícháme na vortexu a necháme 20 min inkubovat při laboratorní teplotě (v případě slepého vzorku místo vzorku pipetujeme výchozí roztok sacharosy). Na spektrofotometru (Obr. 5) změříme absorbanci vzorků při 500 nm (v plastové zúžené kyvetě). Koncentraci glukosy zjistíme z rovnice kalibrační přímky roztoků glukosy (8 koncentrací v rozsahu 2,5 20 mmol.l -1 ) a přepočtem příslušného ředění. 9

Obr. 5. Spektrofotometr VIS-723G (Rayleigh). e) Rozklad peroxidu vodíku magnetickým celobuněčným biokatalyzátorem různé počáteční koncentrace peroxidu vodíku (titrační stanovení manganometrie) Ze zásobního 30% peroxidu vodíku si ředěním připravíme roztoky o různých koncentracích (např. koncentrace 0,01% 0,5% 1% 2% H 2 O 2 ). Do alespoň 4 plastových zavíracích zkumavek (50 ml) navážíme asi 200 mg pečlivě promytých kuliček (vlhké váhy) a do každé přidáme roztok (25 ml) o rozdílné koncentraci peroxidu vodíku. Zkumavky umístíme na rotátor a necháme reagovat při laboratorní teplotě po dobu 60 min při otáčkách 20 rpm. Poté vyjmeme z rotátoru a pomocí magnetu separujeme kuličky ke stěně. Z každé zkumavky odebereme do kádinek 20 ml vzorku. Stanovení nerozloženého zbytkového peroxidu vodíku provedeme manganometrickou titrací: k 20 ml vzorku titrační baňce (o objemu 500 ml) přidáme 40 ml destilované vody a 15 ml roztoku kyseliny sírové (490 g.l -1 ). Obsah v baňce rozmícháme a po kapkách za stálého míchání přidáváme z byrety roztok manganistanu draselného (0,25 mol.l -1 ) až do okamžiku, než se objeví světle růžové zbarvení, které přetrvává po dobu 30 sekund. (Pozn.: původní vzorky 0,5%, 1% a 2% H 2 O 2 titrujeme byretou o objemu 25 ml se stupnicí po 0,1 ml, nejnižší koncentraci 0,01% pipetou po 10-20 µl). Spotřebované objemy titračního roztoku si zaznamenáme a vypočítáme zbývající koncentraci peroxidu vodíku v reakční směsi po reakci. 10

Obr. 6. Rotátor Falc F205. 1.4. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Hydrolýza sacharosy: Koncentraci glukosy v reakční směsi po reakci vypočítáme dosazením naměřených hodnot absorbancí do rovnice lineární regrese kalibrační přímky standardních roztoků glukosy, uvažujeme příslušné ředění vzorku před spektrofotometrickým stanovením. Množství vzniklé glukosy v jednotlivých reakčních cyklech odpovídá aktivitě celobuněčného biokatalyzátoru. V grafu opakovaného použití (operační stability) na osu x uvedeme počet změřených reakčních cyklů a na osu y můžeme uvést koncentraci glukosy v každém reakčním cyklu nebo zbytkovou aktivitu v % (koncentraci glukosy v prvním cyklu uvažujeme jako 100 % aktivity, případný pokles enzymové aktivity se projeví i menším obsahem vzniklé glukosy, a tedy snížením procentového vyjádření aktivity). Rozklad peroxidu vodíku: MnO - 4 + 8H + + 5e - Mn 2+ + 4H 2 O 5H 2 O 2 + 2MnO - 4 + 6H + 5O 2 + 2Mn 2+ + 8H 2 O. Z rovnice oxidace peroxidu vodíku si vyjádříme poměr látkových množství peroxidu vodíku a manganistanu draselného: 5 n(h 2 O 2 ) = 2 n(mno - 4 ) n(h 2 O 2 ) = 5/2 n(mno - 4 ) 11

Poté si vyjádříme vztah pro výpočet koncentrace peroxidu vodíku, který zbyl ve směsi po reakci: c(h 2 O 2 ) = 5 * c(mno - 4 ) * V(MnO - 4 ) / 2 * V (H 2 O 2 ) Koncentraci peroxidu vodíku jsme vypočítali v objemu 75 ml roztoku použitých pro titraci. Proto ještě vypočítáme koncentraci v původním nezředěného vzorku roztoku peroxidu vodíku použitého před / po reakci s kuličkami. Do grafu na osu x zaznamenáme použité počáteční koncentrace roztoků peroxidu vodíku před reakcí a na osu y zaznačíme zbytkovou koncentraci peroxidu vodíku po reakci s kuličkami. 1.5. PŘÍKLADY VÝSLEDKŮ, MOŽNÉ PROBLÉMY A PRAKTICKÉ RADY PRO EXPERIMENTY a) Příklady výsledků Hydrolýza sacharosy magnetickým celobuněčným biokatalyzátorem opakované použití: Uvedený experiment demonstruje velký význam opakovaného použití imobilizovaných kvasinkových buněk a zvláště usnadnění procesu separace díky jeho magnetickým vlastnostem za použití magnetu. Tyto předpoklady jsou důležité pro použití biokatalyzátoru v potravinářském průmyslu a biotechnologiích. Imobilizované buňky a jejich enzymy si zachovávají po enkapsulaci do biopolymeru aktivitu a reagují se substrátem (zde invertasa hydrolyzující sacharosu), nedochází k výraznějšímu poklesu aktivity, jak je vidět z grafu naměřených hodnot (Obr. 8). Graf zobrazuje koncentraci glukosy po reakci v jednotlivých reakčních cyklech (zjištěna z naměřených absorbancí po dosazení do rovnice kalibrační přímky (Obr. 7), započítáno také ředění vzorku). Z časových důvodů jsou zde provedeny čtyři reakční cykly. Dále je možno v reakcích pokračovat a sledovat případný úbytek enzymové aktivity, kterou lze vyjádřit i v procentech a do grafu zanést jako zbytkovou aktivitu (%) na osu y (koncentrace glukosy po prvním reakčním cyklu odpovídá 100%). 12

Obr. 7. Kalibrační řada roztoků glukosy závislost absorbance na koncentraci glukosy, lineární regrese (rovnice regrese a hodnota spolehlivosti). Obr. 8. Opakované použití (operační stabilita) magnetického celobuněčného biokatalyzátoru závislost hydrolýzy sacharosy imobilizovaným biokatalyzátorem na počtu reakčních cyklů. Rozklad peroxidu vodíku magnetickým celobuněčným biokatalyzátorem různé počáteční koncentrace peroxidu vodíku: Tento experiment demonstruje možnost použití biokatalyzátoru pro reakci s dalším substrátem peroxidem vodíku, kdy dochází k jeho rozkladu 13

v buňkách obsaženým enzymem katalasou. Použité množství kuliček při daných reakčních podmínkách rozložilo vždy při různých koncentracích peroxidu vodíku přibližně stejný podíl, v průměru 40 % obsahu peroxidu vodíku. Výsledky jsou patrné z porovnání počáteční koncentrace peroxidu vodíku před reakcí a zbytkové koncentrace po reakci (Obr. 9). Kdybychom zvýšili množství reagujících kuliček případně reakční čas, došlo by k rozkladu většího množství peroxidu vodíku. Obr. 9. Použití magnetického celobuněčného biokatalyzátoru pro reakci s různými koncentracemi substrátu závislost rozkladu peroxidu vodíku imobilizovaným biokatalyzátorem na počáteční koncentraci peroxidu vodíku. Z důvodu omezeného časového prostoru bylo pro demonstrativní účely vybráno testování těchto dvou závislostí. Kromě opakovaného použití biokatalyzátoru a reakce s různými koncentracemi substrátu lze testovat např. časovou závislost reakce enzymu se substrátem a závislost množství vzniklého produktu na množství biokatalyzátoru. b) Možné problémy a praktické rady pro experimenty Při tvorbě kuliček magnetického celobuněčného biokatalyzátoru opatrně odkapáváme dávky směsi do roztoku chloridu vápenatého tak, aby se nám tento roztok nedostal do kontaktu se špičkou stříkačky dávkovače směs by 14

tak začala tuhnout už ve špičce a ucpal by se tak její otvor. Vytvořené kuličky se shromažďují na hladině, po nakapání určitého množství kuliček je vhodné krouživým pohybem roztokem zamíchat, aby se kuličky ponořily do celého objemu a nedocházelo tak k jejich shlukování na hladině. (Při práci s dávkovačem také dbáme na správnou manipulaci se zařízením (Obr. 10) dle pokynů vedoucího cvičení a přiloženého návodu. Ovládání je odlišné od klasických automatických pipet, nesprávným nasazováním stříkačky by mohlo dojít k poškození mechanismu dávkovače.) 15

Obr. 10. Manipulace s krokovým dávkovačem: dávkovaný objem regulujeme otočným šroubem (hodnoty dle tabulky na dávkovači); sklopíme střední páčku směrem dolů; vsuneme stříkačku do spodního otvoru a opatrně přitlačíme, dojde k zacvaknutí; vrátíme sklopenou páčku do původní kolmé polohy (při nejnižší poloze páčky je i píst stříkačky v celém jejím objemu); pomalým posunem páčky směrem vzhůru nasajeme obsah do stříkačky; zbytky směsi na stěnách stříkačky setřeme buničinou a dávkovač je připraven k použití; uchopíme dávkovač a palcem můžeme stlačovat vrchní páčku, která již dávkuje zvolený objem; po vyprázdnění obsahu stříkačky opět sklopíme střední páčku směrem dolů; stříkačku z dávkovače uvolníme posunutím spodní páčky (poté sklopíme střední páčku do původní kolmé polohy). Při manipulaci s magnetickým celobuněčným biokatalyzátorem dbáme na opatrnou manipulaci, abychom nepoškodili jeho strukturu. Při opakovaném použití magnetický celobuněčný biokatalyzátor vždy důkladně promyjeme, aby byl zbaven jeho povrch zbytků nezreagovaného substrátu či produktů reakce. Při použití setu na stanovení glukosy si pro použití odlijeme potřebné množství ze zásobní lahve, nesmí dojít ke kontaminaci jejího obsahu. Při přípravě roztoku kyseliny sírové pro titraci při ředění postupujeme opatrně (ochranné pomůcky rukavice, brýle), po malých částech přidáváme kyselinu do vody a chladíme na ledu, neboť se intenzivně uvolňuje teplo. Při titraci dbáme na opatrnou manipulaci s byretou a na promazání skleněných součástí postranního kohoutu pro snadné a přesné dávkování. Při manganometrii se první nadbytečná kapka titračního činidla (roztoku manganistanu draselného) po dosažení bodu ekvivalence projeví přetrvávajícím růžovým zbarvením titrovaného roztoku. V byretě v tomto případě odečítáme horní meniskus, neboť se jedná o titrační činidlo intenzivního zbarvení. Další variantou přípravy magnetických mikročástic oxidů železa je syntéza ze soli železa (síran železnatý) v alkalickém prostředí za účasti mikrovlnného záření. V tomto návodu byl pro realizaci vybrán postup vzniku částic při varu roztoků železnaté a železité soli. 16

Pro demonstraci významu magnetických vlastností (snadná a rychlá manipulace magnetická separace) imobilizovaného biokatalyzátoru lze pro srovnání připravit sérii magnetických (s magnetickými částicemi) a nemagnetických kuliček. Pro srovnávací experimenty může být imobilizován i komerční enzym (např. Invertasa ze Saccharomyces cerevisiae, Sigma), je však zřejmá výhodnost a účelnost enzymu fungujícího přímo v buňce (neprovádí se izolace enzymu, finančně nenáročný materiál pekařské droždí kvasnice v porovnání s drahým komerčním enzymem). 1.6. KONTROLNÍ OTÁZKY Uveďte možnosti různých typů imobilizace mikrobiálních buněk. Porovnejte vlastnosti buněk imobilizovaných adsorpcí a kovalentně a výhody / nevýhody těchto imobilizačních postupů. Jak lze následně stabilizovat imobilizované buňky? Jaký typ imobilizace mikrobiálních buněk byl použit v popsané laboratorní úloze? Diskutujte možnosti této imobilizační metody. V čem spočívají hlavní výhody použití imobilizovaných systému? Jaký význam má magnetická vlastnost nosiče pro imobilizaci? Uveďte příklady různých způsobů magnetické modifikace nosiče pro imobilizaci. Jak byla magnetická modifikace provedena v popsané laboratorní úloze? Jaká matrice je vhodná pro imobilizaci mikrobiálních buněk? Uveďte příklady. Jaké enzymy jsou např. obsaženy v buňkách Saccharomyces cerevisiae? Které reakce katalyzují a jaké vznikají produkty, jak se využívají v průmyslu? Co je to invertní cukr? Zjistěte princip setu pro stanovení obsahu glukosy ve vzorku. Popište princip a význam metody prováděné v popsané laboratorní úloze. 17

1.7. SEZNAM LITERATURY /1/ Katzbauer B., Narodoslawsky M., Moser A.: BioProcess Engineering 12, 1995: 173-179. /2/ Elnashar M. M.: Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology 1, 2010: 61-77. /3/ Zuidam N. J., Nedović V. A.: Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing, Springer, 2010: 31-100 (a), 327-344(b). /4/ Ishige T., Honda K., Shimizu S.: Current Opinion in Chemical Biology 9, 2005: 174-180. /5/ Groboillot A., Boadi D. K., Poncelot D., Neufled R. J.: Critical Reviews in Biotechnology 14, 1994: 75-107. /6/ Safarikova M., Maderova Z., Safarik I.: Food Research International 42, 2009: 521-524. /7/ Safarik I., Safarikova M.: China Particuology 5, 2007: 19-25. /8/ Guisan J. M.: Immobilization of Enzymes and Cells 2nd ed., Humana Press, 2006: 345-355. /9/ Safarik I., Sabatkova Z., Safarikova M.: Journal of Magnetism and Magnetic Materials 321, 2009: 1478-1481. /10/ Safarik I., Sabatkova Z., Safarikova M.: Journal of Agricultural and Food Chemistry 56, 2008: 7925-7928. /11/ Kourkoutas Y., Bekatorou A., Banat I. M., Marchant R., Koutinas A. A.: Food Microbiology 21, 2004: 377-397. 18