SPR Povrchová Plasmonová Resonance Zdroj: Wiki
Co je SPR? Fyzikální jev využívající interakci světla s tenkou vrstvou kovu k měření absorbce látek na tuto vrstvu Rozhraní optický hranol voda Voda Lom Odraz Hranol Část světla se odráží a část se láme
Odražené světlo Kritický úhel totální odraz Od určitého úhlu dopadu dochází k totálnímu odrazu Světlo neprochází do vody zcela se odráží zpět do hranolu 100% Kritický úhel Voda Hranol 0% ~53 0 Úhel dopadu světla
Přidáme vodivou vrstvu na rozhraní hranol-voda Na rozhraní kov-dielektrikum (voda) při totálním vnitřním odrazu světla dochází k excitaci elektronů v kovu vznikají tzv. plasmony Na rozhraní kov-voda vzniká tzv. evanescentní vlna Při určitém úhlu dopadu a frekvenci světla dojde k resonanci při které dochází k absorbci světla téměř žádné světlo není odraženo
Odražené světlo SPR Pokles odrazu při správném úhlu dopadu světla se nazývá SPR dip 100% Plasmon SPR dip Hranol 0% 53 Úhel dopadu světla
Odražené světlo SPR měření absorpce na povrch Úhel kdy dochází k rezonanci je závislý na indexu lomu média v blízkosti rozhraní Při změně složení média dochází ke změně úhlu dopadu světla při kterém dochází k rezonanci 100% Plasmon Hranol 0% Úhel dopadu světla
Odpověď Intenzita SPR-křivka převod úhlu na jednotky odezvy Čas [min] Úhel
Instrumentace Jak měříme SPR Měřicí cela Hranol Diodové pole CCD kamera Úhel dopadu světla se měří postupným zapínáním LED diod v diodovém poli vyhodnocovaném pomocí CCD kamery
SPR Experiment Na povrch čipu vhodným způsobem imobilizujeme 1. interakčního partnera Ligand Na takto modifikovaný čip přivedeme mobilní fázi obsahující rozpuštěný druhý interakční partner Analyt Měřením jednotek odezvy během vazby analytu a po ukončení přídavku analytu jsme schopni určit vzájemnou afinitu ligandu a analytu a kinetiku jejich interakce
Postup měření Příprava a plánování Návrh experimentu Výběr podmínek Příprava čipu Imobilizace ligandu Kovalentní / Nekovalentní Vlastní interakce Několik koncentrací analytu Vazba a postupná disociace Regenerace čipu Pokud je možná (nekovalentní imobilizace)
Příprava a plánování Interakční podmínky ph, pufr, koncentrace, omezení nespecifických interakcí Kontrola Pozitivní / Negativní Který partner bude ligand a který analyt Pokud není interakce 1:1, více vazebných míst ligand Neznámá/neurčitelná koncentrace - ligand Způsob imobilizace výběr vhodného měřicího čipu
Způsoby imobilizace Často nejdůležitější podmínka úspěšného měření Způsoby imobilizace: Kovalentní Pomocí protilátky Pomocí značky
Způsoby imobilizace Kovalentní vazba aminoskupin (EDAC) Nekovalentní Vazba avidin biotin Metaloafinitní (Ni-NTA) Protein A (protilátky) Sendvičové uspořádání
Způsoby imobilizace sendvičové metody Imobilizace liposomů Čip potažený avidinem liposomy
Postup imobilizace Příprava čipu (conditioning) Oplach povrchu čipu SDS, NaOH, HCl Aktivace povrchu čipu EDAC, Ni 2+ Vazba ligandu Deaktivace Stabilizace
Imobilizace ligandu Deaktivace Aktivace Množství imobilizovaného ligandu je třeba upravit podle očekávané síly interakce s analytem Maximální odezva analytu by měla být příliš vysoká a je přímo úměrná poměru Mw analytu a ligandu M A Rmax n RL M L
Měřící čip Interakce probíhá na křížení Paralelní kanály min 2 (měřicí a referenční) Systém Proteon 6x6 měřicích ploch Jako reference se používají body mezi křížením
ProteOn XPR36 pumpy Čip Autosampler Zásobník pufrů Oplach jehel
Analyt Měřicí čip Proteon Čtvercový čip a 6 kanálků, které mohou být otočeny o 90 Možnost až 36 interakcí zároveň Ligand
Interakce Je nezbytné znát koncentraci analytu (pro K D a k a ) Vzorek stočit, bez bublin, ve stejném pufru v jakém bude probíhat interakce Equilibrium Asociace Disociace Změřit řadu koncentrací okolo předpokládané K D (K D = 10nM 1 nm až 100 nm)
Response, RU Response, RU Response, RU Asociace (+ rovnovážný stav) Délka nástřiku (+ průtok) 60 50 40 30 20 10 180 160 140 120 100 80 60 40 20 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20-60 -40-20 0 20 40 60-50 0 50 100 150 200 0 100 200 300 400 500 600 time, seconds time, seconds time, seconds krátká optimální Zbytečně dlouhá Koncentrace analytu 120 25 90 100 20 70 80 15 50 60 40 10 30 20 5 10 0 0-10 -20 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000-5 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 nízká optimální příliš vysoká
Disociace Interakce se stejným K D mohou mít odlišnou sílu vazby jinou k d K D =1x10-6 [M] k a =1x10 2 (1/Ms); k d =1x10-4 (1/s) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0-2 0 50 100 150 200 250 300 k a =1x10 5 (1/Ms); k d =1x10-1 (1/s) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0-20 0 50 100 150 200 250 300
Referencování Odečtení referenčního měření je nezbytné pro odstranění vlivu následujících jevů: Změna refrakčního lomu pufru (bulk effect) Baseline drift Odmývání ligandu z povrchu čipu Nespecifická vazba analytu na čip Reference povrchu a pufru Pufr bez analytu Povrch bez ligandu
RU RU Referenční povrch Měřicí dráha bez navázaného ligandu: vliv pufru Původní data čas Referencovaná data čas
RU RU Referenční povrch Reference na tzv. interspot Využití všech 6 kanálů Nemusí být stejný povrch Původní data čas Referencovaná data čas
RU RU Referenční mobilní fáze Mobilní fáze bez analytu na povrchu s ligandem Odstraňuje baseline drift Paraelně nebo před/po měření Již referencováno na povrch Čas Dvojitě referencováno Čas
Referenční mobilní fáze sec sec Pouze pufr Odmývání ligandu z povrchu čipu
Zpracování výsledků Získaná data dosud nezpracovaná (6x6 experimentů)
Před vlastním zpracováním Odečtení reference Povrch bez ligadu Případně dvojitá reference Zarovnání v osách x a y na 0 Odstranění artefaktů Úzké prošvihy Bubliny v mobilní fázy
Analýza dat Zpracovaná data Analyzovaná data 200 150 100 ka=6.88x10 4 kd=0.0125 KA=5.5x10 6 KD=1.82x10-7 Chi 2 =4.86 50 0-50 3800 4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 Lineární regrese stavu ekvilibria, exponenciální ve fázích asociace a disociace K D je možné spočíst jak z ekvilibria tak z poměru k a a k d k a a k d se počítají z nerovnovážných stavů (asociace a disociace)
Interakce A+B k a k d AB k a popisuje rychlost asociace komplexu Jednotkou k a je M -1 s -1, obvykle mezi 10 3 a 10 7 k d popisuje rychlost disociace komplexu Jednotkou k d je s -1, obvykle mezi 10-1 a 10-6 K D je poměr k d ku k a
Kinetika interakce d[ab]/dt=k a [A] t [B] t -k d [AB] t Během asociace: [A] = konstantní [B] = [B] max [AB]t V rovnovážném stavu: d[ab]/dt=0 k a [A] eq [B] eq =k d [AB] eq [AB] eq = Disociace - [A]=0 [AB] t = [A][B] max [A]+K D [AB] 0 e -k dt
Req RU Analýza rovnovážného stavu Pro[A]>>K D R eq = R max time X X X X Různé koncentrace analytu Pro [A]<<KD R eq = X X [A]R max K D [A]
Proč k a a k d? analýza kinetiky Interakce se stejným K D mohou mít odlišnou sílu vazby jinou k d K D z kinetických dat a rovnovážného stavu by měla být stejná K D =1x10-6 [M] k a =1x10 2 (1/Ms); k d =1x10-4 (1/s) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0-2 0 50 100 150 200 250 300 k a =1x10 5 (1/Ms); k d =1x10-1 (1/s) 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0-20 0 50 100 150 200 250 300
Modely používané v analýze kinetiky vazby Langmuirův model: klasická interakce 1:1 Limitovaný přenosem hmoty: difuze analytu k ligandu je pomalejší než vlastní interakce Bivalentní analyt: 2 (stejná) vazebná místa na analytu Heterogenní analyt / ligand Langmuirův model s driftem baseliny
Hodnocení výsledků
Hodnocení výsledků Program vám vždy spočte nějakou hodnotu K D, ale je tato hodnota reálná? Vizuální kontrola proložení 50 40 30 45 20 35 10 25 0-10 15-20 0 10 30 50 70 90 110 130 150 5-5 -30-10 10 30 50 70 90 110 130 150
Hodnocení výsledků Rozdíl oproti teoretickým hodnotám (residuals): co nejmenší a hlavně náhodně distribuované okolo 0
Hodnocení výsledků Chi 2 druhá mocnina průměru residuals. V případě ideálního průběhu křivky je rovna šumu (1-2 RU) Dobrý fit by měl vycházet s chi 2 max. 20 Pokud nemáte dobrou shodu experimentálních dat s modelem, potom výsledky fitování tímto modelem nemůžete použít!
Regenerace čipu Pouze u některých typů nekovalentní vazby Nejčastěji NTA čipy odmytí iontů pomocí EDTA Destruktivní kompletní očištění čipu až na zlatou vrstvu/sklo a vytvoření nového povrchu (externě, např. Ústav fotoniky a elektroniky AV ČR)
Příklady použití Inhibitory enzymu Farmaceutické využití Ligand protein (vazba aminoskupin, his-tag) Protein lipidová částice Imobilizace liposomů na čip pomocí lipidové kotvy Charakterizace protilátek Afinita vůči antigenu, specifita Ligand protilátka (vazba aminoskupin, protein A) Protein protein interakce Interakce protein nukleová kyselina
Příklad: interakce protilátka-antigen Interleukin-2 + příslušná protilátka Biorad Protilátka imobilizována pomocí vazby aminoskupin
Příklad: interakce protilátka-antigen M-PMV matrixový protein + protilátka antihis-tag Protilátka imobilizována pomocí vazby aminoskupin
Termoforéza Objevena 1870 (Jonh Tyndall) Částice v plynu/kapalině se v gradientu teploty pohybují (pozitivní/negativní termoforéza) D difuzní koeficient D T koeficient termální difuze Ve vodném prostředí silně ovlivněna změnou hydratace molekuly Tradičně používána při výrobě čistých polovodičů Je nutný velký teplotní gradient (10 8 K/cm) Dlouho nepoužitelná pro biologické systémy Využitelná až díky pokroku v IR laserech velký gradient teploty při rozdílu cca 2-5 C
Microscale Thermophoresis Vyvinuta společností nanotemper Termoforetický pohyb zajištěn IR laserem, termoforesa je sledována pomocí fluorescence Jeden z interakčních partnerů musí fluoreskovat (a druhý nesmí, alespoň ne ve stejné oblasti)
Příprava vzorku Na rozdíl od SPR není potřebná imobilizace Fluorescenční značení: - autofluorescence (malá molekula, tryptofan u proteinu) - koexprese proteinu s GFP - kovalentní značení fluoroforem (vazba přes lysin) Konstantní koncentrace značeného partnera Koncentrační řada neznačeného partnera (musíme znát koncentraci)
Měření termoforézy
Měření a interpretace výsledků Měří se fluorescence v bodě, kam je zamířen IR laser Sleduje se úbytek/zvýšení fluorescence v závislosti na koncentraci interakčního partnera Vyhodnocení podobné jako u SPR (fluroreskující molekula ligand, neznačená molekula analyt)
Srovnání termoforézy s SPR Výhody: Levnější Není potřeba imobilizace Rychlejší Nevýhody: Vypovídá pouze o stavu v rovnováze Nutnost fluorescenčního značení Problémy u agregujících vzorků