urychlit sedimentaci pevných částic v hustota, viskozita

Transkript

1 Centrifugace

2 Literatura

3 Centrifugace Důvodem použití centrifug je nutnost urychlit sedimentaci pevných částic v kapalném prostředí. Nasedimentacimávliv 1. vlastnost látky: velikost, tvar, hustota 2. vlastnost prostředí (rozpouštědla): hustota, viskozita

4 Centrifugace 20. léta 20. století - Svedberg - počátky laboratorních centrifug a analytické centrifugace; teoretické základy metody 50. léta - Brakke - centrifugace v gradientu hustoty

5 Theodor Svedberg ( ) 1971) Nobelova cena za chemii 1926 pojmenována po něm Svedbergova jednotka pro vyjádření sedimentačního koeficientu

6 Centrifugace Odstranění hrubých částic z roztoku Sediment (pelet) supernatant Izolace organel nebo biomakromolekul Stanovení základních parametrů MW, hustota, sedimentační koeficient

7 Použití Centrifugace Preparativní Analytická

8 Rozdělení centrifug Centrifugace Pomalootáčková Rychlootáčková Ultracentrifugace ot/min ot/min ot/min

9 Otáčky g ω 2 g = ω.r r rad ω- uhlová rychlost (rad/s) ω = 2π. π f f otáčky/min

10 Otáčky g rad

11 Preparativní centrifugace Centrifugace diferenciální dvě fáze (sediment supernatant) zonální zóny (gradient)

12 Metody nanášení vzorku Metoda frontální vzorek v celé kyvetě zonální vzorek - úzká zóna

13 Preparativní centrifuga

14 Preparativní centrifuga

15 Preparativní ultracentrifuga

16 Rotory Úhlový diferenciální centrifugace Výkyvné zonální centrifugace Zonální bez kyvet, vzorek je uvnitř rotoru

17 Úhlový rotor

18 Diferenciální centrifugace opakovaná centrifugace se zvyšující se rychlostí otáček = gravitací

19 Výkyvný rotor

20 Gradientová centrifugace Hustotní bariera Diskontinuální Kontinuální

21 Gradientová centrifugace Hustotní bariera Diskontinuální Kontinuální

22 Gradientová centrifugace média Kriteria pro výběr centrifugačního media: musí v roztoku tvořit gradient nesmí interferovat se vzorkem musí být lehce odstranitelné ze vzorku

23 Gradientová centrifugace Sacharosa média Glycerol Ficoll - dextran Hypertonické prostředí Nutno připravit gradient Percoll SiO 2 CsCl Cs 2 SO 4 Gradient vzniká během centrifugace

24 Gradientová centrifugace

25 Gradientová centrifugace Metoda Izopyknická Nerovnovážná

26 Gradientová centrifugace

27 Gradientová centrifugace

28 Diferenciální versus gradientová centrifugace

29 Zonální rotor

30 Zonální rotor

31 Centrifugace se zonálním rotorem

32 Centrifugace se zonálním rotorem

33 Centrifugace se zonálním rotorem

34 Analytická ultracentrifugace

35 Analytická ultracentrifugace

36 Analytická ultracentrifugace

37 Analytická ultracentrifuga

38 Optický systém

39 Optický systém

40 Optický systém Absorbční optický systém UV-VIS od 200 do 800 nm detekce makromolekul obsahujících silný chromofor Rayleighův interferenční optický systém měří změny indexu lomu analýza makromolekul neobsahujících silný chromofor (např.polysacharidů) nebo vzorků obsahujích v pufru silně absorbující látky (např.atp/gtp, DTT oxidovaný)

41 Optický systém Zkřížená optika Interferenční optika Fotografiký systém Absorbční systém

42 Analytická ultracentrifugace Metoda sedimentační rovnováhy sedimentační rychlosti

43 Metoda sedimentační rovnováhy M r = 2 RT d ln (1 Vρ) 2 dx c

44 Metoda sedimentační rovnováhy M r M r- molární hmotnost V - parciální objem 2 RT d lnc = ω - úhlová rychlost ρ - hustota roztoku 2 (1 Vρ) dx x - vzdálenost od osy otáčení c - koncentrace

45 Metoda sedimentační rovnováhy

46 Metoda sedimentační rovnováhy Termodynamické informace (závisí na Mr) Experimentálně lze stanovit : Relativní molekulovou hmotnost sacharosa Mr (Mr = 360) až po viry (Mr = mnoho milionů) Stav molekul v roztoku - asociace Rovnovážné konstanty v roztoku K výpočet volné energie asociačních reakcí

47 Metoda sedimentační rychlosti sorbance A - abs x - vzdálenost 2 Mr - molární hmotnost V - parciální objem ϖ xm r (1 V ρ ) v = ω - úhlová rychlost ρ - hustota roztoku f x - vzdálenost od osy otáčení f - frikční koeficient

48 Metoda sedimentační rychlosti

49 Metoda sedimentační rychlosti Hydrodynamické parametry (závisí na Mr a tvaru molekuly) Experimentálně lze stanovit : Sedimentační koeficients Difuzní konstant onstantu D nebo frikční faktor f Relativní molekulovou hmotnost Mr Tvar molekuly v roztoku