VYSOKÁ ŠKOLA BÁŇSKÁ TECHNICKÁ UNIVERZITA OSTRAVA Hornicko-geologická fakulta Institut environmentálního inženýrství

VYSOKÁ ŠKOLA BÁŇSKÁ TECHNICKÁ UNIVERZITA OSTRAVA Hornicko-geologická fakulta Institut environmentálního inženýrství MIKROMYCETY A JEJICH MORFOLOGIE V LABORATORNÍCH PODMÍNKÁCH bakalářská práce Autor: Vedoucí bakalářské práce: Kristýna Paráková Mgr. Hana Vojtková, Ph.D. Ostrava 2014

PROHLÁŠENÍ Celou bakalářskou práci včetně příloh, jsem vypracovala samostatně a uvedla jsem všechny použité podklady a literaturu. - Byla jsem seznámena s tím, že na moji bakalářskou práci se plně vztahuje zákon č. 121/2000 Sb. autorský zákon, zejména 35 využití díla v rámci občanských a náboženských obřadů, v rámci školních představení a využití díla školního a 60 školní dílo. - Beru na vědomí, že Vysoká škola báňská Technická univerzita Ostrava (dále jen VŠB- TUO) má právo nevýdělečně, ke své vnitřní potřebě, bakalářskou práci užít ( 35 odst. 3). - Souhlasím s tím, že jeden výtisk bakalářské práce bude uložen v Ústřední knihovně VŠB- TUO k prezenčnímu nahlédnutí a jeden výtisk bude uložen u vedoucího bakalářské práce. Souhlasím s tím, že údaje o bakalářské práci, obsažené v Záznamu o závěrečné práci, umístěném v příloze mé bakalářské práce, budou zveřejněny v informačním systému VŠB- TUO. - Souhlasím s tím, že bakalářská práce je licencovaná pod Creative Commons Attribution- NonCommercial-ShareAlike 3.0 Unported licencí. Pro zobrazení kopie této licence, je možno navštívit http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/ - Bylo sjednáno, že s VŠB-TUO, v případě zájmu o komerční využití z její strany, uzavřu licenční smlouvu s oprávněním užít dílo v rozsahu 12 odst. 4 autorského zákona. - Bylo sjednáno, že užít své dílo bakalářskou práci nebo poskytnout licenci k jejímu komerčnímu využití mohu jen se souhlasem VŠB-TUO, která je oprávněna v takovém případě ode mne požadovat přiměřený příspěvek na úhradu nákladů, které byly VŠB-TUO na vytvoření díla vynaloženy (až do jejich skutečné výše). V Ostravě dne 30. 4. 2014.. Kristýna Paráková

PODĚKOVÁNÍ Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucí bakalářské práce Mgr. Haně Vojtkové, Ph.D. za profesionální vedení, trpělivost a připomínky při vypracování této závěrečné práce.

ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá morfologií mikroskopických vláknitých hub v laboratorních podmínkách. Práce je zaměřena na základní charakteristiku mikromycet, která zahrnuje morfologii, výživu, rozmnožování, druhovou diverzitu a významné druhy plísní. Dále je věnovaná pozornost použitým kultivačním médiím a práci v laboratoři při kultivaci mikroskopických hub. Na závěr jsou popsány a vyhodnoceny kultivované vzorky plísní. KLÍČOVÁ SLOVA Mikromycety, kultivace, kultivační půdy, saprofytismus, Ascomycota, Penicillium ABSTRACT The bachelor thesis deals with the morphology of microscopic fungi in laboratory conditions. This work is focused on the basic characteristics of fungi, which includes the morphology, nutrition, reproduction, the species diversity and important species of fungi. In addition, attention is paid to the used culture media and laboratory work in the cultivation of microscopic fungi. In conclusion there are cultivated specimens of fungi described and evaluated. KEY WORDS Micromycetes, cultivation, culture media, Ascomycota, Penicillium

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A. niger Aspergillus niger P. crustosum Penicillium crustosum P. glabrum Penicillium glabrum P. chrysogenum Penicillium chrysogenum P. polonicum Penicillium polonicum CMA CYA CZA EA CHYGA MA MHA OA PCA PDRBA SBA kukuřičný agar Czapkův agar s kvasičným extraktem Czapkův agar Endův agar Chloramfenikol glukosou agar Maltózová agar Mueller-Hinton agar Ovesný agar Bramborovo-mrkvový agar Bramborový agar s bengálskou červení Sabouradův agar

OBSAH 1 Úvod... 1 2 Základní charakteristika mikromycet... 2 2.1 Chytridiomycota... 3 2.2 Zygomycota... 4 2.3 Ascomycota... 4 2.4 Basidiomycota... 5 2.5 Deuteromycota... 6 3 Morfologie mikromycet... 7 4 Výživa mikromycet... 9 4.1 Parazitismus... 9 4.2 Saprofytismus... 10 5 Rozmnožování... 11 5.1 Nepohlavní rozmnožování... 11 5.1.1 Fragmentace hyf... 11 5.1.2 Dělení somatických buněk... 11 5.1.3 Pučení somatických buněk... 12 5.1.4 Tvorba nepohlavních spor... 12 5.2 Pohlavní rozmnožování... 12 6 Diverzita mikromycet... 14 7 Významné rody mikromycet... 15 7.1 Aspergillus... 15 7.1.1 Aspergillus niger... 15 7.1.2 Aspergillus flavus... 16 7.2 Penicillium... 16 7.2.1 Penicillium digitatum a italicum... 16

7.2.2 Penicillium camemberti a roqueforti... 17 7.3 Mucor... 17 7.4 Rhizopus... 17 8 Kultivace mikromycet v laboratorních podmínkách... 18 8.1 Materiál a metody... 18 8.2 Kultivované druhy... 22 8.2.1 Aspergillus... 22 8.2.2 Penicillium... 22 8.2.3 Cladiosporium sp.... 24 8.2.4 Microascus... 24 8.3 Vyhodnocení kultivovaných druhů... 25 9 Environmentální význam mikromycet... 26 9.1 Biodegradace... 26 9.2 Bioremediace... 26 9.3 Potravinářský a farmaceutický průmysl... 26 10 Závěr... 27

1 Úvod Téma bakalářské práce je zaměřeno na mikromycety a jejich morfologii v laboratorních podmínkách. Jejím cílem je prokázat na základě dostupné literatury, že vybrané druhy mikroskopických vláknitých hub: Aspergillus niger, Penicillium polonicum, Penicillium chrysogenum, Penicillium crustosum, Penicillium glabrum, Cladiosporium sp., Scopulariopsis brevicaulis, mohou vytvářet v optimálních laboratorních podmínkách kolonie odlišných morfologických znaků na několika typech živných kultivačních půd. Tato práce zahrnuje literární rešerši základní charakteristiky mikroskopických vláknitých hub a posouzení kultivovaných vzorků. 2014 1

2 Základní charakteristika mikromycet Mikromycety se zde vyskytují od nepaměti lidstva. Staly se součástí životního a pracovního prostředí člověka. Odborný název mikroskopických hub pochází z řeckého slova mykos, což v překladu znamená houba. Vědní obor, který se zabývá houbami, se nazývá mykologie. Tento vědní obor vznikl na počátku devatenáctého století, kdy došlo i k velkému rozvoji mykologie, a zabýval se morfologií, fylogenetikou, taxonomií, výskytem a funkcí hub v přírodě (Malíř, 2003; Gibson, 2007). Mezníkem mikroskopických hub se stal objev antibiotik, který dal základ rozvoji biotechnologiím využívajících mikromycet k výrobě léků, enzymů a potravin (Ostrý, 2000). Ještě do nedávna byly houby a rostliny považovány za stejnou skupinu živých organismů. Houby, na rozdíl od rostlin, neobsahují chloroplasty, chromoplasty, leukoplasty, fotosyntetické pigmenty a hlavní chemickou složkou jejich buněčné stěny je chitin, kdežto u rostlin celulóza (differencebetween.net, 2014; Kalina et al., 2005). Mikromycety jsou rozděleny do několika oddělení na základě podobnosti (Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota a Deuteromycota). Spolu s kvasinkami tvoří skupinu mikroskopických hub, které ze sta tisíc druhů hub tvoří šest tisíc rodů (Malíř, 2003; Ostrý, 2000; Bell, 1983). Mikroskopické houby jsou jedno až mnohobuněčné eukaryotické organismy (Ostrý, 2000). Patří k heterotrofním organismům a živí se osmoticky absorpčním způsobem. Produkují extracelulární enzymy, kterými rozkládají sloučeniny a ty procházejí buněčnou stěnou do buňky hub. Řadí se k saprofytům, kteří získávají živiny z organických zbytků, nebo k parazitům, kteří napadají živé organismy (Kalina et al., 2005). Jejich výskyt je kosmopolitní a to díky jejich schopnosti přizpůsobit se nejrůznějším podmínkám (Ostrý, 2000). Tělo mikromycet je tvořeno stélkou, která na povrchu substrátu vytváří různě zbarvené mycelium (Vojtková, 2013/2014). Význam mikroskopických vláknitých hub je všestranný. Dokážou vyrábět humus a rozložit celulózu a chitin, v potravinářském průmyslu se plísně využívají například k výrobě vína či mléčných výrobků. V chemickém a farmaceutickém průmyslu se mikromycety využívají k výrobě organických kyselin, hormonů, vitamínů nebo antibiotik. Dále mají využití v environmentální biotechnologii, kdy dokážou na sebe navázat a vstřebat těžké kovy z vodních toků. Mikromycety však mají i význam negativní, jsou původci chorob planých 2014 2

i kulturních rostlin a způsobují kožní i vnitřní nemoci živočichů a člověka. Některé druhy mikroskopických vláknitých hub jsou toxinogenní a jejich toxiny, které produkují, mohou způsobit tzv. mykotoxikózy, které jsou pro lidský i zvířecí organismus nebezpečné (Vojtková, 2013/2014). 2.1 Chytridiomycota Jedná se o nejstarší skupinu mikroskopických hub a dřív byla chytridiomycota považována za přechodnou skupinu mezi prvoky a houbami. Až díky fylogenetické studii se prokázalo, že patří do říše fungi (Pommerville, 2011; James et al., 2006). Chytridiomycota byla považována za vodní houby, avšak většina druhů se vyskytuje v půdě jako saprofyty rostoucí na organickém materiálu (Esser et al., 2001). Hlavním charakteristickým znakem je tvorba pohyblivých zoospor s bičíkem. K dalším znakům tohoto oddělení patří coenocytická stélka, která může být oválnou buňkou, malou protáhlou hyfou nebo dobře vyvinutým podhoubím. Chytridiomycota se rozmnožují, jak sexuálně tak i asexuálně. Nepohlavní reprodukce probíhá pomocí zoospor a celá stélka je přeměněna na zoosporangium. Do této čeledi patří mnoho důležitých obligátních parazitů, kteří způsobují vážné onemocnění rostlin a endoparazitů. Většina rodů je spojena s rozkladem mrtvé organické hmoty ve vodních a pozemních stanovištích (Dube, 2005). Obrázek 1: Životní cyklus Chytridiomycot (Foros, 2003) 2014 3

2.2 Zygomycota Kmen Zygomycota obsahuje zhruba tisíc druhů a je rozdělen do dvou tříd: Zygomycetes a Trichomycetes. Zástupci se nejčastěji nacházejí v půdě nebo ve zvířecím trusu (Hogg, 2005; Carlile et al., 2001). Hyfy zygomycot jsou coenocytické a obsahují haploidní jádra. Charakteristickým znakem tohoto kmene je tvorba zygospor, které vznikají pářením dvou diferenciovaných gametangií (Hogg, 2005; Esser et al., 2001). Zygomycota jsou důležitá z hlediska ekonomického dopadu na zpracování potravin, v přírodě mají významnou funkci dekompozitorů organických substrátů v půdě. Někteří zástupci parazitují na hmyzu, rostlinách, houbách a mohou způsobovat i mykózu u lidí (Misra et al., 2012; Kubátová et al., 2006). Obrázek 2: Životní cyklus Zygomycot (Foros, 2003) 2.3 Ascomycota Ascomycota neboli vřeckovýtrusné houby jsou největším kmenem říše hub, kde je popsáno zhruba 45% druhů. Charakteristickým znakem je vřecko, které obsahuje askospory. K dalším znakům tohoto kmene patří somatické mycelium, na kterém vznikají pevné shluky sklerocia (Dube, 2005). Právě vřecka, ve kterých se vyskytuje diploidní jádro, 2014 4

jsou jejich jediným společným znakem. Většina druhů vřeckovýtrusných hub žije paraziticky, ale vyskytují se i druhy, které jsou saprotrofní nebo symbiotické. V této skupině se také nacházejí druhy, které jsou technicky a potravinářky významné, používají se například na výrobu antibiotik, růstových regulátorů a feromonů. Vyskytují se na všech typech stanovišť, kde mohou přetrvávat celoročně, avšak ve vodním prostředí se vyskytují jen vzácně (Kalina et al., 2005). Probíhá sexuální i asexuální reprodukce. U pohlavního rozmnožování dochází ke spojení dvou kompatibilních jader (Sumbali et al., 2009). Obrázek 3: Životní cyklus Ascomycot (Foros, 2003) 2.4 Basidiomycota Basidiomycota neboli stopkovýtrusné houby se svou stavbou podobají houbám vřeckovýtrusným (Vojtková, 2013/2014). Druhy zastupující tuto čeleď patří z největší části k suchozemským organismům a pouze ojediněle se vyskytují ve vodním biotopu (Kalina et al., 2005). U oddělení Basidiomycota není asexuální rozmnožování běžné, avšak pohlavní rozmnožování je charakteristickým znakem tohoto oddělení. Sexuální reprodukce probíhá v basidiu, kde se vytváří čtyři bazidiospory. Na životním cyklu basidiomycot se podílejí tři druhy mycelia: primární, sekundární a terciární. Na primárním 2014 5

myceliu dochází ke klíčení bazidiospor a skládá se z haploidních, monokaryotických přepažených hyf. Sekundární mycelium je složeno z dikaryotických buněk, které obsahují dvě jádra z opačných typů páření a vytváří basidia. Terciární mycelium se skládá ze specializovaných dikaryotických hyf, které se podílejí na tvorbě basidia (Dube, 2005). Obrázek 4: Životní cyklus Basidiomycot (Foros, 2003) 2.5 Deuteromycota Deuteromycota, neboli houby nedokonalé, nejsou přirozenou taxonomickou jednotkou hub, které tvoří dvě stádia nepohlavní - anamorfa a pohlavní - telemorfa. Oddělení bylo vytvořeno jako pomocné pro houby, které jsou pouze v anamorfní fázi (Vojtková, 2013/2014; Kalina et al., 2005). Telemorfa buď není známa, nebo je zvlášť zařazena mezi ascomycota či basidiomycota. Mají velmi silně vytvořené vzdušné mycelium různých barev a jsou producenty dalších metabolitů. Rozmnožují se především nepohlavně pomocí konidií, které vznikají na hyfách v konidioforech nebo na povrchu konidiomů (Vojtková, 2013/2014). Deuteromycota se vyskytují ve všech biotopech a nejčastěji se objevují v půdě nebo na rostlinných substrátech. Většina druhů tohoto oddělení tvoří mykotoxiny a patří k významným rostlinným parazitům (Kalina et al., 2005). 2014 6

3 Morfologie mikromycet Vláknité mikroskopické houby jsou eukaryotické organismy a jejich základní stavební jednotkou stélky jsou hyfy, které vytvářejí mycelium (Gibson, 2007). Většina zástupců má stélku myceliální, což znamená, že je tvořena vláknitými hyfami myceliem. Hyfy vytvářejí řetězec buněk, který obsahuje jedno nebo více jader a pevné buněčné stěny obklopují všechny hyfy (Wearing, 2010). Hyfy jsou rozvětvené tubulární buňky, které jsou vyplněné cytoplazmou, která roste a stává se vakualizovanou. Nejstarší hyfy jsou prázdné a mohou být odříznuty od zbývajícího mycelia. Hyfy jsou kontinuální nebo rozdělené do oddílů přepážkami tzv. septy. Jestliže jsou hyfy spojité, tvoří se septa pouze při rozmnožování nebo ve starších hyfách. Septa se vytvářejí centripetálním růstem od stěny hyfy a pouze výjimečně jsou celistvé. Strukturám přidávají septa tuhost a pomáhají kontrolovat tok živin prostřednictvím mycelia. V kontinuální hyfě jsou jádra roztroušená po celé cytoplazmě, naopak v hyfě, která je rozdělená přepážkami, může každá buňka obsahovat jedno a více jader. Septa u přehrádkovaných hyf se liší ve složitosti. Nejčastěji se vyskytují perforovaná septa s centrálním pórem, což umožňuje pohyb cytoplazmy, jader a organel z jedné buňky do druhé (britannica.com, 2014; Heritage et al., 1996). Obrázek 5: Rozdělení houbových hyf (Medical-Labs, 2014) Buňka mikroskopických hub se nijak zvlášť od ostatních organismů neliší. Buňka obsahuje lomazomy, buněčnou stěnu, plazmatickou membránu, jádro, jadérko, jaderný obal, ribozomy, endoplazmatické retikulum, glykogen, mitochondrie a vakuoly. Buněčná stěna 2014 7

je složitá složením i strukturou a její chemické složení není zcela jednotné. Je vícevrstevná a její základní strukturu tvoří nukleonové kyseliny, sacharidy a z 80% polysacharidy jako jsou například bílkoviny a tuky, které slouží k ovládání pohybu vody, aby nedošlo k vysychání stěn. Největší podíl polysacharidové složky tvoří chitin a chitosan u oddělení Zygomycota, nebo chitin a β - 1,3 - glukan, který je běžný u oddělení Chytridiomycota a Basidiomycota. Dále je tvořená z lamel, které tvoří fibrily (britannica.com, 2014; Moore, 2011; Griffin, 1994). Obrázek 6: Buňka mikroskopických vláknitých hub (Kalina et al., 2005) 2014 8

4 Výživa mikromycet Mikromycety jsou heterotrofní organismy konzumující živé i mrtvé organismy se schopností rozkládat veškeré substráty založené na bázi uhlíku. Mohou se živit saprofyticky, paraziticky, anebo žít v symbióze. Energii z potravy získávají pomocí hyf a vylučujících enzymů, které je štěpí na menší organické molekuly a jsou tak absorbovány (Gibson, 2007). Jestliže jsou živiny rozpuštěné, mohou být přímo absorbovány hyfami do buněk. Houby produkují silné enzymy v lysozomech, které mají dvojitou membránu a chrání zbytek buňky před strávením. Produkované enzymy jsou specifické pro substrát, ve kterém působí. Například na rostlinném substrátu bude rozkládat složitý polymer celulózy i ligninu ve stěnách rostlinných buněk. V takovém případě mikromycety produkují celulázu, která působí na celulózu a lignin. Pokud se mikroskopické houby vyskytnou na substrátu mrtvé tkáně živočichů, začnou produkovat různé enzymy. Je li enzym připraven, je cytoplasma i s lysozomy přesunuta ven z buňky aktivním transportem do enzymů, které se uvolňují do substrátu. Tímto způsobem dochází k nerovnováze houbové buňky. Během trávení substrátu enzymy dochází k rozpouštění živin a jsou absorbovány zpět do houby osmózou, čímž se vyrovnává vytvořený nerovnovážný stav. Jakmile jsou horní vrstvy substrátu tráveny, mikromycety začnou růst hlouběji do podkladu a rozšiřovat se kolem původního místa (Hamilton, 2006). 4.1 Parazitismus Parazitické mikroskopické houby získávají živiny z živých rostlin a živočichů (Heritage et al., 1996). Vývoj parazitů je epifytický (vnější), nebo endofytický (vnitřní) (Gwynne- Vaughan, 1922). Vztahy mezi hostitelem a parazitickými houbami jsou různé. U některých jednobuněčných parazitů probíhá celý vývoj uvnitř hostitelovy buňky. Nebo žijí v mezibuněčných prostorách či pod pokožkou a získávají potravu vstřebáváním (Gwynne-Vaughan, 1922). Epifytičtí parazité získávají potravu a živiny odesíláním haustoria do epidermálních buněk hostitele. Potrava se vstřebává přes nepropustné membrány hostitele a parazit tak způsobuje minimální škody (Gwynne-Vaughan, 1922). 2014 9

4.2 Saprofytismus Saprofytické mikroskopické vláknité houby žijí na rozkládajícím se organickém materiálu. Většina mikromycet se živí saprofyticky v půdě, kde hrají zásadní roli v recyklaci organické hmoty. Živí se vylučovanými hydrolytickými enzymy, které stráví různé polymery k produkci rozpustných produktů, které jsou houbou absorbovány (Heritage et al., 1996). 2014 10

5 Rozmnožování Vláknité mikroskopické houby se rozmnožují rozrůstáním hyf nebo sporami. Tyto spory mohou vznikat vegetativně (nepohlavní rozmnožování) a po spájení (pohlavní rozmnožování) (Šilhánková, 2008). Během asexuální reprodukce vzniká více jedinců než u pohlavního rozmnožování proto, že se může opakovat během roku několikrát (Špaček, 1999). Stadium nepohlavního rozmnožování se nazývá anamorfa a naopak stadium pohlavního rozmnožování se nazývá telemorfa. Pokud jsou houby schopny rozmnožovat se vegetativně i spájením, jejich stadium je nazýváno holomorfa (Kalina et al., 2005). 5.1 Nepohlavní rozmnožování Nepohlavní rozmnožování hub je velmi významné především pro rozšíření druhu a u mnoha druhů je dominantním způsobem rozmnožování. Cyklus nepohlavního rozmnožování probíhá několikrát během vegetační sezóny a vzniká při něm velké množství jedinců (Doležálková, 2010; Kalina et al., 2005). Nepohlavně rozmnožující se houby jsou nazývány mitosporické. U nepohlavního rozmnožování nedochází ke střídání jaderných fází a může probíhat na haploidním i dykaryotickém myceliu. Rozmnožování probíhá několika způsoby: dělením buněk, fragmentací hyf nebo stélky, pučením somatických buněk anebo tvorbou nepohlavních spor. U hub je nejčastější právě tvorba nepohlavních spor (Kalina et al., 2005; Špaček, 1999). 5.1.1 Fragmentace hyf Malý fragment hyfy, který je oddělen od mateřského mycelia, je schopen vyvinout nového jedince. Takto vzniklé buňky se nazývají artrospory. Tento typ nepohlavního rozmnožování se vyskytuje nejčastěji u pododdělení basidiomycotina (Sharma, 2004; Špaček, 1999). 5.1.2 Dělení somatických buněk Během somatického dělení buňky dochází k zaškrcení a tvorbě buněčných přehrádek, čímž z jedné mateřské buňky vznikají dceřiné. Tento způsob nepohlavního rozmnožování se vyskytuje především u kvasinek (Špaček, 1999). 2014 11

5.1.3 Pučení somatických buněk Při pučení dochází k tvorbě výrůstků na mateřské buňce. Zatím, co se výrůstek tvoří, se jádro mateřské buňky dělí a dceřiné jádro putuje do výrůstku. Jakmile se výrůstek zvětší, dojde k jeho oddělení od mateřské buňky a stane se novým jedincem. Tento způsob se vyskytuje taktéž nejčastěji u kvasinek, ale v určitých fázích vývinu, či za určitých růstových podmínek k pučení dochází i u ostatních druhů hub (Špaček, 1999). 5.1.4 Tvorba nepohlavních spor Nepohlavní spory mají rozmanitý tvar, velikost, barvu, mohou být jak jednobuněčné, tak vícebuněčné. Pouze u chytridiomycot vznikají zoospory, které mají bičík, a u ostatních oddělení se vytvářejí aplanospory, u nichž se bičíky nevyskytují. Spory nejčastěji vznikají endogenně nebo exogenně na vegetativních hyfách neboli na konidioforech. Seskupují se v různých tvarech a to v tzv. sporodochium, acervulus, koremie anebo pyknidy. Spory vzniklé na konidioforech se nazývají konidie, které vznikají dvěma základními typy: thalickým a blastickým (Kalina et al., 2005). Konidie thalického typu tzv. thalokonidie vznikají z předem vytvořené buňky hyfy, která se rozdělí septy a rozpadne se na jednobuněčné části. Thalokonidie se zvětšují a nabývají konečného tvaru až po uvolnění buňky. Jeden z běžných typů thalokonidií jsou artrospory (Kalina et al., 2005). Blastokonidie, což jsou konidie blastického typu, vznikají pučením z konidiogenní buňky a k jejímu zvětšování dochází už před oddělením od konidiogenní buňky septem. U tohoto typu konidií rozlišujeme další dva typy: holoblastický, u kterého se při tvorbě konidií vyskytují všechny vrstvy stěny konidiogenní buňky, a enterblastický, kde se na tvorbě konidií podílejí pouze vnitřní stěny buňky. Nejběžnější konidie, které vznikají blastickým typem, jsou porospory, fialospory a anelospory (Kalina et al., 2005). 5.2 Pohlavní rozmnožování Mikroskopické houby, které jsou schopny pohlavního rozmnožování, nazýváme meiosporické. U pohlavního rozmnožování musí dojít vždy ke třem po sobě jdoucím fázím - k plazmogamii, karyogamii a meióze. U ascomycot a basidiomycot se vyskytuje časově i prostorově oddělená plazmogamie a karyogamie a vznikají tak různě dlouhé dikaryofáze (Kalina et al., 2005). Diploidní chromozomy jsou odděleny na dvě dceřiné buňky, z nichž 2014 12

každá obsahuje jednu sadu chromozomů. Plazmogamie je fáze, ve které dochází ke spojení dvou haploidních jader. V karyogamii dochází ke vzniku diploidního jádra, které obsahuje dvě sady chromozomů a takto vytvořená buňka se nazývá zygota. Poslední fází je meióza, při které dochází k dělení buněk a počet chromozómů se snižuje na jeden chromozóm na jednu buňku (britannica.com, 2014). Ke karyogamii a následné meióze dochází v jednotlivých specializovaných buňkách: zygoty, zygospory, vřecka a bazidie. Meiózou pak vznikají znovu haploidní spory tzv. zoospory, askospory a bazidiospory. U mikroskopických hub se můžeme setkat s několika typy procesů pohlavního rozmnožování a to s gametogamií, gametangiogamií, spermatizací, somatogamií a autogamií (Kalina et al., 2005). Pohlavní rozmnožování probíhá u typů homotalických i heterotalických. Při homotalismu je potřebná jen jedna stélka. Mycelium, které vzniká z jedné spory homotalických hub, obsahuje jádra obou pohlaví. Tato jádra spolu splynou a dochází ke vzniku zygot. Naopak při heterotalismu je zapotřebí dvou slučitelných typů stélek. V tomto případě mycelium, které vyroste ze spory heterotalických hub, obsahuje jen jádra jednoho pohlaví (Špaček, 1999).. Obrázek 7: Sexuální a asexuální reprodukce mikromycet (expertsmind, 2014) 2014 13

6 Diverzita mikromycet Ačkoliv mikroskopické vláknité houby mají specifické požadavky na stopové prvky, včetně vápníku, hořčíku, železa, zinku, mědi a manganu, k nejdůležitějším faktorům jejich rozmanitosti patří vlhkost, živiny a teplota (Khan et al., 2012). Mikromycety jsou přizpůsobeny teplejšímu klimatu a optimální teplota pro růst kolonií je 15 C až 20 C. Existují psychrofilní a termofilní druhy plísní (Mueller et al., 2004). Termofilní neboli teplomilné mikromycety dokážou růst ve vysokých teplotách. Jejich minimální teplota pro růst je 20 C a maximální 62 C. Termofilní mikroskopické houby mají silnou schopnost rozkládat polysacharidovou složku biomasy (Maheshwari et al., 2000). Naopak psychrofilní neboli chladnomilné mikromycety jsou schopny přežít a rozmnožovat se v extrémně nízkých teplotách, kdy nejnižší limitní teplota je mínus 20 C. Chladnomilné mikroskopické vláknité houby mají sníženou aktivitu enzymu, tekutost membrány a dokážou snížit transport živin a odpadních produktů (D Amico et al., 2006). Dalším významným faktorem je vlhkost vzduchu. Druhy plísní mají odlišné požadavky na vodní aktivitu. Aktivita vody je ekvivalentní k relativní vlhkosti vzduchu. Většina mikromycet vyžaduje úroveň vodní aktivity, která má nejméně 70% relativní vlhkosti (fsec.ucf.edu, 2007). Existují i xerofilní druhy, což jsou plísně rostoucí na suchých místech. Dokážou růst na substrátech s vysokými koncentracemi cukru nebo soli, které mají sníženou vodní aktivitu, která jim ztěžuje příjem vody (Kubátová, 2012). Pro rozmanitost vláknitých hub vyskytujících se v půdě je důležitější množství živin (Mueller et al., 2004). Druhovou diverzitu mikroskopických hub ovlivňuje i lidská činnost. Jakékoliv fyzické narušení životního prostředí plísní, jako je těžba dřeva nebo chemické znečištění má na rozmanitost dramatický dopad. Mikromycety mohou být ovlivněny antropogenní činností přímo nebo nepřímo prostřednictvím narušení rostlinné diverzity (Mueller et al., 2004). 2014 14

7 Významné rody mikromycet Vzhledem k tvorbě vzácných mykotoxinů, jejich využití v potravinářství a biotechnologiích patří mezi významné rody mikroskopických vláknitých hub Aspergillus, Penicillium, Mucor a Rhizopus. 7.1 Aspergillus Rod Aspergillus neboli česky kropidlák se řadí do třídy Eurotiomycetes a čeledi Trichocomaceae. Tento rod se rozmnožuje pouze asexuálně a charakteristickým znakem je hlavičkovité zakončení konidioforů, které se na vrcholu rozšiřuje v tzv. měchýřek. Po celém jeho obvodu vyrůstají konidionosné buňky fialidy, na nichž se vyvíjejí konidie (Varga, 2008; Klaban, 2011; Machida et al., 2010). Aspergillus patří k celosvětově nejznámějším a nejčastějším mikroskopickým vláknitým houbám, avšak nejčastěji se vyskytují v subtropických a tropických oblastech. Nacházejí se v půdě, ve vodě i v ovzduší, kde je jedním z nejčastějších houbových spor. Rod Aspergillus patří mezi hospodářsky významné mikroskopické vláknité houby. Tyto způsobují kontaminaci potravinářských výrobků a mají silnou lipolytickou aktivitu, čímž jsou nebezpečné pro tuky, oleje a pro potraviny s vyšším obsahem tuku. V půdě se podílejí na rozkladu odumřelých zbytků organismů a vyznačují se saprofytickým způsobem života. Využívají se při syntéze chemikálií a v biotechnologii pro produkci enzymů a k průmyslové výrobě organických kyselin. Aspergillus je producentem aflatoxinu, což je jeden z nejdůležitějších mykotoxinů a některé jeho druhy způsobují závažné onemocnění lidí (Klaban, 2011; Pitt et al., 2009; Hess-Kosa, 2011). 7.1.1 Aspergillus niger Aspergillus niger je mikroskopická vláknitá houba rostoucí aerobně na organické hmotě a je schopna růst v širokém rozsahu teplot (6 C 47 C) a ph. Díky těmto podmínkám a vysoké produkci konidiofor se řadí ke kosmopolitním organismům. Aspergillus niger nepatří k patogenním mikromycetám, i přesto, že produkují sekundární metabolity. Ochratoxin A produkuje za příznivých podmínek pouze 3 10% jedinců (Schuster, 2002). Aspergillus niger patří k nejdůležitějším mikroorganismům používaných v biotechnologii pro výrobu extracelulárních enzymů a kyseliny citronové, která se využívá v potravinářském, farmaceutickém a kosmetickém průmyslu. Aplikuje se také 2014 15

v biotransformacích při nakládání s odpady a dokáže absorbovat těžké kovy z odpadních vod (Kapoor, 1999, Schuster, 2002). 7.1.2 Aspergillus flavus Aspergillus flavus patří k saprofytickým mikroskopickým vláknitým houbám a vyskytuje se nejčastěji v půdě a na organické hmotě. Tento druh se vyvíjí i na suchých místech při vysokých teplotách v rozmezí 12 C 48 C, což přispívá k jeho patogenitě na člověka (aspergillusflavus.org, 2005). Aspergillus flavus je významný oportunní patogen a je nejčastější příčinou aspergilózy u lidí. Je producentem karcinogenního sekundárního metabolitu aflatoxinu, který patří k nejsilnějším přirozeně se vyskytujícím toxinům. Napadá a kontaminuje krmiva a potraviny (Machida et al., 2009). 7.2 Penicillium Rod Penicillium česky nazýván štětičkovec se řadí do třídy Pezizomycotina a čeledi Trichocomaceae. Penicillium patří k všudypřítomným oportunním saprofytům a nejčastěji se vyskytuje v půdě. Charakteristickým znakem jsou pleomorfní stádia, která jsou u tohoto rodu známá. Podle typu větvení konidioforů se rod Penicillium rozděluje na čtyři podrody a to Aspergilloides, Furcatum, Penicillium a Biverticillium (Pitt et al., 2009; Klaban, 2011). Penicillium je hospodářsky významný rod, způsobuje kažení potravin a krmiv a v půdě se účastní na rozkladu organických látek. Stejně jako Aspergillus je Penicillium jedním z nejběžnějších vyskytujících se plísní ve vzduchu, které způsobují u lidí alergické reakce. Je také nejčastějším původcem posklizňových chorob a podílí se na rozpadu ovoce a zeleniny. Vytváří sekundární metabolity mykotoxinů, které jsou toxické jak pro zvířata tak i pro lidi. Z nich nejznámější je patulin, ochratoxin A a citrin (Carlile, 2001). 7.2.1 Penicillium digitatum a italicum Penicillium digitatum a italicum rostou na povrchu citrusových plodů, kde produkují práškové olivově zbarvené konidie a způsobují tzv. modrou hnilobu citrusů, která je z 90% zodpovědná za znehodnocení napadených plodů (Ariza et al., 2002). Konidie mají válcovitý tvar a na okraji kolonie je produkován sladký zápach. K odlišným znakům 2014 16

těchto dvou velmi podobných druhů patří rychlost růstu, zbarvení a vzhled konidií (Peberdy, 1987). 7.2.2 Penicillium camemberti a roqueforti Tyto dva druhy Penicillium jsou používány při zrání sýru díky mycelia, které významně přispívá k chuti a váže na sebe vlhkost, čímž nedochází k rozvoji mykotoxigenních hub (Leitao, 2011). Může se vyskytnout také jako kontaminant potravin a v čisté kultuře produkuje PR toxin. Kolonie těchto rodů patří k rychle rostoucím a zbarvení je nejčastěji tmavozelené s bílým třásnitým okrajem. Konidiofory mají velké hladké kulovité konidie (Kubátová, 2006). 7.3 Mucor Česky plíseň hlavičkotvará se řadí do třídy Mucormycotina a do čeledi Mucoracea. Je známo více než padesát druhů a patří k velmi častým a rozšířeným mikroskopickým vláknitým houbám. Nejčastěji se vyskytují v půdě, organických materiálech a na vlhkých stanovištích. Některé druhy jsou schopny růst a fermentovat v anaerobních podmínkách. Kolonie rodu Mucor rychle rostou a vytvářejí bavlněný povlak bílé až žluté barvy. Rod Mucor způsobuje kažení potravin a textilu, hraje důležitou roli v biodegradaci organických materiálů a používá se při fermentačním procesu, kdy je škrob přeměněn na glukózu (mycology.adelaide.edu.au, 2014; Mehrotra et al., 1990; Pitt et al., 2009). 7.4 Rhizopus Rhizopus česky tzv. kropidlovec je rozšířený rod mukorovitých plísní, které rostou rychle na kultivačních půdách. Vytvářejí rozvětvená mycelia šedé barvy. Sporangiofory se vyskytují ve svazcích po dvou a více a nevětví se. Vyrůstají na stolonech, které tvoří na pevném podkladu rozvětvené tmavohnědé rhizoidy. Sporangia jsou kulovitá a kolumela má vyvinutou apofýzu. Po prasknutí sporangia se kolumela s apofýzou obrací, což je pro tento rod charakteristické. Produkční kmeny ve vhodném médiu vytvářejí značné množství kyseliny fumarové, která musí být neutralizována přídavkem CaCO 3. Rhizopus se využívá ve fermentačním průmyslu při výrobě potravin a nápojů (Klaban, 2011; Hui et al., 1995). 2014 17

8 Kultivace mikromycet v laboratorních podmínkách Mikroskopické vláknité houby mají schopnost růstu a rozmnožování na neživých kultivačních médiích, které musí svým složením splňovat optimální podmínky pro růst mikromycet. Mimo potřebných živin v médiích je také potřeba při kultivaci zajistit optimální teplotu, vlhkost a ph prostředí (Podstatová, 2009). Při kultivaci se jako první musí připravit živná média, které se sterilizují v autoklávu a poté se rozdělí do Petriho misek. Na takto připravené preparáty se očkují očkovací kličkou čisté kultury do tří bodů, které tvoří vrcholy rovnostranného trojúhelníku (Frébortová, 2008; Šilhánková, 2002). Při očkování plísní nesmí do kultivačního média vniknout cizí organismy, aby nedošlo ke kontaminaci a následnému znehodnocení vzorku. Kultury vytvořené na agarech se musí přeočkovávat během dvou až šesti měsíců, aby se zamezilo odumírání mikroskopických vláknitých hub. Takto kultivované plísně necháme růst při optimální teplotě, která je 20 C až 28 C (Hodek, 2009; Booth, 1971). Mikromycety jsou následně identifikovány na základě morfologické charakteristiky. Sledují se makroskopické znaky, které jsou ovlivněny použitou živnou půdou a stářím buněčné kultury a zjišťuje se rychlost růstu, charakter povrchu kolonií, barva a vzhled mycelia. Poté se sledují znaky mikroskopické, které zahrnují charakter vzdušného mycelia (tloušťka vláken, přítomnost septů, barva a struktura mycelia), sporangioforů nebo konidioforů (délka, tloušťka stěn, barva a způsob větvení) a fruktifikačních orgánů (tvar, velikost, barva, struktura povrchu) (Harrigan, 1998; Šilhánková, 2002; Hodek, 2009). 8.1 Materiál a metody Kultivační média a jejich příprava Kultivační média vytvářejí prostředí, které umožňuje růst houbových mikroorganismů. Mají definované složení a existují v tekutém a tuhém typu (lekarske.slovniky.cz, 2008). Použitá dehydratovaná kultivační média byla zakoupena od firmy Himedia Laboratories Ltd., Mumbai, Indie a jejich složení je popsáno níže. Média byla připravena dle návodu výrobce a byla sterilizována v autoklávu při teplotě 120 C po dobu 15 minut. 2014 18

Czapkův agar (CZA) Czapkův agar je univerzální semi-syntetické médium pro kultivaci kvasinek a plísní. Toto médium bylo vyvinuto Thomem a Churchem a má definované chemické složení. CZA je doporučován také pro izolaci rodů Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces a některých dalších hub s podobnými fyziologickými požadavky. Jako jediný zdroj uhlíku je v médiu obsažená sacharóza a dusičnan sodný jako jediný zdroj dusíku. Hydrogenfosforečnan draselný, síran hořečnatý, chlorid draselný a síran železnatý jsou zdroje esenciálních iontů (himedia.cz, 2010). Složení média: sacharosa (30,0g), dusičnan sodný (2,0g), hydrogenfosforečnan draselný (1,0g), síran hořečnatý (0,5g), chlorid draselný (0,5g), síran železnatý (0,01g), agar (15,0g), destilovaná voda (1000ml). Konečné ph dehydrovaného média při 25 C je 7,3 ± 0,2 (himedia.cz, 2010). Bramborovo mrkvový agar (PCA) Médium je vhodné pro kultivaci mikroskopických hub, zejména pro Pyronema domestici, Actinoplanes awajinensis, Actinoplanes nirasakiensis, Amorphosphorangium auranticolor, Streptomyces flavus a Thermoactinomyces vulgaris. Mrkvový a bramborový odvar poskytuje potřebné sacharidy, bílkoviny, minerály a vitamíny pro růst mikroskopických organismů (himedia.cz, 2010). Složení média: bramborová infuze (250,0g), mrkvová infuse (200,0g), agar (15,0g). Konečné ph dehydrovaného média při 25 C je 6,5 ± 0,2 (himedia.cz, 2010). Mueller - Hinton agar (MHA) MHA byl původně vyvinut jako jednoduché transparentní agarové médium pro kultivaci patogenních druhů Neisseria. V současnosti je toto médium využíváno jako testovací médium pro antimikrobiální citlivost. Doporučuje se pro šíření antimikrobiálních látek impregnovaných na papírovém disku pomocí agarového gelu. Po přidání 5% ovčí krve nebo hemoglobinu lze MHA používat pro antimikrobiální testování citlivosti Streptococcus pneumoniae a Haemophilus influenzae. Vzhledem k tomu, že se jedná o širokospektrální půdu, není MHA vhodný pro kultivaci pomalu rostoucích organismů 2014 19

z důvodu zvýšené inkubace nežádoucích mikroorganismů. MHA se osvědčil také ke kultivaci mikroskopických hub (himedia.cz, 2010). Složení média: hovězí masová infuse (300,0g), Kyselý hydrolyzát kaseinu (17,5g), škrob (1,5g), agar (17g). Konečné ph dehydrovaného média při 25 C je 7,3 ± 0,2 (himedia.cz, 2010). Endův agar (EA) Endo agar se používá přednostně pro detekci a rozlišení laktosa-pozitivních a laktosanegativních koliformních bakterií. Podle ČSN EN ISO 6579 je doporučen jako významný prostředek v mikrobiologickém zkoumání vod, odpadních vod, mléčných výrobků i potravin. EA se používá k stanovení počtu koliformních bakterií po presumptivní zkoušce pitné vody. Dále se používá pro detekci a izolaci koliformních bakterií a fekálních koliformních bakterií z mléka, mléčných výrobků a potravin. Médium svým složením umožňuje také kultivaci některých skupin mikroskopických hub (himedia.cz, 2010). Složení média: masový pepton (10,0g), laktosa (10,0g), siřičitan sodný (2,5g), hydrogenfosforečnan draselný (3,5g), basický fuchsin (0,5g), agar (15,0g). Konečné ph dehydrovaného média při 25 C je 7,5 ± 0,2 (himedia.cz, 2010). Chloramfenikol glukosou agar (CHYGA) Používá se pro selektivní izolaci a stanovení počtů kvasinek a plísní především v mléce a mléčných výrobcích (himedia.cz, 2010). Složení média: kvasničný extrakt (5,0g), dextrosa (20,0g), chloramfenikol (0,1g), agar (14,9g). Konečné ph dehydrovaného média při 25 C je 6,6 ± 0,2 (himedia.cz, 2010). Maltózový agar (MA) Obecné kultivační médium, které se využívá pro detekci, izolaci a stanovení počtů plísní. V médiu je využit sladový extrakt, který poskytuje kyselé prostředí a živiny příznivé pro růst a metabolismus kvasinek a plísní. Mykologický pepton přispívá k rychlejšímu růstu s typickou morfologií a pigmentací. Pro mykologický počet je vhodné upravit reakci média přidáním 10% kyseliny mléčné. Za účelem potlačení růstu bakterií mohou 2014 20

být přidána antibiotika jako sterilní roztok k roztavenému médiu těsně před nalitím do sterilních Petriho misek (himedia.cz, 2010). Složení média: sladový extrakt (30,0g), mykologický pepton (5,0g), agar (15,0g). Konečné ph dehydrovaného média při 25 C je 5,4 ± 0,2 (himedia.cz, 2010). Bramborový agar s bengálskou červení (PDRBA) Tento agar je doporučen pro zjištění počtu kvasinek a plísní v potravinách a mléčných výrobcích. Používá se také pro stimulaci sporulace, pro udržování kmenových kultur některých mikroorganismů a pro diferenciaci odrůd na základě výroby pigmentu. PDRBA zvyšuje produkci askospora. Infuze brambor a dextrózy podporují bujný růst plísní. Okyselení přípravku na ph 3,5 kyselinou vinnou inhibuje růst bakterií, takový agar se však již nesmí zahřívat, protože může zhydrolyzovat a pak nebude tuhnout. Bengálská červeň je barvivo příbuzné eosinu, které inhibuje šíření některých rychle rostoucích hub a má také antibakteriální vlastnosti (himedia.cz, 2010). Složení média: bramborová infuse (200,0g), dextrosa (20,0g), bengálská červeň (0,0084g), agar (15,0g). Konečné ph dehydrovaného média při 25 C je 5,6 ± 0,2 (himedia.cz, 2010). Sabouradův agar (SBA) SBA se obecně používá pro kultivaci kvasinek, plísní a acidotolerantních bakterií. Toto médium se také používá pro stanovení mikrobiální kontaminace v potravinách, kosmetice a klinických vzorků. Mykologický pepton poskytuje dusíkaté sloučeniny, dextróza poskytuje zdroj energie. Vysoká koncentrace dextrózy a nízké ph podporuje růst plísní a zabraňuje kontaminaci bakterií z testovaných vzorků. Některé patogenní houby mohou produkovat infekční spóry, které se snadno rozptylují ve vzduchu, takže experimenty je nutné provádět v bezpečnostním boxu. Pro silně kontaminované vzorky musí být médium doplněno inhibičními látkami pro zpomalení především acidofilních bakterií (himedia.cz, 2010). Složení média: mykologický pepton (10,0g), dextrosa (40,0g), agar (15,0g). Konečné ph dehydrovaného média při 25 C je 5,6 ± 0,2 (himedia.cz, 2010). 2014 21

8.2 Kultivované druhy V laboratoři byly kultivovány následující druhy mikroskopických vláknitých hub: Aspergillus niger, Penicillium polonicum, Penicillium chrysogenum, Penicillium crustosum, Penicillium glabrum, Cladiosporium sp. a Scopulariopsis brevicaulis na výše uvedených kultivačních médiích. Doba kultivace byla sedm dní při teplotě 24 C. 8.2.1 Aspergillus Doporučená identifikační média při kultivaci rodu Aspergillus jsou CYA, MA a pozorují se mikroskopické a makroskopické morfologické znaky, které jsou založeny na stavbě konidioforů. K mikroskopickým znakům patří typ konidioforů (uniseriátní a biseriátní), tvar měchýřku (kulovitý, podlouhlý, kyjovitý) a kordiální hlavice (paprsčitá, sloupcovitá). K nejvýznamnějším makroskopickým znakům patří zbarvení, povrchová struktura, velikost kolonií po sedmi, deseti a čtrnácti dnech a vzhled konidiální hlavice (Kubátová, 2006). 8.2.1.1 Aspergillus niger Kolonie Aspergillus niger rostou rychle, mají černé zbarvení a produkují do agaru žlutý pigment. Konidiofory jsou biseriátní s hladkou stopkou a kulovitým měchýřkem, který má v průměru cca 50-75 µm. Konidiální hlavice má paprsčitý tvar, konidie jsou kulovité a nepravidelně hrubě bradavčité (Kubátová, 2006). Optimální teplota při kultivaci je 35 C přičemž minimum je 6 C až 8 C a maximum 45 C až 47 C (Kubátová, 2006). 8.2.2 Penicillium U rodu Penicillium jsou morfologické znaky založeny na nepohlavním stádiu. Hlavní částí jsou konidiofory, které slouží k tvorbě konidií. K mikroskopickým znakům se řadí stavba konidioforu, u které se posuzuje: typ větvení, povrchová struktura, velikost a tvar konidií. Existují čtyři typy konidioforů, které závisí na podrodech Aspergilloides, Furcatum, Penicillium a Biverticillium. Makroskopické znaky kolonií se hodnotí na živných médiích CYA a MA. K nejvýznamnějším znakům patří povrchová struktura, zbarvení kolonií a velikost po sedmi, deseti a čtrnácti dnech (Kubátová, 2006). 2014 22

8.2.2.1 Penicillium polonicum Penicillium polonicum patří mezi xerofilní mikroskopické vláknité houby a za optimálních podmínek produkuje neurotoxiny. Optimállní teplota pro kultivaci P. polonicum je 20 C a nejvhodnějším kultivačním médiem pro růst kultur je MA (Núñez et al., 2000). 8.2.2.2 Penicillium chrysogenum P. chrysogenum patří mezi xerofilní druhy, které se vyskytují hojně po celém světě a je nejběžnější Penicillium kontaminující potraviny. Je původcem mykóz a produkuje antibiotikum penicilin. Při kultivaci k diagnostickým makromorfologickým znakům P. chrysogenum patří rychle rostoucí kolonie, které jsou sametové s paprsčitými rýhami, bílým myceliálním okrajem s modrozeleně zbarvenou sporulující částí. Do agaru produkuje žlutý pigment a spodní strana kolonie je světle béžová. Optimální teplota pro růst P. chrysogenum je 23 C, přičemž minimum je 4 C a maximum je 37 C. Běžnými mikromorfologickými znaky jsou konidiofory s hladkou stopkou, které jsou štětcovitě větvené a na konci divergentních větví s metulami vyrůstají lahvicovité fialidy, ze kterých vyrůstají elipsovité konidie (Kubátová, 2006; Liu, 1993). 8.2.2.3 Penicillium crustosum P. crustosum je producentem mykotoxinů penitremu, roquefortinu, kyseliny terestrové, patří k častým kontaminantům potravin a způsobuje hnilobu jablek. Jeho kolonie patří k rychle rostoucím, jsou sametové, šedozelené barvy s bílým okrajovým myceliem. Konidiofory bývají dlouhé 200 až 400 μm a jsou hrubě bradavčité a asymetricky větvené. Fialidy bývají ampuliformní a konidie kulovité a hladké (Kubátová, 2006). 8.2.2.4 Penicillium glabrum Penicillium glabrum je široce rozšířený druh, který se často nachází na potravinách nebo v půdě a neprodukuje mykotoxiny. Kolonie jsou rychle rostoucí a stejně jako u P. crustosum jsou sametové, tmavozelené barvy s bílým okrajovým myceliem. Spodní strana kolonií je zbarvená do žluta až hnědočervena. Konidiofory jsou monoverticilátní, hladké a mají malý měchýřek. Fialidy jsou ampuliformní, konidie kulovité a jemně bradavčité (Kubátová, 2006). 2014 23

8.2.3 Cladiosporium sp. Cladosporium patří k celosvětově rozšířeným houbám a mohou být endofytické nebo patogenní. Vyskytují se na opadaném listí a na bylinných a dřevnatých stoncích. Jsou často izolovány z ovzduší, půdy, potravin i textilu (Dugan, 2008). Nejvhodnějším agarem pro identifikaci je bramborový agar a optimální teplota pro růst je 20 C až 25 C. Kolonie Cladosporium sp. patří k pomalu rostoucím a zbarvení může být zelené, černohnědé, někdy šedé nebo žlutohnědé. Konidiofory a konidie jsou rovnoměrně pigmentované. Konidie mají hladkou strukturu a jsou produkovány v rozvětvených řetězcích (mycology.adelaide.edu.au, 2014). 8.2.4 Microascus Charakteristickým znakem rodem Microascus je tvorba černých plodnic s dlouhým krčkem a ústím typu peritecia nebo bez krčku a ústí typu kleistothecia. Identifikační znaky jsou spojeny s pohlavním i nepohlavním stádiem. K doporučeným identifikačním médiím patří MA, OA, CMA a PCA (Kubátová, 2006). 8.2.4.1 Scopulariopsis brevicaulis Scopulariopsis brevicaulis je celosvětově rozšířený a často bývá izolovaný z půdy, dřeva, rostlinných zbytků a klinických materiálů. Řadí se k saprotrofním houbám kontaminující potraviny a je častým původcem onychomykóz (Kubátová, 2006). Kolonie jsou sametové nebo funikulózní a mají světle hnědé zbarvení. Optimální teplota pro růst se pohybuje okolo 24 C a minimální a maximální teplota, při které dokáže Scopulariopsis brevicaulis růst, je 5 C a 37 C. Konidiogenní buňky vyrůstají na štětcovitě větvených konidioforech a jsou válcovitého tvaru s širokým krčkem. Konidie jsou produkovány v řetězcích a jsou hruškovité s uťatou bází a bradavčitou stěnou (Kubátová, 2006). 2014 24

8.3 Vyhodnocení kultivovaných druhů Kultivované vzorky mikroskopických vláknitých hub byly fotograficky zdokumentovány viz. seznam příloh. V následujících tabulkách je zaznamenáno zbarvení mycelia a jejich velikost na daných kultivačních médiích. Tabulka 1: Porovnání mikromycet na kultivačních půdách: SAB, PCA, CZA, MHA Aspergillus niger Penicillium polonicum Penicillium chrysogenum Penicillium crustosum Penicillium glabrum Cladosporium sp. Scopulariopsis brevicaulis SAB PCA CZA MHA 27 mm 48 mm 54 mm 41 mm zelenošedé šedobéžové zelenobílé bílé 27 mm / 37 mm 28 mm zelenobílé / bílozelené bílošedé 30 mm 40 mm 40 mm 40 mm zelenomodré zelenobéžové bílozelené bílé 33 mm 47 mm 62 mm 19 mm šedomodré šedomodré bílozelené bílé 60 mm / / 36 mm žíhané šedé / / šedobílé 29 mm 40 mm 39 mm 16 mm zelenohnědé zelenočerné zelenošedé šedobílé 42 mm 21 mm 27 mm 23 mm VELIKOST černožluté hnědošedé bíločerné hnědožluté ZBARVENÍ Tabulka 2: Porovnání mikromycet na kultivačních půdách: EA, MA, YGCHA Aspergillus niger Penicillium polonicum Penicillium chrysogenum Penicillium crustosum Penicillium glabrum Cladosporium sp. Scopulariopsis brevicaulis EA MA YGCHA 35 mm 50 mm 50 mm šedozelené zelené zelenošedé 40 mm 36 mm 19 mm bílošedé zelenočerné černozelené / 46 mm / / šedomodré / 37 mm 55 mm 58 mm zelenošedé šedomodré zelenošedé 31 mm 35 mm 62 mm šedé šedobílé šedě žíhané 12 mm 49 mm 48 mm šedozelené bílozelené zelenohnědé 45 mm 23 mm 21 mm VELIKOST černobílé černožluté černožluté ZBARVENÍ 2014 25

9 Environmentální význam mikromycet Mikromycety způsobují mykotoxikózy u lidí, onemocnění rostlin i živočichů, hnilobu a kontaminaci potravin, a i přes tyto negativní vlastnosti mají zásadní environmentální význam v biosféře. Používají se jako modelové organismy pro genetiku, buněčnou, molekulární biologii a pro studium metabolických drah a mikrobiální testy vitamínů a aminokyselin. Snadno se kultivují, rychle se rozmnožují a mají krátký životní cyklus. Jsou hlavními dekompozitory komplexních složek rostlinných zbytků a jsou prospěšné v zemědělství, zahradnictví a lesnictví. Využívají se v průmyslových fermentačních procesech, při výrobě biochemikálií a v bioremediaci (thekingdomfungi.edu, 2000; Kendrick, 2011). 9.1 Biodegradace Saprotrofní mikroskopické vláknité houby využívají mrtvé organické látky jako zdroj živin, čímž jsou zodpovědné za biologickou rozložitelnost organických látek a hrají důležitou roli v recyklaci základních prvků. Díky extracelulárních enzymů, které mikromycety produkují, jsou schopny degradovat komplexní polymery, jako je celulóza, bílkoviny a lignin (fungionline.org, 2014). Spolu s bakteriemi jsou schopny recyklace odumřelých materiálů na formu, která může být znovu použita (countrysideinfo.co, 2000). 9.2 Bioremediace Některé druhy mikromycet, ale i kvasinek vylučují enzymy, které jsou schopny neutralizovat a rozkládat znečišťující látky, jako jsou insekticidy, herbicidy, těžké kovy, kreozotem, dehet a uhlovodíková paliva. Z toho důvodu se používají v procesech zaměřených na snižování koncentrace a toxicity odpadních materiálů z průmyslových procesů a k čištění kontaminované půdy a vody. Díky bioremediaci dochází k obnově znečištěného životního prostředí (fungionline.org, 2014; Sace, 2010). 9.3 Potravinářský a farmaceutický průmysl Mikroskopické vláknité houby jsou využívány při výrobě potravin, jako je droždí a sýry, a nápojů. Některé druhy jsou schopny produkovat antibiotické látky a používají se ve farmaceutickém průmyslu k výrobě steroidů, hormonů a léků: penicilin, cyklosporin (countrysideinfo.co, 2000; thekingdomfungi.edu, 2000). 2014 26

10 Závěr Cílem bakalářské práce bylo posoudit morfologické znaky mikroskopických vláknitých hub v laboratorních podmínkách. V laboratoři bylo vytvořeno osm typů kultivačních médií, na které byly očkovány vybrané druhy mikromycet. Mikroskopické vláknité houby na médiích vytvořily vzhledově odlišné kolonie. Plísně se lišily barvou, tvarem, strukturou i velikostí. Například Aspergillus niger, pro který je charakteristická černá barva, vytvořil na MHA kolonie bílé barvy. Bakalářskou prací bylo potvrzeno, že mikroskopické houby patří opravdu ke kosmopolitním organismům, mají schopnost lehce se přizpůsobit daným podmínkám a mohou vytvářet vzhledově odlišné kolonie podle složení substrátu, na kterém rostou. 2014 27

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ARIZA, M. R., T. O. LARSEN, B. O. PETERSEN, J. DUUS a A. F. BARRERO. Penicillium digitatum metabolites on synthetic média and citrus fruits. Agricultural and food chemismy. 2002. č. 50. s. 6361-6365. doi: 15028872. Dostupné z: http://hera.ugr.es/doi/15028872.pdf ASPERGILLUSFLAVUS. Aspergillus flavus. Aspergillusflavus.org [online]. 2005 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.aspergillusflavus.org/aflavus/index.html BELL. A. Dung fungi: on illustrated guide to coprophilous fungi in New Zeland. Victoria University Press, 1983. ISBN 0-86473-001-2 BOOTH, C. Methods in microbiology. Academic Press inc, 1971. ISBN 12-521504-5 CARLILE, M. J., S. C. WATKINSON a G. W. GOODAY. The Fungi. Academic Press, 2001. ISBN 978-0-12738-446-7 CONSUMER. Mold growth. fsec.ucf.edu/en [online]. 2007 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.fsec.ucf.edu/en/consumer/buildings/basics/moldgrowth.htm ČADERSKÝ-ENVITEK. Dehydratovaná kultivační média a suplementy. Himedia.cz [online]. 2010 [cit. 2013-12-05]. Dostupné z: http://himedia.cz D AMICO S., T. COLLINS, J. C. MARX, G. FELLER a CH. GERDAY. Psychrophilic microorganisms: challenges for life. Embo Rep. 2006. č. 7. s. 385-389. doi: 10.1038/sj.embor.7400662 Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1456908/ DIFFERENCE BETWEEN. Fungi vs Plants. Differencebetween.net [online]. 2010 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.differencebetween.net/science/difference-betweenfungi-and-plants/ DOLEŽÁLKOVÁ, I. Rigorózní práce. Účinky vybraných monoacylglycerolů na růst bakterií a mikroskopických hub [online]. Brno, 2010. [cit. 2013-12-05]. Dostupné z: http://is.muni.cz/th/105941/prif_r/rp_dolezalkova.pdf DUBE, H. C. An intruduction to fungi. Vikas, 2005. 2014 28

DUGAN, F. M., U. BRAUN, J. Z. GROENEWALD a P. W. CROUS. Morphological plasticity in cladosporium sphaerospermum. 2008. Personia. č. 21 s. 9-16. doi: 10.3767/003158508X334389. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2846128/pdf/per-21-9.pdf ENCYCLOPAEDIA BRITANNICA. Fungus. Britannica.com [online]. 2014 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.britannica.com/ebchecked/topic/222357/fungus/57964/structure-of-the-thallus EXPERTSMIND. expertsmind.com[online]. 2014 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.expertsmind.com/topic/microbiology/reproduction-in-fungi-92579.aspx FOROS. vi.cl [online]. 2003 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.vi.cl/foro/topic/1071-apuntes-de-biologia-y-quimica/page-44 FRÉBORTOVÁ, J. Laboratorní cvičení z mikrobiologie. Univerzita Palackého v Olomouci, 2008. ISBN 978-80-244-2139-1 FUNGI ONLINE. Importance of fungi. Fungionline.org.uk [online]. 2006-2014 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.fungionline.org.uk/1intro/5importance.html#import6 GIBSON, J. P. a T. R. GIBSON. Plant diversity. Chelsea house, 2007. ISBN 10: 0-7910- 8960-6 GRIFFIN, D. H. Fungal physyology. Wiley, 1994. ISBN 0-471-16615-4 GWYNNE-VAUGHAN, H. Fungi: ascomycetes, ustilaginales, uridenales. Cambridge University Press, 2010. ISBN 978-1-108-01321-5 HAMILTON, G. Kingdoms of life fungi. Milliken publishing company, 2006. HARRIGAN, W. F. Laboratory methods in food microbiology. Academic Press, 1998. ISBN 0-12-326043-4 HERITAGE, J., E. G. V. EVANS a R. A. KILLINGTON. Introductory microbiology. Cambridge University Press, 1996. ISBN 0-521-44516-7 2014 29

HESS-KOSA, K. Indoor air quality: the lastex sampling and analytical methods. CRC Press, 2011. ISBN 978-1-4398-2665-2 HODEK, P. Laboratorní cvičení z biologie a biochemie mikroorganismů. Karolinum, 2009. ISBN 978-80-246-1667-4 HOGG, S. Essential microbiology. Wiley, 2005. ISBN 0-471-49753-3 HUI, Y. H. a G. G. KHACHATOURIANS. Food biotechnology: microorganisms. Wiley, 1995. ISBN 0-471-18570-1 JAMES, T. Y., P. M. LETCHER, J. E. LONGCORE, S. E. MOZLEY-STANDRIDGE, D. PORTER, M. J. POWELL a G. W. GRIFFITH. A molecular phylogeny of the flagellated fungi (Chytridiomycota) and description of a new fylum (Blastocladiomycota). Mycologia. 2006. č. 98. s. 860-871. doi: 10.3852. Dostupné z: http://www.mycologia.org/content/98/6/860.full KALINA, T. a J. VÁŇA. Sinice, řasy, houby, mechorosty a podobné organismy v současné biologii. Karolinum, 2005. ISBN 80-246-1036-1 KAPOOR, A. a D. R. CULLIMORE. Removal of heavy metals using the fungus Aspergillus niger. Elsevier. 1999. č. 70. s. 95-104. doi: 10.1016/S0960-8524(98)00192-8. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0960852498001928 KENDRICK, B. Fungi: ecological importance and impact on humans. els. 2011. č. 17. doi: 10.1002/9780470015902.a0000369.pub2. Dostupné z: http://www.els.net/wileycda/elsarticle/refid-a0000369.html KHAN, A. A. H. a S. M. KARUPPAYIL. Fungal pollution of indoor environments and its management. Saudi J Biol Sci. 2012. č. 19. s. 405-426. doi: 10.1016/j.sjbs.2012.06.002. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3730554/ KLABAN, V. Ekologie mikroorganismů: ilustrovaný lexikon biologie, ekologie a patogeniky mikroorganismů. Glén, 2011. ISBN 978-80-7262-770-7 2014 30

KUBÁTOVÁ, A. a M. VÁŇOVÁ. Atlas zygomycetů - online. Katedra botaniky Univerzity Karlovy v Praze, 2006 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://botany.natur.cuni.cz/cs/book/export/html/499 KUBÁTOVÁ, A. Atlas mikroskopických saprotrofních - online. Katedra botaniky Univerzity Karlovy v Praze, 2006 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://botany.natur.cuni.cz/cs/atlas-mikroskopickych-saprotrofnich-hub-ascomycota-2006 KUBÁTOVÁ, A. Houby v naších domácnostech aneb o čem doma víte I nevíte. Živa. 2012. č. 5. s. 224-228. Dostupné z: http://ziva.avcr.cz/2012-5/houby-v-nasichdomacnostech-aneb-o-cem-doma-vite-i-nevite.html KUBÁTOVÁ, A. Miniatlas mikroorganismů - online. Katedra botaniky Univerzity Karlovy v Praze, 2006 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.vscht.cz/main/soucasti/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/ LEITAO, A. L. Mycofactories. Universidade nova de lisboa, 2011. ISBN 978-1-60805-223-3 LIU, T. a D. YU. Morphological measurements on Penicillium chrysogenum broths by rheology and filtration methods. Biotechnology and bioengineering. 2004. č. 42. s. 777-784. doi: 10.1002/bit.260420614. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.260420614/pdf MAHESHWARI, R., G. BHARADWAJ a M. K. BHAT. Thermophilic fungi: their physiology and enzymes. Microbiol Mol Biol Reviews. 2000. č. 64. s. 461-488. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc99000/ MACHIDA, M. a K. GOMI. Aspergillus: molecular biology and genomics. Caister Academic Press, 2010. ISBN 978-1-904455-53-0 MEDICAL-LABS. medical-labs.net [online]. 2014 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.medical-labs.net/fungi-hyphae-1522/forms-of-hyphae-septate-and-coenocytichyphae/ MEHROTRA, R. S. a K. R. ANEJA. An introduction to mycology. New age international publishers, 1990. ISBN 81-224-0089-2 2014 31

MISRA, J. K., J. P. TEWARI a S. K. DESHMUKH. Systematics and evolution of fungi. Science publishers, 2012. ISBN 978-1-57808-723-5 MOORE, D., G. D. ROBSON a A. D. J. TRINCI. 21st century guide book to fungi. Cambridge University Press, 2011. ISBN 978-1-107-00676-8 MUELLER G. M., G. F. BILLS a M. S. FOSTER. Biodiversity of fungi: inventory and monitoring methods. Elsevier Academic Press, 2004. ISBN 0-12-509551-1 MYCOLOGY ONLINE. Cladosporium. Mycology.adelaide.edu.au [online]. 2014 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.mycology.adelaide.edu.au/fungal_descriptions/hyphomycetes_%28dematiace ous%29/cladosporium/ MYCOLOGY ONLINE. Mucor. mycology.adelaide.edu.au [online]. 2014 [cit. 2014-04- 28]. Dostupné z: http://www.mycology.adelaide.edu.au/fungal_descriptions/zygomycetes/mucor/ NÚÑEZ, F., D. M. CARMEN, R. MAR, A. EMILIO, M. ALBERTO a A. MIGUEL. Effects of substrate, water activity and temperature on growth and verrucosidin production by penicillium polonicum isolated from dry-cured ham. Journal of food protection. 2000. č. 2. s. 155-291. Dostupné z: http://www.ingentaconnect.com/content/iafp/jfp/2000/00000063/00000002/art00013 OFFWELL WOODLAND & WILDLIFE. The importance of fungi. Countrysideinfo.co.uk [online]. 2000 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.countrysideinfo.co.uk/fungi/importce.htm PEBERDY, J. F. Penicillium and acremonium. Plenum Press, 1987. ISBN 0-306-42345-6 PITT, J. I. a A. D. HOCKING. Fungi and food spoilage. Springer, 2009. ISBN 978-0-387-92206-5 PODSTATOVÁ, H. Základy epidemiologie a hygieny. Glén, 2009. ISBN 978-80-7262-597-0 2014 32

POMMERVILLE, J. C. Fundamentals of microbiology. World headquarters, 2011. ISBN 978-443-5000 SACE, J. The role of fungi in the eco systém. Bright hub. 2010. Dostupné z: http://www.brighthub.com/environment/science-environmental/articles/88505.aspx SHARMA, P. D. The fungi. Rastogi publications, 2004. ISBN 81-7133-768-6 SCHUSTER, E., N. DUNN-COLEMAN, J. C. FRISVAD a P. W. M. DIJCK. On the safety of Aspergillus niger- a review. Appl microbiol biotechnol. 2002. č. 59. s. 426-435. doi: 10.1007/s00253-002-1032-6. Dostupné z: http://www.google.cz/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=9&cad=rja&uact=8& ved=0ciabebywca&url=http%3a%2f%2fwww.researchgate.net%2fpublication%2f1 1213736_On_the_safety_of_Aspergillus_niger-- a_review%2ffile%2f79e41507d1b799c2de.pdf&ei=wstju9wynrcfiaet1ohgaw&usg= AFQjCNF3OOxgMvENIMKA5kzBRc5aSdKPlg&sig2=swbHG3m0MEkIxo-fulyAw&bvm=bv.64542518,d.aGc SUMBALI, G. a R. S. MEHROTRA. Principles of microbiology. TATA Mc Graw Hill, 2009. ISBN 13: 978-0-07-014120-9 ŠPAČEK, J. Hlenky, houby, řasy. Masarykova Univerzita, 1999. ISBN 80-210-2157-8 THE KINGDOM FUNGI. uwlax.edu [online]. 2000 [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://www.uwlax.edu/biology/volk/fungi3/ VARGA, J. a R. A. SAMSON. Aspergillus in the genomic era. Wageningen academic publishers, 2008. ISBN 978-90-8686-065-4 VELKÝ LÉKAŘSKÝ SLOVNÍK. Kultivační media (půdy). Lekarske.slovniky.cz [online]. 2008 [cit. 2013-12-05]. Dostupné z: http://lekarske.slovniky.cz/lexikonpojem/kultivacni-media-pudy-2 VOJTKOVÁ, H. Mikrobiologie II. Přednáška. Ostrava: VŠB-TU, 2013/2014. WEARING, J. Fungi: mushrooms, toadstools, molds, yeasts and other fungi. Crabtree publishing company, 2010. ISBN 978-0-7787-5375-9 2014 33

SEZNAM OBRÁZKŮ Obrázek 1: Životní cyklus Chytridiomycot (Foros, 2003)... 3 Obrázek 2: Životní cyklus Zygomycot (Foros, 2003)... 4 Obrázek 3: Životní cyklus Ascomycot (Foros, 2003)... 5 Obrázek 4: Životní cyklus Basidiomycot (Foros, 2003)... 6 Obrázek 5: Rozdělení houbových hyf (Medical-Labs, 2014)... 7 Obrázek 6: Buňka mikroskopických vláknitých hub (Kalina et al., 2005)... 8 Obrázek 7: Sexuální a asexuální reprodukce mikromycet (expertsmind, 2014)... 13 SEZNAM TABULEK Tabulka 1: Porovnání mikromycet na kultivačních půdách: SAB, PCA, CZA, MHA... 25 Tabulka 2: Porovnání mikromycet na kultivačních půdách: EA, MA, YGCHA... 25 2014 34

SEZNAM PŘÍLOH Aspergillus niger na CZA (Paráková, 2013) Aspergillus niger na EA (Paráková, 2013) 2014 35

Aspergillus niger na MA (Paráková, 2013) Aspergillus niger na MHA (Paráková, 2013) 2014 36

Aspergillus niger na PCA (Paráková, 2013) Aspergillus niger na SAB (Paráková, 2013) 2014 37

Aspergillus niger na YGCHA (Paráková, 2013) Penicillium polonicum na EA (Paráková, 2013) 2014 38

Penicillium polonicum na MA (Paráková, 2013) Penicillium polonicum na MHA (Paráková, 2013) 2014 39

Penicillium polonicum na SAB (Paráková, 2013) Penicillium polonicum na YGCHA (Paráková, 2013) 2014 40

Penicillium chrysogenum na MA (Paráková, 2013) Penicillium chrysogenum na MHA (Paráková, 2013) 2014 41

Penicillium chrysogenum na PCA (Paráková, 2013) Penicillium chrysogenum na SAB (Paráková, 2013) 2014 42

Penicillium crustosum na EA (Paráková, 2013) Penicillium crustosum na MA (Paráková, 2013) 2014 43

Penicillium crustosum na MHA (Paráková, 2013) Penicillium crustosum na PCA (Paráková, 2013) 2014 44

Penicillium crustosum na SAB (Paráková, 2013) Penicillium crustosum na YGCHA (Paráková, 2013) 2014 45

Penicillium glabrum na EA (Paráková, 2013) Penicillium glabrum na MA (Paráková, 2013) 2014 46

Penicillium glabrum na MHA (Paráková, 2013) Penicillium glabrum na SAB (Paráková, 2013) 2014 47

Penicillium glabrum na YGCHA (Paráková, 2013) Cladosporium sp. na EA (Paráková, 2013) 2014 48

Cladosporium sp. na MA (Paráková, 2013) Cladosporium sp. na SAB (Paráková, 2013) 2014 49

Cladosporium sp. na YGCHA (Paráková, 2013) Scopulariopsis brevicaulis na MA (Paráková, 2013) 2014 50

Scopulariopsis brevicaulis na SAB (Paráková, 2013) Scopulariopsis brevicaulis na YGCHA (Paráková, 2013) 2014 51