Mikroskopické houby a jejich diagnostika. Význam v průmyslu, lékařství a potravinářství.

Transkript

1 Titulní strana Mikroskopické houby a jejich diagnostika. Význam v průmyslu, lékařství a potravinářství. Alena Kubátová Přírodovědecká fakulta UK, Katedra botaniky tel , kubatova@natur.cuni.cz

2 Informace na úvod Přednášky U3V Mykologie najdete na adrese:

3 Něco o studiu mykologie na katedře botaniky mikroskopické houby v asociaci s dřevinami a kůrovci saprotrofní mikromycety antropogenních půd saprotrofní půdní houby přirozených stanovišť houby na potravinách, alergenní, klinického významu Mykologie na katedře botaniky: příklady výzkumných témat potravinářská mykologie: Dr. V. Ostrý lékařská mykologie: Dr. M. Skořepová Dr. S. Dobiášová Dr. V. Chrenková Dr. P. Hamal

4 OBSAH dnešní lekce I. Úvod Základní pojmy, výskyt a význam mikromycetů, systematické zařazení, metody identifikace mikromycetů, nejvýznamnější rody mikroskopických hub II. Využití mikroskopických hub biotechnologie III. Mikromycety jako původci onemocnění člověka, kontaminanty potravin, producenti mykotoxinů.

5 Doporučená literatura ATLAS OF CLINICAL FUNGI G. S. de Hoog J. Guarro J. Gene M. J. Figueras 2001, 1160 stran ISBN: interaktivní CD-ROM verze

6 Doporučená literatura Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka F. Malíř V. Ostrý 2003, 349 stran

7 Doporučená literatura FUNGI AND FOOD SPOILAGE J. I. Pitt A. D. Hocking 1997, 593 stran

8 Doporučená literatura MICROFUNGI S. Gravesen J. Frisvad R. A. Samson 1994, 168 stran

9 I. Úvod - Základní pojmy Mikroskopické houby (mikromycety) = vláknité mikromycety + kvasinky Organismy mikroskopických rozměrů (mikroorganismy), jejichž morfologii je možné pozorovat jen mikroskopem. Víceméně se kryjí s termínem plísně (angl. moulds, něm. Schimmelpilze), jsou charakterizované tvorbou různě zbarveného porostu (mycelia) na povrchu substrátu. Výskyt: např. stěny vlhkých bytů, kazící se potraviny, ale i mykotická onemocnění člověka...

10 Základní pojmy Plísně Často používaný termín jak laiky tak odborníky (včetně lékařů, fytopatologů, hygieniků): plesnivé potraviny, plísňová onemocnění nohou, plísně v ovzduší apod. Termín plísně však v původním úzkém významu v mykologii zahrnoval jen určité skupiny tzv. nižších hub: chytridiomycety (vodní houby) zygomycety (např. plíseň hlavičková) oomycety (např. plíseň bramborová) dnes říše Chromista, nikoliv říše Fungi

11 Základní pojmy Plísně Postupně však termín plísně přerostl svůj původní úzký význam a všeobecně je nyní užíván pro všechny mikroskopické houby. Podobnou paralelou je např. čaj. Správně je pod tímto označením chápán čaj z lístků čajovníku, avšak termín se nyní široce používá i pro množství nálevů z jiných rostlin. Oba termíny (mikr. houby, plísně) tedy nemají hodnotu systematickou, zahrnují houby a houbové organismy z různých skupin: Fungi: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, výjimečně i Basidiomycota Chromista: Oomycota (Peronosporomycota)

12 Základní vlastnosti mikromycetů Heterotrofní nemají chlorofyl, nejsou schopny fotosyntézy, rostou i ve tmě 1) Saprotrofní živiny získávají rozkladem odumřelé organické hmoty (rostlinné, živočišné, bakteriální). Jsou vybaveny rozsáhlým enzymatickým aparátem, který jim umožňuje obsadit rozmanité substráty, rozkládat je a rozloženými látkami se živit. 2) Parazitické žijí na živých organismech.

13 Výskyt mikroskopických hub půda základní rezervoár mikromycetů ovzduší - spory hub a úlomky mycelia, šíření potraviny a krmiva uložená v nevhodných podmínkách provlhlé zdi obytných budov, pracovních prostor a skladišť napadené rostliny fytopatogenní druhy nemocní lidé i další živočichové napadený hmyz entomopatogenní druhy

14 Význam mikromycetů z hlediska člověka Pozitivní: Biotechnologie sýry a jiné potravinové speciality antibiotika organické kyseliny houbové preparáty proti hmyzu houbové preparáty proti parazitickým houbám

15 Význam mikromycetů z hlediska člověka Negativní: Mykózy onemocnění člověka aj. živočichů původci mykóz: oportunní patogeni Alergie - příčina alergií: spory hub v ovzduší Mykotoxikózy příčina: toxiny produkované mikr. houbami do potravin a krmiv Degradace potravin i různých průmyslových materiálů (biodeteriorace) Zdroj: MUDr. T. Špačinská

16 Systematické zařazení mikromycetů - příklady odd. Zygomycota houby spájivé řád Mucorales odd. Ascomycota houby vřeckovýtrusné řád teleomorfa (pohl. stádium) anamorfa (nepohl. stádium) Eurotiales Eurotium, Emericella Aspergillus Talaromyces Penicillium Hypocreales Nectria, Gibberella Fusarium Hypocrea Trichoderma Claviceps Sphacelia Onygenales Arthroderma Trichophyton Dothideales Pleospora Alternaria Melanopsamma Stachybotrys Microascales Microascus Scopulariopsis Ophiostomatales Ophiostoma Graphium

17 Polyfázový přístup: kombinace více metod Studium: Metody studia mikromycetů morfologie: životní cyklus (teleomorfa a anamorfa ), studium pohl. a nepohlavních struktur fyziologie: např. růst při 25, 37 C, využívání různých zdrojů N biochemie: produkce extrolitů (sekundárních metabolitů včetně mykotoxinů) ekologie: areál rozšíření, typ substrátu, spektrum hostitelů, patogenní schopnosti molekulárních znaků: např. oblast ITS 1, 2, rdna, beta-tubulin

18 Morfologické studium 1. mikroskopické znaky - týkají se mikroskopických struktur - mají primární význam pro identifikaci hub 2. makroskopické znaky - týkají se vzhledu kolonií - mají sekundární význam

19 Morfologické studium mikroskopických znaků

20 Morfologické studium - hodnocení makroskopických znaků kolonií

21 Fyziologické metody 1. schopnost růstu při určité teplotě (25 C, 37 C) 2. schopnost využívat různé zdroje N (př. dusičnany x dusitany, kreatin) 3. schopnost růst na médiu s omezeným obsahem vody (osmofilní houby) 4. a mnohé jiné

22 Biochemické metody Zjišťují tvorbu sekundárních metabolitů, např. pigmentů či mykotoxinů. Nejjednodušší metoda tenkovrstevná chromatografie (screeningový charakter) Přesnější metody: - kapalinová chromatografie (HPLC) - spektrofotometrie

23 Metody molekulární biologie Jeden z nejrychleji se rozvíjejících směrů ve všech specializacích biologie. V oblasti identifikace mikromycetů nám umožní zjistit nejen druhové zařazení, ale také např. příslušnost k určité populaci. Současný stav: prakticky lze již využít při diagnostice hub některých skupin. Vysoká finanční náročnost - zařízení laboratoře.

24 Nejvýznamnější rody mikroskopických hub Penicillium Aspergillus Fusarium Jejich význam, charakteristické znaky, druhová determinace

25 Penicillium význam 352 druhů v přírodě jedna z nejčastějších hub (půda, ovzduší) rozkladač rostl. zbytků častý kontaminant potravin a krmiv produkce mykotoxinů široká škála alergenní houby malé konidie patogenní druh pouze 1 (P.marneffei) potravinářství výroba sýrů farmacie výroba antibiotika penicilínu

26 Penicillium morfologické znaky založeny na nepohlavním stádiu houby, jehož hlavní částí jsou konidiofory, slouží k tvorbě spór konidií, jimi se houba šíří v prostředí konidiofor štětcovitý štětičkovec u některých druhů je známo i pohlavní stádium Eupenicillium, Talaromyces, charakteristické tvorbou drobných plodnic (menších než 1 mm)

27 Penicillium mikroskopické znaky konidioforu typ větvení povrchová struktura velikost konidií tvar konidií, fialid

28 Penicillium typy konidioforů 4 podrody: Aspergilloides Furcatum Penicillium Biverticillium

29 Penicillium - makroskopické znaky kolonií Identifikační média: CYA (Czapkův agar s kvasničným extraktem) MEA (agar s malt-extraktem) Inkubační teplota: 25 C, 37 C Doba kultivace: 7, 10, 14 dní Znaky kolonií: povrchová struktura kolonií zbarvení kolonií, exudátu, spodní strany kolonií velikost kolonií po 7, 10, 14 dnech

30 Penicillium - makroskopické znaky kolonií velikost po určité době pigmentace povrchová struktura

31 Penicillium - fyziologické znaky příklad 1 CREA agar s kreatinem a indikátorem ph (bromkresolový purpur) schopnost využívat kreatin jako zdroj N schopnost tvorby kyselých látek schopnost tvorby zásaditých látek

32 Penicillium - fyziologické znaky příklad 2 P. solitum schopnost vyvolávat hnilobu jablek pro odlišení druhů P. expansum, P. solitum a P. crustosum P. crustosum P. expansum

33 Penicillium - fyziologické znaky příklad 3 schopnost vyvolávat hnilobu citrusových plodů Penicillium italicum modrozelené porosty Penicillium digitatum olivově zelené porosty

34 Penicillium využití biochemických znaků detekce mykotoxinů povahy alkaloidů pomocí Ehrlichova činidla (dimethylaminobenzaldehyd, ethanol, HCl) Penicillium commune produkce kyseliny cyklopiazonové

35 Aspergillus význam 362 druhů výskyt v přírodě hlavně v teplejších oblastech světa (půda) u nás častý kontaminant potravin a krmiv mnohé druhy jsou osmofilní produkce významných mykotoxinů alergenní houby oportunně patogenní druhy mykózy potravinářství výroba organických kyselin

36 Aspergillus morfologické znaky podobně jako u penicilií založeny na nepohlavním stádiu houby, jehož funkcí je produkovat spory a šířit se jimi do přostředí konidiofor připomíná kropenku (aspergillum), česky kropidlák u některých druhů je známo i pohlavní stádium např. Eurotium, Neosartorya charakteristické tvorbou drobných plodnic (menších než 1 mm)

37 Aspergillus - mikroskopické znaky 2 typy konidioforů

38 Aspergillus mikroskopické znaky

39 Aspergillus - makroskopické znaky kolonií Identifikační média: CYA (Czapkův agar s kvasničným extraktem) MEA (agar s malt-extraktem) Inkubační teplota: 25 C, 37 C Doba kultivace: 7, 10, 14 dní Znaky kolonií: zbarvení kolonií, spodní strany kolonií povrchová struktura kolonií velikost kolonií po 7, 10, 14 dnech vzhled konidiální hlavice pod binokulární lupou

40 Aspergillus - makroskopické znaky kolonií A. candidus A. terreus A. flavus A. niger A. fumigatus A. ustus A. wentii A. versicolor zbarvení kolonií včetně spodní strany rychlost růstu povrchová struktura

41 Aspergillus identifikační média Aspergillus wentii po 10 dnech CYA MEA doporučená identifikační média SAB GKCH média používaná pro izolaci v mikrobiologických laboratořích

42 Aspergillus - fyziologické metody Eurotium amstelodami anamorfa Aspergillus vitis CZ CYA MEA GKCH SAB Pro osmofilní houby se doporučují média s nízkým obsahem dostupné vody. CY20S DG18

43 Aspergillus biochemické metody rychlá detekce aflatoxinů pomocí par čpavku u kmenů sekce Flavi pozitivní reakce: růžový pigment na spodní straně kolonií

44 kmeny Aspergillus flavus Aspergillus, Penicillium biochemické metody tenkovrstevná chromatografie - screening vyříznout váleček z kolonie smočit v chloroformu s ethanolem otisknout na silikagelovou desku desku vyvíjet ve směsi toluen/ethylacetát/kys. mravenčí prohlížet pod UV světlem detekce aflatoxinu B 1

45 Aspergillus - biochemické metody absorbance Spektrofotometrie nm aflatoxin B 1 absorpční maxima : 225, 267, 362 nm absorbance citrinin absorpční maxima : 214, 244, 327 nm

46 Fusarium více než 100 druhů Fusarium solani

47 Fusarium význam 166 druhů výskyt v přírodě na substrátech rostlinného původu častý kontaminant krmiv, obilí produkce významných mykotoxinů mnohé druhy jsou paraziti rostlin - fytopatogenní (hniloby rostlin) příležitostně patogenní druhy mykózy u člověka (např. keratitis, disseminované infekce)

48 Fusarium morfologické znaky založeny na nepohlavním stádiu houby, jehož hlavní částí jsou konidiofory s konidiemi 2 typy konidií: makro- a mikrokonidie makrokonidie zakřivené srpatka u některých druhů je známo i pohlavní stádium Nectria, Gibberella charakteristické tvorbou drobných plodnic (menších než 1 mm)

49 Fusarium metodika Identifikační média pro makroznaky: PDA (bramborodextrozový agar) PSA (bramborosacharozový agar) zbarvení kolonií, spodní strany kolonií rychlost růstu kolonií Identifikační média pro mikroznaky: SNA (syntetický živný agar) s filtračním papírem makro- a mikrokonidie, fialidy, chlamydospory Inkubační teplota: 25 C Osvětlení: bílé světlo 12 h/ black light 12 h Doba kultivace: 5, 7, 10, 14 dní

50 Fusarium - makroskopické znaky kolonií F. acuminatum F. incarnatum F. oxysporum zbarvení kolonií včetně spodní strany rychlost růstu

51 Fusarium - mikroskopické znaky Hodnotí se tvar a velikost konidií a fialid, chlamydospory monofialidy mikrokonidie polyfialidy makrokonidie

52 producent mykotoxinů PGA 14 dní, 25 C Fusarium culmorum

53 Fusarium culmorum - makrokonidie

54 Konec první části. Děkuji za pozornost!