MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2011 HANA SCHINDLEROVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Ověřování parentit u skotu Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík Vypracovala: Hana Schindlerová Brno 2011 2

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Ověřování parentit u skotu vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uloţena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně dne... Podpis.. 3

Poděkování Ráda bych poděkovala panu Ing. Liborovi Stehlíkovi za rady a pomoc při zpracování mé bakalářské práce. Také bych ráda poděkovala za podporu mým rodičům a sestře Štěpánce. 4

Abstrakt Ve své práci se zabývám problematikou zjišťování parentit u skotu. Častým problémem je stále neprůkaznost původu skotu s následkem sníţení genetického zisku. Toto jsou bezesporu faktory, které ovlivňují plemennou hodnotu býka, a to jak ve smyslu nadhodnocování či podhodnocování. Rodičovství je moţné ověřovat několika způsoby. Pomocí polymorfismu krevních systémů počínaje, minisatelitů, mikrosatelitů a metodou SNP konče. Moderní genetickou metodou dnešní doby je bezesporu vyuţití mikrosatelitů. V České republice provádí určování parentit tři akreditované laboratoře (laboratoř Agrogenomiky při Mendlově univerzitě v Brně, Genservice v Brně a laboratoř v Hradišťsku pod Medníkem), jejichţ práce podléhá Plemenářskému zákonu č. 154/2000 Sb. Klíčová slova: DNA, rodičovství, mikrosatelity Abstract The bachelor thesis is focused on the parentity verification testing.. A frequent problem is still inconclusive bovine origin, resulting in a reduction of genetic gain. These are undoubtedly factors that affect the value of the herd bull, and both in terms of overestimation or underestimation. Parenting can be verified in several ways.the verifications of parentity can be done through the blood, minisatelite, microsatelite and SNP s polymorphism. Nowadays, the modern genetics methods are based on microsatelite analysis. Totally three different and independent accredited laboratories are presented in the Czech Republic Laboratory of Agrogenomics at Mendel University in Brno, Brno Genservice and Laboratory of Immunogenetis in Hradišťko pod Medníkem. All of mentioned laboratories meet the criteria of 154/2000 Sb. Key words: DNA, microsatellites, parentity 5

Obsah 1 ÚVOD... 7 2 CÍL PRÁCE... 8 3 DNA ANALÝZY UŢÍVANÉ PRO OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ... 9 3.1 Historie... 9 3.2 Izolace DNA z krve... 9 3.2.1 Klasická proteinázová metoda... 9 3.3 Izolace DNA z chlupu... 10 3.3.1 Postup odběru chlupů u skotu... 10 3.3.2 Zpracování vzorků... 11 3.4 PCR... 11 3.4.1 Princip metody... 12 3.5 Fragmentační analýza... 13 4 SATELITNÍ DNA... 15 4.1 Uţívání minisatelitní DNA... 15 4.2 Uţívání mikrosatelitů... 15 4.3 Uţívání SNP... 17 4.4 Výhody SNP oproti mikrosatelitům... 18 5 ZÁKONNÉ PODKLADY K OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ U SKOTU... 19 6 VLASTNÍ PRÁCE... 24 6.1 Ověřování parentit u otců plemene holštýn... 24 6.2 Porovnávaní býci... 25 6.2.1 Výskyt alel v celé populaci... 27 6.3 Výpočet frekvence pro celou populaci:... 28 6.4 Ověřování parentity (5 býků)... 29 7 POUŢITÁ TERMINOLOGIE... 40 8 ZÁVĚR... 41 9 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY... 42 6

1 ÚVOD Ověřování rodičovství (parentity) patří v současné době k běţně uţívaným genetickým testům. Tento test je zaloţen na testování DNA. Jde o DNA rodiče a potomka. Analyzují se jednotlivé mikrosatelity. Dřívější metody vyuţívaly krevních skupin a polymorfismu bílkovin. Potomek dostává do své genetické výbavy jednu kopii od otce a jednu od matky, proto musí DNA potomka obsahovat mikrosatelity obou rodičů. Pokud ne, nejedná se o rodičovství. Správné určení rodičovství má vliv na odhad plemenné hodnoty a také na úspěšnost šlechtitelského programu. Chyby v identifikaci, chybný záznam nebo záměna telat, hraje velmi důleţitou ekonomickou roli (Roy et al., 1995). V ČR se ověřováním původu a genetického typu zabývá Laboratoř agrogenomiky Mendlovy univerzity v Brně, Laboratoř imunogenetiky Českomoravské společnosti chovatelů, a.s. Hradišťsko pod Medníkem (pouze hospodářská zvířata a psi) a zkušební laboratoř molekulární genetiky a cytogenetiky GENSERVICE, s.r.o., Brno (akreditace ČIA pro určování paternity a individuální identifikace zvířat) (Bryndová, 2009). 7

2 CÍL PRÁCE Cílem předloţené bakalářské práce byly následující úkoly: - zjistit současný stav v ověřování parentit v ČR včetně legislativy - seznámit se s postupem určování genetických typů a ověřování původu skotu v laboratořích genomiky - z podkladů laboratorních testů mikrosatelitů DNA analyzovat rozdíly v alelách a genotypech MS u skotu - provést analýzy mikrosatelitů stanovených u rodičů a jejich potomků, ověřit původy a vyhledat příslušné otce 8

3 DNA ANALÝZY UŽÍVANÉ PRO OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ V dnešní době nastal velký rozvoj v různých odvětví vědy, zejména v molekulární genetice. 3.1 Historie Uţ dříve lidé poznali, ţe pokud spolu kříţí samce a samici s dobrými vlastnostmi, které poţadovali, například růst, zmasilost, ţivotaschopnost, dostanou potomky podobných vlastností, proto zde došlo k potřebě ověřovat, zda jsou rodiče skuteční. Na počátku 20. století byly objeveny krevní skupiny. Krevní skupinou se rozumí geneticky determinovaná vlastnost červené krvinky charakterizovaná přítomností specifických antigenů (Kutěj,Šamaj 2006). LANDSTEINER, byl prvním objevitelem, který v roce 1901 objevil individuální rozdíly u lidských erytrocytů. Skoro ve stejnou dobu probíhal ale i výzkum antigenních individuálních rozdílů u ţivočichů: EHRLICH a MORGENROTH u koz, TODD a WHITE u skotu, LANGER a MILLER u slepic. Později se ukázalo, ţe tato výlučnost antigenů jednoho jedince je dána existencí omezených počtů antigenních faktorů, které vzájemným kombinováním zajišťují odlišení jedinců stejného druhu. Dochází ale k překrývání některých antigenních faktorů, z nichţ některé jsou společné celé řadě jedinců (Kníţe, Šiler et al., 1978). DNA lze v dnešní době zjistit z krve, chlupové cibulky, tkáně, mléka a sperma. 3.2 Izolace DNA z krve Jednou z moţností jak získat DNA je izolace z krve. 3.2.1 Klasická proteinázová metoda 1. K 50µl krve v 1,5 ml eppendorfově zkumavce přidat 500µl TE pufru, centrifugovat při 10 000 otáčkách za 1 minutu. Opakovat minimálně 3 tak, aby vzorek nebyl červeně zabarven. 2. Odstraněním supernatanu je získán sediment obsahující leukocyty. 9

3. Inkubovat 2-10 hodin ve 100µl lyzačního pufru s proteinázou K při 54 C (Knoll, Vykoukalová 2002). Výnos DNA můţe být zvýšen aţ o 15 %, pokud se postup opakuje se stejným 200ml vzorkem obsahujícím eluát. Pokud je výnos DNA niţší (méně neţ 3mg) objem elučního pufru se sníţí na 100 µl, abychom dosáhli vyšší koncentrace DNA v eluátu. Pokud je DNA méně neţ 1mg, můţeme sníţit objem elučního pufru aţ na 50µl. Celkový výnos DNA se sníţí o 10-15 % (Finnzymes). Z praktického hlediska je tento postup náročnější na odběr materiálu. Například odběr u volně se pasoucích stád. 3.3 Izolace DNA z chlupu Abychom izolovali DNA a přesně určili genetický typ, je zapotřebí chlupových cibulek. V následující kapitole je popsán odběr chlupů u skotu a zpracování vzorků. 3.3.1 Postup odběru chlupů u skotu - snaţit se chlupy vytrhávat z neznečištěných míst - kořen ocasu, slabiny, kohoutek - nestříhat, ale vytrhávat srst proti směru růstu - zkontrolovat, zda srst obsahuje chlupové cibulky - umístit do přiloţeného papírového sáčku - nadepsat číslo zvířete (popř. poslední 4 čísla) - vyplnit přiloţenou objednávku (Stehlík 2010). 10

3.3.2 Zpracování vzorků 1) Vzorky tkáně nařezat skalpelem a semlít na jemný prášek. Prášek by měl být co nejjemnější pro optimální lyzi. 2) Přidá se 200µl pufru T1, směs by měla být homogenní. Nutné pouţívat ochranné rukavice. 3) Přidat 200µl proteinázy K do směsi, promíchat a inkubovat minimálně 1-2hodiny při 56 C (pokud se tkáň rozkládá špatně, prodlouţíme inkubaci přes noc). Délka inkubace je závislá na tom, jak je vzorek homogenizovaný. Během inkubace směs obracet. Měla by být průhledná. Pufr T1 denaturuje proteiny, proteináza K štěpí denaturované bílkoviny na menší fragmenty. 4) Přidat 20µl Rase A a inkubuje se dalších 5 minut při 37 C. Zbytkové fragmenty RNA budou odstraněny během dalšího postupu. Přidat 200µl pufru T2, inkubovat 10 minut při 70 C. 5) Směs nechat vychladnout 1 minutu, pak přidat 200µl 100 % ethanolu. Musíme zabránit vysráţení DNA (promíchat). I přes promíchání můţe k vysráţení dojít, proto se musíme přesvědčit, ţe DNA přeneseme spolu s kapalinou do kolon. 6) Centrifugace 1 minutu. 7) Přidat 500 pufru T3. Ten zajistí nízký obsah solí v eluátu. 8) Odstřeďovat 1 minutu při 13000 otáčkách za minutu, tím se odstředí reziduát T3 pufru. Zbytek ethanolu by mohl mít vliv na enzymatické reakce (Taq DNA polymeráza). Vloţit do čisté zkumavky, inkubovat 5 minut při pokojové teplotě, poté vloţit do odstředivky na 2 minuty (JETQUICK). 3.4 PCR Polymerázová řetězová reakce, která slouţí k získání dostatečného mnoţství DNA pro další analýzy. Metoda byla poprvé popsána v roce 1985 (Saiki et al.,1987). 11

PCR můţe být pouţita jen tehdy, kdyţ je známá nukleotidová sekvence ohraničující analyzovaný gen nebo sekvenci DNA (Snustad, Simmons 2009). 3.4.1 Princip metody PCR je zaloţena na extenzi primerů a geometrické amplifikaci (namnoţení) molekul DNA za cyklického opakování tří kroků lišících se pouze teplotními podmínkami (Knoll, Vykoukalová 2002). Při této amplifikaci je vhodné mít dva primery, kaţdý na jeden řetězec dvoušroubovice. Primery ohraničují cílovou sekvenci z kaţdé strany, aby byla moţná selektivní amplifikace. Primery jsou syntetizovány jako oligonukleotidy a jsou přidávány do reakce v nadbytku, takţe kaţdý z primerů je zpravidla schopen být k dispozici po kaţdém denaturačním kroku. Další podmínkou je dostupnost termostabilní DNA polymerázy. To je čištěný enzym termofilní bakterie Thermus aquaticus a podle svého producenta se nazývá Taq. Kromě primerů a Taq polymerázy je nutné, aby kaţdá PCR reakce obsahovala pufr a 4 dntps, tj. volné nukleotidy, které jsou nutné při komplementárním doplňování rozpletených DNA řetězců (Řehout et al., 2005). PCR umoţňuje současnou syntézu obou komplementárních vláken extenzí (prodluţováním) dvou primerů (jednořetězcových oligonukleotidů) připojených ke komplementárním řetězcům na protilehlých koncích templátu. Umístění obou primerů tak ohraničuje amplifikovaný úsek DNA. Kaţdý cyklus PCR zahrnuje teplotní denaturaci DNA, připojení primerů (annealing) a syntézu DNA (elongace). V kaţdém cyklu se mnoţství DNA zdvojnásobí a tím se zdvojnásobí mnoţství templátu pro následující cyklus. V důsledku toho dochází k exponenciální amplifikaci, tj. z kaţdé molekuly původního templátu bude vytvořeno 2 n kopií, kde n je počet cyklů. Například po 30 cyklech by mělo dojít zhruba k 10 10 násobnému namnoţení DNA. V praxi je však amplifikace limitována koncentrací substrátů a aktivitou enzymu. Obecně 10 5-10 6 násobné amplifikace můţe být dosaţeno v 30 aţ 50 cyklech. Účinnost amplifikace je odhadována mezi 60 a 85 %, ale můţe být sníţena přítomností většího mnoţství templátu. Zvyšuje se totiţ pravděpodobnost hybridizace templátu s komplementárním řetězcem DNA, místo s primerem. Na účinnost amplifikace má také vliv nespecifická hybridizace primerů s jinými sekvencemi na cílové DNA. Za optimálních podmínek 12

však mohou být detekovány PCR amplifikacemi i geonomové sekvence o jedné kopii a viry (KNOLL, Vykoukalová 2002). Pomocí přístroje zvaný termální cykler se střídá teplota reakce ve třech základních krocích. V kaţdém cyklu se mnoţství DNA zdvojnásobí, tj. po 30 cyklech bude teoreticky 2 30 nově nesyntetizovaných molekul DNA. Protoţe se při PCR pracuje s velmi malým mnoţstvím, je reakce poměrně citlivá. Je tedy nutné dbát na přísnou hygienu a čistotu práce, aby nedošlo ke kontaminaci (např. leţí-li otevřené zkumavky delší dobu v laboratoři, či pracujeme-li bez rukavic). Proto je nejlepší připravovat reakci ve sterilním boxu. Dále je nutný vţdy přesný popis pouţívaných zkumavek a kvalita kontroly, zejména tehdy, jsou-li analýzy prováděny v humánní medicíně nebo pro soudní účely (Řehout et al., 2005). 3.5 Fragmentační analýza Namnoţení mikrosatelitní DNA probíhá pomocí metody PCR a je moţné pomnoţit všechny mikrosatelity v jedné zkumavce (multiplex PCR ). Fragmenty DNA mikrosatelitů jsou potom podrobeny kapilární elektroforéze (fragmentární analýza) na genetickém analyzátoru (sekvenátoru), kde jsou jednotlivé DNA fragmenty separovány na základě své velikosti. Detekce se provádí automaticky pomocí fluorescence. Kit firmy Finnzymes Diagnostics na stanovení DNA polymorfismu u skotu (Bovine GenotypoesTM Panel 3.1) slouţí k amplifikaci 18 dinukleotidových markerů. Testovaný kit nabízí vysoce kvalitní a dobře vybalancovanou intenzitu výstupního signálu. Výhodou je poměrně vysoká stabilita multiplexní PCR reakce, nízké detekční limity pro geonomovou DNA a v neposlední řadě komfort v podobě master mixů primerů(finnzymes). Uchování DNA Kvalitně a šetrně izolovanou DNA lze dlouhodobě uchovávat zamraţenou v ethanolu, v lyofilizovaném stavu a nejčastěji ve vodném roztoku (případně pufru). Pro 13

potřeby PCR se uchovává DNA ve vodě při -20 C, dlouhodobě aţ při -70 C. Rozmrazování negativně ovlivňuje kvalitu DNA, proto u vzácných vzorků je vhodné uloţit alikvotní vzorek. Pufr TE zvyšuje délku skladovatelnosti DNA, ale vzhledem k obsahu EDTA, který inhibuje PCR se nedoporučuje (KNOLL, Vykoukalová 2002). 14

4 SATELITNÍ DNA V posledních letech je velmi intenzivně sledován výskyt satelitů. Satelitní DNA je obecné označení pro výskyt mnoha relativně krátkých sekvencí v geonomu ve formě tzv. tandemových repetic, tzn. za sebou leţících opakujících se jednotek DNA. Podle své délky se zařazují do několika tříd: - maxisatelity celková délka repetitivní DNA je 5 x 10 5 párů bází. Na chromozomu jsou často lokalizovány v blízkosti centromery. - minisatelity krátké hypervariabilní sekvence DNA, uspořádané rovněţ jako tandemové repetice, jsou tvořeny sekvencemi 10-60 párů bází. - mikrosatelity jsou tvořeny 2-6 bázemi (Řehout et al., 2000). 4.1 Užívání minisatelitní DNA Minisatelity, označované také jako VNTR (variable number tandem repeat). Minisatelity jsou seřazeny tandemově a mohou mít 10-60 opakujících se párů bází (bp). Jedinci se pak liší v počtech opakování a restrikčních místech (Dvořák et al., 2002). Sem patří i vzácně se vyskytující dalece nebo inzerce v intronové části způsobené např. transpozomy (KNOLL, Vykoukalová 2002). Pro potřeby laboratorního testování je nutné si uvědomit, ţe jsou minisatelity velmi dlouhé. Proto není moţné je amplifikovat pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce). K detekci minisatelitní DNA je nutné pouţít značenou sondu a restrikční enzymy, které štěpí tuto DNA. Minisatelity jsou hypervariabilní, proto lze po provedení elektroforézy získat na gelu hustý ţebřík DNA, jehoţ pruhy jsou individuálně specifické. V praxi se však tyto postupy k určování rodičovství u hospodářských zvířat nepouţívají (Dvořák et al., 2002). 4.2 Užívání mikrosatelitů Mikrosatelity (syn. STR short tandem repeats), jsou krátké tandemové repetice sloţené z mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidových motivů. Vyskytují se ve všech eukaryotních genomech. 15

Významnou vlastností je vysoký stupeň polymorfizmu způsobený variabilním počtem tandemových repetic (obvykle 10-30). Nejčastěji se vyskytující repeticí u savců je motiv (AC) n (Knoll, Vykoukalová 2002), ty se vyskytují na 50-100 tisících různých lokusech v genomu ţivočichů (Dvořák et. al., 2002). Polymorfismus mikrosatelitů je moţné rychle a spolehlivě zjistit pomocí PCR. Díky těmto vlastnostem jsou mikrosatelity dobrými markery pro vazbové mapování genů a studium diverzity včetně ověřování rodičovství (Knoll, Vykoukalová 2002). Mnoţství opakování daných bází (např. GA, CTA) je v desítkách, někdy i stovkách a označují se (TGA) n. Jiné příklady jsou GA 6, CTA 215. Blok, ve kterém se opakují mikrosatelitní elementy se nazývá mikrosatelitní jednotka. Ty se pak v genu vyskytují v různém počtu kopií (Dvořák et. al., 2002). V současné době jsou mikrosatelity nejčastěji pouţívaným typem markeru. Jejich genotypizace je prováděna rutinně tak, ţe se v PCR amplifikuje příslušný úsek DNA, který nese daný mikrosatelit a jenţ je identifikován sekvencí bází v primeru. Fragmenty se liší délkou, která je dána počtem opakování mikrosatelitního motivu. Délka je určována elektroforeticky, většinou na automatickém sekvenátoru (Řehout et al., 2005). Příklad tří různých alel mikrosatelitů lišících se délkou DNA (Knoll, Vykoukalová 2002). Mikrosatelit (GC) n 5ʹATCGGTATTGCGCGCGCGCGCGCGCTACGTT 3ʹ n=8 5ʹ ATCGGTATTGCGCGCGCGCTACGTT 3ʹ n=5 5ʹ ATCGGTATTGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCTACGTT 3ʹ n=11 16

Tab. č. 1 Panel mikrosatelitů (ISAG 2003). Lokus Chromozom Opakování Velikost (bp) TGLA227 18 di 63-115 BM2113 2 di 116-146 TGLA53 16 di 147-197 ETH10 5 di 198-234 SPS115 15 di 240-270 SPS113 10 di 279-307 RM067 4 di 83-101 TGLA126 20 di 104-132 TGLA122 21 di 133-193 INRA23 3 di 194-236 BM1818 23 di 248-276 ETH3 19 di 89-131 ETH225 9 di 132-166 BM1824 1 di 170-218 CSRM60 10 di 79-115 MGTG4B 4 di 129-153 CSSM66 14 di 171-209 ILSTS006 7 di 277-309 18 genotypů mikrosatelitů, které zahrnují všech 12 lokusů, doporučené ISAG pro rutinní používání pro určování rodičovství u skotu (ISAG 2003). 4.3 Užívání SNP V geonomu ţivočichů se nachází mimo minisatelitů a mikrosatelitů i další variabilita, která vzniká bodovými mutacemi. Mutace mohou vznikat záměnou báze DNA za jinou, ztrátou jedné báze (delece), přehozením po sobě následujících bází (inverze) či vloţením další báze do sekvence (inzerce) a došlo ke vzniku jednonukleotidového polymorfismu SNP (Dvořák et al., 2002). Jak uvádí Werner et al., (2004) SNP byly podrobeny následujícím výběrovým kritériím: 17

- četnost menších alel musí být větší neţ 0,1 u dvou ze tří zkoumaných plemen - markery by neměly úzce souviset Frekvence alel byly odhadnuty na základě analýzy sekvenování DNA nebo genotypizace jednotlivých vzorků DNA. Vybrané SNP lokusy byly radiačně mapovány nebo mapovány pomocí fluorescenční in-situ hybridizace a testovány na mutace. Tato metoda umoţňuje určit rodičovství na 99,9 % (Werner et al., 2004). 4.4 Výhody SNP oproti mikrosatelitům Pro porovnání SNP a mikrosatelitů jsou zde uvedeny výhody metody SNP: 1) niţší mutační rychlost 2) více vyuţívaný v laboratorní praxi 3) vhodnost pro standardní zobrazení výsledků genotypizace DNA 4) vhodnost pro různé genotypy a vysoký potenciál pro automatizaci 5) naopak nevýhodou SNP je to, ţe má niţší obsah informací ve srovnání s vysoce polymorfními mikrosatelity. Tuto nevýhodu lze ale kompenzovat vyšším počtem markerů (Werner et al., 2004). 18

5 ZÁKONNÉ PODKLADY K OVĚŘOVÁNÍ RODIČOVSTVÍ U SKOTU V České republice se určování rodičovství řídí zákonem č. 154/2000 Sb. o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat a o změně některých souvisejících zákonů (plemenářský zákon). Účelem tohoto zákona je stanovit podmínky a pravidla pro šlechtění a plemenitbu vyjmenovaných hospodářských zvířat, pro ochranu, uchovávání a vyuţívání genetických zdrojů zvířat, pro označování označovaných zvířat a pro evidenci evidovaných zvířat, chovaných na území České republiky tak, aby tato činnost byla za podpory ze státních prostředků nástrojem pro zvelebování populací těchto zvířat a zachování jejich genetické rozmanitosti. 14 Genetické zdroje Pro účely tohoto zákona se dále rozumí a) genetickým zdrojem zvířete jedinec, sperma, vajíčko, embryo, popřípadě ostatní genetický materiál autochtonního nebo lokálně adaptovaného druhu, plemene nebo populace zvířete, nacházející se na území České republiky, mající význam pro výţivu a zemědělství, pro uchování biologické a genetické rozmanitosti světového přírodního bohatství a pro umoţnění jeho vyuţívání pro potřeby současných i budoucích generací, zařazené do Národního programu konzervace a vyuţívání genetických zdrojů zvířat významných pro výţivu a zemědělství, b) určenou osobou příspěvková organizace zřízená ministerstvem pro realizaci Národního programu, pro provozování genobanky a pro koordinaci opatření s tím souvisejících, jejíţ identifikační údaje jsou uveřejněny ve Věstníku Ministerstva zemědělství, c) genobankou soubor zařízení slouţících ke konzervaci a vyuţívání genetických zdrojů zvířat provozovaný určenou osobou, d) vzorkem genetického zdroje zvířete odebraný reprodukční materiál zvířete, zejména sperma, vaječné buňky, embrya, případně další tkáně, umoţňující přenos a regeneraci genetického zdroje zvířete při zachování jeho genetického základu, 19

e) uváděním do oběhu plemenného zvířete, spermatu, embrya, vaječné buňky, násadových vajec drůbeţe a plemenného materiálu ryb a včel, jejich nákup nebo prodej, nabízení k prodeji a kaţdý jiný způsob převodu za úplatu nebo bezúplatně jiným osobám. Šlechtitelská činnost a šlechtitelská opatření spočívají: a) ve stanovení šlechtitelských programů pro dosaţení chovných cílů, b) ve zjišťování a evidování původu, vlastností a znaků vyjmenovaných hospodářských zvířat, c) v provádění kontroly uţitkovosti, výkonnostních zkoušek, výkonnostních testů, kontroly dědičnosti, posuzování vlastností, znaků a zdraví vyjmenovaných hospodářských zvířat, d) ve kvalifikovaném odhadu plemenné hodnoty vyjmenovaných hospodářských zvířat, e) ve vedení plemenných knih nebo plemenářských evidencí, f) v ověřování a osvědčování původu nebo stanovování genetického typu plemenných zvířat, g) v hodnocení vyjmenovaných hospodářských zvířat a jejich cílevědomé selekci a připařování v souladu se šlechtitelskými programy a cíli, h) v ochraně dědičných vlastností a znaků určité populace (genofondu) a udrţování genetických zdrojů, i) ve vystavování dokladů o původu, výkonnosti a hodnotě plemenných zvířat, j) ve zveřejňování dosaţených plemenných hodnot zvířat, výsledků šlechtění a plemenářské činnosti Ověřování a osvědčování původu a stanovování genetického typu plemenných zvířat (1) Původ plemenných zvířat ověřují a jejich genetické typy stanovují oprávněné osoby. (2) Oprávněná osoba je povinna a) doloţit způsobilost k ověřování a osvědčování původů a stanovování genetických typů plemenných zvířat osvědčením o akreditaci, b) doloţit účast v mezinárodních srovnávacích testech, pokud se tyto testy provádějí, a trvale splňovat jejich kritéria, 20

c) ověřovat původ a stanovovat genetický typ plemenného zvířete, poţádá-li o to Česká plemenářská inspekce nebo orgány veterinární správy pro výkon kontrolní činnosti (odstavec 4) nebo uznané chovatelské sdruţení anebo osoba uvedená v odstavci 6, d) vydávat osvědčení o ověření původu a osvědčení o stanovení genetického typu a poskytovat je České plemenářské inspekci nebo orgánům veterinární správy pro výkon kontrolní činnosti (odstavec 4) nebo uznaným chovatelským sdruţením anebo osobě uvedené v odstavci 6, pokud o ně poţádala. (3) Původ musí být ověřen u a) býků před výběrem k plemenitbě, b) hříbat narozených po inseminaci nebo po přenosu embryí, c) hříbat plemene anglický plnokrevník a klusák, d) hejna plemenných ryb zařazených do genetických zdrojů a do plemenitby, e) dovezeného plemenného materiálu včel. (4) Původ zvířat můţe být také namátkově ověřen pro výkon kontrolní činnosti. (5) Genetický typ musí být stanoven u a) býků a hřebců vybraných pro plemenitbu, b) kanců v rozsahu stanoveném ve šlechtitelském programu, c) beranů a kozlů zařazených do inseminace. (6) O ověření původu podle odstavce 3 nebo o stanovení genetického typu podle odstavce 5 je povinen poţádat majitel zvířete. (7) Osvědčení o ověření původu a osvědčení o stanovení genetického typu musí obsahovat identifikační údaje majitele zvířete, identifikační údaje zvířete, identifikační údaje rodičů zvířete a výsledek ověření původu nebo výsledek stanovení genetického typu zvířete. (8) Vyhláška stanoví podrobnosti o údajích osvědčení o ověření původu a osvědčení o stanovení genetického typu. 26 Potvrzení o původu plemenných zvířat, doklad o původu prasat a osvědčení o původu hejna (1) Potvrzení o původu plemenných zvířat je doklad o identitě, původu a výkonnosti plemenných zvířat, dárců spermatu, embryí, vaječných buněk, násadových vajec a plemenného materiálu ryb (dále jen "potvrzení o původu"). 21

(2) Potvrzení o původu vydává a údaje v něm uvedené na ţádost chovatele porovnává uznané chovatelské sdruţení, a to podle zápisu plemenného zvířete v plemenné knize nebo v plemenářské evidenci. (3) Doklad o původu prasat pro své smluvní chovy vydává a údaje v něm uvedené porovnává chovatelský podnik prasat, a to podle zápisu zvířete v chovném registru. (4) K produkci násadových vajec je nutné osvědčení o původu hejna. Osvědčení o původu hejna vydává pro tuzemské chovy drůbeţe uznané chovatelské sdruţení, pro chovy drůbeţe přemístěné z jiných členských států Evropské unie nebo dovezené ze třetích zemí oprávněná osoba. (5) Vyhláška stanoví podrobnosti o údajích potvrzení o původu platné i pro přemísťovaná a dováţená zvířata, sperma, embrya, vaječné buňky a plemenný materiál ryb a podrobnosti o údajích osvědčení o původu hejna. 29 Náležitosti osvědčení o ověření původu nebo stanovení genetického typu: (2)Výsledek ověřování původu se vyjadřuje slovy: a) původ souhlasí s uvedenými rodiči, pokud kombinace genetických typů rodičů je kompatibilní s genetickým typem potomka. b) původ nesouhlasí s uvedenými rodiči, pokud kombinace genetických typů rodičů je nekompatibilní s genetickým typem potomka, a to: 1. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí otec 2. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí matka 3. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče 4. původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nelze určit, který z rodičů nesouhlasí 22

c) původ souhlasí s otcem uvedeným na prvním místě za předpokladu správné matky, pokud bylo udáno více moţných otců a všichni byli vyloučeni aţ na jednoho, který se uvede na prvním místě. d) původ nelze ověřit, pokud není k dispozici genetický typ jednoho nebo obou rodičů(u plemenných ryb rodičovských hejn) a nebo z více udaných moţných otců, nelze vyloučit dva a více otců e) základní testace potvrzení, ţe genetický typ zvířete byl zahrnut do databáze genetických typů vedených oprávněnou osobou s cílem umoţnit ověření původu jeho potomků (Plemenářský zákon). Zákon č.32/2011 SB. Zákon, kterým se mění zákon č.154/2000 Sb., o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat a o změně některých souvisejících zákonů (plemenářský zákon), ve znění pozdějších předpisů. V 2 odst. 1 písm. b) se za slovo "Bovinae" vkládají slova "s výjimkou volně ţijících ţivočichů 15) "(Plemenářský zákon). 23

6 VLASTNÍ PRÁCE Ve své práci jsem ověřovala údaje z genetického analyzátoru ABI PRISM 310, které dodala Laboratoř agrogenomiky. Určovala jsem parentitu u otců plemene holštýn, zjišťovala četnost alel a vypočítávala frekvence alel. 6.1 Ověřování parentit u otců plemene holštýn V České republice je holštýnské plemeno jedním z nejčastějších plemen s trţní produkcí mléka, i kdyţ v roce 2010 došlo k dosti výraznému poklesu počtu krav i chovů dojených plemen skotu. Ukončující se proces převodného kříţení se projevuje poklesem stavů v posledních dvou letech. Holštýnské plemeno dnes zahrnuje celkem 57,2 % krav v kontrole uţitkovosti v ČR (52,5 % černostrakaté a 4,7 % červené holštýnské). Holštýnských krav ubylo 7077 ks, z toho představoval pokles červených holštýnek 1372 ks. Celkový stav holštýnských krav, včetně kříţenců k 31. 10. 2010 činil 205 290 kusů (Svaz chovatelů holštýnského skotu). Holštýnské plemeno patří do skupiny niţších plemen. Černostrakatý skot pochází ze severozápadní Evropy. V těchto oblastech se vyvinulo v průběhu 17. aţ 19. století z různých místních populací a postupně se rozšiřovalo do celého světa. V Evropě bylo nejdříve šlechtěno na exteriérově vyváţený typ středního rámce (131 aţ 132cm v kohoutku) s velmi dobrou mléčnou produkcí, vyšším obsahem mléčných sloţek a dobrým osvalením. Pro zvířata severoamerické provenience se vţilo označení holštýnský skot. Dnes je to nejprošlechtěnější plemeno na mléčnou uţitkovost. Jeho zbarvení je převáţně černostrakaté a ojediněle se vyskytují recesivně zaloţení červenostrakatí jedinci (RED holštýn). K nejprošlechtěnějším populacím patří stáda v Izraeli, Kanadě a USA, kde průměrná uţitkovost dosahuje 10 000kg mléka za laktaci. Chov v ČR je zaloţen na genetickém materiálu ze Severní Ameriky, Francie, Holandska, Dánska, Itálie a SRN (svaz chovatelů holštýnského skotu). 24

6.2 Porovnávaní býci Porovnáváni byli potomci pěti býků, kteří jsou uvedeny níţe: - NEB 878 - NBY 198 - NBY 166 - NBY 165 - NX 929 - TGLA 53 k tomuto lokusu nebyly zadány potřebné údaje, proto jsem s ním nepracovala a dále ho jiţ neuvádím. Plemenný býk NBY 166 Tento plemenný býk měl v mé práci uvedeno 7 potomků. Byli to: CP 26, CP 101, CP 96, GO 25, GO 53, GO 55, GO 48. Jméno: Drake Narozen: 22. 3. 1999 Ušní číslo: CZ 052371 386 Otec: NBY 091 Matka: USA 000015071250 Plemenný býk NBY 165 U tohoto plemenného býka jsem napočítala 11 potomků. Byli to: CP 50, CP 59, CP 61, CP 43, CP103, CP 18, GO 19, GO 26, GO 38, GO 42, GO 77 Jméno: Disc Narozen: 20. 2. 2009 25

Ušní číslo: CZ 109860 582 Otec: NBY 91 Matka: USA000014764491 Plemenný býk NBY 198 Tento plemenný býk měl uvedeno nejvíce potomků, a to 14. Byli to: SE 19, SE 21, SE 22, SE 31, SE 34, SE 35, SE 62, SE 56, SE 64, SE 68, SE 77, SE 84, SE 85, SE 91 Jméno: Mister Dean Narozen: 21. 3. 1999 Ušní číslo: neuvedeno Otec: NBY 116 Matka: NLD 000107279512 Plemenný býk NEB 878 Tento plemenný býk měl v mé práci uvedeno 13 potomků. Byli to: SE 1, SE 4, SE 5, SE 12, SE 14, SE 30, Se 32, SE 69, SE 67, SE 76, SE 90, SE 93, SE 98 Plemenný býk NX 929 Tento plemenný býk měl v mé práci uvedeno 7 potomků, stejně jako býk NBY 166. Byli to: GO 13, GO 8, GO 14, GO 49, GO 51, GO 72, GO 69 Jméno: Dušan 26

Narozen: 19. 10. 1997 Ušní číslo: HU000000015559 Otec: 266-683 Matka: USA000014711940 (Svaz chovatelů holštýnského skotu). 6.2.1 Výskyt alel v celé populaci Výskyt alel byl sledován u 109 kusů plemene holštýn. Z toho bylo 5 plemenných býků, 52 matek a 52 potomků. Alely byly pozorovány u níţe uvedených mikrosatelitů. Tab. č. 2 Pozorované alely u plemene holštýn v celé populaci Lokusy Relativní frekvence alel BM 1824 178,180,182, 186, 188, 190 BM 21113 121, 125, 127, 131, 133, 135, 137, 139 ETH 3 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 109 ETH 10 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225 ETH 225 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 INRA 023 198, 200, 202, 206, 208, 210, 214, 218 SPS 115 248, 252, 254, 256, 258, 260 TGLA 122 139, 143, 151, 153, 159, 161, 163, 173, 183 27

TGLA 126 115, 117, 119,121, 123 TGLA 227 81, 83, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 103 6.3 Výpočet frekvence pro celou populaci: Frekvence alel byly vypočítány dle vzorce (Hruban et al., 2000). kde p = relativní četnost alely A q = relativní četnost alely B = relativní četnost homozygotního genotypu AA b = relativní četnost homozygotního genotypu BB h = relativní četnost heterozygotního genotypu AB Ve své práci jsem v celé populaci napočítala 109 jedinců. Tab. č. 3 Vypočtené frekvence pro celou populaci Lokusy BM 1824 Alely 178 180 182 186 188 190 0,2442 0,2162 0,2442 0,005 0,2162 0,0742 BM 121 125 127 131 133 135 137 139 28

21113 0,005 0,234 0,216 0,055 0,086 0,197 0,101 0,106 ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227 109 117 119 121 123 125 127 129 0,005 0,48 0,055 0,009 0,005 0,157 0,142 0,147 213 215 217 219 221 223 225 0,151 0,005 0,156 0,472 0,037 0,119 0,060 140 142 144 146 148 150 152 0,156 0,005 0,118 0,05 0,341 0,28 0,05 198 200 202 206 208 210 214 218 0,005 0,064 0,083 0,216 0,145 0,234 0,248 0,005 248 252 254 256 258 260 0,505 0,138 0,073 0,124 0,092 0,068 139 143 151 153 159 161 163 173 183 0,009 0,344 0,134 0,138 0,005 0,055 0,161 0,018 0,136 115 117 119 121 123 0,339 0,385 0,130 0,096 0,05 81 83 87 89 91 93 97 99 103 0,225 0,046 0,018 0,06 0,188 0,182 0,248 0,005 0,028 Nejvíce alel se nacházelo v lokusech TGLA 122 (alely 139, 143, 151, 153, 159, 161, 163,173, 183) a TGLA 227 (alely 81, 83, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 103) v počtu 9 alel. Nejméně alel se nacházelo v lokusu TGLA 126 v počtu 5 alel. Jsou to: 115, 117,119,121, 123. 6.4 Ověřování parentity (5 býků) Otec NEB 878 Potomek 139500/61 29

Matka 103302/61 Tab. č.4 Ověřování rodičovství potomků u býka NEB 878 Otec NEB 878 Matka 103302/61 Potomek 139500/61 BM 1824 178 182 178 182 178 188 BM 21113 125 135 127 135 135 135 ETH 3 117 127 117 125 117 127 ETH 10 213 219 213 217 221 223 ETH 225 148 148 144 146 148 150 INRA 023 210 214 208 208 202 208 SPS 115 248 248 248 248 248 TGLA 122 149 149 149 163 143 173 TGLA 126 119 121 115 117 115 117 TGLA 227 81 89 81 89 81 97 Sledovaný potomek máv lokusu ETH 10 alely 221 a 223, jeho otec má alely 213 a 219, matka je také heterozygot s alenami 213 a 217, to znamená, ţe ani od otce, ani od matky potomek nedostal ţádnou z uvedených alel. V lokusu ETH 225 je otec homozygot a má alely 148 a 148, matka má alely 144 a 146. Od otce tedy dostal alelu 148, ale od matky nedostal ţádnou. V dalším lokusu INRA 023 má otec alely 210 a 214,potomek má alely 202 a 208, matka je homozygot 208 a 208, předala tedy potomku alelu 208, ale od otce nedostal ţádnou z alel. V lokusu TGLA 122 je otec homozygot a má alely 149 a 149, matka má alely 149 a 163. Potomek má alely 143 a 173 a nedostal tedy alely od ţádného z rodičů. TGLA 126, zde dostal potomek jednu alelu od matky, 115 nebo 117, ale od otce jehoţ lokusy jsou 119 a 121 nedostal nic. TGLA 227 dostal opět potomek alelu od matky, ale od otce nedostal ţádnou. 30

Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče. Otec NEB 878 Potomek 139499/61 Matka 116156/61 Tab. č. 5 Ověřování rodičovství potomků u býka NEB 878 Otec NEB 878 Matka 116156/61 Potomek 139499/61 BM 1824 178 182 182 188 178 182 BM 21113 125 135 125 135 125 125 ETH 3 117 127 117 129 117 129 ETH 10 213 219 221 223 219 223 ETH 225 148 148 148 150 148 148 INRA 023 210 214 200 214 200 214 SPS 115 248 248 248 258 248 248 TGLA 122 149 149 173 173 149 149 TGLA 126 119 121 115 119 115 119 TGLA 227 81 89 89 97 81 97 V lokusu TGLA jsou všichni jedinci (otec, matka, potomek) homozygoti, kaţdý však s odlišnými alelami, potomek dostal alelu pouze od otce. Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí matka. Otec NBY 198 Potomek 126386/61 31

Matka 102191/61 Tab. č. 6 Ověřování rodičovství u býka NBY 198 Otec NBY 198 Matka 102191/61 Potomek 126386/61 BM 1824 188 180 188 180 188 BM 21113 125 125 127 127 135 ETH 3 117 117 117 117 129 ETH 10 219 219 223 219 219 ETH 225 140 148 140 148 140 150 INRA 023 206 210 202 210 202 206 SPS 115 248 252 248 254 252 254 TGLA 122 143 163 143 143 143 183 TGLA 126 115 117 117 117 117 117 TGLA 227 91 103 81 97 97 97 Otec má v lokusu ETH 225 uvedené alely 140 a 148, z nichţ nepředal potomku ani jednu alelu, pouze matka mu předala alelu 140. V lokusu TGLA 122 dostal heterozygotní potomek alelu pouze od matky, od otce nikoli. Potomek je v lokusu TGLA 127 homozygot, alelu dostal pouze od matky. Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí otec Otec NBY 166 Potomek 114113/70 Matka 104364/70 32

Tab. č. 7 Ověřování rodičovství potomků u býka NBY 166 Otec NBY 166 Matka 104364/70 Potomek 114113/70 BM 1824 178 182 180 182 180 182 BM 21113 127 127 125 125 133 139 ETH 3 117 117 117 117 117 129 ETH 10 219 223 213 219 217 219 ETH 225 150 150 146 152 140 140 INRA 023 214 214 202 208 202 210 SPS 115 256 260 248 248 248 248 TGLA 122 143 143 143 143 171 173 TGLA 126 115 117 115 125 115 117 TGLA 227 91 91 81 97 93 97 V lokusech BM 21113, ETH 225 a TGLA 122 nedostal potomek od ţádného z rodičů stejnou alelu. V lokusech INRA 023, SPS 115 a TGLA 127 dostal potomek vţdy alelu pouze od matky, od otce nedostal nic, otec nesouhlasí. Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče Otec NX 929 Potomek 112967/70 Matka 100624/70 Tab. č. 8 Ověřování rodičovství potomků u býka NX 929 33

Otec NX 929 Matka 100624/70 Potomek 112967/70 BM 1824 178 190 180 182 188 188 BM 21113 125 127 125 135 135 137 ETH 3 117 127 117 117 117 117 ETH 10 213 219 217 219 219 219 ETH 225 148 150 140 150 140 152 INRA 023 200 202 210 214 206 206 SPS 115 248 252 248 248 248 252 TGLA 122 143 149 143 151 149 149 TGLA 126 115 117 115 117 117 117 TGLA 227 91 91 81 97 91 97 V lokusu BM 1824 je potomek homozygot 188 a 188, otec má alely 178 a 190, matka je také heterozygot, má alely 180 a 182, potomek tedy od ţádného z nich alely nedostal. Otec má v lokusu BM 21113 alely 125 a 127, matka předala potomku alelu 135, potomek má alely 135 a 137, tedy od otce ţádnou nedostal. V lokusech ETH 225 a INRA 023 nedostal potomek ţádnou alelu od otce, pouze od matky. Potomek je homozygot v lokusu TGLA 122, otec s alelami 143 a 149 předal potomku alelu 149, matka nepředala ţádnou alelu. Původ nesouhlasí s uvedenými rodiči nesouhlasí oba rodiče Vypočítané frekvence potomstva po býcích NEB 878, NBY 198, NBY 166, NBY 165, NX 929 Takto jsem prozkoumala všechny lokusy u všech býků. Pokud byl býk heterozygot, vyšly stejné alely, ale pokud byl býk v některém z lokusů homozygot, alely nesouhlasily. 34

Tab. č. 9 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NEB 878 BM 1824 BM 21113 ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227 178 180 182 188 190 0,370 0,222 0,240 0,093 0,075 125 127 131 133 135 137 139 0,296 0,13 0,037 0,037 0,278 0,111 0,111 117 119 125 127 129 0,389 0,037 0,167 0,222 0,148 213 215 217 219 221 223 0,204 0,019 0,130 0,500 0,037 0,110 140 144 146 148 150 152 0,093 0,190 0,056 0,365 0,185 198 200 202 206 208 210 214 0,037 0,135 0,093 0,165 0,13 0,24 0,2 248 254 256 258 260 0,648 0,148 0,093 0,092 0,019 143 149 151 159 161 163 173 0,222 0,389 0,037 0,019 0,074 0,203 0,056 115 117 119 121 123 0,241 0,185 0,241 0,259 0,074 81 83 89 91 93 97 103 0,278 0,074 0,148 0,074 0,111 0,278 0,037 Býk NEB 878 je heterozygot 178/182 v lokusu BM 1824, pokud vyberu dvě nejvyšší frekvence, vyjdou mi po porovnání opět alely 178/182. Z toho je patrné, jakým způsobem docházelo k segregaci alel. Opakování nevyšlo u alel, které byly homozygotní,byly to: 148/148 v lokusu ETH 225, 248/248 v lokusu SPS 115 a 149/149 v lokusu TGLA 122. 35

Tab. č. 10 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 198 BM 1824 BM 21113 ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227 178 180 182 188 190 0,103 0,259 0,103 0,379 0,156 125 127 131 133 135 137 139 0,31 0,293 0,017 0,017 0,155 0,052 0,156 117 119 125 127 129 0,569 0,121 0,069 0,086 0,152 213 217 219 221 223 0,121 0,069 0,655 0,017 0,138 140 148 150 152 0,241 0,379 0,239 0,087 200 202 206 208 210 214 0,034 0,086 0,293 0,017 0,276 0,294 248 252 254 256 258 260 0,345 0,449 0,103 0,052 0,034 0,017 143 149 151 153 161 163 171 181 183 0,397 0,069 0,069 0,034 0,121 0,190 0,034 0,017 0,069 115 117 121 123 0,345 0,534 0,069 0,052 81 83 91 93 97 99 103 0,241 0,034 0,260 0,034 0,190 0,017 0,224 U býka NBY 198 byly všechny lokusy heterozygotní, segregace alel byla tedy dobře viditelná. Tab. č. 11 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 166 36

BM 1824 BM 21113 ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227 178 180 182 186 188 190 0,233 1,133 0,333 0,033 0,201 0,067 125 127 131 133 135 137 139 0,200 0,233 1,134 0,033 0,067 0,100 0,233 109 117 125 127 129 0,033 0,600 0,100 0,167 0,1 213 217 219 221 223 225 0,100 0,133 0,333 0,033 0,233 0,167 140 146 148 150 152 0,200 0,167 0,200 0,366 0,067 200 202 206 208 210 212 214 0,233 0,067 0,167 0,100 0,133 0,033 0,267 248 252 256 260 0,200 0,133 0,267 0,400 143 149 151 153 163 171 173 0,467 0,200 0,100 0,100 0,067 0,033 0,033 115 117 121 123 125 0,567 0,167 0,100 0,133 0,033 79 81 83 91 93 97 103 0,067 0,267 0,165 0,267 0,067 0,100 0,067 Býk NBY 166 měl převáţnou většinu párů(6 z 11) alel homozygotních, a to: 127/127, 117/117, 150/150, 214/214, 134/143, 91/91, segregace alel byla tedy málo viditelná. Tab. č. 12 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 165 BM 1824 178 180 182 188 0,302 0,196 0,302 0,196 37

BM 21113 ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 127 131 133 135 137 139 0,239 0,109 0,108 0,196 0,261 0,087 117 119 123 125 127 129 0,248 0,065 0,088 0,152 0,13 0,217 213 217 219 221 223 225 0,109 0,152 0,326 0,131 0,217 0,065 140 144 146 148 150 0,087 0,152 0,022 0,478 0,261 200 202 206 208 210 214 218 0,086 0,043 0,261 0,152 0,239 0,196 0,022 248 252 254 256 258 260 0,174 0,022 0,239 0,261 0,022 0,413 139 143 149 151 161 163 171 183 0,043 0,196 0,110 0,196 0,065 0,304 0,043 0,043 115 117 121 123 0,391 0,370 0,174 0,065 TGLA 81 83 87 89 91 97 103 227 0,087 0,109 0,022 0,109 0,304 0,304 0,065 Protoţe byl býk ve všech lokusech heterozygot, daly se ve všech lokusech pop porovnání objevit shodné alely. Tab. č. 13 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NX 929 BM 1824 BM 21113 178 180 182 188 190 0,234 0,100 0,133 0,223 0,300 121 125 127 131 133 135 137 0,033 0,200 0,267 0,167 0,133 0,167 0,033 38

ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227 117 125 127 129 0,433 0,133 0,300 0,134 213 217 219 221 225 0,200 0,199 0,467 0,067 0,067 140 142 146 148 150 152 0,100 0,033 0,134 0,267 0,400 0,067 200 202 206 208 210 214 0,167 0,200 0,167 0,033 0,233 0,200 248 252 256 260 0,700 0,200 0,033 0,067 143 149 151 163 0,500 0,233 0,134 0,133 115 117 121 0,233 0,667 0,100 81 87 91 95 97 0,267 0,167 0,300 0,033 0,233 Býk NX 929 měl pouze jeden lokus homozygotní, byla teda dobře viditelná segregace alel. Při porovnávání alel jsem nalezla dvě alely, které jsou v tabulkách pouze jednou, pro jednoho býka. Je to alela 91, nacházející se pouze u býka NBY 198 a alela 190, která je totoţná pouze pro býka NX 929. 39

7 POUŽITÁ TERMINOLOGIE DNA (deoxyribonukleová kyselina) je nositelkou genetické informace všech organismů (s výjimkou nebuněčných organismů). DNA je pro ţivot nezbytnou látkou, která ve své struktuře kóduje a buňkám zadává jejich program a tím předurčuje vývoj a vlastnosti celého organismu. U eukaryotických organizmů (jako rostliny a ţivočichové) je DNA uloţena vţdy uvnitř buněčného jádra. Gen je základní fyzikální a funkční jednotka dědičnosti obsahující genetickou informaci. Genotyp je soubor všech genů organismu (Bryndová 2009). Alela jedna z různých forem genu nebo sekvence DNA, která můţe existovat na jednom lokusu lišící se v DNA sekvenci a ovlivňující funkčnost jednoho produktu (RNA nebo proteinu). Lokus místo v chromozomech, kde je umístěn určitý gen. Jednotlivé alely genů se nachází na shodných lokusech v homologiích chromozomech (Knoll, Vykoukalová 2009). Parentita určování rodičovství Paternita určování otcovství (Bryndová 2009). Mikrosatelity jsou krátké tandemové repetice sloţené z mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidových motivů. Vyskytují se ve všech eukaryotních geonomech. Významnou vlastností je vysoký stupeň polymorfizmu(proměnlivost určitých úseků genomu) způsobený variabilním počtem tandemových repetic (obvykle 20-30). Nejčastěji se vyskytující repeticí je u savců motiv (AC) n. 40

8 ZÁVĚR Přesnost identifikace jedinců, určování genotypů a ověřování parentity signalizují vysokou úroveň molekulární genetiky. Hlavním úkolem zjišťování je nesníţit plemennou hodnotu, která se odráţí i v uţitkových vlastnostech hospodářských zvířat. Nesprávně určený původ má tedy negativní dopad na ekonomiku. Jak je ale patrné z tabulek č.4 aţ č.8, i v dnešní době stále dochází k záměnám matek a otců. Ve své práci jsem porovnávala potomstvo od pěti býků (NEB 878, BM 21113, ETH 3, ETH 10,ETH 225, INRA 023, SPS 115, TGLA 122, TGLA 126 a TGLA 227 ) a pouze v populaci býka NBY 165 nedošlo k záměně rodičů. U býka NEB 615 jsem zjistila dva potomky, kteří nesouhlasili a u ostatních býků po jednom potomkovi. Vzhledem k dnes jiţ velmi vyuţívaného postupu inseminace a důkladnému značení inseminačních dávek, jsem očekávala spíše kladné výsledky, neţ jsem nalezla. Při porovnávání jsem zjistila, ţe nejvíce alel se nacházelo v lokusech TGLA 122 (alely 139, 143, 151, 153, 159, 161, 163,173, 183) a TGLA 227 (alely 81, 83, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 103) v počtu 9 alel. Nejméně alel se nacházelo v lokusu TGLA 126 v počtu 5 alel. Jsou to: 115, 117,119,121, 123. Dále jsem při porovnávání alel nalezla dvě alely, které jsou v tabulkách pouze jednou, pro jednoho býka. Je to alela 91, nacházející se pouze u býka NBY 198 a alela 190, která je totoţná pouze pro býka NX 929. Tato práce je pro mou budoucí praxi jistě přínosem, a to jak z pohledu budoucího zootechnika, tak i z pohledu kupujícího či prodávajícího chovatele. 41

9 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY BRYNDOVÁ, Marta. Jak geneticky určit druh dravce?. Zpravodaj Klubu sokolníků ČMMJ. 2009, 46, s. 58-60. ČR. Plemenářský zákon. In Zákony 2011. 2011, 3, s. 1-720 DVOŘÁK, Josef, et al. Ověřování parentity u prasat, skotu a koní. [s.l.] : [s.n.], 2002. 48 s. HRUBAN, V., MAJZLÍK, I. Obecná genetika. CZU v Praze, 2000, 1. vyd., 316 s. Informace o skotu : Holštýnské. In SCHCHS [online]. [s.l.] : [s.n.], 2006 [cit. 2011-03- 21]. Dostupné z WWW: <http://www.hovezimaso.cz/detail.php?plemeno=h>. KNÍŢE., ŠILER R.: Genetika zvířat. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 1978, s.99-312. KNOLL, Aleš; VYKOUKALOVÁ, Zuzana. Molekulární genetika zvířat. 2002. Brno : [s.n.], 2002. Laboratorní protokoly vybraných metodik, s. 1-100. Kutěj V., Šamaj M.: Krevní skupiny [online]. FN Olomouc, Olomouc, 2006(cit.2011-02-21). Parentage testing and individual identifikacion using short tandem repeat loci : introduction. In Bovine genotypes. [s.l.] : [s.n.], 2009. s. 1-20. Dostupné na http://public.fnol.cz/www/urgent/seminare/20060309/ks_kut.pdf Ron M., Domochovsky R., Golik M., Seroussi E., Ezra E., Shturman C., Weller J.I.: Analysis of vaginal swabs for paternity trstiny and marker-assisted selection in cattle. Journal of Dairy Science, 2003, vol. 86, s.1789-1796 42

ŘEHOUT, Václav, et al. Genetika I.. České Budějovice : [s.n.], 2000. 256 s. ŘEHOUT, Václav, et al. Genetika II. České Budějovice : [s.n.], 2005. 189 s. SNUSTAD, D.Peter; SIMMONS, Michael J. Genetika. Brno : [s.n.], 2009. 871 s. STEHLÍK, Libor. Brněnská genetika pro masný skot. Zpravodaj českého svazu chovatelů masného skotu. 2010, XVII, 3, s. 22-23. ŠUBRT, Jan; HROUZ, Jiří. Obecná zootechnika. Brno : [s.n.], 2009. 201 s. URBAN, Tomáš, et al. Genetika(návody do cvičení). [s.l.] : [s.n.], 2007. 108 s. WERNER, F., et al. Detection and characterization of SNPs useful for identiti control and parentage testing in major European dairy breeds. International Society for Animal Genetics. 2004, 35, s. 44-49. 43

SEZNAM TABULEK Tab. č. 1 Panel mikrosatelitů Tab. č. 2 Pozorované alely u plemene holštýn v celé populaci Tab. č. 3 Vypočtené frekvence pro celou populaci Tab. č.4 Ověřování rodičovství potomků u býka NEB 878 Tab. č. 5 Ověřování rodičovství potomků u býka NEB 878 Tab. č. 6 Ověřování rodičovství u býka NBY 198 Tab. č. 7 Ověřování rodičovství potomků u býka NBY 166 Tab. č. 8 Ověřování rodičovství potomků u býka NX 929 Tab. č. 9 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NEB 878 Tab. č. 10 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 198 Tab. č. 11 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 166 Tab. č. 12 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NBY 165 Tab. č. 13 Vypočítané frekvence potomků plemenného býka NX 929 44

PŘÍLOHY Seznam příloh: Příloha č. 1 Výpis ověřovaných býků plemene holštýn Příloha č. 2 Popis býka NX 929 DUSAN Příloha č. 3 Popis býka NBY 166 DRAKE Příloha č. 4 Popis býka NBY 165 DISC54 Příloha č. 5 Popis býka NBY 198 MISTER DEAN 45

Příloha č. 1 Výpis ověřovaných býků plemene holštýn Regist/číslo BM 1824 BM 21113 ETH 3 ETH 10 ETH 225 INRA 023 SPS 115 TGLA 122 TGLA 126 TGLA 227 O NEB 878 178 182 125 135 117 127 213 219 148 148 210 214 248 248 149 149 119 121 81 89 P 146116/614 178 180 125 131 117 129 213 219 148 150 214 214 248 248 143 149 119 119 89 97 M 47881/614 180 182 131 135 125 129 219 219 140 150 202 214 248 256 143 159 117 119 97 97 P 146120/614 178 182 125 127 117 129 219 219 148 148 208 214 248 254 143 149 115 121 81 89 M 47846/614 182 182 127 137 117 129 213 219 148 148 206 208 248 254 143 163 115 115 83 89 P 146102/614 178 180 135 139 117 127 219 219 140 148 210 214 248 254 143 149 115 119 81 97 M 57681/614 178 180 135 139 117 127 213 219 140 148 206 210 248 254 143 143 115 123 89 97 P 139500/614 178 188 135 135 117 127 221 223 148 150 202 208 248 248 143 173 115 117 81 97 M 103302/614 178 182 127 135 117 125 213 217 144 146 208 208 248 149 163 115 117 81 89 P 139499/614 178 182 125 125 117 129 219 223 148 148 200 214 248 248 149 149 115 119 81 97 M 116156/614 182 188 125 135 117 129 221 223 148 150 200 214 248 258 173 173 115 119 89 97 P 126384/614 119 127 213 219 148 152 248 256 97 M 102145/614 178 188 125 137 119 125 217 219 148 152 208 210 256 260 149 149 115 123 83 97 P 126377/614 178 180 125 135 117 117 213 217 148 148 202 210 248 254 149 149 121 121 81 103 M 102196/614 180 188 125 135 117 129 217 219 148 150 202 210 248 254 149 149 117 121 89 103 P 118086/704 178 178 125 135 117 129 219 219 146 148 214 214 248 248 149 161 121 121 81 97 M 096383/744 178 180 125 135 129 129 219 219 146 148 202 214 248 248 143 161 119 121 97 97 P 112991/704 178 182 125 135 117 117 213 217 148 148 210 210 248 256 149 163 115 121 81 93

M 095092/744 182 190 125 135 117 117 217 219 148 148 208 210 248 256 151 163 115 117 89 93 P 124373/704 178 178 135 139 117 125 213 219 140 148 198 210 248 248 143 149 121 123 81 81 M 001244/764 178 182 137 139 117 125 215 219 140 152 198 206 248 248 143 149 117 123 81 91 P 123775/704 178 178 125 137 117 127 213 219 148 150 210 210 248 248 149 151 121 121 81 93 M 090118/744 178 188 125 137 117 129 219 219 150 150 210 214 248 248 151 163 117 121 81 93 P 123777/704 180 182 125 133 125 127 213 219 148 152 206 214 248 254 149 161 119 121 81 83 M 000523/764 180 180 133 135 125 127 213 223 148 152 206 206 248 254 149 161 115 121 83 97 P 12774/704 180 182 125 139 125 127 219 219 148 150 206 210 248 248 143 149 117 119 81 93 M 100209/704 180 180 137 139 125 129 217 219 150 152 206 206 248 256 143 149 117 117 93 97 O NBY 198 188 125 219 140 148 206 210 248 252 143 163 115 117 91 103 P 139487/614 180 188 125 135 117 117 219 219 140 140 206 210 252 252 143 163 117 117 91 97 M 51664/614 180 188 133 135 117 117 219 219 140 148 206 210 248 252 143 149 117 117 97 103 P 130948/614 180 188 125 139 117 119 213 219 140 148 206 206 248 252 153 163 115 115 103 103 M 115763/614 180 190 137 139 117 119 213 223 140 148 206 214 248 248 153 183 115 117 91 103 P 138368/614 180 188 127 137 117 127 219 223 140 140 206 214 248 252 143 143 115 117 81 103 M 115746/614 180 182 127 137 119 127 219 223 140 148 214 214 252 256 143 181 115 115 81 99 P 126387/614 188 188 125 127 117 129 219 219 140 148 202 206 248 252 143 143 115 123 91 91 M 102193/614 178 188 125 135 117 129 219 219 148 150 202 210 248 248 143 151 115 123 91 97 P 126393/614 188 188 125 127 117 117 217 219 148 150 206 210 252 252 143 161 115 117 91 97 M 102217/614 180 188 125 139 117 125 217 223 140 150 202 210 248 252 161 163 115 123 81 97 47