Retinoblastom Mgr. Veronika Peňásová vpenasova@fnbrno.cz Laboratoř molekulární diagnostiky, OLG FN Brno Klinika dětské onkologie, FN Brno
Retinoblastom (RBL) zhoubný nádor oka, pocházející z primitivních buněk sítnice incidence: 1/15 000 až 1/20 000 živě narozených dětí manifestace: do 5-ti let věku projevy: ztráta zrakové ostrosti, strabismus, leukokorie, slepota, zvětšování oka, zarudnutí, otok postižení: oko, mozek, mícha úspěšnost léčby: nádor uvnitř oka 95% mimo oblast oka 0-40%
Gen RB1 jediný známý gen asociovaný se vznikem retinoblastomu lokalizace - 13q14.1-14.2 27 exonů, >180kb genomické DNA kóduje retinoblastomový tumorsupresorový protein (prb,928 aa), významný negativní regulátor buněčného cyklu tumor-supresorová aktivita mutace RB1 gen inaktivace ztráta deregulace buněčného cyklu vznik retinoblastomu
prb protein brzda buněčného cyklu http://teachline.ls.huji.ac.il/72373/substance_x/cell-cycle2.jpe Kontrolní bod přestupu z G1 do S fáze: prb v aktivní formě váže transkripční faktor E2F cyklind- a cykline-dependentní kinázy fosforylují a tím inaktivují prb inaktivovaný prb uvolňuje E2F transkripční faktory, které stimulují expresi genů potřebných pro vstup do S fáze
RBL model dvoustupňového vzniku nádorů (TSG) Vznik RBL vysvětluje Knudsonova teorie dvou zásahů: Alfred G. Knudson ( 1922) Knudson s hypothesis (1971) nehereditární retinoblastom - 50-60% pacientů -dvě somatické mutace - pozdější rozvoj RBL (24.měsíc věku) - unilaterální forma retinoblastomu hereditární retinoblastom - 40-50% pacientů - první mutace germinální - druhý zásah - mutace somatická - časnější rozvoj RBL (8.měsíc věku) - bilaterální (multifokální) forma, ale i unilaterální - molekulární diagnostika!! - vyšší riziko vzniku sekundárních malignit (osteosarkom, SA měkkých tkání, )
Formy retinoblastomu familiární 6% x sporadický 94% bilaterální 25-30% x unilaterální 70-75% hereditární 40-50% x nehereditární 50-60%
Molekulárně genetická analýza genu RB1 v genu RB1 bylo popsáno více než 600 mutací rozmístěny po celé kódující oblasti genu a zahrnují všechny typy změn dále byla u retinoblastomu popsána hypermetylace cytosinu v CpG dinukleotidech promotoru různé formy inaktivace RB1 genu vedou k rozdílné penetranci a expresivitě, a tudíž rozdílným klinickým projevům onemocnění
Hlavní typy mutací zapřičiňující vznik RBL Typ mutace výskyt metoda detekce jednonukleotidové substituce 40-50% RBL sekvenační analýza malé delece a inzerce 25-30% RBL sekvenační analýza velké delece a přestavby 10% familiárních RBL MLPA kvantitativní multiplex PCR hypermetylace promotorové oblasti RB1 10% RBL metylační analýza cytogenetické aberace (delece a přestavby 13q14) 8% bilaterálních RBL 1-5% sporadických RBL FISH testy heterozygozity
Sekvenace cdna a DNA Sekvenace cdna izolace RNA reverzní transkripce do cdna sekvenace 6-ti úseků cdna: úsek 1 exon 1-4 úsek 2 exon 4-9 úsek 3 exon 9-15 úsek 4 exon 14-19 úsek 5 exon 19-22 úsek 6 exon 22-27 Sekvenace DNA izolace DNA sekvenace příslušného exonu ověřění sekvenční změny na úrovni DNA
MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - metoda umožňující detekci delecí či duplikací jednoho a více exonů hybridizace a ligace specifických sond k exonům RB1 (kromě 5,10,15,16) multiplex PCR - amplifikace hybridizovaných sond fragmentační analýza (Beckman CEQ-8000) Coffalyser (v 1.4) Source:www.eurogentest.org/web/info/public/unit5/MLPA_validation_study _NoE_Eurogentest.xhtml
Metylační analýza promotoru hypermetylace CpG ostrůvků promotorové oblasti vede k represi transkripce - umlčování genu u TSG (RB1, BRCA1, p15, p16..) představuje hypermetylace promotorů jeden z mechanismů onkogeneze hypermetylace promotorové oblasti popsána u sporadických i hereditárních retinoblastomů nemetylovaná DNA 5 -ACGT -3 5 -AUGT-3 metylovaná DNA 5 -AC*GT-3 modifikace bisulfidem sodným 5 -AC*GT-3 PCR s primery specifickými pro metylovanou a nemetylovanou DNA 5 -AUGT-3 1.cyklus PCR 5 -AC*GT-3 3 -TACA-5 3 -TG CA -5 PCR amplifikace 5 -ATGT-3 5 -ACGT- 3 3 -TACA-5 3 -TGCA-5 detekce metylačního statusu pomocí PAG elektroforézy / sekvenování / HRM (high resolution melting)