Plynová chromatografie,gc - II Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
2.1.2 Náplňové kolony pro GLC - nosiče Rovnováha plyn-kapalina, kapalina zakotvena na vhodném pevném nosiči Nosiče Na povrchu poutá ve formě tenkého kapalného filmu stacionární zakotvenou fázi Vlastnosti nosiče mohou ovlivnit účinnost dělení Nosič musí: Mít vhodně velký povrch, obvykle 0.1-20 m 2 g -1 Umožňovat rovnoměrné pokrytí povrchu kapalnou fází, 1-30 % Být chemicky inertní vůči zakotvené kapalině a děleným látkám nejen při laboratorní, ale i vysoké pracovní teplotě Mít stejnoměrné zrnění a mechanickou pevnost Nosič nesmí: Obsahovat mikropóry Mít adsorpční vlastnosti (Obě vlastnosti vedou k deformaci zón)
Deaktivace nosičů a) Křemelinové nosiče, které jsou používány v GLC, obsahují až 10 % minerálních nečistot, železo, oxidy hliníku apod., které mívají nežádoucí katalytické účinky na dělené analyty b) Nosiče mohou obsahovat silanolové skupiny SiOH, jež jsou příčinou chvostování látek ad a) * Odstranění minerálních nežádoucích nečistot lze provést tzv. kyselým praním koncentrovanými kyselinami * Obvykle za horka kyselinou chlorovodíkovou, závěrem důkladné promytí destilovanou vodou * Nosiče AW, např. Chromosorb P AW ad b) * Pro dokonalou deaktivaci je vhodné blokovat silanoly silanizací sloučeninami jako dimethyldichlorsilan, hexamethyldisilazan, trimethylchlorsilan * Úprava silanizací se děje po předchozím kyselém praní * Nosič je podroben silanizaci koncentrovaným činidlem, činidlem ve vhodném rozpouštědle, nebo je nosič vystaven parám činidla * Komerčně lze získat libovolné nosiče po jejich příslušné úpravě * Silanizované nosiče nesou zkratku užitého činidla, např. Chromosorb W AW HMDS
Křemelinové nosiče Jedny z prvních nosičů, stále velmi používané Křemičitý skelet zbytky mořských rostlin a živočichů Podle původu a dalšího zpracování lze rozdělit do dvou kategorií: 1. Růžové nosiče Vyrábí se drcením ohnivzdorných cihel (Firebrick) na potřebnou velikost částic Nosič je tvrdý, odolný vůči otěru, má větší specifický povrch střední průměr pórů 1µm, snáší vysoké smočení až 30 % Prakticky se používá na chromatografii nepolárních látek, uhlovodíků, nebo slabě polárních látek Pro silně polární látky se nepoužívá, docházelo by k výrazné adsorpci a deformaci píků Chromosorb P
2. Bílé nosiče Připravují se z filtrační křemeliny přídavkem 2% uhličitanu sodného a kalcinací při 900 C Střední průměr pórů 8-9µm, menší mechanická odolnost, pravidelnější zrnitost, vyšší permeabilita, adsorpce polárních látek je malá Nosič je vhodný pro dělení polárních látek Základní typ těchto nosičů je Chromosorb W, je vhodný pro nepolární a polární složky, zejména po kyselém praní a odstranění volných silanololů Chromosorb G je určen zvláště pro separaci polárních látek, má malý specifický povrch, mechanickou odolnost blízkou růžovým nosičům, maximální zakotvení 5 %, které v důsledku vyšší specifické hmotnosti odpovídá 12.5 % obsahu kapalné fáze na Chromosorbu W Chromosorb W a G mohou mít speciální HP úpravu pro dělení steroidů a alkaloidů Gas Chrom Q je vysoce deaktivovaný křemelinový nosič pro náročné separace především polárních složek
2.1.3 Náplňové kolony pro GLC zakotvené fáze Zakotvená fáze zadržuje jednotlivé složky na základě rozdělovacích koeficientů Uplatňují se mnohé interakce mezi složkami a stacionární fází Požadavky na zakotvenou fázi: Dobrá rozpustnost analyzovaného vzorku v kapalné fázi. Pokud je rozpustnost nízká, složky mají malou retenci a nejsou plně rozděleny Rozdílná rozpustnost pro jednotlivé dělené složky Teplotní stálost - někdy má katalytický nepříznivý efekt nosič Netěkavost - tenze par nemá přesáhnout 1 až 10 Pa při pracovní teplotě Chemická inertnost vzhledem ke vzorku za dané teploty Nízká viskozita při pracovní teplotě Teplotní limity Dolní hranicí bývá bod tání fáze a horní hranice je závislá na tenzi par. Limitní horní hranice teploty závisí na množství fáze, při nízkém smočení lze použít vyšší teplotu, a na citlivosti detektoru
Volba vhodné zakotvené fáze Jednoduchá metoda pro výběr optimální zakotvené fáze není k dispozici. Důležité jsou zkušenosti a výsledky v literatuře Bylo připraveno více než ~ 700 nejrůznějších zakotvených fází, v praxi se používá daleko menší škála fází Nicméně obecně je volba vhodné fáze určena složením vzorku. Stacionární fáze by měla být podobného typu jako složky analyzovaného vzorku Uhlovodíky se dobře dělí na uhlovodíkové zakotvené fázi. Látky polární na polární fázi. Pro látky s rozdílnou polaritou a současně blízkým bodem varu musí být použito zakotvených fází různé polarity
Rohrschneiderovy konstanty Stacionární fáze jsou obvykle charakterizovány podle jejich polarity Není jednoduché definovat polaritu kvantitativně, z toho důvodu je zaveden systém elučních indexů umožňující vyjádřit charakter různých stacionárních fází v exaktnější podobě Retence látky na koloně záleží na interakcích mezi funkčními skupinami látky a stacionární fází Změnu retence eluované složky na měřené koloně v porovnání s její retencí na nepolární koloně lze numericky vyjádřit pomocí indexového systému navrženého Rohrschneiderem Polarita zakotvené fáze je charakterizována na základě rozdílů retenčních indexů I x zkoušené fáze oproti nepolární fázisqualanu, který je použit jako standard: I= I I a x (20) polární squalan = a je charakteristická konstanta chromatografované látky, x je polarita stacionární fáze
Rohrschneider navrhl pro charakterizaci zakotvené fáze vypočítat tato I pro pět vybraných látek: benzen, ethanol, methylethylketon, nitromethan a pyridin, čímž se získají konstanty x, y, z, u, s charakterizující polaritu stacionární fáze Indexový rozdíl je definován: I = ax+ by+ cz+ du+ es (21) Členy a, b, c, d, e jsou konstanty charakterizující vlastnost složky, jsou nezávislé na stacionární fázi Pro benzen je a=100, b=0, c=0, d=0, e=0. Pro ethanol je b=100, ostatní členy a, c, d, e jsou nulové, podobně jsou odvozeny hodnoty členů pro další standardy Rovnice (21) může být využívána ke zjištění: 1. Hodnot členů a-e pro zkoumané látky 2. Hodnot konstant x-s pro nově testované stacionární fáze 3. Výpočet retenčního indexu I dané látky na dané stacionární fázi
Ad 1. Členy a, b, c, d, e pro látky (jiné než standardy) lze zjistit takto: a) Pro látku M se zjistí retenční indexy I na pěti zakotvených fázích odlišné polarity, pro které jsou známy konstanty x - s b) Vypočtou se hodnoty I podle výrazu: I = M M I polární Isqualan c) Vypočtené hodnoty se dosadí do vztahu (21), z pěti vztahů se vypočtou hodnoty členů a, b, c, d, e Ad 2. Pro charakterizaci stacionárních fází je základním předpokladem, že naměřené hodnoty jsou získány za stejných podmínek Původní Rohrschneiderova data byla stanovena při teplotě kolony 100 C s 20 % hm. stacionární fázi na Chromosorbu W AW s přídavkem Alkatergu T pro minimalizaci chvostování Příklad: Zjištění konstant x - s na polypropylenglykolu 550X Kovatsův index pro benzen na squalanu I benzen squalan = 649 Kovatsův index pro benzen na polypropylenglykolu 550X I benzen polypropyl englykol= 763
Rohrschneiderova konstanta x pro polypropylenglykol je rovna: x= I * 0.01= x = 763-649 * 0.01= 1. benzen benzen ( I - I )* 0. 01 polypropylenglykol ( ) 14 pro ostatní konstanty: y= I * 0.01= y = 660-384 * 0.01= 2. squalan ethanol ethanol ( I - I )* 0. 01 polypropylenglykol ( ) 76 ( 669-531) *0.01 1. 68 ( 769-457) * 0.01 3. 12 ( 903-695) * 0.01 2. 08 z = = u = = s = = squalan Testovací látky vybrané Rohrschneiderem byly voleny tak, aby umožnily postihnout různé typy interakcí analyt-stacionární fáze Benzen testuje disperzní interakce indukovaných dipólů nenasycených uhlovodíků se stacionární kapalinou Ethanol vodíkové vazby alkoholů a kyselin se stacionární fází, ve kterých je tato fáze donorem elektronového páru, ethanol akceporem
Methylethylketon testuje donor-akceptorové interakce elektronového páru aldehydů, etherů, ketonů a esterů se stacionární fází, ve kterých je tato fáze akceptorem elektronového páru, methylethylketon donorem Nitromethan a pyridin testují složené interakce jež zahrnují interakce výše zmíněné Vztah mezi Rohrschneiderovými konstantami a interakcemi složka-stacionární fáze Rohrschneiderova konstanta Charakter interakce (z hlediska složky) Typické složky x y z u s Disperzní síly Aromáty Alkeny Elektron akceptor Alkoholy Nitrily Organické kyseliny Elektron donor Ethery Aldehydy Nitrily kovů Estery Epoxidy Komplexní Komplexní Nitromethan Pyridin Dioxan
Ad 3. Na základě konstant x s lze usuzovat na retenční pořadí dělených složek Např. pro n-butylketon (b.v. 91 C) a n-propanol (97 C) je možno zvolit zakotvenou fázi tak, aby prvá nebo druhá složka byla eluována dříve. Má-li se jako první eluovat alkohol, volí se fáze s vysokým indexem z vůči y, naopak pokud je žádoucí aby se eluoval alkohol až za ketonem, zvolí se fáze s vysokou hodnotou indexu y
Z Rohrschneiderovy rovnice lze vypočítat retenční index I dělené látky, známe-li odpovídající konstanty Např. pro n-propanol: a = -9.42, b = 105.26, c = 0.25, d = 6.63, e = -7.49 Index I pro n-propanol na squalanu I = 485 (100 C) Hledaný index I pro n-propanol např. na neopentylglykosukcinátu, který má Rohrschneiderovy konstanty: x = 2.68, y = 4.88, z = 3.87, u = 6.13, s = 5.21 Je roven: I n-propanol NPGS I n-propanol NPGS I -propanol = I n NPGS = n-propanol Sq + I n-propanol NPGS 9.42 * 2.68+ 105.26* 4.88+ = 485+ + 6.63* 6.13 7.49*5.21 976 0.25*3.87
McReynoldsovy konstanty Určitým nedostatkem Rohrschneiderových konstant je nízká molekulová hmotnost některých testovacích látek, které jsou eluovány příliš rychle na nepolárních a slabě polárních kolonách, a proto je nutno pro výpočet retenčních Kovatsových indexů pracovat s plynnými uhlovodíky Především proto zvolil McReynolds částečně odlišné standardy, kterých bylo zpočátku deset, dnes se obvykle užívá jen pět následujících: benzen, n-butanol, 2-pentanon, nitropropan, pyridin Postup při výpočtech je stejný jako v případě Rohrschneiderových indexů s jediným rozdílem, hodnoty se uvádějí jako I ne I/100 (Rohrschneider) V současné technické literatuře jsou obvykle častěji používány McReynoldsovy indexy Je známo, že jak Rohrschneiderovy, tak Mc Reynoldsovy indexy jsou poměrně nepřesné při charakterizaci stacionárních fází V současnosti se pracuje na odlišných a přesnějších postupech hodnocení fází, ale dosud nebyl předložen ucelenější a široce akceptovaný koncept, který by nahradil Mc Reynoldsovův přístup
Kovatsovy retenční indexy Retenční indexový systém, retenční index I x Retenční index vyjadřuje retenční chování sledované látky v jednotné stupnici, kdy za pevné body základní stupnice byly zvoleny retenční hodnoty n-alkánů Retenční index I x libovolné složky se vypočítá podle rovnice: I log V = 100 logv R(Cz+ 1) logv R(složky) R(Cz) x + logv R(Cz) 100z (22) V R je redukovaný retenční objem, Cz je n-alkan se z uhlíkovými atomy, Cz+1 je n-alkan s z+1 uhlíky Přičemž se volí: V R(Cz) < VR(složky) < VR(Cz+ 1) Retenční index je roven stonásobku počtu uhlíků Např. Pro ethan a n-butan budou indexy rovny 200, resp. 400
Logaritmická stupnice je aplikována proto, že logaritmus retenčního objemu n-alkanů vzrůstá lineárně s délkou řetězce Prakticky se postupuje tak, že se směs n-alkanů analyzuje za stejných podmínek jako studovaný vzorek, pak se proti logaritmu redukovaného objemu vynese z nebo I x Retenční objem ve vzorci může být nahrazen retenčním časem Je-li retenční index látky např. roven I x = 610, objevuje se tato složka v chromatogramu mezi n-hexanem a n-heptanem Při analýze za programované teploty se indexy počítají přibližně na základě vztahu: I X = 100 X (Cz+ 1) X (složky) (Cz) x + X (Cz) 100z (23) X je eluční teplota příslušné složky a srovnávacích n-alkanů
Volba množství stacionární fáze vzhledem k nosiči Nosiče je možno pokrývat jen určitým množstvím stacionární fáze, toto množství je specifické pro každý nosič a je vyjádřeno % hm. Analytické dělení se většinou provádí na kolonách s malým smočením, pro Chromosorb W ~3 %, nízké množství stacionární fáze má následující výhody: 1. H klesá s klesající sílou vrstvy 2. Nižší šum základní linie detektoru 3. Částice sorbentu se neslepují 4. Doba analýz je kratší 5. Lze užívat nižší teploty Nízké množství zakotvené fáze má ale určité nevýhody: U křemelinových nosičů klesá efektivní polarita velmi polárních fází s klesajícím smočením v důsledku neúplné deaktivace nosičů. Snížení množství stacionární zakotvené fáze pod 1 % tak někdy vede ke chvostování a špatné reprodukovatelnosti přípravy sorbentu
Příprava náplňových kolon pro GLC 1. Metoda odpařovací Podle předem zvoleného požadovaného zakotveného množství se vypočítá a odděleně naváží stacionární fáze a nosič Stacionární (zakotvovaná) fáze se rozpustí ve vhodném rozpouštědle tak, že nosič je úplně převrstven Roztok se převede do rotační vakuové odparky, rozpouštědlo se postupně odpaří Sorbent se usuší Metoda vede k přípravě sorbentu s definovaným množstvím zakotvené fáze, které je dáno přímo navážkami vstupních složek Nevýhodou je nestejnoměrné smočení nosiče 2. Metoda filtrační Směs nosiče a rozpuštěné stacionární fáze se odfiltruje za vakua a přebytečné rozpouštědlo se odpaří Množství stacionární zakotvené fáze se stanoví z hmotnostní bilance Vrstva stacionární fáze je při tomto postupu rovnoměrná
Plnění náplňových kolon Plnění se může provádět zvýšeným tlakem nebo naopak za vakua Setřásání sorbentu vede k rovnoměrnému uložení sorbentu v koloně Před první analýzou je třeba kondicionace sorbentu za zvýšené teploty po dobu řádově hodin, dochází ke změnám ve stacionární fázi, např. síťování Volba nosného plynu Prvním kritériem je kompatibilita s detektorem Nosný plyn má také vliv na kvalitu separace, především účinnost a rychlost Obecně nosné plyny nesmí obsahovat kyslík a vodu, používají se buď velmi čisté plyny v tlakových lahvích, případně vyráběné generátory, nebo je využito sušících a chemisropčních filtrů
Preparativní kolony Plynová chromatografie může být využita i pro preparativní účely Používají se široké kolony o vnitřním průměru několika centimetrů s náplní mající vysokém množství zakotvené fáze ~ 20 % Dávkují se mililitry vzorku Detektory se používají nedestrukční-např. tepelně vodivostní nebo destrukční např.plameno-ionizační (pokud je jen malé množství eluátu vedeno do detektoru) Komponenty jsou zachytávány do nádobek chlazených na takovou teplotu, aby došlo k vymražení izolovaných složek
2.1.4 Kapilární kolony Teorii a aplikace kapilárních kolon pro GC poprvé rozpracoval Golay - 1958 Kapiláry jsou 10-100 m dlouhé, vnitřní průměr je 0.1-0.7 mm Vnitřní stěna je pokryta vrstvou stacionární fáze První kapilární kolony byly měděné, nerezové a skleněné, dnes převažuje užití taveného křemene pokrytého vrstvou polyimidu Rozdělení kapilárních kolon Podle způsobu uložení stacionární fáze v kapilární koloně se rozlišují typy kapilárních kolon 1. WCOT-Wall Coated Open Tubular Tenký film stacionární fáze je nanesen nebo chemicky vázán přímo na stěnu kapiláry. Tloušťka filmu je 0.1-5µm. Tento typ kapilárních kolon je nejvíce užíván. Kolony jsou určeny pro GLC 2. SCOT-Support Coated Open Tubular Na vnitřní stěně kapiláry je vrstva nosiče, který nese zakotvenou stacionární fázi. Tloušťka vrstvy je 1-5µm 3. PLOT-Porous Layer Open Tubular Na vnitřní stěně kapiláry je nanesena nebo chemicky vytvořena pórovitá vrstva, kolony jsou určeny pro GSC
Srovnání náplňových a kapilárních kolon Kapilární kolony (zvláště WCOT) mají velmi vysoké účinnosti ve srovnání s náplňovými kolonami, především díky jejich délce a minimálnímu odporu vůči toku mobilní fáze, tj. jejich velmi dobré permeabilitě Účinnost kapilárních kolon je až 500 000 tp na kolonu, na náplňových kolonách kolem 10 000 tp na kolonu Fázový poměr (poměr objemu mobilní/stacionární fáze v koloně) je v případě WCOT obvykle velký, a tím posunut ve prospěch rychlých analýz, malých retenčních faktorů (viz vysvětlení dále) Množství nastřikovaného vzorku na kapilární kolony je řádově v nanogramech, v případě náplňových kolon v mikrogramech Teploty na kapilárních kolonách mohou být o 20-50 C nižší než na náplňových kolonách
Fázový poměr pro WCOT Fázový poměr β je definován jako poměr: objem mobilní fáze/objem stacionární fáze v koloně. Pro WCOT kapiláry je fázový poměr roven: r β= (24) 2d f r je vnitřní poloměr kapiláry Současně platí: K k= (25) β a pak platí: 2d k= K r f (26) protože distribuční konstanta K je charakteristická a konstantní pro určitou stacionární fázi (za dané teploty), retenční faktor k je přímo úměrný tloušťce stacionární vrstvy v kapiláře d f a nepřímo úměrný vnitřnímu poloměru kapiláry r Volbou průměru kapiláry a tloušťky stacionární fáze lze účinně ovlivňovat retenci složky
Protože na kapilárních kolonách lze pracovat bez velkého nárůstu tlaku a ztráty účinnosti i při vysokých lineárních rychlostech, čas potřebný na analýzu lze zkrátit ve srovnání s náplňovou kolonou i 10x Kapilární kolony jsou často velmi tepelně odolné díky kovalentní chemické vazbě stacionární fáze-povrch kapiláry V teplotním gradientu lze dělit značně složité směsi obsahující látky s velmi odlišnými body varu Vzhledem k velmi vysoké účinnosti je možno většinu vzorků rozdělit na některé z ~ 5-6 druhů WCOT kapilár, nedokonalá selektivita je nahrazena vysokým rozlišením Kapilární separace jsou vhodné pro fingerprinting a identifikaci
Stacionární fáze WCOT Mnohé stacionární fáze jsou substituované methyl silikonové polymery. Substituenty udělují fázi odpovídající polaritu Kapiláry mají vynikající tepelnou stabilitu do 300-350 C. Obvykle se uvádí dvě teploty horního limitu, jedna pro izotermální analýzy, druhá pro gradientové separace. Překročení teplotních limitů vede k degradaci stacionární fáze Také silné kyseliny a báze, spolu s kyslíkem zhoršují kvalitu stacionární fáze Column bleed je značně omezen, díky kovalentní vazbě stacionární fáze k povrchu kapiláry
Stacionární fáze PLOT Používané stacionární fáze jsou ve velké většině určeny pro GSC Stacionární fáze jsou chemickou formou obdobné jako pro GSC na náplňových kolonách Separační mechanismus je obvykle založen na některé ze tří typů interakcí, tzn. dělení na základě velikosti molekul, na základě silných dipólových interakcí nebo polarizovatelnosti molekul Hlavní aplikace jsou v oblasti separací permanentních plynů, vysoce těkavých nízkomolekulárních látek, lehkých uhlovodíků C1-C6, tyto látky mají velmi malé kapacitní faktory (0.01-1) na WCOT kapilárách Výhody PLOT kolon ve srovnání s náplňovými kolonami jsou stejné jako obecně pro kapilární kolony
Vnitřní průměr kolon je obvykle 0.32-0.53 mm Vnitřní stěna kapiláry z taveného křemene je pokryta porézní vrstvou imobilizovaných jemných částeček o rozměrech d f = 0.1-5 µm, které jsou imobilizovány pojivem nebo dvoustupňovou polymerací na povrchu částic Tloušťka porézní vrstvy je 5-50 µm Délka kolon kolem 30 m Běžná kolona obsahuje ~ 10 10 částic Kapacita PLOT kolon je podstatně menší, asi 100x, než WCOT kapilár, tomu musí odpovídat dávkované množství vzorku, obvykle do 0.25 ml plynu nebo nástřik s děličem