Svět RNA a proteinů REGULACE TRANSLACE Požadavky kladené na funkční translaci Bezchybný přepis genetické informace Regulace translace jak převést informaci obsaženou ve struktuře mrna do odlišné struktury proteinů Ø Správně reagovat na proměnlivost v rámci buňky, orgánu a celého organismu Ø Přepisovat kvalitativně se měnící spektra proteinů Ø Přepisovat stejné typy mrna, ale v jiném kvantitativním zastoupení Ø Regulovat přepis konstitutivních i signálních typů proteinů Ø Schopnost vybrat si za velmi nepříznivých podmínek typy proteinů, které jsou pro udržení homeostaze klíčové Ø Schopnost oprav translačních chyb Ø Dokonale sladit translaci a degradaci Ø (Oprava chyb (tmrna) Vysoká míra volnosti všech procesů, regulace na mnoha úrovních 1
Regulace translace Jaký je vztah mezi syntézou bílkovin a ontogenezí? Regulace translace syntéza proteinů - mitotická dělení - zvětšování buněk a tvorba buněčné stěny - udržování nezbytného souboru konstitutivních proteinů Rostliny ---přisedlost = kontinuální diferenciace vytváření orgánů v průběhu ontogenese --- fotosyntéza specifické proteiny fotosyntetického aparátu Regulace translace a mitosa Regulace translace svět Prokaryont a svět Eukaryont 2
Prokaryonta Eukaryonta Eukaryonta 3
Regulace translace Eukaryonta 1. Translační aparát 2. Translace 3. Proteiny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace proteinů v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech 1. Translační aparát Syntéza proteinů potřebuje translační aparát a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) trna d) aminokyseliny e) ribosomy f) regulační proteiny translační faktory Jen 3-10% celkové RNA tvoří mrna zbytek nekódující RNA, trna, rrna mrna v cytosolu není vždy ihned přepisována Translační regulace genové exprese 4
Regulace translace Regulace translace RNA samouspořádávání molekul RNA fyzikálně chemické vlastnosti samouspořádávání RNA molekul do kompaktních partikulí = obrovská konfigurační a tím i funkční mnohotvárnost Ø sekundární struktura RNA, soubor krátkých úseků dvoušroubovic na základě komplementárního párování (trna) Ø terciární uspořádání: izolovaná rrna vytváří kompaktní partikule 16S a po přidání Mg iontů a spermidinu vznikají 40S partikule 1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny 1. Translační aparát - mrna a vazebné proteiny na 5 UTR zralá mrna 5
1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny na 3 UTR 1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny mrna vázána na proteiny: Ø mnohonásobně navýšena možnost regulací Vazba proteinů: Ø specifickými rozpoznávacími sekvencemi Ø strukturálními elementy 2 typy interakcí RNA-proteinů v cytosolu Ø součást konstitutivních regulací (housekeeping genes) Ø odpoveď na vnější podněty Ø odpověď na vývojové (vnitřní) podněty 1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny 1. Translační aparát mrna a vazebné proteiny proteiny, RNA = jednovláknové lineární molekuly tvořící biopolyméry co umožňuje práci polymérů : Ø nekonvalentní interakce se substrátem nebo receptory Ø reakce katalyzovány přímo makromolekulami nebo připojenými enzymatickými faktory Ø flexibilita = možnost konformačních proměn, rovnováha mezi alternativními stavy a fixace jedné konformace připojením ligantu Ø periodické konformační změny indukované energeticky = periodické změny afinit vazebných míst proměnlivost proteinů: posttranslační modifikace různé funkce, stejné nebo odlišné lokalizace molekulární stroje Funkce : transformace chemické, tepelné, elektrické nebo nukleární energie do energie mechanické, pohybové Ø transportní system mikrotubulů ( tubulin-kinesin, tubulin-dynein) Ø transportní system mitrofilament (actin-myosin) Ø DNA a RNA polymerázy Ø ribosomy Ø aminoacyl t-rna syntetázy Ø myofibrily a další Všechny využívají vysokoenergetické makromolekuly - ATP, GTP 6
1. Translační aparát 1. Translační aparát cytoskelet a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) aminokyseliny d) ribosomy e) regulační bílkoviny translační faktory 1. Translační aparát cytoskelet Kdy prokázána důležitá role lokalizace specifických mrna v rostlinné buňce : Ø pohyb mrna plasmodesmaty, virové proteiny jež zajišťují pohyb virů směrem do buňky = mrna vazebné bílkoviny a mají přímý kontakt s cytoskeletem Ø putování endogenních mrna mezi buňkami na dlouhé vzdálenosti Ø třídění mrna kodujících zásobní semenné bílkoviny prolaminy jejich vazba k ER v endospermu: (prolamin mrna obsahuje signal pro jeden a více bílkovin jež zprostředkovávají vazbu této mrna k ER a cytoskeletu) 1. Translační aparát cytoskelet Buněčné funkce cytoskeletu Ø architektura buňky = platforma pro putování a lokalizaci mrnp, signálních molekul Ø buněčná polarita Ø asymetrické oddělení složek podílejících se na vývojových změnách na úrovni buňky Molekulární funkce cytoskeletu Ø pohyb v buňce ( chromozómy při mitoze, organely, váčky) Ø adheze Ø migrace Ø lokalizace signálních molekul Ø uspořádávání translačního aparátu + regulace translace Kryoelektronová tomografie=3d vizualizace v nm rozlišení Kim S Coulombe PA, 2010, Mol.Cell Biol. 11, 75-81 (příklady z živočišné i rostlinné říše) Ø putování netranslatovatelných mrna rostoucí pylovou láčkou 7
1. Translační aparát cytoskelet Ø Síť tvořená ER a cytoskeletem Ø Cytoskelet Ø Endoplasmatické retikulum Ribozomy Eukaryot ve 3 základních uspořádáních: 1. volné, spojeny s cytoskeletem (mrnp) 2. vázáné na membrány 3. translačně regulované mrnp komplexy (prosomy?) Proměnlivost v závislosti na typu buňky, tkáně, stádiu diferenciace Rychle rostoucí tkáně vyšší podíl volných ribosomů ( 60% mladé listy 78% retikulocyty) Diferencované buňky vyšší podíl mebránově vázaných (75% jaterní buňky) obecně syntéza sekrečních bílkovin (stěnové bílkoviny u rostlin) 1. Translační aparát cytoskelet Cytoskelet jednotlivé jeho složky mají své specifické funkce: Ø Tubulin = podílí se na transportu Ø Aktin - na MF (mikrofilamenta) se váží polyribozomy - impuls s tvorbě mikrofilament eif2 - recyklace - na IF (intermed. filamenta ) se váží prosomy Prosomy: mají podobu 20S nebo 26S( přítomny soubory ATPáz, proteáz, aktivátorů a inhibitorů) 1: jsou komplexem multikatalytických proteináz (MCP complexes) 2. asociují s netranslatovatelnými mrnp ( trans-faktory), připoutávají mrna k cytoskeletu = skladování genetické informac 2. Translace - recyklace eif2.gdp Další funkce eif2 je podmíněna změnou vazby eif2:gdp na eif2:gtp eif2:gdp musí navázat další faktor eif2b (guanidin nukledotid exchange faktor) fosforylace eif2b zintensivní vazbu faktorů, komplex eif2:eif2b:gdp je stabilní = dramatický pokles iniciace a brání vytvoření eif2:gtp 8
1. Translační aparát cytoskelet Cytoskelet jednotlivé jeho složky mají své specifické funkce: Ø Tubulin = podílí se na transportu Ø Aktin - na MF (mikrofilamenta) se váží polyribozomy - impuls s tvorbě mikrofilament eif2 - recyklace - na IF (intermed. filamenta ) se váží prosomy Prosomy: mají podobu 20S nebo 26S( přítomny soubory ATPáz, proteáz, aktivátorů a inhibitorů) 1: jsou komplexem multikatalytických proteináz (MCP complexes) 2. asociují s netranslatovatelnými mrnp ( trans-faktory), připoutávají mrna k cytoskeletu = skladování genetické informac 1. Translační aparát cytoskelet 1. Translační aparát cytoskelet Cytoskelet: Ø podílí se na prostorové a časové regulaci translace (in situ lokalizace mrna: vysoké procento mrna spojeno s cytoskelem) interakce cytoskelet mrna: Ø mechanismus jež zajistí vyšší koncentraci všech složek translačního aparátu a tím vyšší účinnost translace Ø zajistí subcelulární lokalizaci mrna v buňce subcelulární ( periferní ) lokalizace mrna : Ø k hromadění určitých typů mrna a bílkovin v určitých, specifických buněčných kompartmentech a to vede k asymetrii v buňce: - impuls k diferenciaci buňky - nebo k účinnému transportu bílkovin do organel Úloha myosinu při dopravě nákladu sítí aktinových microfibril 9
1. Translační aparát cytoskelet Regulace lokální translace v axonech Translačně regulované mrnp komplexy Ø cytoskelet se podílí na zablokování mrna syntézy až do okamžiku její správné lokalizace v buňce Ø na cytoskelet se navazují: Ø mrna, Ø komplexy mrnp, jež obsahují Ø mrna vazebné proteiny i mirna Ø složky translačního aparátu : elongační faktory, ribosomy aminoacyltrna- synthetasy NERVOVÉ BUŇKY, PYLOVÉ LÁČKY charakteristické pro dlouživý růst buněk role tubulinu i aktinu Lin AC, Holt CE, 2008 Regulace lokální translace v axonech 1. Translační aparát cytoskelet cytoskelet uspořádávání translačního aparátu + regulace translace Ø narušení F-aktinu pokles translace (křeček stres ) Ø zvýšení polymerace aktinu-nárůst translace (poraněné hlízy brambor) Ø narušení F-aktinové sítě mutací eef1a (F308L, S405P) hromadění 80S ribozomů, pokles polyzomů, blokace iniciace (kvasinky) eef1- ve 2 formách: 1. eef1a.gtp = translačně aktivní = vazba na aminoacyl-trna = transport do místa A na ribosomu 2. eef1a-vázán an aktin = translačně neaktivní (70% u Dictyostelium) 2 modulující podjednotky: eef1balfa, eef1bgama eef1balfa: exchange factor eef1bgama: struktura umožňující vazbu na cytoskelet (intermediátní filamenta keratinu karcinogeneze) Důkazy existence stociometrické rovnováhy mezi: aminoacyl-trna eef1a eef1balfa - eef1bgama - cytoskeletem = cytoskelet se přímo podílí na regulaci elongace a tím i iniciace 10
Elongační faktor versus cytoskelet model organizace translačního aparátu a cytoskeletu hladina keratinu v buňkách epitelu = marker karcinogeneze 1. Translační aparát a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) trna d) aminokyseliny e) ribosomy f) regulační proteiny translační faktory 11
1. Translační aparát - trna trna = adaptér zajišťuje přímé spojení mezi sekvencí aminokyselin v bílkovině a genetickou informací v mrna 1. translační aparát úpravy trna Je tvořena 75-95 nukleotidy Je syntetizována ve dvou krocích: Ø Ø přepisována z trna genů akceptorové rameno syntetizováno později (může byt obnoveno i během životnosti molekuly) 1) sestřih 5 -konce 2) sestřih 3 -konce 3) dodatečná syntéza CCA sekvence v 3 konci 4) sestřih intronu 5) modifikace nukleotidů 1. translační aparát trna strukturní modifikace 1. translační aparát - modifikace nukleotidů trna Inosin Deaminace A Queuosin Excise G, inserce Q 12
1. translační aparát - trna 1. translační aparát - posttranskripční modifikace trna Struktura trna: 80 popsaných nukleotidových derivátů (2001) Ø 5 terminální fosfátová skupina Ø akceptorový stonek se 7 basemi na základě párová 5 - a 3 terminálních nukleotidů Ø CCA konec rozpoznává trna Ø D rameno se 4 basemi stonku a lístku často obsahuje dihydrouridin Ø T rameno se stonkem o 5 basích často obsahuje pseudouridin Ø base mimo antikodon jsou často modifikovány, především metylacemi Ø první antikodonová base bývá modifikována na inosin (z adeninu) nebo na pseudouridin (z uracilu) Význam: Ø specificita aminoacylace Ø rozpoznání kodónu Ø 3D struktura molekuly Ø zvýšení povrchu trna (dostupnost pro enzymy) 1. translační aparát - trna 1. translační aparát - trna Ø Struktura trna: Primární = pořadí nukleotidů Sekundární = tvar jeteloivého listu (díky párování basí) Terciární = helix ve tvaru L (interakce basí ze vzdálených míst) Ø 61 kodonů + 3 stop kodony Ø 20 (22) aminokyselin (selenocystein v živočišných buňkách: stop kodón UGA) mrna se sekvencí SECIS = selenocystein incorporation signal za UGA nebo 3 UTR (pyrrolyzin u archaebakterií a Desulfitobacterium hafniense: stop kodón UAG Ø 1 aminokyselina kódována více triplety (synonyma) = kód je degenerovaný Ø výběr mezi kodóny vzácně či běžné využívané = kodónový dialekt Ø každá trna se specifickou aminokyselinou má specifický kodón Ø pro přenos 1 aminokyseliny - více trna (synonymní kodóny) akceptorové rameno se napojí na na TpsíC rameno a vytváří helix, po napojení D smyčky se jetelový list uspořádává do funkční podoby L-helixu 13
1. translační aparát - trna a genetický kód 1. translační aparát - trna a genetický kód Ø 61 kodonů + 3 stop kodony Ø 20 aminokyselin 30-40 trna u Prokaryot 50-100 trnas u Eukaryot 31 typů trna = minimum 1. + 2. base = bezchybné párování 3. base = kolísavé párování = wooble = nestandardní párování 3 nukleotidu mrna 5 nukleotidu trna antikodonu = flexibilita antikodonové smyčky 2 kodony zcela přesné: AUG methionin UGG tryptofan 1 aminokyselina = víc než 1 trna Ø 5 isoforem-trna pro Leu (E.coli) 1 trna = může párovat více kodonů Ø trna pro Phe čte UUU i UUC 1. Translační aparát - trna 1. Translační aparát molekuly trna: Ø procházejí sestřihem a modifikací basí Ø obojí má funkční důležitost Ø charakteristické konečné uspořádání od jetelového listu do L-helixu - výsledkem dipolových interakcí bazí ve dvouvláknových úsecích molekuly - stabilizací vazeb vodíkovými můstky mezi basemi a fosfátovými skupinami a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) trna d) aminokyseliny e) ribosomy f) regulační proteiny translační faktory Ø z celé molekuly vazebně přístupná pouze 2 funkční místa: a) 3 koncová sekvence CCA = místo vazby aminokyseliny b) antikodón ve smyčce oproti stonku = vazba kódon- antikodón 14
Aminokyseliny - genetický kód Aminokyseliny = velmi malé biomolekuly, mw. 135 daltonů 1. Translační aparát a) mrna + mrna-vazebné proteiny b) cytoskelet c) trna d) aminokyseliny e) ribosomy f) regulační proteiny translační faktory 70S ribosom 1.Translační aparát- ribosomy Ribosomy: velké ribonukleoproteinové továrny na proteiny tvořeny kovalentně vázanými r-bílkovina a rrna Prokaryonta poskládáný ribosom: pouze ve spojení s mrna Eukaryonta 80S ribosom 1. Translační aparát-syntéza ribosomálních proteinů Transport RPmRNA z jádra Ø TOP (5 -terminal oligopyrimidine úsek) pravděpodobná funkce při exportu Translace Ø krátký 5 -UTR (40 nt) Ø omezená sekundární struktura Ø RPmRNA oscilují: stav represe nebo translačně regulované aktivace Ø v případě aktivace je translace téměř na maximu účinnosti Uvolnění nascentních RP z ribosomu Ø lokalisace polysomů syntetisujících RP v blízkosti jaderných pórů Ø silná RNA-vazebná kapacita, úloha HSP70 Ø okamžitý transport do jádra a do jadérka 15
1. Translační aparátvlastnosti a funkce ribosomálních proteinů ribosomální proteiny L, S: Ø molekulová hmotnost: L proteiny 12 4 kda S proteiny 61 5 kda Ø extremně basické ph 8.5 a výše Ø jsou v ribosomu většinou v jediné kopii většina r-proteinů a všechny rrna mají části svých molekul na povrchu ribosomu 1. Translační aparát-ribosomy Proteiny přítomné v ribosomu ve stoichiometrických množstvích 1. translační aparát ribosomy Vytváření ribosomů je mnohostupňový proces a probíhá v kompartmentech: Ø jadérka Ø nukleoplasmy Ø cytoplasmy vytváření ribosomálních podjednotek = spolupráce nejméně 200 typů proteinů (včetně ribosomálních) + RNA molekul výsledkem je rovnováha v zastoupení obou typů molekul RP E.coli 16
1. Translační aparát- ribosomy 1.Translační aparát- ribosomy Jadérko je místem: Ø Syntézy pre-rna, sestřihu (výjímkou je 5S rrna:syntéza v jádře) Ø Uskládávání ribosomálních podjednotek z rrna a ribosomálních proteinů Pre-rRNA se v jadérku objevuje ve formě 4 vláken Ø ribosomální proteiny procházejí jaderným porem z cytoplasmy, z jádra pokračují do jadérka Ø pre-rrna + r-proteiny = zahájení setřihu rrna Ø formování podjednotek Ø vyputování podjednotek do jádra a jadernými pory do cytoplasmy nedostatečná biogenese ribosomů pokles translace (stres, hladovění) biogeneze ribosomů za minutu: 1500 kvasinky, 7500 HeLa buňky paní Henrieta Lacks HeLa buňky 1948 1. Translační aparát- ribosomální proteiny RP Biogenese ribosomů (R) Ø zdroj heterogenity ribosomů = bílkoviny + snornp jadérka: - standartní R - část R se sníženou účinností pro určitý typ mrna - heterogenita R tak vysoká, že přepisuje jen určité mrna - některé RP mají fukci mimo R Důsledky narušení biogenese: Ø narůstající údaje na lidských buňkách (postupná idenfikace molekulární podstaty mnoha onemocnění) Ø relativně nižší hladina embryonální letality a vysoká hladiná závažných onemocnění Ø stále nejasný vztah mezi biogenesí R a karcinogenesí Freed EF et al. When ribosomes go bad: diseases of ribosome biogenesis, Mol. BioSyst 6, 481-493, 2010 17
Chyby při biogenezui ribosomů a jejich dopad v podobě závažných onemocnění Translační aparát- RP Kódování ribosomálních proteinů kvasinky: 2 geny - 2/3 z nich duplikována se stejnou funkci, u několika jinou rostliny: malé genové rodiny (2 7 členů), podobnost sekvencí aminokyselin je 65-100%, liší se posttranslačními modifikacemi = heterogenita ribosomů Ø koordinace exprese, funkční specifita jednotlivých členů?? 2 geny RBS5, 1: vysoká hladina exprese v proliferujících buňkách prýtu a kořene 2: nízká hladina v buňkách kde probíhá diferenciace 2 geny RBL23a, 23aA: snížená hladina(rnai) =výrazné vývojové defekty 23aB: žádné fenotypové následky mutace různých genů kódujících RP- ribosomální proteiny se podílejí na regulaci vývoje rostlin analýza embryonálních vývojových mutantů (EMBRYO-DEFECTIVE) = mutace RB S6, S11, L2, L8, L23, L19, L40, (vyšší nebo nižší hladiny exprese RB) další typy mutací: zpožděné kvetení, morfologie listů, děloh, kondiční fenotyp: projev až pod vlivem UV. savčí buňky: 1 gen (pseudoknoty, alternativní sestřih) Byrne ME, A role of the ribosome in developmen,trends in Plant Science 14, 512-518, 2009 Warmer JR, MaIntosh KB, How common are extraribosomal function of ribosomal proteins? Mol Cell 34 3-11, 2009 1. Translační aparát- vlastnosti RP preferenční syntéza: Ø S14 v endospermu, S13 + L2 v rychle rostoucích tkáních, S15 při mitose, L27, L34 po poranění, L34 po aplikaci hormonů regulace syntézy Ø translačně regulována exprese S4, S6, L3, zřejmě i dalších RP postranslační modifikace Ø fosforylace S6 po stresu(u Eukaryot) Ø acetylace Eco L7, L12, L10, a celou řadu dalších Úloha RP mimo ribosomy? 1. Translační aparát- úloha RP nezastupitelná role: stavba, stabilita, opora rrna, funkce ribosomu S1 (61 kda)!!! Ø iniciace translace Ø interakce mrna a S9 Ø přivádí mrna na ribosom Ø jediná zásobní v cytosolu L2 poblíž PT domény rrna Ø tvorba peptidové vazby Ø velice konservativní L6, L7/L12, S12, S4, S5 Ø přesnost translace Ø snad ochrana citlivých oblastí rrna L11 A místo Ø vazba trna k A místu Ø iniciace translokace S5 Ø translokace trna z A do P místa L9 P místo Ø konformace trna v P místě L1 E místo Ø uvolnění deacylované trna z RS L5, L18 a L25 se váží na 5S rrna 18
1. Translační aparát- úloha RP mimo ribosom 2. Translace - ribosomykyselé P-proteiny S3 Ø DNA-UV-endonukleasová aktivita Ø reparace DNA Ø snad signalizační funkce při propojení reparace DNA se zráním RS a iniciací translace Ø zpětná vazba - kontrola vlastní syntézy Ø některé RP jsou i transkripčními faktory Ø važí se na vlastní transkript blokují sestřih S3a Ø overexprese v nádorových buňkách Ø váže další bílkoviny důležité pro transkripční regulaci Ø overexprese = inhibice diferenciace Ø vyřazení = stimulace diferenciace, inhibice buněčného růstu L7 Ø inhibice translace specifických mrna in vitro Ø regulace translace v souvislosti s kontrolou proliferace zralých lymfocytů kyselé (P) ribosomální proteiny: pi - 3-5 přímá regulace translační aktivity Ø cyklují: vázány na ribosomy po fosforylaci, uvolněny do cytosolu po defosforylaci Ø víc jak v jedné kopii na ribosom, skladovány v cytosolu P-proteiny: P1, P2, P0 fylogeneticky konservovány Ø E. coli : L7, L12, L10 (acetylovány) Ø P1 (m.w.11.5), P2 (11.1), P0 (36.5) Ø P1+ P2 kodovány 2 geny, (rozdíl v acetylaci prvního N-serinu) Ø P1 protilátka- reakce s bílkovinou m.w. 36.5 = P0 funční struktura: podélný stonek P1 homodimer + P2 homodimer + PO = pentamerní komplex mw.150 kda (rost. buňky: + P3 mw 12.2 funkce nejasná) 1. translační aparát ribosomy 1. translační aparát ribosomy ribosomy jsou nejen strukturou na které translace probíha, ale podílejí se aktivně na celém procesu jejich úloha v syntéze bílkovin nezastupitelná Podílejí se na přesné orientaci všech složek translačního aparátu: Ø mrna Ø trna nesoucí specifickou aminokyselinu spolu s antikodonem Ø GTP Ø proteinových faktorů pro iniciaci, elongaci a terminaci Základní údaje o struktuře ribosomů z 60. let, funkční úloha zůstávala nejasná Posledních 15 let intensivní studium prokaryontního(eukaryontního) ribosomu první trojrozměrná struktura až 2000 Ribosomy Nobelova cena za chemii 2009 velká podjednotka má klíčovou roli strukturuje peptidyl-transferázové centrum 19
PROKARYOTA xxx EUKARYOTA mají stejnou funkci v obou říších, zprostředkovávají stejný soubor chemických reakcí Ø liší se velikostí podjednotek a tím i velikostí ribosomů 70S 80S Ø Počet ribosomů v buňce 15 000 (E.coli) 600 000 až mil. (jaterní buňka) několik mil. (rostlinné buńky) Ø Velikost ribosomů 20-30nm 40-50nm 25 až 30% obsahu eukaryontní buňky připadá na ribosomy vysoká biogenese u rostoucích buněk potřebují k tomu až 60% celkové buněčné transkripce rostlinné ribosomy jsou menší než savčí a mají výšší heterogenitu 37-62% tvoří rrna, zbytek proteiny (RP) 1.Translační aparát- ribosomy Ribosomální podjednotky: Bakterií (70S), Eukaryot (80S), Mitochondrií (55-77S) Velká podjednotka 50S 60S 39S 23S 28S 16S rrnas 5S 5S 5S 5.8S proteiny 33 47 48 Malá podjednotka 30S 40S 28S rrnas 16S 18S 12S proteiny 20 33 29 Eukaryota: velká podjednotka protáhlejší malá podjendotka strukturovanější rozdíly dány přidáním dalších RNA segmentů i r-proteinů Eukaryontní ribosom A: ES=extension segments (rrna = zelená, RB=žlutá) B: ES7 + ES 39 + specificky eukaryontní bílkoviny 1.Translační aparát- ribosomy Stejná funkce jako u Prokaryot, ale větší podjednotky: více rrna = expansion segments of rrna více bílkovin = expansion segments of RP immuno EM, Xray, NMR modelování, mutace, řada onemocnění, cryo-em rekonstrukce rostlinných a houbových 80S ribosomů : lokalizace 3 funkčně specifickych erp: RACKI, S19e v malé podjednotce L30e ve velké podjednotce celkem lokalizace 49 erp (33 ve velké a 16 v malé podjednotce) zbývá 31 nejasných Armache JP et al. 2010, PNAS 20
1. Translační aparát- ribosomy Výsledky analýz Prokaryontních ribosomů ribosom tvořen 2 nestejnými podjednotkami: (SSU) +(LSU) Spojení podjednotek labilní, jen funkční při translaci rrna samouspořádávají se do kompaktních struktur tvoří jádro podjednotek a na ně se navazují ribosomální bílkoviny ribosomální bílkoviny - kolem 80 výrazně basických bílkovin váží se na rrna a mezi sebou navzájem malá podjednotka plochá, protáhlá: h=head, cl=cleft, pl=platform velká podjednotka hemisférická, se 3 výraznými výstupky: cp=centrální (5S rrna), L1 (L1 bílkovina), St = stalk-stonek (L7/L12) oblast interfáze je víceméně plochá, s IC = interfase canyon (hlubokou prohlubní) 1.Translační aparát- ribosomy Proč trojrozměrná rekonstrukce, detekce funčních míst a jejich úloha v translaci až nyní? Komplexnost struktury - několik typů rrna a víc jak 50 r-bílkovin (první studie obdobné jako u virových partikulí) Prohlubeň (canyon) ve velké podjednotce se prohloubí po spojení podjednotek v tunel a vzniklý prostor místem interakce s trna, mezi kodonem a antikodonem a) Vazba imet-trna v místě P (zelená), b) vazba EF-G GDP (fialová), c) připojení komplexu Sec61 pro přenos nascentní bílkoviny do membrán (červená) a) + b) E. coli, c) kvasinka ribosomy mají nepravidelný tvar!!! nové přístupy : - 2-D elektroforéza - několik typů chromatografií (SEC, HPLC, FPLC) - X-ray krystalografie - NMR - elektronová mikroskopie - kryoelekronová mikroskopie - mutační analýzy - modelování 21
1.Translační aparát- ribosomy 1. translační aparát - funkční domény 23S rrna Skládání ribosomálních podjednotek 1. translační aparát ribosom (E.coli) Terciární struktury bílkovin a jejich lokalizace v podjednotkách velká podjednotka malá podjednotka 1. translační aparát ribosomy Napojení ribosomálních bílkovin a rrna N,C= konce bílkovin, P= putativní trna-vazebné místo, R= aktivní místa 22
1. translační aparát ribosomy Topografie r-bílkovin na intaktních ribosomálních podjednotkách E.coli (imuno-em analýza vazeb protein-protein) Pohyb dvou volně spojených podjednotek nezbytné pro funkci ribosomu: pulsating ribosome contraction SSU pohyblivost mezi hlavou a tělem LSU pohyblibost - L1 vypouklina + stonek L7/L12 malý rotační pohyb SSU a LSU podél osy (v oblasti interfáze) 2.Translace - ribosomy Translační aparát ribosomy flexibilita L1 bílkoviny = vysoká účinnost tranlace Pohyblivost ribosomů Ø pohyb trna, mrna + rostoucího polypeptidového řetězce Ø konformační změny obou podjednotek Ø změny flexibility jejich domén Ø Ø Ø 3D struktura ukázala vazebná místa: V. doména 23S rrna (=exit, uvolnění deacylované trna z ribosomu) r-proteinů: S9, S2, S10 mrna 23
1. Translační aparát ribosomy 1. Translační aparát ribosomy Ribosom Jádro podjednotky tvořeno vysoce polymérní samouspořádanou rrna Ø Každá ribosomální bílkovina má své dané vazebné místo Ø Ribosomy : jsou translačním aparátem: čtou genetickou informaci + syntetizují odpovídají polypeptid ribosom má 3 funkce: 1. Dekódující zodpovídá za uspořádání AMI v souladu se sekvencí nukleotidů navazování příslušných aminoacyl-trna 2. Enzymatickou - zprostředkovává transpeptidázovou reakci = prodloužení nově vznikajícího polypeptidu (katalyzována peptidyl transferázou) 3. Transportní - umožní pohyb podél mrna a průchod trna úloha ribosomálních podjednotek v těchto reakcích: 1 = malá podjednotka 2 = velká podjednotka 3 = obě podjednotky 24
Děkuji za pozornost Přijďte zase příště na kus řeči o translaci 25