Univerzita Palackého v Olomouci Diplomová práce Olomouc 2012 Bc. Zuzana Korbášová
Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta Katedra buněčné biologie a genetiky Výskyt a variabilita fytoplazmy stolburu v Hyalesthes obsoletus a dalších potenciálních vektorech. Diplomová práce Bc. Zuzana Korbášová Studijní program: Biologie Studijní obor: Molekulární a buněčná biologie Forma studia: Prezenční Olomouc 2012 Vedoucí práce: Mgr. Dana Šafářová, Ph.D.
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Dany Šafářové, Ph.D. a za použití citované literatury. V Olomouci dne: 16.4.2012 Bc. Zuzana Korbášová
Souhrn Fytoplazmy, které byly objeveny v roce 1967 v sítkovicích infikovaných rostlin, jsou jednobuněčné prokaryotní organismy bez buněčné stěny, které mohou přežívat a množit se pouze ve floému rostlin nebo v hemolymfě hmyzích vektorů. V infikovaných rostlinách způsobují řadu příznaků jako žloutnutí a svinování listů, proliferaci, sterilitu, zakrnění až odumření celé rostliny. Mezi významné zástupce fytoplazem patří fytoplazma stolburu, která na révě vinné způsobuje chorobu označovanou jako Bois noir. Napadá ovšem i další kulturní plodiny především z čeledi Solanaceae. Přenáší ji zejména žilnatka vironosná (Hyalesthes obsoletus Signoret), ale i jiní zástupci hmyzích vektorů. Pro šíření fytoplazmy stolburu je také velmi důležitý její výskyt v rezervoárových rostlinách jako je svlačec rolní a kopřiva dvoudomá. Experimentální část diplomové práce byla zaměřena na studium výskytu a variability fytoplazmy stolburu v Hyalesthes obsoletus a dalších potenciálních vektorech pomocí metod nested PCR, RFLP analýzy a sekvenování. Výskyt fytoplazmy stolburu byl potvrzen u 57 % jedinců Hyalesthes obsoletus ze všech studovaných lokalit na jižní Moravě. Dále byla fytoplazma stolburu potvrzena u Anaceratagallia ribauti a poprvé byla její přítomnost prokázána u Trioza urticae (29 % jedinců), v menší míře také u druhů Adelphocoris lineolatus, Agallia consobrina a Laodelphax striatella. Přítomnost fytoplazmy žloutenky aster byla poprvé prokázána u Dicranotropis hamata (65 % jedinců). Tato fytoplazma byla detekována i u druhů Adelphocoris lineolatus, Anaceratagallia ribauti, Lygus rugulipennis, a její přítomnost byla potvrzena u Javesella pellucida, Laodelphax striatella, a Aphrodes bicinctus. Analýzou variability sekvence 16S rrna genu bylo zjištěno, že všechny izoláty fytoplazmy stolburu vykazovaly 100% identitu a byla u nich zjištěna minimální variabilita. U izolátů příslušejících k fytoplazmě žloutenky aster byla zaznamenána 99% identita. Tyto izoláty příslušely do dvou podskupin 16 SrI-C a 16 SrI-F.
Summary Phytoplasmas, discovered in 1967 in sieves of infected plants, are single-celled procaryotic organisms without cell wall, which can survive and multiple only in plant phloem or in the haemolymph of insect vectors. In the infected plants, they are causing a lot of symptoms such as yellowing and curling of leaves, proliferation, sterility, stunting and death of whole plant. The important representative of phytoplasmas is stolbur phytoplasma which infects grapevine and causes the disease known as Bois noir. Stolbur phytoplasma can infect other crops especially from the family Solanaceae. It is transmitted mainly by Hyalesthes obsoletus Signoret, but it can be trasmitted by the other kinds of insect vectors. For the spread of stolbur phytoplasma is also very important its occurrence in reservoir plants such as bindweed and nettle. The experimental part of this diploma thesis was aimed to study the occurrence and variability of stolbur phytoplasma in Hyalesthes obsoletus and other potential vectors, using the nested PCR, RFLP analysis and sequencing. The occurence of stolbur phytoplasma was confirmed in 57 % of Hyalesthes obsoletus indviduals from all studied localities of South Moravia. Stolbur phytoplasma was also confirmed in Anaceratagallia ribauti and for the first time its presence was demonstrated in Trioza urticae (29 % individuals) and also in Adelphocoris lineolatus, Agallia consobrina, and Laodelphax striatella. Aster yellows phytoplasma was firstly demonstrated in Dicranotropis hamata (65 % individuals), as well as in Adelphocoris lineolatus, Anaceratagallia ribauti, Lygus rugulipennis and its presence was confirmed in Javesella pellucida, Laodelphax striatella, and Aphrodes bicinctus. Analysis of sequence variability of 16S rrna gene as well as phylogenetic analysis revealed position of phytoplasma isolates analysed. The all stolbur phytoplasma isolates showed minimal variability and 100% identity. The isolates belonging to Aster yellows phytoplasma group showed more variability, with the recognized 99% identity. These isolates were divided into two significant subgroups 16SrI-C and 16SrI-F.
Chtěla bych poděkovat Mgr. Daně Šafářová, Ph.D. za pomoc, cenné rady a trpělivost při vypracování mé diplomové práce. Dále pak dr. Pavlu Lautererovi za determinaci hmyzu, RNDr. Pavle Válové, Mgr. Martinu Starému a p. Janě Veselské za pomoc při praktické části mé práce. Experimentální část diplomové práce vznikla za finanční podpory COST akce FA0807 a projektu COST OC10032 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky.
Obsah 1. Úvod 9 2. Cíle práce 10 3. Literární přehled 11 3.1 Fytoplazmy 11 3.1.1 Historie objevu fytoplazem 11 3.1.2 Klasifikace fytoplazem 12 3.1.3 Genom fytoplazem 12 3.1.4 Přenos a šíření fytoplazem v hostitelských rostlinách 13 3.1.5 Symptomy infekce rostlin fytoplazmami 14 3.2 Fytoplazma stolburu 15 3.2.1 Taxonomie fytoplazmy stolburu 15 3.2.2 Vektoři fytoplazmy stolburu 16 3.2.3 Hostitelé fytoplazmy stolburu 16 3.2.4 Geografické rozšíření fytoplazmy stolburu 16 3.2.5 Symptomy infekce fytoplazmou stolburu 17 3.2.6 Genetická variabilita fytoplazmy stolburu 18 3.2.6.1 Genetická variabilita tuf genu 18 3.2.6.2 Genetická variabilita vmp1 genu 19 3.3 Vektoři fytoplazmy stolburu 20 3.3.1 Žilnatka vironosná (Hyalesthes obsoletus, Signoret 1865) 20 3.3.1.1 Morfologie a taxonomické zařazení 20 3.3.1.2 Zeměpisné rozšíření 21 3.3.1.3 Vývojový cyklus a hostitelské rostliny 22 3.3.1.4 Ochranná opatření proti Hyalesthes obsoletus 23 3.3.2 Další vektoři stolburu 23 4. Materiál a metody 25 4.1 Biologický materiál 25 4.2 Izolace DNA 25 4.3 Detekce fytoplazem 26 4.3.1 Nested PCR 26 4.3.2 Detekce PCR produktu 28
4.4 Identifikace fytoplazem pomocí RFLP analýzy 28 4.5 Purifikace PCR produktu 29 4.5.1 Izolace PCR produktu z gelu 30 4.6 Sekvenační značení 31 4.7 Analýza sekvencí DNA 31 4.8 Přístrojové vybavení laboratoře 32 5. Výsledky 33 6. Diskuze 51 7. Závěr 55 8. Seznam použitých zkratek 56 9. Seznam použité literatury 57 10. Přílohy
1 Úvod Fytoplazmy jsou významné patogeny kulturních i plevelných rostlin. Řadí se do třídy Mollicutes a infikující více než 700 rostlinných druhů. Mezi významné zástupce fytoplazem patří fytoplazma stolburu infikující révu vinnou, a způsobující u ní chorobu označovanou jako Bois noir. Choroba vede k zhoršení zdravotního stavu vinic až k celkovému odumírání keřů a způsobuje významné ekonomické ztráty. Fytoplazma stolburu může infikovat i další hospodářsky významné rostliny, především z čeledi Solanaceae lilkovité (brambor, lilek, celer, rajče, paprika). Fytoplazma stolburu je přenášena křísem žilnatkou vironosnou (Hyalesthes obsoletus Signoret, 1865), ale i jinými druhy hmyzích vektorů např: Pentastiridius beieri, Reptalus panzeri, Macrosteles quadripunctulatus, Anaceratagallia ribauti a pro její šíření je také velmi důležitý výskyt v rezervoárových rostlinách, kterými jsou kopřiva a svlačec. Tento patogen je významný z celosvětového hlediska. Organizací EPPO je zařazen do seznamu karanténních patogenů kategorie A2 (EPPO/Sept2011) a podléhá, na základě zákona č. 326/2004 Sb., o opatřeních proti zavlékání a rozšiřování škodlivých organismů rostlin a rostlinných produktů a vyhlášky č. 330/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a o změně některých souvisejících zákonů, zvláštním fytosanitárním opatřením. V České republice byla v posledních deseti letech fytoplazma stolburu opakovaně detekována. Proto je nezbytné studovat výskyt vektorů a vytipovat další potenciální vektory této fytoplazmy, s cílem poznat patosystém stolburu v našich podmínkách a omezit tak šíření tohoto významného patogena. 9
2 Cíl práce Cílem mé diplomové práce je vypracování literární rešerše na téma Výskyt a variabilita fytoplazmy stolburu v Hyalesthes obsoletus a dalších potenciálních vektorech. Cílem praktické části je detekce fytoplazmy stolburu ve vektorech pomocí molekulárních metod (izolace DNA, nested PCR, elektroforéza) a následná studie specifity amplifikace a variability fytoplazmy stolburu. 10
3 Literární přehled 3.1 Fytoplazmy Fytoplazmy jsou jednobuněčné prokaryotní organismy, kulovitého nebo protáhlého tvaru o velikosti od 200 do 800 µm, obalené pouze jedinou buněčnou membránou, bez buněčné stěny. Velikost jejich genomu se pohybuje v rozmezí od 680 do 1600 kb a ve srovnání s nejblíže příbuznými bakteriemi je i velmi redukovaný. Fytoplazmy nejsou schopny samostatné existence, mohou přežívat a množit se pouze ve floému rostlin či v hemolymfě hmyzích vektorů a mohou infikovat i hmyzí vajíčka (Bertaccini, 2007; Hogenhout et al., 2010; Lee et al., 2000; Marcone et al., 1999). 3.1.1 Historie objevu fytoplazem Choroby rostlin vykazující žloutenku byly známé už od konce roku 1800. Původně se myslelo, že tyto choroby způsobují viry. Až v roce 1967 Doi et al. objevili pomocí elektronové mikroskopie v sítkovicích infikovaných rostlin přítomnost prokaryotních buněk bez buněčné stěny. Tyto unikátní rostlinné patogeny nazval MLOs (mycoplasmalike organisms), podle jejich podobnosti v morfologii a ultrastruktuře se zvířecími mykoplasmaty (třída Mollicutes) (Gundersen et al., 1994). Po dobu nejméně tři desetiletí se MLOs nedařilo kultivovat v in vitro podmínkách a proto bylo velice obtížné charakterizovat tyto patogeny a určit jejich taxonomické zařazení tradičními metodami (Gundersen et al., 1994). Situace se změnila s rozvojem molekulárních technik, jako purifikace nukleových kyselin, hybridizace DNA, či polymerázová řetězová reakce (PCR), které umožnily rozmach ve studiu biologie a taxonomie fytoplazem. Gundersen et al. v roce 1994 na základě sekvenční analýzy 16S rdna a genů pro ribozomální proteiny prokázali, že fytoplazmy tvoří jednu skupinu monofyletického původu, která je více příbuzná k rodu Acholeplasma než k ostatním mollicutes. Nejbližšími identifikovanými příbuznými fytoplazem jsou Acholeplasma palmae a Acholeplasma modicum patřící do skupiny Anaeroplasma (Marcone et al., 1999). 11
V roce 1990 The International Committee of Systematic Bacteriology (ICSB), Subcommittee on the Taxonomy of Mollicutes rozhodlo o nahrazení triviálního názvu MLOs termínem fytoplazmy (Seemüller et al., 1998). A v roce 2004 bylo definováno označení taxonomické jednotky druh jako Candidatus phytoplasma (Firrao et al., 2004). 3.1.2 Klasifikace fytoplazem Po celá desetiletí chyběl komplexní systém pro klasifikaci fytoplazem, což omezovalo jejich výzkum. Zpočátku byly pokusy identifikovat a klasifikovat neznámé fytoplazmy založené na analýze amplifikované 16S rdna sekvence. Lee et al. (1993) navrhli klasifikační systém založený na RFLP analýze amplifikované 16S rdna sekvence, který zahrnoval 9 hlavních skupin fytoplazem (tzv. 16S rdna skupiny) a 14 podskupin. Tento systém byl později rozšířen na 14 skupin a 32 podskupin (Lee et al., 1998). V roce 1998 Seemüller et al. provedli fylogenetickou analýzu sekvencí 16S rrna genu ze 75 druhů fytoplazem, a rozšířili klasifikační systém na 20 skupin. Na základě podobností 16S rdna sekvencí kmenů fytoplazem navrhla IRPCM v roce 2004 taxonomickou jednotku zastupující druh Candidatus phytoplasma spp. Pro popis izolátu jako nového druhu Ca phytoplasma musí být splněny podmínky: izolát musí být charakterizován na základě sekvence 16S rrna genu delší než 1200 bp, v tomto genu musí vykazovat menší než 97,5% podobnost s jakýmkoli jiným dříve popsaným druhem Candidatus phytoplasma. Jako nový druh mohou být popsány i izoláty které tuto podmínku nesplňují, ale jedná se o jasně ekologicky oddělené populace. Potom mohou být uznány jako samostatné druhy pokud jsou přenášeny odlišným vektorem, mají jiného rostlinného hostitele a existují důkazy o průkazné molekulární variabilitě dosažené na základě hybridizace s cdna próbami, sérologické reakce nebo dalších PCR technik (Firrao, 2004). 3.1.3 Genom fytoplazem Poznatky o genomu fytoplazem jsou doposud omezené a vycházejí z kompletních genomů čtyř fytoplazem, které se podařilo osekvenovat. Jedná se o kmeny Onion Yellows Phytoplasma (OY-M), Aster yellows witches - broom phytoplasma (AY-WB) náležících k fytoplazmě žloutenky aster Candidatus (Ca.) Phytoplasma asteris, dále pak kmen Ca. Phytoplasma australiense a kmen AP náležící ke skupině fytoplazma proliferace jabloně, 12
druhu Ca Phytoplasma mali (Bai et al., 2006; Kube et al., 2008; Oshima et al., 2004; Tran- Nguyen et al., 2008;). Srovnáním získaných genomů fytoplazem bylo zjištěno, že jsou bohaté na A+T báze, mají malý počet trna genů, dvě kopie rrna operonu a redukovaný počet genů, které kódují základní metabolické dráhy, proto musí fytoplazmy využívat základní metabolity jejich rostlinných a hmyzích hostitelů (Bai et al., 2006; Tran-Nguyen et al., 2008). U některých fytoplazem byla také popsána přítomnost extrachromozomální DNA (Denes et al., 1991; Oshima et al., 2001). Je známo, že geny kódované v extrachromozomální DNA hrají důležitou roli v patogenicitě mnoha rostlinných patogenních bakterií (Vivian et al., 2001). 3.1.4 Přenos a šíření fytoplazem v hostitelských rostlinách Fytoplazmy jsou přenášeny z rostliny na rostlinu perzistentním způsobem pomocí hmyzích vektorů, především křísů, mer a ploštic (Weintraub et al., 2006). Hmyz se živí floémovou šťávou rostlin ve kterém mohou být fytoplazmy. Ty přecházejí přes stěny trávícího traktu do hemolymfy vektora, kde se množí, a následně do slinných žláz. Při dalším sání vektora jsou fytoplazmy přeneseny do další rostliny, skrze slinné tekutiny (Obr. 1) (Agrios, 1997). Fytoplazmy mohou přezimovat v infikovaných hmyzích vektorech i ve vytrvalých rostlinách, které tak slouží jako rezervoáry fytoplazem a z nich jsou v následujícím vegetační období dále rozšiřovány. Fytoplazmy se mohou šířit i vegetativně a to pomocí řízků, hlíz, oddenků či cibulek. Experimentálně je možné přenést fytoplazmy na hostitelskou rostlinu pomocí parazitické rostliny kokotice (Cuscuta spp.) (Lee et al., 2000; Marcone, 2010). 13
Obr.1: Životní cyklus fytoplazem (upraveno dle: 15http://papilio.ab.a.u-tokyo.ac.jp/planpath/phyto-genome/index.html) 3.1.5 Symptomy infekce rostlin fytoplazmami Rostliny infikované fytoplazmami vykazují řadu univerzálních i specifických příznaků. Mezi ně patří virescence (vývoj zelených květů a pokles schopnosti tvorby normálního květního pigmentu), sterilita, nadměrná produkce prýtu metlovitost (witches -broom), zkrácení internodií, celkové zakrnění, změny ve zbarvení listů nebo výhonků - žloutnutí či červenání, kroucení listů, odumírání prýtů nebo větví až odumření celé rostliny. Typ a intenzita příznaků závisí na druhu fytoplazem, které způsobují infekci, na stádiu infekce, na stáří rostliny v době infekce a vnějších podmínkách prostředí. Za vznik příznaků jsou zodpovědné jednak změny fyziologických funkcí jako např. snížení fotosyntézy, vodivosti průduchů a kořenového dýchání, dále změny sekundárního metabolismu a poruchy hormonální rovnováhy rostlin, ke kterým v infikovaných rostlinách dochází. Obecně platí, že symptomy vyvolané fytoplazmovou infekcí, mají na rostliny jednoznačně negativní vliv. Některé druhy rostlin ale mohou být tolerantní nebo odolné vůči fytoplazmovým infekcím. Takové rostliny jsou bez příznaků nebo vykazují pouze slabé příznaky infekce. V jednom vzácném případě u rostliny vánoční hvězda (Poisentie) je infekce fytoplazmou z pohledu člověka žádoucí, neboť symptomy vyvolané touto infekcí způsobují křovinatý růst a mnohokvětnatost (Lee et al., 1997, 2000; Marcone, 2010). 14
3.2 Fytoplazma stolburu Fytoplazma stolburu je významným karanténním patogenem, který u napadených rostlin vyvolává žloutenku a způsobuje velké ekonomické ztráty ve výnosu a kvalitě plodů. U révy vinné (Vitis vinifera) je tato choroba označovaná různými názvy: Bois noir (BN) ve Francii, Vergilbungskrankheit (VK) v Německu či Legno nero (LN) v Itálii. 3.2.1 Taxonomie fytoplazmy stolburu Lee et al. (1998) na základě RFLP analýzy s použitím třech základních restrikčních endonukleáz MseI, RsaI a AluI klasifikovali fytoplazmu stolburu jako charakteristického zástupce skupiny 16Sr-XII, náležící do podskupiny A (16SrXII-A). Tuto klasifikaci potvrdili v roce 2007 i Wei et al. pomocí počítačové simulace analýzy RFLP. Pro zástupce této skupiny byl navržen druhový název Candidatus Phytoplasma solani (Firrao et al. 2004; Lee et al., 1998). Jeho oficiální použití, ale nebylo dodnes potvrzeno. Podle klasifikace navržené Lee et al. (1998) se fytoplazmy ze skupiny 16S rdna-xii dělí na dvě podskupiny. Wei et al. (2007) na základě virtuální RFLP analýzy vybraných izolátů i s dalšími restrikčními enzymy, jako jsou BfaI, EcoRI, HhaI, TaqI, HinfI, HpaII, KpnI a Sau3AI, rozšířili počet podskupin na pět (Tab. 1). Tab.1: Rozdělení zástupců skupiny 16S rdna-xii na podskupiny dle klasifikace Lee et al. (1998) a Wei et al., (2007) Lee et al. (1998) Wei et al. (2007) kmen 16Sr skupina 16Sr skupina Stolbur STOL ( Ca Phytoplasma solani ) XII-A XII-A Grapevine yelows XII-A Celery yellows CelY XII-A Ca Phytoplasma australiense XII-B XII-B Phormium yellow leaf Pyl XII-B Strawberry lethal yellows XII-C Ca Phytoplasma japonicum XII-D Ca Phytoplasma fragariae XII-E 15
3.2.2 Vektoři fytoplazmy stolburu Jako hlavní a nejvýznamnější vektor fytoplazmy stolburu a především choroby Bois noir je považována žilnatka vironosná (Hyalesthes obsoletus Signoret, 1865) (Sforza et al., 1998; Weber et al., 1998). Bylo zjištěno, že fytoplazma stolburu se přenáší i pomocí jiných druhů hmyzích vektorů jako např.: Pentastiridius beieri, Reptalus panzeri (Gatineau et al., 2001; Jović et al., 2007; Maixner et al., 1995), Macrosteles quadripunctulatus (Kirschbaum), Anaceratagallia ribauti (Ossiannilsson) (Battle et al., 2008; Riedle-Bauer et al., 2008). Fytoplazma stolburu byla detekována i v dalších druzích křísů, mer a ploštic, např. v Reptalus quinquecostatus, Dictyophara europaea, Psammotettix alienus, Anoplotettix fuscovenosus, Dryodurgades reticulatus, ale jejich role vektora zatím nebyla potvrzena (Cvrković et al., 2011; Riedle- Bauer et al., 2006; Trivellone et al., 2005). 3.2.3 Hostitelé fytoplazmy stolburu Fytoplazma stolburu infikuje široké spektrum kulturních i plevelných rostlin. Hospodářsky významnými hostiteli jsou především réva vinná (Vitis vinifera) a lilkovité (Solanaceae) lilek (Solanum melongena), celer (Apium graveolens), rajče (Solanum lycopersicum), paprika (Capsicum annuum), brambory (Solanum tuberosum) (Cvrković et al., 2011; Sforza et al., 1998). Mezi hlavní rezervoárové rostliny fytoplazmy stolburu patří především svlačec rolní (Convolvulus arvensis L.), kopřiva dvoudomá (Urtica dioica L.), dalšími pak jsou opletník plotní (Calystegia sepium L.) a vesnovka obecná (Cardaria draba L.), ze kterých se pomocí hmyzích vektorů přenáší na další kulturní či plevelné rostliny (Cimerman et al., 2009; Langer et al., 2004; Navrátil et al., 2009). Dalšími hostiteli jsou potom jahodník (Fragaria vesca), cukrová řepa (Beta vulgaris L.), či kukuřice (Zea mays L.) (Cimerman et al., 2009; Mitrović et al., 2011). 3.2.4 Geografické rozšíření fytoplazmy stolburu Fytoplazma stolburu je rozšířena hlavně na území Francie, Itálie a Německa. Dále byla také identifikována ve Švýcarsku, Chorvatsku, Španělsku, Izraeli a Libanonu. Výskyt fytoplazmy stolburu byl také zaznamenán na území Srbska, Turecka i Bulharska 16
(Avramov et al., 2011; Boudon-Padieu, 2003; Canik et al., 2011; Ćurković et al., 2001; Ivanović et al., 2011; Kessler et al., 2011; Laviňa et al., 1995; Orenstein et al., 2001). Pravděpodobně první zprávy o výskytu fytoplazmy v tehdejším Československu pocházejí z roku 1933, kdy byl popsán výskyt zvláštní mozaiky na rajčatech v okolí Břeclavi (Valenta, 1953). V České republice byly choroby způsobené fytoplazmou stolburu extrémně rozšířeny až do roku 1950. Následně až do devadesátých let nebyly poznamenány žádné výskyty, pravděpodobně díky používání insekticidů a herbicidů. Až od roku 2003 pak bylo pozorováno pozvolné šíření stolburu, především na jižní Moravě (Navrátil et al., 2009). 3.2.5 Symptomy infekce fytoplazmou stolburu Hlavními příznaky infekce fytoplazmou stolburu je na révě vinné změna zbarvení listů a žilek, předčasné zčervenání listů (Obr. 2) u červených a zežloutnutí u bílých odrůd vína. V extrémních případech dochází také ke svinování listů, listy jsou křehké a nekrotizují. Může také docházet k předčasnému opadu a usychání květů a plodů, nebo dřevnatění letorostů (Hren et al., 2009; Laviňa et al., 1995; Milkus et al., 2005). Na bramboru se infekce fytoplazmou stolburu projevuje předčasným vadnutím rostlin, mohou se objevit změny zbarvení, tvaru a postavení listů, na květech nejsou pozorovány žádné změny. Hlízy infikovaných rostlin jsou povadlé a měkké a klíčky nitkovité. Typickými symptomy infekce na rajčatech jsou redukované, chlorotické nebo antokyanizované listy. Největší změny jsou pozorovány na květech, kalichy listnatí a koruna často abortuje stejně jako pohlavní orgány. Výhonky jsou často více vzpřímené než u zdravých rostlin. Na infikované paprice je možné pozorovat vadnutí jako u brambor. Vrcholové listy jsou menší, žloutnou a svinují se. Na květech se žádné změny nevyskytují. Naopak infikovaný svlačec ztrácí charakteristickou plazivost a tvoří se keříčkovité formy s redukovanými listy. Květy jsou deformované, redukované a mají nazelenalé okvětí (Valenta, 1953). 17
Obr. 2. Příznaky infekce révy vinné fytoplazmou stolburu - červenání listů, zasychání plodů (Foto: Dana Šafářová) 3.2.6 Genetická variabilita fytoplazmy stolburu Překrývající se území vektorů a hostitelských rostlin dalo dostatek možností k tomu, aby spolu mohly fytoplazmy navzájem interagovat a vyměňovat si genetickou informaci a to jak vertikálně, tak i horizontálně (Lee et al., 1998). Sekvence 16S rrna genu, která je základním parametrem používaným při detekci a klasifikaci fytoplazem, není dostatečně variabilní k podrobnější diferenciaci fytoplazem, které se liší specifitou k hostitelské rostlině či vektoru. Proto byly pro přesnější odlišení izolátů hledány jiné DNA sekvence, přičemž se pro studium variability jako velmi vhodné jeví neribozomální geny jako např. tuf, vmp1, map a secy (Cimerman et al., 2009; Pacifico et al., 2007; Schneider et al., 1997). 3.2.6.1 Genetická variabilita tuf genu Tuf gen je konzervativní gen, který kóduje elongační faktor Tu (EF-Tu) a má hlavní funkci při translačních procesech. Poprvé byla možnost jeho využití při rozlišení a klasifikaci fytoplazem ověřena při analýze izolátů fytoplazem skupin žloutenky aster, stolburu a X-disease. Amplifikace tuf fragmentů pomocí specifických primerů ftufay/rtufay a jejich následná sekvenční analýza prokázala, že zástupci skupiny žloutenky aster a stolburu jsou nejbližší příbuzní ze skupiny fytoplazem a také, že tuf gen je variabilnější než 16S rdna a je tedy vhodný pro rozlišování a klasifikaci fytoplazem, které je obtížné rozlišit na základě 16S rdna (Schneider et al., 1997). 18
Langer et al. (2004) využili amplifikaci tuf genu a RFLP analýzu ke studiu genetické variability izolátů fytoplazmy stolburu Vergilbungskrankheit (VK) z révy vinné v Německu. Jako vzorky použili infikovanou révu vinnou, svlačec, kopřivu, opletník a vektora Hyalesthes obsoletus. S pomocí restrikčních endonukleáz DraI a HpaII odlišili tři základní typy izolátů VK-I, VK-II a VK-III. Typ VK-I, označovaný také jako tuf-a nebo tuf-i, byl detekován v révě vinné, H. obsoletus i kopřivě z většiny vinařských oblastí napadených chorobou Bois noir (BN). Typ VK-II, také označovaný jako tuf-b nebo tuf-ii, je nejrozšířenější. Byl nalezen ve vinné révě, H. obsoletus a ve svlačcích. Typ VK-III, označovaný jako tuf-c, byl nalezen v révě vinné, H. obsoletus a svlačci Calystegia sepium z oblasti řeky Mosel. Fylogenetické analýzy také ukázaly, že typ VK-II a VK-III jsou příbuzné ale význam typu VK-III je zatím stále nejasný. Obdobné rozložení tuf typů a výhradní přítomnost fytoplazem stolburu typu tuf-i u kopřiv a tuf-ii u svlačce zjistili i Pacifico et al. (2009). Avšak v České republice, na jižní Moravě (Lednice, Perná a Březí), byl typ tuf-b (tuf-ii) nalezen nejen u svlačce, ale také u kopřivy, která je spojována pouze s přítomností typu tuf-a (tuf-i) (Fialová et al., 2009). 3.2.6.2 Genetická variabilita vmp1 genu Vmp1 gen byl dříve nazýván stol1h10. Je to gen, který kóduje povrchový membránový protein a je spojen se schopností fytoplazem interagovat s konkrétním hmyzím vektorem. Vmp1 gen je dlouhý 1674 bp, kóduje 557 aminokyselin, jeho molekulová hmotnost je 57,8 kda a je homologní ke genu, který kóduje povrchový lipoprotein VPMA Mycoplasma agalactiae. Pomocí Southern blot hybridizace bylo prokázáno, že se na chromozómech fytoplazem vyskytuje v několika odlišných kopiích (Cimerman et al., 2009). Vmp1 gen je mnohem variabilnější než předchozí tuf gen. Amplifikace vmp1 fragmentu pomocí primerů 1H10F/1H10R a následná restrikční analýza s použitím restrikční endonukleázy RsaI umožnila na základě získaných restrikčních profilů odlišit osm typů izolátů (A až H), zatímco restrikční analýza tuf genu pomocí enzymu HpaII poskytla pouze dva typy izolátů (Cimerman et al., 2009). Variabilitu později potvrdili i Pacifico et al. (2009) kteří charakterizovali izoláty fytoplazem pocházejících z různých hostitelských rostlin (réva vinná, svlačec, kopřiva) a vektora H. obsoletus původem z Francie a Itálie. Vmp1 gen amplifikovali pomocí nested PCR se stolbur specifickými primery H10F1/H10R1 a H10F2/H10R2 a získali tři různě velké produkty. V následné RFLP analýze s použitím restrikčních enzymů RsaI a AluI rozdělili produkty do dvanácti odlišných profilů (V1 až V12). Ve vzorcích révy vinné původem 19
z Francie byl nejčastěji zastoupen profil V1, ve vzorcích z Itálie pak profil V3, který byl také identifikován v infikovaných kopřivách a u 98 % hmyzích vektorů H. obsoletus odchycených na kopřivách. Všechny BN izoláty z vektorů odchycených na svlačci byly typu V12. Při porovnání s variabilitou tuf genu zjistili, že profily V3 a V5 genu vmp1 byly unikátní pro izoláty typu tuf-i. V1 profil byl přítomen u obou typů tuf-i i tuf-ii. A všechny ostatní profily byly spojovány s typem tuf-ii. K podobným výsledkům došel i Murolo et al. (2010). Také v České republice byla u izolátů fytoplazmy stolburu, které pocházely z různých hostitelských rostlin (miřík celer, paprika, rajče, brambor, réva vinná, laskavec ohnutý, opletník plotní, pcháč oset, svlačec, durman a kopřiva) z jižní Moravy (Lednice, Perná a Březí) zaznamenána vyšší variabilita vmp1 genu. Amplifikací vmp1 fragmentu pomocí nested PCR s použitím primerů StolH10F1/R1 a TYPHH10F/R a následnou RFLP analýzou pomocí restrikčního enzymu RsaI bylo odlišeno pět různých profilů, označených jako I-V, přičemž nejčastěji byl zastoupen profil I, který byl detekován v sedmi z jedenácti hostitelských rostlin v Lednici (Fialová et al., 2009). 3.3 Vektoři fytoplazmy stolburu 3.3.1 Žilnatka vironosná (Hyalesthes obsoletus Signoret, 1865) Za nejvýznamnějšího vektora fytoplazmy stolburu a tím i příčinu šíření choroby označované jako stolbur (nebo dříve také bezsemennost) je považován polyfágní křís, Hyalesthes obsoletus Sign. 1865 (viz. Obr. 3) (Sforza et al., 1998; Valenta, 1953; Weber et al., 1998). 3.3.1.1 Morfologie a taxonomické zařazení Hyalesthes obsoletus Sign. patří do čeledi Cixiidae (Homoptera). Dospělí jedinci (imaga) mají velikost od 4,5 do 6 mm. Na přední části hlavy mají utnuté černé temeno s bílým okrajem. Čelo je černé a jeho kýl u štítu (clypeum) nemá třetí oko (oculus), což je typický znak pro Hyalesthes. Štít je zcela bez kýlu a to je typický znak pro druh Hyalesthes obsoletus Sign. Po stranách jsou dvě tmavé oči. Pronotum je bílé, ale těsně za hlavou tmavě zabarvené. Následuje mohutný štít s pěti podélnými kýly, na jehož bocích jsou dvě krytky, které shora 20
zakrývají bázi křídel a to je znak čeledi Cixiidae. Přední pár křídel značně přesahuje břicho a spodní křídla. Křídla jsou blanitá, bezbarvá, průhledná a bohatě žilkovaná. Tělo je na spodní straně tmavě hnědé až černé. Vajíčka jsou žlutobílá, elipsoidního tvaru a jsou dlouhá asi 0,5 mm. Jejich počet ve snůšce je poměrně vysoký až 60 kusů. Larvy jsou bílé, bez pigmentu. Mají redukované oči, které se vyvíjí až v posledních stádiích života. Charakteristickým znakem jsou zvláštní bílé chvosty, které jsou složené z tenkých voskových trubiček, vylučovaných z voskových žláz zadních segmentů břicha. Larvy tyto chvosty periodicky odhazují a nahrazují je novými. Larvy posledního instaru jsou také schopny skákavého pohybu. Od ostatních podobných rodů jako Oliarus a Cixius se dá Hyalesthes obsoletus Sign. rozpoznat jednak podle přítomnosti pěti podélných kýlů na štítě za pronotem, dále podle dvou očí na hlavě, kdy třetí oko se nevyvinulo a také podle jednoduchého zakončení zadních nohou, které nemají vyvinutý typický ostruhovitý trn. Avšak nejspolehlivější znaky pro rozpoznání jsou na pohlavních orgánech (Valenta, 1953). Obr. 3: Hyalesthes obsoletus Sign. (Foto: Laboratoř molekulární biologie mikroorganismů) Laboratoř molekulární biologie mikroorganismů) 3.3.1.2 Zeměpisné rozšíření Výskyt Hyalesthes obsoletus Sign. je zaznamenán především ve střední a jižní Evropě, Německu, Francii, Itálii, Středním východě, Rusku, Bulharsku, Maďarsku, ale i Turecku, Íránu, Izraeli atd. (Avramov et al., 2008; Červená et al., 2007; Klein et al., 2001; Lessio et al., 2007; Maixner, 1994; Orosz et al., 1996; Sforza et al., 1998; Valenta, 1953). 21
První zmínka o výskytu žilnatky vironosné (H. obsoletus) na území Československa pochází z roku 1896, kdy byla zaznamenána na Moravě, v okolí Brna (Valenta, 1953). V první polovině padesátých let minulého století byl H. obsoletus široce rozšířen i na jižním Slovensku (Blattný, 1953) a pravděpodobně se vyskytoval i v Čechách. Nejčastější výskyt byl popsán v rovinách, méně často v podhorských oblastech a v horách jen vzácně. Nejhojněji se vyskytoval v oblastech do 300 m. n. m., nad 400 m. n. m. méně často (Valenta, 1953). Poté se po několik desetiletí žádné zmínky o výskytu H. obsoletus neobjevovaly, k vymizení žilnatky došlo pravděpodobně z důvodu intenzivního používání insekticidů a herbicidů v zemědělské produkci. Až po roce 2000 byl znovu zaznamenán nepříliš častý výskyt na jižní Moravě, která je důležitou zemědělskou oblastí v České republice (Březíková et Linhartová, 2007). 3.3.1.3 Vývojový cyklus a hostitelské rostliny H. obsoletus má ročně jen jednu okřídlenou generaci. Dospělí jedinci žijí na nadzemních orgánech rostlin, především na listech. Samičky po spáření (zhruba na počátku července) začínají klást vajíčka zpravidla 2-3 cm pod povrch půdy. Vylíhlé larvy migrují v půdě ke kořenům svlačce (Convolvulus arvensis L.) nebo kopřivy (Urtica dioica L.), které jsou hlavní hostitelskou rostlinou, kde si vytváří dutinku krytou bílými voskovými výpotky. Na kořenech se živí sáním a v hloubce asi 10-12 cm přezimují. H. obsoletus má celkem pět larválních instarů. Larvy posledního instaru se stěhují do povrchových vrstev půdy. K vylíhnutí potřebují dospělí jedinci v červnu a červenci sucho, aby došlo k popraskání půdy a oni tak mohli prasklinami půdu opustit. Dospělci žijí poměrně krátkou dobu, asi jen jeden měsíc a jejich výskyt končí koncem srpna. Období aktivity H. obsoletus jako vektora stolburu je omezené jen na období migrace, které začíná jen krátce po vylíhnutí a trvá přibližně jeden měsíc (www.greenplantprotection.eu, 2009; Valenta, 1953). Hlavní biologickou charakteristikou individuálního vývoje H. obsoletus je střídání hostitelských rostlin a proto je jejich okruh mimořádně široký. Dochází k němu krátce po vylíhnutí dospělců, kteří opouštějí mateřskou rostlinu a stěhují se na další rostliny. Tento hostitelský cyklus tvoří jednak omezený počet vytrvalých rostlin, především plevele, na kterých se vyvíjí larvy a dále pak široký okruh jednoletých a vytrvalých rostlin, většinou kulturních plodin, na kterých žije dospělý jedinec. Příčiny migrace jsou vysvětlovány tím, že dospělý jedinec H. obsoletus potřebuje změnu potravy a proto se po vylíhnutí stěhuje na jinou rostlinu (Valenta, 1953). 22
Hlavní hostitelskou rostlinou žilnatky jsou svlačec (Convolvulus arvensis L.) a kopřiva (Urtica dioica L.), které jsou často rozptýleny po celém poli a tvoří složku travnatých porostů mezí, svahů a náspů (Kessler et al., 2011; Sforza et al., 1999; Valenta, 1953). Analýzou preferencí hostitelské rostliny bylo zjištěno, že dospělí jedinci, kteří se vyvíjeli na kopřivě, preferují kopřivu před svlačcem. Zároveň larvy, které nemají žádnou hostitelskou preferenci, se na kopřivě vyvíjejí mnohem lépe než na svlačci a dospělí jedinci přežívají na kopřivě podstatně déle než na svlačci a mnohem raději na kopřivě sají. Na základě těchto závěrů se dá říci, že H. obsoletus preferuje, jako svoji hlavní hostitelskou rostlinu, kopřivu (Kessler et al., 2011). Dalšími hostitelskými rostlinami jsou opletník plotní (Calistegia sepium), řeřicha (Cardaria draba), levandule (Lavandula angustifolia Mill.), vzácněji bodlák (Cirsium arvense), čekanka (Cichorium intybus), jahodník (Fragaria vesca.) durman (Datura stramonium), pcháč (Cirsium arvense), laskavec (Amaranthus retroflexus). Z kulturních plodin to jsou především lilkovité (Solanaceae) lilek brambor (Solanum tuberosum), lilek rajče (Solanum lycopersicum), dále pak paprika (Capsicum annuum), miřík celer (Apium graveolens) či slunečnice (Helianthus sp.) (Fialová et al., 2009; Sforza et al., 1999; Valenta, 1953). 3.3.1.4 Ochranná opatření proti Hyalesthes obsoletus Ochranná opatření proti H. obsoletus jsou v podstatě opatřeními proti výskytu a šíření fytoplazmy stolburu. Jednou z možností je likvidace ohnisek výskytu choroby, zejména likvidace rezervoárových rostlin, plevelů a především svlačce a kopřivy. Dalším doporučeným opatřením je narušení povrchu půdy okopáváním nebo oráním, čímž se jednak ničí podzemní komůrky larev a jednak dochází i k mechanickému poškození larev, které posléze hynou (Červená et al., 2007; Valenta, 1953). 3.3.2 Další vektoři stolburu Kromě Hyalesthes obsoletus Signoret, 1865 /žilnatka vironosná/, který je považován za hlavního vektora fytoplazmy stolburu (Sforza et al., 1998), jsou známí i další hmyzí vektoři Pentastiridius beieri (Wagner, 1970), Reptalus panzeri (Löw, 1883) /žilnatka travní/ (Gatineau et al., 2001; Jović et al., 2007; Maixner et al., 1995), Macrosteles quadripunctulatus (Kirschbaum, 1868), Anaceratagallia ribauti (Ossiannilsson, 1938) 23
/tečkovka žilkovaná/ (Battle et al., 2008; Riedle-Bauer et al., 2008). Dále byli identifikováni jako fytoplazma stolbur pozitivní i druhy Reptalus qiunque-costatus (Dufour), Dictyophara europaea (Linnaeus, 1767) /čelnatka řebříčková/ (Cvrković et al., 2011), Psammotettix alienus (Dahlbom, 1850) /křísek polní/, Anoplotettix fuscovenosus (Ferrari, 1882), Dryodurgades reticulatus (Herrich-Schäffer, 1834) (Riedle-Bauer et al., 2006), ale důkaz o tom že jsou vektoři fytoplazmy stolburu chybí. V České republice se z dalších vektorů fytoplazmy stolburu, kromě H. obsoletus, vyskytují i Reptalus panzeri (Löw, 1883) /žilnatka travní/, Euscelis incisus (Kirschbaum, 1858) /křísek obecný/, Macrosteles laevis (Ribaut, 1927) /křísek žlutošedý/, Macrosteles quadripunctulatus (Kirschbaum, 1868), Macrosteles cristatus (Ribaut, 1927), Macrosteles viridigriseus (Edwards, 1922), Speudotettix subfusculus (Fallén, 1806) /křísek hnědý/, Anoscopus albifrons (Linnaeus, 1758), Aphrodes bicinctus (Schrank, 1776) /mokřatka polní/ a ploštice rodu Lygus Hahn, 1833 /klopuška/ (Neklyudova et al., 1973; Orságová et al., 2011; Palermo et al., 2004). 24
4 Materiál a metody 4.1 Biologický materiál Vektoři a potenciální vektoři fytoplazmy stolburu Hyalesthes obsoletus Signoret, 1865; Adelphocoris lineolatus (Goeze, 1778); Agallia consobrina Curtis, 1833; Anaceratagallia ribauti (Ossiannilsson, 1938); Aphrodes bicintus (Schrank, 1776); Dicranotropis hamata (Boheman, 1847); Dictyophara europaea (Linnaeus, 1767); Empoasca sp., Hardya tenuis (Germar, 1821); Javesella pellucida (Fabricius, 1794); Laodelphax striatella (Fallén, 1826); Lygus rugulipennis Poppius, 1911; Trioza urticae (Linneaus, 1758), kteří byli odchytáváni v lokalitách Lednice, kravín (rumištní společenstvo s převahou kopřivy, v blízkosti opuštěné budovy kravína), Lednice, slunečnice (příkopy kolem silnice u slunečnicového pole, s převahou kopřiv), Březí a Perná (okraje vinic, s porostem kopřiv a svlačce). Odchyty byly prováděny v týdenních a 14-ti denních intervalech v období od června do srpna roku 2010. Jedinci byli dlouhodobě uchovávány v 70% etanolu v -20 C a průběžně determinovány dr. Pavlem Lautererem (Moravské muzeum v Brně). 4.2 Izolace D A Celková DNA byla z hmyzích vektorů izolována pomocí kitu Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) modifikovaným postupem výrobce. Jeden jedinec analyzovaného zástupce hmyzu byl umístěn do 1,5ml zkumavky. K němu byl přidán pufr Nuclei lysis solution a vzorek byl homogenizován rozdrcením pomocí mikrohomogenizátoru (P-Lab). Použité objemy reagencií pro izolaci DNA jsou uvedeny v Tab. 2. Lyzační směs byla inkubována 15 min při 65 C (přibližně po 7 min inkubace byla směs promíchána) a poté ponechána 5 min při pokojové teplotě. Následně byl k lyzátu přidán roztok RNase solution a směs byla promíchána převrácením zkumavky (25x) a stočena krátkým pulzem na stolní centrifuze. Směs byla inkubována 15 min při 37 C a po inkubaci ponechána 5 min při pokojové teplotě. Poté byl k lyzátu přidán roztok Protein Precipitation solution a směs byla 20 s vortexována při 1 600 rpm. Vzorky byly vychlazeny 5 min na ledu a následně stočeny 4 min při 13 000 rpm v centrifuze (Biofuge pico, Heraeus). Posléze byl 25
supernatant obsahující DNA přenesen do nových 1,5ml zkumavek, k němu byl přidán isopropanol, směs byla promíchána převrácením (5x) a inkubována při -20 C přes noc. Následující den byly vzorky s vysráženou DNA centrifugovány 1 min při 13 000 rpm při pokojové teplotě a supernatant byl opatrně odstraněn. K peletu bylo přidáno 200 µl 70% etanolu. Obsah zkumavek byl promíchán převrácením (1x) a centrifugován 1 min při 13 000 rpm při pokojové teplotě. Supernatant byl odstraněn a izolovaná DNA byla vysušena při 45 C 30 min v rotační vakuové odparce Speedvac (Thermo Savant). Poté byl k peletu přidán roztok Rehydratation solution a DNA byla rozpouštěna 10 min při 65 C a 300 rpm pomocí inkubační třepačky (Mixing Block MB-102, Bioer). Kvalita a koncentrace izolované DNA byla stanovena spektrofotometricky pomocí spektrofotometru NanoDrop1000 (Thermo Scientific) a izolovaná DNA byla uchovávána při -20 C. Tab.2: Objem reagencií použitých pro izolaci DNA Množství reagencie [µl] Velikost Nuclei lysis RNase Protein precipitation Rehydratation jedince solution solution solution Isopropanol solution <4,5 mm 100 2 34 100 20 >4,5 mm 200 3 67 200 50 4.3 Detekce fytoplazem 4.3.1 ested PCR Pro detekci fytoplazem ve vektorech byla použita metoda nested PCR s univerzálními primery, které amplifikují úseky genu pro 16S rdna. Nejprve byla připravena reakční směs pro direct PCR s použitím primerů P1 a P7, k reakční směsi byla přidána izolovaná DNA a byla provedena PCR amplifikace za podmínek specifických pro primery P1/P7. Následně byla připravena reakční směs pro nested PCR s použitím primerů R16F2/R16R2. Do této směsi byly jako templátová DNA přidány 40x ředěné odpovídající produkty direct PCR a byla provedena PCR amplifikace. Složení reakční směsi a specifické podmínky PCR amplifikace jsou shrnuty v Tab. 3-5. 26
Tab. 3: Složení reakční směsi pro direct a nested PCR Objem zásobního roztoku Položka 1 test Pufr (5x) 4 µl MgCl2 (25 mm) 1,2 µl Voda 11,1 µl dntp (2 mm) 1 µl f primer (20 pmol/ µl) 0,25 µl r primer (20 pmol/ µl) 0,25 µl Go Taq pol (5U/ µl ) 0,2 µl Objem směsi 18 µl Objem reakce 20 µl Vzorek 2 Vysvětlivky: f primer-p1 nebo R16F2, r primer-p7 nebo R16R2 Sekvence primerů P1 a P7 ( direct PCR) podle (Deng et Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995) P1 (5 - AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T - 3 ) P7( 5 - CGT CCT TCA TCG GCT CTT - 3 ) Velikost produktu: cca 1,8 kb (1865 bp) Sekvence primerů R16F2/R16R2 ( nested PCR) podle (Lee et al., 1993) R16F2 (5 - ACG ACT GCT AAG ACT GG - 3 ) R16R2 (5 - TGA CGG GCC GTG TGT ACA AAC CCC G - 3 ) Velikost produktu: cca 1,2 kp (1241 bp) Tab. 4: Teplotní podmínky a časový profil PCR amplifikace pro primery P1/P7 Teplota Doba Počet cyklů 95 C 2 min 1 95 C 1 min 55 C 1 min 35 72 C 3 min 72 C 10 min 1 Tab. 5: Teplotní podmínky a časový profil PCR amplifikace pro primery R16F2/R16R2 Teplota Doba Počet cyklů 95 C 2 min 1 95 C 1 min 50 C 1 min 35 72 C 1 min 72 C 10 min 1 27
4.3.2 Detekce PCR produktu Produkty R16F2/R16R2 ( nested PCR) byly detekovány a hodnoceny v 1% agarózovém TAE gelu. Zásobní roztok 1% agarózového gelu byl připraven smícháním 3 g agarózy (Agarose I, Amresco ), s 300 ml TAE (1x) pufru a následným rozvařením v mikrovlnné troubě. Roztok byl dlouhodobě uchováván při 4 C v chladničce. Elektroforetický gel byl připraven, po rozehřátí zásobního roztoku v mikrovlnné troubě, smícháním 50 ml 1% agarózy s 3 µl barviva GelRed (GelRed Nucleic Acid Gel Stain, Biotium). Gel byl nalit do vaničky o rozměru 10x10 cm a ponechán cca 60 min tuhnout při pokojové teplotě. Gel byl umístěn do elektroforetické komory a převrstven 1x TAE pufrem. Elektroforetický gel byl standardně pipetován podle schématu: do první jamky bylo naneseno 2 µl standardu molekulové hmotnosti (Gene Ruler 100bp Plus DNA Ladder, Fermentas), do dalších jamek pak 5 µl PCR produktu nested PCR. Elekroforetická separace probíhala cca 30 min při 80 V. Po skončení elektroforézy byly PCR produkty vizualizovány pomocí UV transluminátoru a dokumentovány pomocí programu GeneSnap a dokumentačního systému G:Box Syngene (Syngene). 4.4 Identifikace fytoplazem pomocí RFLP analýzy Produkty nested PCR byly podrobeny RFLP analýze s cílem identifikace detekovaných fytoplazem pomocí restrikčních endonukleáz RsaI a MseI. Nejprve byla připravena reakční směs (Tab. 6), k ní bylo přidáno 9 µl nested PCR amplikonu. Směs byla zakápnuta minerálním olejem a inkubována při 37 C po dobu 16 h (přes noc) v termobloku. Tab. 6: Rozpis reakční směsi pro RFLP analýzu Položka Množství na 1 test [µl] Pufr 1,25 BSA 10x 1,3 Voda 0,8 Restrikční endonukleáza 0,2 nested PCR produkt 9 28
Po inkubaci byly produkty RFLP analýzy separovány ve 2,5% agarózovém TBE gelu (MetaPhor Agarose, Lonza) s 3 µl barviva GelRed (GelRed Nucleic Acid Gel Stain, Biotium). Elektroforetický gel byl pipetován podle schématu: do první jamky bylo naneseno 2 µl standardu molekulové hmotnosti (Gene Ruler 100bp DNA Ladder, Fermentas), do druhé a třetí jamky bylo naneseno 5 µl pozitivní kontroly (AP, STOL) a do dalších jamek 5 µl RFLP produktů. Elektroforetická separace probíhala při 50 V po dobu cca 60 min a po skončení elektroforézy byly výsledky vizualizovány pomocí UV transluminátoru a dokumentovány pomocí programu GeneSnap a dokumentačního systému G:Box Syngene (Syngene). 4.5 Purifikace PCR produktu Specifita reakce a identita PCR produktů byla ověřena pomocí sekvenování. Seznam analyzovaných vzorků o různé specifitě z různých vektorů je uveden v tabulce (Tab. 7). Tab. 7: Vzorky vybrané pro sekvenační značení vektor lokalita hostitelská rostlina specifita produktu počet jedinců Hyalesthes obsoletus Lednice, kravín kopřiva Specifický 4 Hyalesthes obsoletus Perná kopřiva Specifický 2 Trioza urticae Perná svlačec Specifický 1 Trioza urticae Lednice, kravín kopřiva Specifický 6 Dicranotropis hamata Březí svlačec Nespecifický 2 Dicranotropis hamata Březí svlačec Specifický 8 Dicranotropis hamata Perná svlačec Specifický 2 Javesella pellucida Březí svlačec Specifický 4 Adelphocoris linoleatus Březí svlačec Specifický 1 Adelphocoris linoleatus Lednice, kravín kopřiva Specifický 3 Anaceratagallia ribauti Březí svlačec Specifický 1 Anaceratagallia ribauti Perná svlačec, kopřiva Specifický 2 Laodelphax striatella Perná svlačec Specifický 1 Laodelphax striatella Březí svlačec Specifický 2 Laodelphax striatella Perná svlačec Nespecifický 1 Aphrodes bicinctus Perná svlačec, kopřiva Specifický 2 Lygus rugulipennis Březí svlačec Specifický 1 Agalia consobrina Lednice, kravín kopřiva Specifický 1 29
4.5.1 Izolace PCR produktu z gelu PCR produkty určené pro sekvenování byly izolovány pomocí QIAquick Gel Extraction Kit podle protokolu výrobce (QIAquick Spin Handbook 07/2002; QIAGEN, Germany). Nejprve byl připraven 1% agarózový TAE gel smícháním 75 ml zásobního roztoku a 6 µl ethidium bromidu (10 mg/ml). Do první jamky ztuhlého gelu bylo naneseno 2 µl standardu molekulové hmotnosti (Gene Ruler 100bp Plus DNA Ladder, Fermentas) a do dalších jamek veškerý nested PCR produkt R16F2/R16R2. Následně byla provedena elektroforetická separace při 80V po dobu cca 45 min. Po skončení elektroforézy byl pod UV transluminátorem sterilním skalpelem vyříznut PCR produkt odpovídající velikosti (cca 1200 bp), přenesen do připravené a zvážené zkumavky a byla zjištěna jeho hmotnost. Ke gelu ve zkumavce byl přidán QG pufr odpovídající trojnásobku hmotnosti gelu (100 mg gelu ~ 100 µl pufru). Směs byla inkubována 10 min při 50 C v termo-bloku, dokud nedošlo k úplnému rozpuštění gelu. Během inkubace byla směs promíchávána na vortexu v intervalu 2-3 min. Po úplném rozpuštění gelu bylo zkontrolováno, zda barva směsi je žlutá a byl k ní přidán jeden objem izopropanolu (100 mg gelu ~ 100 µl izopropanolu) a směs byla promíchána na vortexu. Dále byla připravena kolonka pro izolaci DNA. Fialová QIAquick kolonka byla vložena do 2ml sběrné zkumavky a byl do ní napipetován celý objem směsi (maximálně však 700 µl). Kolonka byla centrifugována 1 min při 13 000 rpm. Obsah sběrné zkumavky byl vylit a kolonka byla vrácena do sběrné zkumavky. Do kolonky bylo přidáno 500 µl QG pufru, kolonka byla centrifugována 1 min při 13 000 rpm a opět byl vylit obsah ve sběrné zkumavce, tím došlo k odstranění zbytků agarózy. Kolonka byla vrácena do sběrné zkumavky a bylo do ní napipetováno 750 µl PE pufru. Kolonka byla centrifugována 1 min při 13 000 rpm, čímž došlo k promytí kolonky a obsah sběrné zkumavky byl vylit. Kolonka byla následně centrifugována 1 min při 13 000 rpm naprázdno a tím došlo k jejímu vysušení. Poté byla kolonka přenesena do čisté 1,5ml zkumavky. Pro eluci DNA bylo na střed kolonky napipetováno 50 µl destilované vody a centrifugováno 1 min při 13 000 rpm. Vyizolovaná DNA byla uchovávána při -20 C pro další zpracování. 30
4.6 Sekvenační značení Purifikované PCR produkty byly obousměrně sekvenovány specifickými primery R16F2/R16R2 pomocí BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems ) v celkovém objemu 10 µl podle modifikovaných pokynů výrobce (Tab. 8, 9) a analyzovány genetickým analyzátorem ABI PRISM 3730 na pracovišti ÚEB ČSAV, Olomouc. Pro sekvenační značení bylo použito 40 ng templátové DNA. Tab. 8: Rozpis reakční směsi pro sekvenační reakci Směs pro primer Položka R16F2/R16R2 Pufr 1 µl BigDye 1 µl Primer (1,6 pmol/µl) 2 µl Vzorek DNA 3 µl Voda 3 µl Objem reakce 10 µl Tab. 9: Teplotní podmínky a časový profil sekvenační reakce Teplota Doba Počet cyklů 96 C 1 min 1 96 C 10 sec 50 C 5 sec 35 60 C 4 min 10 C 10 min 1 4.7 Analýza sekvencí D A Obousměrné sekvence analyzovaných DNA fragmentů byly složeny do konečné sekvence ( contig ) za pomoci programu Seqman (DNASTAR, Lasergene). Jejich identita byla zjištěna porovnáním se známými sekvencemi dostupnými v databázi GenBank pomocí programu Blast (BLAST, http://www.ncbi.nih.gov/blast) nebo iphyclassifier (http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi) Získané R16F2/R2 sekvence jednotlivých izolátů byly seřazeny pomocí algoritmu Clustal, neúplné (krátké) sekvence byly z další analýzy vyřazeny a byla získána matice o délce 1131 bp. Genetická variabilita izolátů a jejich fylogenetické vztahy byly následně 31
analyzovány pomocí modelu Maximum Composite Likelihood a metody neighbor-joining analýzy programu Mega 5.0, bootstrap opakování 500x. Získaný fylogenetický strom byl vizualizován pomocí TreeExplorer (Mega 5.0) (Tamura et al., 2011). 4.8 Přístrojové vybavení laboratoře Mikrovlnná trouba Horizontální elektroforéza, Biometra Zdroj stejnosměrného proudu Power Pack P 25, Biometra Minicentrifuga SPECTRAFUGE MINI, Labnet International, Inc. Sterilní box TELSTAR PV-100, Telstar Termocyklér T-personal, Biometra Termoblok Dry-Block DB-20, Techne Nanodrop NANODROP 1000 SPECTROPHOTOMETER, Thermo Scientific Fluorometr Hoefer DyNA Quant 200 UV transluminátor G:BOX, Syngene UV transluminátor MACRO VUE UVis-20, Hoefer Váhy AND EK-200G, A&D Co. Ltd. Vortex MS1 MINISHAKER, IKA 32
5 Výsledky Přítomnost fytoplazmy stolburu v Hyalesthes obsoletus a dalších potenciálních vektorech vyskytujících se na lokalitách Lednice, kravín; Lednice, slunečnice; Perná a Březí byla detekována pomocí nested PCR. Z celkem analyzovaných 1344 jedinců bylo detekováno 684 jedinců pozitivních na přítomnost fytoplazmy. Žilnatka vironosná (Hyalesthes obsoletus, Signoret, 1865) Žilnatka vironosná, jako hlavní vektor fytoplazmy stolburu, se vyskytovala na všech uvedených lokalitách. Celkem bylo na čtyřech sledovaných lokalitách odchyceno a analyzováno pomocí nested PCR 688 jedinců, z nichž u 57 % jedinců byl detekován produkt amplifikace o očekávané velikosti a zjištěna přítomnost fytoplazmy na porostu s převahou kopřiv (Urtica dioica) (Obr. 4). Specifita produktu byla ověřena a identita fytoplazmy byla zjištěna u náhodně vybraných 14ti vzorků, které byly podrobeny RFLP analýze. Porovnáním získaných restrikčních spekter s kontrolními restrikčními spektry izolátů fytoplazmy žloutenky astry (AP) a fytoplazmy stolburu (Stol), bylo potvrzeno, že všechny analyzované PCR produkty odpovídaly fytoplazmě stolburu (Obr. 5). Byla studována i dynamika a infekčnost H. obsoletus na jednotlivých lokalitách. Největší počet jedinců byl odchycen na porostu s převahou kopřiv (Urtica dioica) na lokalitě Lednice, kravín, a to celkem 556 jedinců. Procento jedinců pozitivních na přítomnost fytoplazmy stolburu bylo v průměru 62 % a pohybovalo se v rozmezí od 0 % do 84 % v závislosti na datu odchytu. První záchyt H. obsoletus, kdy byli odchyceny pouze jednotlivé kusy samců a později i samic, byl pozorován ve třetí dekádě měsíce června. Na počátku července byl pozorován postupný nárůst počtu jedinců s kulminací v polovině července. Později došlo k postupnému úbytku H. obsoletus a poslední výskyt jedinců na lokalitě byl zaznamenán v polovině měsíce srpna, kdy bylo odchyceno jen několik kusů samic (Graf 1). Jedinci pozitivní na přítomnost fytoplazmy stolburu byli zjištěni už při prvních odchytech na konci června. Na počátku července se poměr pozitivních jedinců zvýšil na 40 % a v polovině července bylo procento pozitivních jedinců již 68 %, z nichž nejvíce pozitivní byly samice. Ke konci července bylo z odchycených jedinců zjištěno 82 % pozitivních na 33