Stanovení budivých návykových látek (amfetamin, efedrin, extáze) pomocí LC-MS, GC-MS a CE-MS Budivé aminy Budivé aminy patří mezi stimulační látky (stimulanty) zvyšující hladinu noradrenalinu, serotoninu, a dopaminu v mozku. Využívají se v léčbě poruchy pozornosti s hyperaktivitou [ADHD] zejména u dětí, dále při léčbě úrazů mozku, narkolepsie a chronického únavového syndromu. Původně se některé budivé aminy používaly i jako anorektikum k potlačení hladu a snížení tělesné hmotnosti. Budivé aminy patří mezi drogy. Drogy je možné definovat jako jakoukoli látku, která je-li vpravena do živého organismu, může pozměnit jednu nebo více jeho funkcí a vyvolat závislost. Kromě budivých aminů patří mezi stimulanty i např. kofein a thein, nikotin a kokain a částečně i extáze. Chemické struktury drog patřící do skupiny amfetaminů (fenetylaminy amfetaminového typu) a jejich prekurzorů jsou zobrazeny na obr. 1. Obr. 1: Struktury amfetaminů a jejich prekurzorů
Stimulační drogy mají obecně následující účinky na lidský organismus: 1) zvyšují vnitřní napětí a strach, vyvolávají úzkostné stavy a psychózy, 2) zvyšují riziko agresivního chování, 3) vedou ke změnám v chování (např. zvyšují sebevědomí, vedou k přeceňování vlastních schopností), 4) vysazení užívání budivých aminů vede ke spavosti, únavě, zvýšenému snění, dysforie a deprese, 5) jejich užívání vede ke vzniku psychické závislosti, fyzická závislost nevzniká. Amfetamin a methamfetamin Amfetamin (a-methylphenythylamin) a methamfetamin (N-methyl- a-methylphenetylamin). Jako volná báze je dostupný v kapalné formě. Nejčastěji je amfetamin distribuován jako síran, hydrochlorid nebo fosfát ve formě bílé až nažloutlé krystalické látky. Čistota distribuovaného amfetaminu v ilegálním pouličním prodeji bývá nejčastěji méně než 20 %. Kromě prášku bývá někdy amfetamin v podobě tablet. Syntéza amfetaminu a methamfetaminu Existuje mnoho metod syntézy amfetaminu. Nejjednodušší syntéza amfetaminu je Leuckartova syntéza. Kromě Leuckartovy syntézy existují například ještě Birchova metoda (využívaná nacisty za II. světové války a metoda využívající jodovodík. Obě syntetické cesty jsou zobrazeny na obr. 2. (I.) (II.)
(III.) Obr. 2: Reakční schémata vedoucí k syntéze methamfetaminu. (I.) Leuckartova syntéza, (II.) metoda využívající jodovodík, (III.) Birchova syntéza (převzato a upraveno z S. Bell: Forensic Chemistry) Amfetamin je nejčastěji ředěn kofeinem, aby byla maskována nízká koncentrace amfetaminu v dávce a ke zvýšení stimulačního účinku amfetaminu. Amfetamin i methamfetamin jsou navíc opticky aktivními sloučeninami a oba se vyskytují ve dvou optických izomerech L- a D-. D- enantiomery jsou mnohem více fyziologicky účinnější formy, ale jsou z organismu rychleji eliminovány než odpovídající L-isomery. Metabolismus amfetaminu a methamfetaminu Podstatná část aplikovaného metamfetaminu se vylučuje močí v nezměněné formě (cca 45% během 24 h po aplikaci). Vylučování je silně závislé na ph. V kyselé moči se v nezměněné formě vyloučí až 76%, zatímco v alkalické moči jsou to jen cca 2% aplikované dávky. Asi 15% dávky se v játrech metabolizuje hydroxylací na hydroxymetamfetamin. Přibližně 7% dávky se N-demethylací metabolizuje na amfetamin, ze kterého dále vznikají hydroxyamfetamin (2-4%) a norefedrin (2%) (z kterých vzniká hydroxynorefedrin (0,3%)) a konečně fenylaceton (0,9%) metabolizovaný dále na kyselinu benzoovou, resp. kyselinu hippurovou. Jeden z metabolitů, tj. amfetamin je aktivní, ale má slabší účinky než metamfetamin. Schématické znázornění metabolismu methamfetaminu a amfetaminu je na obr. 3 Obr. 3: Schématické znázornění metabolismu methamfetaminu a amfetaminu.
MDMA Methylendioxymethamfetamin (MDMA) patří mezi skupinu drog s budivými účinky obecně označována jako fenetylaminy. Kromě MDMA existuje ještě několik strukturně podobných látek s podobnými působením na lidský organismus (MDA - methylendioxyamfetamine, MDEA - methylendioxyethylamfetamin, MBDB - N-methyl-1-(1,3-benzodioxol-5-yl)-butanamin). MDMA je nejběžnější a nejčastější součástí tablet označovaných jako extáze (taneční droga). Tablety mají typický rozměr okolo 10 mm, jsou ploché eventuálně bikonvexní a váží obvykle v rozmezí 200 až 300 mg. Tablety mají vyraženou charakteristické logo, či strukturu. Charakteristický design tablet není ale vázán pouze na extázi, ale také na další drogy např. amfetamin. Logo na tabletách nevypovídá nic o obsahu a chemické struktuře drogy. Do dnešního dne byly zaznamenány stovky různých log na tabletách obsahující drogu. Jedna z mnoha možností jak mohou vypadat tablety obsahující extázi je zobrazena na obr. 4. Obr. 4: Příklad tablety obsahující MDMA. Hlavní farmakologický účinek MDMA je zvýšení sekrece a inhibice vychytávání serotoninu, dopaminu a norepinefrinu v mozku. MDMA způsobuje euforii, zvýšenou empatii pocit zvýšení energie v organismu a také prohloubení hmatových vjemů. Často je také užití MDMA spojeno přechodně s hypertenzí, hypertermií a dehyratací, zatímco dlouhodobé působení vede k depresi díky snížené produkci serotoninu v CNS. Syntéza MDMA Několik syntetických metod bylo popsáno, přičemž nejznámější je uvedena na následujícím reakčním schématu (obr. 5) Obr. 5: Reakční schéma syntézy MDMA. Identifikace reakčních meziproduktů a vedlejších produktů syntézy umožňuje provést identifikaci konkrétní syntetické cesty a tím i odhalit původ zachycených drog.
Průkaz MDMA barevnou reakcí Marquisovo činidlo poskytuje temně modré zbrarvený s MDMA. Reakce není specifická s Marquisovým činidlem reagují i další léčíva či drogy (např. fenothiaziny, betablokátory a alkaloidy). Marquisovo činidlo: K 5 ml 37-40% roztoku formaldehydu se opatrně přidá 100 ml koncentrované kyseliny sírové (18 M). Analýza budivých aminů chromatografickými metodami Pro rozlišení a identifikaci jednotlivých budivých aminů v biologickém materiálu případně v materiálech zadržených v sítích nelegální distribuce jsou nejvhodnější chromatografické metody (GC, LC), případě kapilární elektroforéza (CE). Zejména v případě analýzy biologického materiálu je nutné provést úpravu a extrakci budivých aminů. Budivé aminy v lidském organismu podléhají jen velmi minimálně konjugaci a není tedy nutná hydrolýza metabolitů (konjugátů) před vlastní extrakcí. Jako extrakční metody se nejčastěji používá extrakce z kapaliny do kapaliny (L-L) extrakce a extrakce pevnou fází (SPE) extrakce. V případě následné analýzy budivých aminů pomocí GC je nutné aminy derivatizovat, zatímco derivatizace aminů pro LC není nutná. V mnoha případech se ale derivatizace budivých aminů provádí i před LC analýzou, a to zejména pro zlepšení retence. Derivatizace není nutná v případě následné analýzy pomocí CE. Derivatizace amfetaminů pro GC V případě GC dochází velmi často k rozmývání a deformacím píků ( tzv. tailing ) budivých aminů a derivatizace se tedy provádí za účelem zlepšení tvaru píků a snížení nežádoucí sorpce analytů na stacionární fázi. Derivatizací amfetaminů před GC analýzou navíc dojde ke zvýšení selektivity stanovení a snížení vlivu nežádoucích interferentů. Derivatizace může být prováděna jako achirální či chirální. Derivatizace achirálními derivatizačními činidly je využívána častěji a hlavně v případech, kdy není nutná separace jednotlivých optických izomerů budivých aminů. V případě, že je studován i poměr jednotlivých enantiomerů budivých aminů ve vzorku provádí se derivatizace chirálními derivatizačními činidly. Další výhodou derivatizace může být zvýšení citlivosti a selektivity hmotnostně spektrometrické detekce. Samotné budivé aminy neposkytují příliš velkou citlivost při hmotnostně spektrometrické detekci s pomocí ionizace elektronem. Vnesením elektronegativního zbytku do molekuly budivých aminů se výrazně zvýší účinnost ionizace a tím i citlivost detekce oproti nederivatizovaným analytům. Navíc MS spektra derivátů budivých aminů jsou mnohem unikátnější než MS spektra nederivatizovaných aminů, které obsahují nespecifické fragmenty a jejich identifikace je velmi složitá. Stejné nespecifické fragmenty se běžně vyskytují i v MS spektrech biologických vzorků, ve kterých budivé aminy nejsou přítomny. Nejčastější derivatizační reakce pro derivatizaci budivých aminů zahrnují silylaci, acylaci a alkylaci. Jako derivatizační činidla se využívají anhydrid trifluoroctové kyseliny (TFA), anhydrid kyseliny pentafluorpropionové (PFPA), anhydrid kyseliny heptafluoromáselné (HFBA) a dále perflourooktanoylchlorid, carbethoxyhexafluorobutyrylchlorid (CB) a N-methyl-N-t-butyldimethylsilyltrifluoroacetamid (MTBSTFA). Pro chirální derivatizaci jsou využívány trifluoroacetyl-l-prolylchlorid (L-TPC), pentafluoropropionyl-l-prolylchloride (L-PPC) a heptafluorobutyryl-l-prolylchlorid (L-HPC). Reakční schéma acetylace amfetaminů je na obr. 6. Kromě spojení GC-MS se pro detekci derivátů budivých aminů využívají ještě plamenově-ionizační detekce (FID), dusíkový-fosforový detektor (NPD), a detektor elektronového záchytu (ECD).
Obr. 6: Příklad acetylace amfetaminů a jeho derivátů. Derivatizace amfetaminů pro LC Retenční chování budivých aminů v LC je obecně lepší než v případě GC analýz. Nicméně i zde je derivatizace prováděna pro zlepšení retenční vlastností a zvýšení citlivosti detekce. Například amfetamin absorbuje UV záření, ale jeho molární dekadický absorpční koeficient je nízký. Vnesením dalšího chromoforu do molekuly budivého aminu tak dojde ke zvýšení absorpce UV záření a tím i citlivosti detekce. Některé derivatizační činidla navíc umožňují uskutečnit citlivou fluorescenční detekci, či elektrochemickou detekci. Jako derivatizační činidla se pro LC používají 3,5-dinitrobenzylchlorid (DNB), fenylisothiokyanát, 4-(N,N-dimethylaminosulphonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazol (DBD-F), fluorosceinisothiokyanát, 1,2-naftochinon-4-sulfonát, fluorenylmethylchloroformiát (FMOC-Cl) a dansyl chlorid. Pro chirální derivatizaci se využívá Marfyho činidla (1-fluoro-2,4-dinitrofenyl-5-L-anilinamid) a dále (-)-1-(9-fluorenyl)ethylchloroformiát (FLEC) a fluorenylmethylchloroformiát-l-prolyl chlorid (FMOC). L-L extrakce budivých aminů L-L představuje nejjednodušší způsob extrakce budivých aminů z biologického materiálu. Budivé aminy mají pk okolo 10. Jde o bazické sloučeniny, které do organického rozpouštědla z vodné fáze budou přecházet z bazického ph. Spolu s bazickými sloučeninami dojde i k extrakci neutrálních látek, takže se extrakt většinou přečištuje reextrakcí do vodné fáze a nakonec zpět do organické fáze. Jako činidlo pro úpravu ph vodných vzorků před extrakcí do organického činidla se nejčastěji používá NaOH. Úkol: Proveďte izolaci amfetaminů z předloženého vzorku moči a identifikujte jednotlivé budivé aminy ve vzorku a proveďte jejich stanovení. Chemikálie: standardní roztoky methamfetaminu, amfetaminu a efedrinu o koncentraci 10 mg/l ve vodě, 50% (w/v) roztok NaOH, 1-chlorobutan, zředěná kyselina sírová (1:1), deionizovaná voda, anhydrid kyseliny heptafluoromáselné, methanol. Pomůcky: mikrozkumavky, vialky pro GC, LC a CE, ultrazvuk, kádinky, odměrný válec, termovap pro odpařování pod proudem dusíku, SPE manifold, SPE kolonky BondElut RP/katex. Postup práce: L-L Extrakce a) Ke 2 ml vzorku ve zkumavce se přidá 50% (w/v) roztok NaOH, výsledné ph musí být okolo 10. b) Ke vzorku se dále přidá 5 ml 1-chlorobutanu a 5 minut se protřepává. Po ustavní rovnováhy se organická fáze přenese do čisté další zkumavky.
c) K organické fázi v čisté zkumavce se přidá zředěná kyselina sírová (5 ml) a zkumavka se opět uzavře a 5 min protřepe. d) Vodná fáze po reextrakci se přenese do další čisté zkumavky a budivé aminy se znovu extrahují do 5 ml 1-chlorobutanu. Organická fáze po extrakci se přenese do čisté zkumavky a nechá se za laboratorní teploty odpařit pod proudem dusíku. e) Extrakt se derivatizuje pomocí HFBA pro případ analýzy vzorku pomocí GC-MS. f) Pro analýzu s pomocí CE a LC se vzorek nederivatizuje. Odpařený extrakce se rekonstituje ve 200 ml methanolu a dávkuje do kapalinového chromatografu či do kapilární elektroforézy. SPE extrakce K vlastní SPE extrakci se využije SPE kolonek obsahující směs katexu a reverzní fáze (SPE BondElute Certify RP/Katex). Návod k SPE extraktoru je přiložen níže. 1. Tři kolonky SPE umístěte do SPE extraktoru a proveďte jejich postupnou kondicionaci. Nejprve kolonky kondicionujte s pomocí 2 ml methanolu a dále s pomocí pufru 2 ml 100 mm fosfátu sodného ph 6,0. 2. Následně na kolonky naneste 5 ml vzorku moči, a 5 ml směsi standardů amfetaminu a methamfetaminu a blank (deionizovaná voda) a kolonky opět promyjte 2 ml 100 mm fosfátu sodného ph 6,0. 3. Následně všechny 3 kolonky promyjte 2 ml 1 M kyseliny octové a kolonky proudem dusíku vysušte a kolonky promyjte 6 ml methanolu. 4. Proveďte eluci zachycených analytů s pomocí 2 ml směsi dichlormethan/isopropanol/hydroxid amonný (78/20/2). 5. Eluované vzorky odpařte do sucha pod proudem dusíku, extrakt rekonstitujte v 50 ml mobilní fáze případně pufru pro CE a analyzujte. Vlastní analýza a) Pod vedením vedoucího cvičení postupně proměřte extrakt po derivatizaci na GC-MS a extrakty bez derivatizace s pomocí LC-ESI-MS a CE-ESI-MS. Podmínky analýz 1. GC Kolona: 100% methyl polysiloxane, 12.5 m 0.2 mm I.D., 0.33 µm, teplotní program: oven: 60 C (1 min) to 140 C (4 min) at 30 C/min, then to 276 C at 20 C/min, 4 min. 2. LC Kolona: Discovery HS F5, 5 cm x 2.1 mm I.D., 3 µm, mobile phase: [A] 0.1% ammonium acetát ve vodě; [B] 0.1% ammonium acetát v acetonitrilu; [C] acetonitril; (10:30:60, A:B:C), průtok mobilní fáze 2 ml/min, teplota kolony 35 C, MS ionizace v kladném modu, injekce vzorku 5 ml. 3. CE Kapilára: nepokrytá křemenná kapilára, 60 cm celková délka, pracovní elektrolyt 50 mm acetát amonný ph 4.5, U = + 20 kv, injekce vzorku 100 mbar/10s. Složení pomocné kapaliny 50:49.5:0.5 (%, v/v) MeOH:H 2 O:HCOOH, průtok pomocné kapaliny 4 ml/min. MS ionizace v kladném modu.
Návod k obsluze SPE extraktor (membránové čerpadlo M 401 a Manifold SPE Supelco) Membránové čerpadlo M 401 Membránové čerpadlo slouží k vytvoření potřebného vakua v SPE manifoldu, tak aby mohla být provedena kondicionace SPE patrony, samotný proces extrakce analytů a následně jejich eluce. 1. Membránové čerpadlo (MČ) se uvede do provozu zastrčením přívodního kabelu do zástrčky elektrické sítě. MČ nemá samostatný vypínač. Zároveň je potřebné zkontrolovat, zdali je připojena gumová hadice vedoucí od MČ na výstupu zajišťující vakuum. Příslušný výstup je označen jako VAKUUM. 2. Na ventilu manometru SPE manifoldu se povolí bílý plastový ventil na maximum. 3. Druhý konec gumové hadice se připojí na vstup SPE manifoldu. Samotná regulace vakua probíhá na regulátoru vakua na SPE manifoldu a s pomocí ventilů pro jednotlivé SPE kolonky na horním víku manifoldu. SPE Manifold SPE manifold slouží k uskutečnění vlastní SPE extrakce 1. Do vnitřního prostoru manifoldu se umístí příslušná nádobka (odpadní nádobky, či nádobky na záchyt eluátu). A manifold se uzavře víkem. 2. Zkontrolovat, zdali jsou všechny ventily pro SPE kolonky (hnědé ferulky na horní desce manifoldu) uzavřeny (ferulky se utáhnou ve směru hodinový ručiček). 3. Do těchto ventilů se umístí SPE patrony pro extrakci. 4. Potřebné vakuum pro kondicionaci, nanášení vzorků, promývání SPE kolonek a eluci vzorku se nastaví na hlavním regulátoru vakua (bílý plastový ventil) na manometru manifoldu, přičemž velikost vakua musí být vždy nižší, než 20 mm Hg sloupce (červená stupnice manometru) 5. Pro kondicionaci, promývání, nanášení vzorku a eluci, se míra vakua adjustuje pomalým pootevřením ventilů (hnědé ferulky se povolí proti směru hodinových ručiček) pro příslušnou SPE kolonku. Opětovně je možné vakuum pro danou SPE kolonku zastavit utáhnutím příslušného ventilu (hnědé ferulky ve směru hodinových ručiček). Ukončení práce na SPE extraktoru Vytáhnutí přívodního kabelu MČ z elektrické sítě se přeruší tvorba vakuu v SPE manifoldu. Je možné ho případně vyčistit. Použitá literature: 1. S. Bell, Forensic Chemistry, Prentice Hall, 2 nd edition, 2012 2. D.G. Barceloux, Medical Toxicology of Drug Abuse, Wiley, 2012 3. B. Levine ed., Principles of Forensic Toxicology, AACCPress, 4 edition, 2013 4. W.R. Kuelpmann ed., Clinical Toxicology Analysis Vol.1,2, Wiley 2009. 5. J. Bogusz: Forensic Science, Wiley, 2000. Doplňující otázky: 1. Jaké jiné analytické techniky by bylo možné využít pro detekci amfetaminů a jejich metabolitů v moči a krvi? 2. Navrhněte fragmentační cestu pro EI-MS amfetaminu.