Název práce: Zkouška disoluce pevných lékových forem Vedoucí práce: Doc. Ing. Petr Zámostný, Ph.D. Jméno zástupce: Ing. Jan Patera Umístění práce: S25b Úvod Uvolňování léčiva z tuhých perorálních lékových forem se zkouší in vitro disolučním testem. Požadavky na aparaturu, provádění a vyhodnocování výsledků disolučního testu jsou přesně uvedeny v českém, evropském i americkém lékopise a v dalších publikacích. Každý lék musí splnit během disoluční zkoušky dané limity. Obecně lze léky ze skupiny tuhých perorálních lékových forem vyskytujících se v současné době na farmaceutickém trhu rozdělit na lékové formy bez úpravy uvolňování léčiva a s modifikovaným uvolňováním léčiva. Lékové formy první skupiny musí splnit pouze jednu podmínku: uvolnit minimální předepsané množství léčiva v požadovaném časovém intervalu. Lékové formy s modifikovaným uvolňováním účinné látky musí splnit minimálně 2 limity, jako je tomu u lékových forem se zpožděným uvolňováním (např. u léků s acidorezistentním obalem) nebo se u nich hodnotí celá disoluční křivka. Rychlost disoluce je ovlivněna nejenom chemickými a fyzikálními vlastnostmi účinné látky, ale i použitými excipienty a výrobním procesem. Náplň práce Náplní této práce je provedení zkoušky disoluce tablet obsahujících ibuprofen. Zkouška se provede v prostředí napodobujícím prostředí v žaludku (ph = 1,2) a v prostředí se zvýšeným ph = 7,2 simulujícím další části trávicího traktu. Úkoly 1. Proveďte zkoušku disoluce zadané lékové formy ibuprofenu v disolučních médiích A a B. Body disolučního profilu měřte v časech 5, 15, 30, 45, 60 minut. Zkoušku provádějte jednou pro každé médium, vždy paralelně v šesti disolučních nádobách. Pro obě zkoušky použijte vždy dvě trojice tablet přípravků různých výrobců (APO Ibuprofen, Ibalgin) 2. Sledujte vizuálně průběh zkoušky (rozpad tablet, tvorba bublin, vzhled lázně) 3. Zkonstruujte disoluční profily všech vzorků. Diskutujte vliv ph prostředí na uvolňování účinné látky. 4. Diskutujte rozdíly mezi oběma přípravky. 1
Přístrojové vybavení Disoluční aparatura Zkouška disoluce se v rámci této práce bude provádět v disolučním přístroji Sotax AT7-smart v uspořádání s pádly. Tento přístroj umožňuje provádět disoluční test paralelně v šesti disolučních nádobách (+ 1 nádoba pro slepý pokus či placebo). Přístroj je vybaven polykarbonátovými disolučními nádobami o využitelném objemu 1000 ml, míchané pádélkovými míchadly a temperované ve společné vodní lázni. Pozor! - Při práci s přístrojem smí jeho komponenty včetně disolučních nádob přijít do styku pouze s vodou a disolučním médiem. V žádném případě nesmí být vystaven působení organických rozpouštědel, včetně zředěného ethanolu, neboť hrozí znehodnocení polykarbonátových částí. Spektrofotometr UVmini-1240 Spektrofotometr UVmini-1240 je konstruován jako jednopaprskový a měří pouze vystupující tok záření. Proto je tedy třeba provést dvě měření: vedle měření vzorku ještě srovnávací pokus, kdy nedochází k absorpci. U reálného vzorku vedle stanovované látky absorbuje i rozpouštědlo, případně činidla obsažená ve vzorku. Proto se při srovnávacím pokusu měří absorbance čistého rozpouštědla, ovšem bez přítomnosti stanovované látky, tj. provede se tzv. slepý pokus. Chemikálie Seznam potřebných chemikálií kyselina chlorovodíková, 36 % hmot. a hustotě 1,18 g cm -3 KH 2PO 4 NaOH demineralizovaná voda ibuprofen, analytický standard Seznam vzorků APO Ibuprofen tablety 400 mg Ibalgin tablety 400 mg Disoluční média Disoluční média musí být zbavena rozpuštěného vzduchu. Toho se docílí převařením vody použité k přípravě média. Objem všech médií je 1000 ml, měří se v odměrném válci před převařením. 2
Disoluční médium A se upraví přídavkem 6,8 g KH 2PO 4 a 0,9 g NaOH. Výsledný roztok má ph asi 7,2 a značnou iontovou sílu a tlumivou kapacitu. Disoluční médium B se upraví na ph = 1,2 přídavkem HCl 36 %, hustota 1,18 g.cm -3. Srovnávací médium v sedmé nádobě je tvořeno nepřevařenou vodou. Slouží k pozorování vlivu deaerace (převaření) na tvorbu bublin. Kalibrační roztoky Kalibrační roztoky je třeba připravit tak, aby pokrývaly rozsah měřených koncentrací. Maximální koncentrace, která se může vyskytnout při disolučním testu může být 400 mg/l. Kalibrační roztoky by proto měly obsahovat následující koncentrace API: K1... 100 mg/l K2... 300 mg/l K3... 500 mg/l Postup přípravy kalibračních roztoků je následující: 1. Navažte potřebné množství analytického standardu ibuprofenu do odměrných baňek 50 ml, naplňte disolučním médiem do cca 2/3, promíchejte krouživými pohyby a vložte na 15 minut do ultrazvukové lázně. 2. Doplňte baňky disolučním médiem po rysku, uzavřete a promíchejte 3. Ověřte, zda došlo k úplnému rozpuštění látky 4. Kalibrační roztoky je třeba připravit pro obě disoluční média. Pracovní postup disoluční zkoušky Příprava disolučního média a disolučního přístroje 1. Disoluční média připravte odměřením potřebného objemu demineralizované vody odměrným válcem přímo do disoluční nádoby a odpipetováním příslušného množství koncentrované HCl stanoveného výpočtem. Objem disolučního média v každé nádobě by měl být 1000 ml ± 10 ml. 2. Nádobu s disolučním médiem ponořte do vodní lázně disolučního přístroje a zajistěte v ponořené poloze trojicí plastových otočných držáků. 3. Postupně takto umístěte všech sedm disolučních nádob. Přístroj musí být vždy plně obsazen disolučními nádobami. Nejsou-li všechny potřeba pro experiment, je možné nepoužité nádoby naplnit obyčejnou vodou. 3
4. Uzavřete opatrně víko disolučního přístroje. Postupujte velmi opatrně, aby nedošlo k poškození disoluční nádoby míchadlem. 5. Vsuňte teplotní čidlo do lázně otvorem ve víku tak, jak je naznačeno na obrázku. 6. Zapněte disoluční přístroj hlavním vypínačem, umístěným na zadní straně přístroje v blízkosti síťového kabelu. 7. Spusťte termostat a míchadlo tlačítky (viz obrázek níže) na panelu disolučního přístroje. Lázeň a disoluční nádoby se nyní budou temperovat na teplotu zkoušky (37 C), což nějakou dobu potrvá (mezitím je možno zadat do přístroje disoluční metodu a vytvořit kalibrační závislost pro spektrofotometrickou analýzu). Specifikace disoluční metody Disoluční metoda představuje soubor parametrů, které přesně definují průběh disoluční zkoušky. Metoda se zadává přes tlačítkový panel disolučního přístroje. 1. Zadávání metody je možné po stisknutí tlačítka se symbolem knihy 4
2. Volby menu se uskutečňují přes odpovídající F-tlačítka Pro vytvoření nové metody je třeba zvolit možnost Edit Method (F2). 3. Následující dialog umožňuje nastavení základních parametrů Mezi jednotlivými položkami se přechází šipkami. Číselné hodnoty je možno změnit zadáním čísla z klávesnice a jeho potvrzením tlačítkem Textové hodnoty představují vždy výběr z několika možností, které se přepínají opakovaným tisknutím tlačítka Je třeba nastavit následující hodnoty: teplota 37 C, otáčky míchadla 75 ot.min -1, pádélková metoda (Paddle), manuální režim odběru vzorků, manuální vkládání tablet a prodlevu mezi jednotlivými tabletami (Stagger) na 30 sekund. Poté se volbou Next (F4) přejde na další parametry. 5
4. Další dialog je určen k nastavení intervalů odběru vzorků Je nezbytné vyplnit první dva sloupce, další nejsou pro manuální uspořádání podstatné. Hodnota v prvním sloupci (rd.) určuje počet odběrů v časovém intervalu uvedeném ve druhém sloupci (Time min.). Řádky se zpracovávají postupně. Ukázka na výše uvedeném obrázku specifikuje odběry tří vzorků v pětiminutových intervalech, poté jednoho vzorku po deseti minutách, pak po dalších 15 minutách a nakonec trojice vzorků ve dvacetiminutových intervalech. Časy odběrů jednotlivých vzorků od počátku experimentu tedy budou 5, 10, 15, 25, 40, 60, 80, 100 minut. Po stisknutí povelu Next je možné v zadávání časového programu pokračovat na další stránce. Poté se volbou Next (F4) přejde na uložení metody. 5. Uložení metody se specifikuje v následujícím dialogu Šipkami je třeba vybrat libovolnou z pozic 0-9, vepsat číselné pojmenování metody a 6
potvrdit klávesou ENTER. Případně může být nutné potvrdit přepsání existující metody v níže zobrazeném dialogu. 6. Poté ověřte, že zadané jméno metody je zobrazeno v pravé části displeje a pokračujte spuštěním metody povelem Start, který potvrdíte i v následujícím dialogu. 7. Není-li přístroj dosud vytemperován, objeví se upozornění Po vytemperování se zobrazí výzva ke skutečnému zahájení metody Disoluční zkouška Tato část práce je velmi náročná na rychlé a správné provedení potřebných úkonů. Doporučuje se proto zkusit si vložení tablet a odběr první série naslepo. Disoluční zkouška se provádí ve více nádobách najednou. Protože není možné odebírat současně více vzorků, pracuje se s prodlevou několika desítek sekund (nastavenou v metodě pod položkou Stagger) mezi jednotlivými nádobami. V tomto režimu práce se při spuštění experimentu vkládá vzorek pouze do první nádoby, do dalších nádob se vkládá až po uplynutí 7
prodlevy. Disoluční přístroj zobrazuje na displeji pokyn k další akci a odpočítává zbývající čas do jejího provedení. 1. Vkládání tablet se provádí tak, že se tableta s předstihem připraví do barevně označeného dávkovacího otvoru a v určený čas se uvolní stiskem táhla na pravém okraji víka přístroje. 2. V určených časech odebírejte vzorky asi 10 ml pipetou do centrifugačních zkumavek. Vzorky co nejdříve odstřeďte při 6000 ot./min, 8 min. 3. Po odstředění opatrně slijte asi ¾ centrifugátu do kádinky. Zkumavku nepřevracejte, aby nedošlo ke zvíření sedimentu. 4. Změřte absorbanci vzorků při vlnové délce absorpčního maxima (viz dále). Spektrofotometrické stanovení obsahu účinné látky Před započetím analýzy vzorků je třeba určit analytické podmínky a vytvořit kalibrační vztah mezi absorbancí a koncentrací. K analýze použijte UV spektrofotometr Shimadzu UVmini 1240. Vzorky je třeba analyzovat v křemenných kyvetách. Kyvety se umisťují do prostoru vzorku v levé části přístroje po otevření víka. Paprsek při čelním pohledu na přístroj prochází zprava doleva, a proto i čirá okénka kyvet musí být orientována v tomto směru. Po vložení kyvety do prostoru vzorku je třeba vždy víko uzavřít a teprve poté provádět měření. Zapnutí přístroje Uvedení přístroje do provozního režimu trvá několik minut, a proto jej proveďte v předstihu. 1. Před zapnutím přístroje vložte do prostoru vzorku kyvetu naplněnou cca 0,5 cm pod okraj demineralizovanou vodou. Pokud se vlhkost nebo nečistoty dostanou na vnější povrch kyvety, je třeba je otřít buničitou vatou a důkladně očistit okénka kyvety. 8
2. Přístroj zapněte síťovým vypínačem na zadní straně Poté nechte přístroj po nějakou dobu zinicializovat. 3. Přístroj je připraven k měření, pokud je na displeji zobrazeno řídící menu Zjištění analytických podmínek a kalibrace 1. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu 2 pro volbu Spectrum. 2. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu 2 pro volbu λ range. Zadejte číselný rozsah od 340 do 250 nm. Jednotlivé vlnové délky potvrďte klávesou ENTER. 3. Vložte do prostoru vzorku kyvetu naplněnou kalibračním roztokem K4 9
4. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu START. Dojde ke změření UV spektra roztoku. 5. Je-li na spektru maximum s absorbancí menší než cca 2, je možné pro měření zvolit vlnovou délku tohoto maxima. Pokud je maximum větší, nebo nelze identifikovat, je roztok příliš koncentrovaný (neplatí Lambert-Beerův zákon) a je nutné provádět měření mimo maximum. Vyberte proto vhodnou vlnovou délku tak, aby absorbance roztoku K4 byla v rozmezí 1 2. Tuto vlnovou délku si poznamenejte. 6. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte opakovaně klávesu RETURN k návratu do hlavního menu. V případě dotazu potvrďte smazání naměřeného spektra OK. 7. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu 1 pro volbu Photometric. 8. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu Go to WL a poté zadejte zvolenou vlnovou délku pro měření. Tato vlnová délka by se měla zobrazit v horní části displeje. 9. Vložte do prostoru vzorku kyvetu naplněnou demineralizovanou vodou. 10. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu Autozero. Absorbance indikovaná ve spodní části displeje by se měla nastavit na nulu. 11. Vložte do prostoru vzorku kyvetu naplněnou kalibračním roztokem K1. 12. Zaznamenejte si hodnotu absorbance tohoto roztoku A K1. 13. Kroky 11 a 12 opakujte pro roztoky K2 K3. 14. Z naměřených absorbancí A K1 A K3 zkonstruujte kalibrační závislost koncentrace na absorbanci. 15. Kalibrační závislost proložte přímkou, zhodnoťte její linearitu a zapište kalibrační rovnici ve tvaru c = k 1 * A + k 2. 10
Stanovení obsahu ibuprofenu ve vzorcích 1. Vzorkem odebraným při disoluční zkoušce naplňte kyvetu. Objem vzorku, který máte k dispozici (zhruba 10 15 ml) využijte na nejméně dvojnásobné vypláchnutí kyvety malým objemem a její naplnění zhruba 0,5 cm pod horní okraj. 2. Vložte kyvetu do spektroforometru a odečtěte absorbanci při vlnové délce, pro kterou jste provedli kalibraci. 3. Z kalibrační rovnice vypočtěte koncentraci kyseliny askorbové v neznámém vzorku (která je rovná koncentraci účinné látky v disoluční nádobě rozpuštěné v okamžiku odběru vzorku. 11