Antioxidační ochrana. Stárnutí. Antioxidanty v potravě MUDr. Jan Pláteník, PhD Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1.LF UK Ionizační záření: Hydroxylový radikál vzniká ionizací vody: H 2 O + hν H + OH Reaktivní formy kyslíku v organismu: Jednoelektronovou redukcí kyslíku (mitochondrie, NADPH oxidasa) vzniká superoxid O 2 Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodíku: O 2 + O 2 + 2 H + O 2 + H 2 O 2 Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvoří z peroxidu hydroxylový radikál: H 2 O 2 + Fe 2+ OH + OH + Fe 3+ 1
Oxidační stres Hladina reaktivních forem kyslíku je udržována v určitých mezích mechanismy antioxidační ochrany Oxidační stres nastává při vychýlení této rovnováhy směrem k oxidaci Antioxidační ochrana prevence tvorby ROS/RNS (regulace produkujících enzymů, sekvestrace přechodných kovů) vychytávání, lapání a zhášení radikálů reparační systémy (fosfolipasy, proteasom, enzymy opravující DNA) 2
Antioxidant v chemii potravin Redukčníčinidlo schopné zastavit řetězovou reakci lipoperoxidace chain-breaking... Např.: Butylovaný hydroxytoluen (BHT) Butylovaný hydroxyanisol (BHA) Tokoferol (Vitamín E) Antioxidační ochrana lidského těla Anatomické uspořádání regulující hladinu kyslíku ve tkáních Antioxidační enzymy Sekvestrace redoxně aktivních kovů Antioxidační substráty Stresová reakce (Reparace oxidačního poškození DNA, proteinů a lipidů) 3
O 2 První organismus (anaerobní)? Vyvinout antioxidační ochranu? Vyhynout? Uchýlit se do anaerobních podmínek? Shluknout se! O 2 O 2 4
Antioxidační ochrana I Regulace O 2 ve tkáních Vdechovaný vzduch: 160 mmhg O 2 Plicní kapiláry: 100 mmhg O 2 Arteriální krev: 85 mmhg O 2 Arterioly: 70 mmhg O 2 Kapiláry: 50 mmhg O 2 Buňky: 1-10 mmhg O 2 Mitochondrie: < 0,5 mmhg O 2 Obr: Wikipedie Mitochondrie jsou původně fagocytované/parazitující bakterie... 5
Antioxidační ochrana II Antioxidační enzymy Superoxiddismutasa: O 2 + O 2 + 2 H + O 2 + H 2 O 2 Katalasa: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Glutathionperoxidasa, peroxiredoxin: H 2 O 2 + 2 R-SH 2 H 2 O + RS-SR Superoxiddismutasa (SOD) Katalyzuje dismutaci superoxidu: O 2 + O 2 + 2 H + O 2 + H 2 O 2 Naprosto nezbytná pro život s kyslíkem SOD1: Cu+Zn (cytosol) SOD2: Mn (mitochondriální matrix) Fe (prokaryotická) EC-SOD: extracelulární, Cu+Zn, MW 135000, vazba na heparansulfát na povrchu cévního lumen 6
Glutathionperoxidasy (GPX) Redukce peroxidů spojená s oxidací glutathionu: 2 GSH + H 2 O 2 GS-SG + 2 H 2 O (glutathion je následně regenerován glutathionreduktasami) Obsahují selenocystein v aktivním místě Cytosolová glutathionperoxidasa: redukuje H 2 O 2 a LOOH po uvolnění z fosfolipidů Fosfolipidhydroperoxid-GSH-peroxidasa: redukuje LOOH i v membránách Glutathion (GSH/GSSG) tripeptid, v každé buňce 1-10 mm udržuje redukční prostředí ICT substrát pro GPX, GST neenzymové reakce s ROS... produkty oxidace GSH jsou toxické pro buňku při oxidačním stresu export GSSG z buňky 7
Katalasa Tetramer, každá podjednotka obsahuje hem s Fe Dismutace peroxidu vodíku: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Peroxisomy, erytrocyty Též peroxidasová aktivita: H 2 O 2 + ROOH H 2 O + ROH + O 2 (ve srovnání s GPX nevýznamná) Oxidace dlouhých mastných kyselin v peroxisomech: 8
O 2 Superoxiddismutasa H 2 O 2 H 2 O Glutathion peroxidasa GSH GS-SG Oxidovaný glutathion (GS-SG) Glutathion reduktasa NADP + Transhydrogenasa NAD + Redukovaný glutathion (GSH) NADPH+H + NADH+H + Pentosový cyklus ATP Základní systém pro odstraňování peroxidu vodíku v lidském těle není glutathionperoxidasa, ale: Peroxiredoxin/thioredoxin 9
O 2 Superoxiddismutasa NADPH+H + H 2 O 2 Peroxiredoxin RED Thioredoxin RED Thioredoxin reduktasa RED SH HS SH HS FADH 2 (Se) GSH Peroxiredoxin OX Thioredoxin OX Thioredoxin reduktasa OX H 2 O S S S S FAD (Se) NADP + Antioxidační ochrana III Sekvestrace železa a mědi Redoxně aktivní přechodné kovy (Fe, Cu) přijímají/dávají jeden elektron snadno... obcházejí spinovou restrikci kyslíku... kovy jsou v aktivních centrech všech proteinů pracujících s kyslíkem Ale, tytéž vlastnosti Fe, Cu jsou škodlivé pokud nejsou kontrolovány Fentonova reakce: H 2 O 2 + Fe 2+ OH + OH + Fe 3+ oxidativní poškození biomolekul 10
Antioxidační ochrana III Sekvestrace železa a mědi Proteiny zacházející s železem a/nebo mědí: transferin: váže 2 atomy Fe 3+ (transport) laktoferin: analogický transferinu, ale Fe neuvolňuje (... jen sekvestrace), leukocyty feritin: H a L podjednotky, H je ferroxidasa, skladování Fe (až 4500 atomů Fe 3+ ) haptoglobin: váže hemoglobin v cirkulaci hemopexin: váže hem v cirkulaci ceruloplasmin: obsahuje Cu, funkce: ferroxidasa (export Fe z buněk) albumin: transport Cu ICT ECT Superoxid Peroxid Fe/Cu Superoxid Peroxid Fe/Cu Superoxiddismutasa Glutathionperoxidasa Katalasa Glutathion Tokoferol Askorbát Redoxně aktivní Fe přítomno (LIP labile iron pool ) Antioxidační enzymy & hladiny glutathionu velmi nízké Tokoferol Askorbát Karotenoidy, kyselina močová, albumin, glukosa, bilirubin... Sekvestrace železa a mědi: - transferin, laktoferin - hemopexin - haptoglobin - ceruloplasmin (ferroxidasa) - Cu vázáno na albumin 11
Antioxidační ochrana IV Nízkomolekulární antioxidační substráty THIOLY: Glutathion Thioredoxin DALŠÍ ENDOGENNÍ METABOLITY: Bilirubin Kyselina močová Kyselina lipoová Z DIETY: Askorbát (Vitamín C) α-tokoferol (Vitamín E) Karotenoidy Rostlinné fenoly Tokoferoly (Vitamin E) skupina 8 isomerů, nejúčinnějšíαtokoferol antioxidant membrán (lipofilní) chain-breaking... zastavujeřetězovou reakci lipoperoxidace 12
Askorbát (Vitamín C) Redoxně aktivní derivát sacharidů U většiny živočichů syntetizován z kyseliny glukuronové Pro člověka, primáty, netopýry a morčata vitamín Deficit způsobuje onemocnění zvané kurděje (skorbut) Askorbát v těle: Hlavní funkce je pro-oxidační: kofaktor hydroxylas Hydroxylace Pro a Lys při syntéze kolagenu Syntéza noradrenalinu z dopaminu Syntéza karnitinu ( úloha v oxidaci tuků) Aktivace hypotalamických peptidových hormonů amidací (CRH, GRH, oxytocin, vasopresin, substance P) Reduktant pro železo: podpora jeho vstřebávání Při poruše sekvestrace Fe (hemochromatosa) může být nebezpečný pro-oxidant (?) Denní potřeba 70-100 mg, vyšší dávky p.o. se vyloučí močí (renální práh cca 200 mg/24 hod.) 13
membránový kompartment: hydrofilní kompartment: LH Tokoferol Semidehydroascorbát LOO -e - +e - řetězová reakce lipoperoxidace Dehydroascorbát L LOOH Tokoferyl radikál Ascorbát dehydroascorbát reduktasa 2GSH GSSG Aktivované neutrofily akumulují dehydroaskorbát (DHA) DHA GLUT1 GSH Glutaredoxin Askorbát GSSG Ochrana membrány neutrofilu před oxidací vlastními ROS... 14
Selen: stopový prvek (denní potřeba 55 µg), možnost deficitu i intoxikace Součást řady antioxidačních enzymů (glutathionperoxidasy, thioredoxinreduktasy) a také např. 5 -dejodasy (T4 T3) Karotenoidy: β-karoten (provitamín A) je prekursor pro syntézu: Retinal vidění Kyselina retinová regulátor genové exprese, růstu a diferenciace buněk Antioxidační ochrana kůže a oka Rostlinné (poly)fenoly Tisíce látek (quercetin, resveratrol, katechiny ) Ovoce, zelenina, čaj, červené víno, sojová omáčka, káva, čokoláda, koření Výborné antioxidanty (reduktanty) in vitro In vivo situace složitější: Resorpce v trávicím traktu? Konverze na jiné deriváty? Další specifické biologické účinky? Obr.:http://www.justaboutskin.com 15
Antioxidační ochrana V Stresová reakce Oxidace nebo nitrosylace kritických -SH skupin Transkripční faktory (NFκB, Nrf-2 ): aktivace, translokace do jádra Indukce genové exprese: chaperony (heat shock proteiny) enzymy antioxidační ochrany metalothionein hemoxygenasa 1 vyšší odolnost vůči dalšímu oxidačnímu stresu Apoptosa jako extrémní antioxidační ochrana? 16
Volné radikály v patogenesi lidských onemocnění Příčina chorobného stavu, např.: cancerogenese v důsledku expozice ionizačnímu záření retinopatie novorozenců (fibroplasia retrolentalis) Významný podíl na patogenesi, např.: aterosclerosa diabetes mellitus hypertenze některé typy rakoviny mozkové trauma/hemoragie ischemicko-reperfusní poškození srdce a jiných orgánů Parkinsonova nemoc Alzheimerova nemoc stárnutí Jen epifenomenon (obecný důsledek tkáňového poškození) Co je to stárnutí U různých živočichů vypadá stejně, ale probíhá různě rychle musí být univerzální děj Stochastický proces, na rozdíl např. od embryogenese není přímo programováno genomem (I když geny hrají roli!) Na molekulární úrovni: neschopnost obnovovat správnou strukturu biomolekul neomezeně dlouho systemic molecular disorder (Hayflick) 17
Radikálová/mitochondriální teorie stárnutí Hromadění oxidačního poškození s věkem (Denham Harman, 1956) Později formulována mitochondriální teorie mitochondrie jsou hlavní zdroj ROS v organismu Ale: nedaří se jednoznačně prokázat, že mito DNA je více poškozována ROS, ani že dramaticky hromadí mutace s věkem Model dle Kirkwooda a Kovalda: Určité množství ROS uniká z mitochondrií a poškozuje ostatní buněčné struktury Prevence tvorby ROS a systémy opravující poškození nejsou nikdy 100 % účinné Mírně poškozené mitochondrie produkují méně energie, než buňka potřebuje Jak se buňky zbavují nepotřebných proteinů a organel Kalpainy, proteasom (proteiny s krátkým poločasem) Autofagie (proteiny s dlouhým poločasem, organely): Makroautofagie (celé organely) Mikroautofagie (makromolekuly, malé organely) Chaperony zprostředkovaná autofagie (KFERQ proteiny) Obr.: http://cpmcnet.columbia.edu/dept/gsas/anatomy/faculty/kessin/autophagy.html 18
Stárnutí jako katabolické selhání Nekompletní degradace v lysosomech, uvolnění Fe z mito, ROS, lipoperoxidace, cross-linking, agregace a polymerace zoxidovaných proteinů a lipidů LIPOFUSCIN (v lysosomech) V cytosolu defektní mito a proteinové agregáty + Deficit hydroláz dodávaných do defektních lysosomů Poškozené a hypertrofované (obří) mito nelze odbourat Méně ATP, více ROS, poškozené mito a lysosomy mohou iniciovat apoptosu.. Obr.: http://www.uni-mainz.de/fb/medizin/anatomie/workshop/em/emtlyso.html Antioxidační ochrana V Stresová reakce Oxidace nebo nitrosylace kritických -SH skupin Transkripční faktory (NFκB, Nrf-2 ): aktivace, translokace do jádra Indukce genové exprese: chaperony (heat shock proteiny) enzymy antioxidační ochrany metalothionein hemoxygenasa 1 vyšší odolnost vůči dalšímu oxidačnímu stresu propagace zánětu 19
Stresová reakce se ve stáří stává chronickou Nick Lane: Oxygen. The Molecule that made the World. Oxford University Press 2002 Disposable soma theory: Jak dlouho má tělo vydržet? V přírodě se většina živočichů stárnutí nedožije selekční stín pro mutace s negativním vlivem v pozdních fázích života V přírodním výběru je rozhodující úspěch v reprodukci! geny prodlužující post-reprodukční období nejsou k ničemu Omezené množství metabolické energie se musí dělit mezi údržbu těla a reprodukci (trade-off) (T.B.L.Kirkwood & S.N. Austad, Nature 408 (2000), 233-238) 20
Antioxidanty jako elixíry mládí? Vitamín E (tokoferol) Vitamín C (askorbát) β-karoten Selen Obr.: http://www.osel.cz Antioxidační potravní doplňky mohou dokonce škodit! Recentní meta-analýza celkové mortality v 68 studiích s podáváním antioxidačních potravních doplňků (232 606 účastníků, 385 publikací): β-karoten, vitamín A a vitamín E signifikantně zvyšují mortalitu Vitamín C a selen nemají vliv (Bjelakovic G et al., JAMA 2007; 297: 842-857) 21
Proč antioxidanty nepomáhají nebo dokonce škodí??? Ve vyšších dávkách už nedělají nic Působí tam kde nemají Inhibice stresové reakce Brání boji proti infekci, nádorovým buňkám, oprávněné apoptose? Mají i jiné účinky než antioxidační tokoferoly: protizánětlivé β-karoten: ko-karcinogen (dohromady s kouřením nebo environmenálními toxiny)? http://www.calpoly.edu/~lcimarel/know.htm Dieta bohatá na ovoce a zeleninu (optim. 5x 80 g denně) je spojena s nižším rizikem kardiovaskulárních chorob, diabetu a některých typů rakoviny (plíce, ústa/hltan) (ale nevíme proč) 22