Leona Leišová a kol.

Leona Leišová a kol. Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008

Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem řešení projektu: MZE0002700602 - Studium a využití biodiverzity, genetických mechanismů a nových metod pro zlepšování biologického potenciálu odrůd a setrvalý rozvoj zemědělství Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. ISBN 978-80-87011-76-8

Leona Leišová, Ladislav Kučera, Jaroslava Ovesná Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008

Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví Předmětem metodiky je uvedení analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa do praxe. Mikrosatelity jsou vzhledem k vysoké úrovni variability vhodné pro charakterizaci odrůd v rámci druhu. Podstatou je amplifikace úseků genomu obsahující daný mikrosatelitní lokus pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) se specifickými primery a následná analýza produktů. Aplikace metodiky předpokládá základní vybavení laboratoře molekulární biologie, jakou má např. ÚKZÚZ nebo šlechtitelské stanice. Metodika je určena především pro potřeby Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin významných pro výživu a zemědělství (148/2003 Sb.) a dále všem uživatelům, kteří se potýkají s problémem pravosti a čistoty odrůd (ÚKZÚZ, šlechtitelské stanice, rezortní výzkumné ústavy, apod.). The use of microsatellite analysis for the characterisation of wheat, barley and oat varieties for the wants of seed companies, breeding stations and variety testing The aim of the methodology is to launch the analysis of microsatellites for the characterisation of wheat, barley and oat into praxis. Microsatellites show a high variability and therefore they are very suitable for this purpose. The principle of the method is the analysis of length variability of the products of PCR (polymerase chain reaction) with primers specific to a microsatellite locus. The application of the method assumes the basically equipped laboratory. and It is meant basically for the use of the National Programme of Conservation and Use of Plant Genetic Resources (148/2003 Sb.) and further for all who are confronted with the problem of the purity of wheat, barley or oat varieties (ÚKZÚZ, breeding stations, Agriculture Research Institutes, and so on). Oponenti: doc. Ing. Jan Bednář, CSc., Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Ing. Ivan Branžovský, Ministerstvo zemědělství Praha Metodika byla schválena odborem výzkumu MZe pod č.j. 46274/2008-18020 ze dne 10.12.2008 Ministerstvo zemědělství doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi.

Obsah: strana I. Úvod a cíl metodiky 5 II. Vlastní popis metodiky 6 Podstata metody 6 Potřebné technické vybavení 7 Pracovní postup a vyhodnocení experimentálních dat 8 Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti 11 III. Přednosti metody a možnosti rutinního využití 13 IV. Popis uplatnění metodiky 13 V. Použitá a další doporučená literatura 14 VI. Seznam publikací, ze kterých metodika vychází 16 Příloha 1 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd pšenice 17 Příloha 2 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd ječmene 18 Příloha 3 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd ovsa 19

I. Úvod a cíl metodiky Charakterizace odrůd obilnin pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví je obecným problémem. S objevem polymerázové řetězové reakce (PCR) a jejím zavedením jako rutinní metody v laboratořích molekulární biologie se však značně zrychlil vývoj metod pro studium genetické variability a tudíž se i problém charakterizace odrůd stal řešitelným. V současné době již existuje mnoho metod, které jsou vhodné pro detekci genetické variability. Jednou z metod, která se rutinně používá je analýza mikrosatelitů. Mikrosatelity jsou úseky DNA s opakujícím se motivem nejčastěji dvou nukleotidů. Počet opakování daného motivu je dán mnoha faktory a je nutno ho chápat z fylogenetického hlediska. Vlastní příčinou je chromosomální dynamika: chromosomální aberace, nerovnoměrný crossing-over, amplifikace a neúplná replikace určitých segmentů chromosomální DNA (Ondřej, 1992). Mikrosatelity se tudíž vyznačují vysokou mírou variability v počtu opakování jejich motivů, která se ve vlastní analýze projeví jako vysoká míra délkového polymorfismu amplifikovaných fragmentů DNA daného mikrosatelitního lokusu. Výhodou analýzy mikrosatelitů je hypervariabilita, kodominance alel, hojný výskyt v genomech eukaryot, potřeba pouze malého množství DNA, vysoká reproducibilita, možnost provádět analýzy jako multiplex, tj. v jedné reakci analyzovat více SSR lokusů, což výrazně zlevňuje cenu analýz (de Vienne et al., 1998). Z mnoha komparativních studií (např.: Russel et al. 1997; Nagaoka and Ogihara, 1997) se analýza mikrosatelitů ukazuje jako nejvhodnější metoda pro analýzy genetické variability v rámci druhu jinými slovy tato metoda nejlépe detekuje rozdíly mezi odrůdami téhož rostlinného druhu. Vzhledem k tomu, že tato metoda není dosud zavedena pro potřeby charakterizace odrůd, vznikla tato metodika, jejímž cílem je zavést metodu analýzy mikrosatelitů do praxe. Metodika byla optimalizována na několika stech odrůdách pšenice, ječmene a ovsa a je potvrzena několika publikacemi (Roussel et al., 2005; Leisova et al., 2007). 5

II. Vlastní popis metodiky analýzy mikrosatelitů Podstata metody I. Odběr vzorků a izolace DNA Podstatou první části je odběr vzorků. Pro izolaci kvalitní DNA se doporučuje použít mladé listy. Vzorky je tedy možno získat dvojím způsobem: napěstováním z osiva nebo na jaře odběrem přímo z pole. Podle typu analýzy je nutno odebrat listy buď z jedné rostliny (např. při analýze kříženců) nebo z nejméně 30 rostlin (např. při charakterizaci odrůd). Listový materiál je uchováván v PE zipových sáčcích nebo jsou listy zabaleny do alobalu a uchovávány při teplotě -80 C nebo je ihned zpracovány. Vzorky jsou doplněny popisem odrůdy a datem, příp. popisem lokality/místa odběru. Pro extrakci DNA je nutné její uvolnění z buněk mechanickým rozdrcením a oddělení DNA od ostatních sloučenin, zejména proteinů, polysacharidů a barviv. Přidáním detergentu CTAB dochází za přítomnosti soli NaCl k vytvoření ve vodě rozpustného komplexu [CTAB-DNA], který je následně směsí chloroformu a izoamylalkoholu (24:1) extrahován do vodné fáze a oddělen takto od proteinů a polysacharidů, které jsou spolu s chloroformovou fází odstraněny. DNA je pak srážena absolutním etanolem a zbytky soli a detergentu jsou odstraněny pomocí 75% roztoku etanolu. DNA je rozpuštěna v pufru TE, který je velmi zředěným vodným roztokem Tris a EDTA, které stabilizují DNA v roztoku. Tris upravuje ph a EDTA vyvazuje Mg 2+ ionty a tím inhibuje činnost enzymů rozkládajících DNA. II. Analýza mikrosatelitů Podstatnou součástí analýzy mikrosatelitů je amplifikace lokusu DNA obsahujícího daný mikrosatelit pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s lokusově specifickými primery. Detekovaný mikrosatelit je určitý motiv bází (ACGT), který se opakuje a tyto počty opakování se mohou lišit u různých genotypů. Detekce délkového polymorfismu amplifikovaných produktů pak znamená detekci různého počtu opakování daného motivu v daném genotypu. Protože je nutno rozlišit délku produktu PCR reakce pro daný mikrosatelit s přesností na 2bp, je nutné použít přesnější metodu než je klasická elektroforéza v agarózovém gelu. Tato metodika byla optimalizována na použití kapilární elektroforézy v přístrojích ABI PRISM 310 a 3130. V tomto případě je možné provádět tzv. multiplexové analýzy a analyzovat tak více (obvykle 3-4) reakce v jedné analýze a to díky fluorescenčně značeným primerům (6-fam, hex, tet, vic, ned, pet). Součástí analýzy je velikostní standard a pokud je třeba porovnávat analýzy mezi sebou pak rovněž standardy alel. 6

Je-li testována pravost odrůdy musí být součástí analýzy referenční DNA dané odrůdy nebo jsou-li k dispozici pouze sestavy alel (např. z jiného pracoviště), pak je vhodné doplnit analýzy o standardy alel společné oběma pracovištím. Potřebné technické vybavení I. Odběr vzorků a izolace DNA Pro uchovávání vzorků a izolaci DNA je třeba následující zařízení: mrazicí box (-80 C) centrifuga s otáčkami min. 11000 otáčet/min. s úhlovým rotorem na mikrozkumavky z umělé hmoty (Ependorfky) o objemu 2 ml třepačka vodní lázeň nebo blokový termostat zařízení na horizontální elektroforézu automatické pipety mikrozkumavky na izolaci DNA 2ml špičky na automatické pipety elektronické předvážky Pro izolaci DNA jsou potřebné následují roztoky a chemikálie: tekutý dusík 2 x CTAB PUFR: 2 M NaCl 40 ml 5 M roztoku 0,2 M Tris 20 ml 1 M rozt. o ph 8,0 50 mm EDTA 10 ml 0,5 M rozt. o ph 8,0 2 % CTAB (Sigma Aldrich) 2 g CTAB s do 100 ml H 2 O up TE PUFR: 10 mm Tris 2,5 ml 1 M roztoku o ph 8,0 1 mm EDTA 0,5 ml 0,5 M rozt. o ph 8,0 do 250 ml H 2 O up směs chloroform : isoamylalkohol (24:1) absolutní tj. min. 96% roztok izopropanolu vychlazený na teplotu - 20 C 70 % roztok etanolu 1 x TAE PUFR TRIS báze (s) 4,8 g 0,48% roztoku ledová CH 3 COOH 1,5 ml 0,5M EDTA (ph = 8,0) 2,0 ml 1mM roztok do 1000ml H 2 O up 7

Velikostní standard λ HindIII (Fermentas), vč. nanášecího pufru II. Analýzy mikrosatelitů pšenice, ječmene a ovsa Pro analýzu mikrosatelitů jsou potřebné následující chemikálie a zařízení: primery specifické pro daný druh rostliny (viz přílohy) dntp Tth polymeráza vč. pufru a MgCl 2 (Biotools) H 2 O up agaróza (SERVA) PCR destičky vč. víček či folie (AB gene), lze použít jednotlivé PCR zkumavky od různých výrobců automatické pipety špičky na automatické pipety termocykler stolní minicentrifuga přístroj na kapilární elektroforézu a vyhodnocení dat Pracovní postup a vyhodnocení experimentálních dat I. Odběr vzorků a izolace DNA Odebrané listy jsou umístěny do zipového sáčku nebo zabaleny do alobalu a opatřeny popisem (název odrůdy, datum odběru, příp. lokalita a další údaje). Asi 0,5 mg rostlinného materiálu je rozetřeno ve třecí misce v prostředí tekutého dusíku; prášek je ihned přemístěn do 2ml mikrozkumavky se 700 l pufru 2xCTAB a promíchán na třepačce. Poté jsou vzorky 30 minut inkubovány ve vodní lázni při teplotě 60 C. Pak je směs ochlazena na laboratorní teplotu. Ke směsi je přidán 1x objem směsi chloroformu a izoamylalkoholu (24:1). Po 10 minutách třepání jsou vzorky centrifugovány při maximálních otáčkách po dobu 10 minut a je odebrána vodná fáze. Tento krok je ještě jednou zopakován. K roztoku vzorku je přidán 1x objem 96% vychlazeného izopropanolu. Pro úplnou precipitaci DNA jsou vzorky inkubovány po dobu asi 15 minut při teplotě 4 C. Poté je DNA odebrána pomocí skleněných háčků vyrobených zatavením konců Pasteurových pipet (Obrázek 1). Vzorky na háčcích jsou umístěny do nových mikrozkumavek s 500 l 75% roztoku etanolu. Vzorky jsou inkubovány min. 1 hodinu (nejlépe přes noc) při teplotě 4 C. 8

Obrázek 1 Skleněný háček na zachycení DNA Supernatant je odstraněn, k peletce DNA je přidáno 500 l 75% roztoku etanolu a vzorky jsou inkubovány alespoň 1 hodinu při teplotě 4 C. Supernatant je odstraněn včetně zbytků etanolu vysušením a DNA je rozpuštěna podle velikosti peletky ve 300-500 l TE pufru. K roztokům DNA je přidáno 20 l roztoku RNázy (20mg/ml) a vzorky jsou inkubovány 10 minut při 37 C. Kvalita a koncentrace izolované DNA je ověřena elektroforézou v 0,8% agarózovém gelu. K 1 l vzorku DNA je přidáno 10 l H 2 O a 3 l nanášecího pufru a směs je nanesena na gel. DNA je vizualizována pomocí ethidiumbromidu (0,3 l/ 60 ml gelu) a detekována pod UV lampou. Koncentrace DNA vzorku je odhadnuta srovnáním se standardem λ Hind III (6 l - podle koncentrace standardu). Vzorky DNA jsou naředěny H 2 Oup na pracovní koncentraci 100ng/μl. II. Analýza mikrosatelitů Do PCR zkumavek nebo PCR destičky je napipetována reakční směs. Doporučuje se připravit si nejprve mastermix (reakční směs bez templátové DNA) do zvláštní zkumavky, ten rozpipetovat a k němu nakonec přidat po 1 l roztoku vzorku DNA. Reakční směs: směs primerů F+R (5 M) 1,0 l 0,33 M dntp (2,5 mm) 1,5 l 0,25 mm pufr (BioTools) (10x) 1,5 l 1 x MgCl 2 (15mM) 2,0 l 2,0 mm Tth polymeráza (BioTools) (5U/ l) 0,2 l 1 U templátová DNA (100ng/ l) 1,0 l 100ng H 2 O 9,2 l reakční objem 15,0 l 9

Vzorky jsou zcentrifugovány na minicentrifuze nebo na centrifuze na PCR destičky a jsou umístěny v termocykleru. PCR reakce se sestává z následujících kroků: 1 cyklus: 95 C... 5 min. 35 cyklů: 95 C... 30 sec. T M *... 30 sec. 72 C... 40 sec. 1 cyklus: 72 C... 5 min. 10 C... * Hodnoty T M jsou pro vybrané mikrosatelitní markery uvedeny v přílohách. Produkty amplifikace jsou separovány elektroforeticky metodou kapilární elektroforézy na přístroji ABI PRISM 310 (Perkin-Elmer) nebo na přístroji ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems): 1. Analýza PCR produktů v přístroji ABI PRISM 310 Jako interní velikostní standard se používá Tamra 500 pro kombinaci primerů fluorescenčně značených 6-FAM, HEX, TET). Vzorky pro analýzu jsou připravovány do zkumavek (PN401957, Applera), uzavřeny víčkem (PN401956, Applera) a zcentrifugovány. Příprava vzorků pro analýzu: Formamid (Applera) 4,8μl Tamra 500 (Applera) 0,4 μl Vzorky 6-FAM 0,2-0,5 μl podle intenzity píků HEX 0,2-0,5 μl podle intenzity píků TET 0,2-0,5 μl podle intenzity píků Vzorky jsou poté inkubovány 7 minut při teplotě 95 C a následně rychle ochlazeny na teplotu 4 C a krátce zcentrifugovány. Nastavení elektroforézy: Kapilára 47cm Gel: POP4 Modul: GS POP4_1ml_C Matrice: C Injektáž: 5-7 sec. Doba běhu: 20-24 minut podle velikosti produktu Výsledkem analýzy elektroforetogramů programem GeneScan a Genotyper jsou velikosti jednotlivých fragmentů v bp a jejich zařazení do kategorií podle velikosti v bp. 10

2. Analýza PCR produktů v přístroji ABI PRISM 3130 Jako interní velikostní standard se používá LIZ500 (Applera) pro kombinaci primerů fluorescenčně značených 6-FAM, VIC, NED a PET. Vzorky pro analýzu jsou pipetovány do optických PCR destiček (PN 4306737, Applera) a překryty speciálními víčky (PN4315933, Applera). Příprava vzorků pro analýzu: Formamid (Applera) 10 μl LIZ500 (Applera) 0,5 μl Vzorky 6-FAM 0,2-0,5 μl podle intenzity píků VIC 0,2-0,5 μl podle intenzity píků NED 0,2-0,5 μl podle intenzity píků PET 0,2-0,5 μl podle intenzity píků Vzorky jsou poté inkubovány 7 minut při teplotě 95 C a následně rychle ochlazeny na teplotu 4 C a krátce zcentrifugovány. Nastavení elektroforézy: Set kapilár: 36 cm Gel: POP7 Matrice: G5 Modul: Fragment Analysis 36_POP7 Výsledkem analýzy elektroforetogramů programem GeneMapper jsou velikosti jednotlivých fragmentů v bp a jejich zařazení do kategorií podle velikosti v bp. Analýza výsledků Tabulky kategorií (alel) jsou transportovány do programu MS Excel a zpracovány do uživatelské podoby sestavy alel pro daný genotyp nebo do podoby binární tabulky. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Analýza je založena na PCR reakci a následné přesné detekci velikosti produktů. Před vlastní analýzou je nutné extrahovat DNA. Časově náročná je extrakce DNA a analýza PCR produktů v závislosti na typu přístroje, ve kterém je prováděna kapilární elektroforéza. Analýza 96 vzorků (počet pozic v PCR destičce) včetně extrakce DNA a analýz 20 mikrosatelitních lokusů trvá min. 14 dnů v případě, že na analýze pracuje 1 člověk. Analýza produktů PCR reakce je finančně náročnější než vlastní PCR reakce. Cena analýzy jednoho vzorku pšenice všemi markery uvedenými 11

v příloze 1 činí 1375,-Kč včetně izolace DNA a analýzy v přístroji ABI PRISM 310. Cena analýzy jednoho vzorku ječmene i ovsa všemi markery uvedenými v příloze 2 a 3 činí 1115,-Kč včetně izolace DNA a analýzy v přístroji ABI PRISM 3130. Ceny analýz jsou uvedeny pouze orientačně, neboť závisejí na kurzu US dolaru a aktuálních cenách. S vlastním přístrojovým vybavením a větším počtem analyzovaných vzorků jsou výsledné ceny analýz výrazně nižší. 12

III. Přednosti metody a možnosti rutinní ho využití Základní předností metody je, že je analýza mikrosatelitů dobře aplikovatelná pro rutinní využití, je robustní a s vysokou mírou reproducibility. Pomocí této metodiky lze rozlišit i velmi příbuzné genotypy mnohem spolehlivěji, než je tomu u dosud používaných klasických postupů zejména proto, že mikrosatelity pokrývají celý genom nikoliv pouze určitý fenotypově se projevující gen. Cena analýz se výrazně zlevňuje, čím více vzorků je analyzováno. Jediným úskalím metody je, že bez aplikace standardů alel a referenčních odrůd není možné porovnávat výsledky z analýz prováděných v různou dobu či v různých laboratořích a pak není možné identifikovat danou odrůdu. Toto úskalí lze však snadno překonat zvolením tzv. standardů alel a ty pak analyzovat vždy s danými vzorky. IV. Popis uplatnění metodiky Metodika je určena všem, kdo se zabývají konzervací genových zdrojů, dále pracovníkům šlechtitelských stanic a semenářských podniků, tj. všude tam, kde se potýkají s otázkou charakterizace odrůd, pravosti osiva a míry diverzity mezi sledovanými odrůdami pšenice, ječmene a ovsa. Uplatní se jako konkrétní protokol pro analýzu odrůd pšenice, ječmene a ovsa v laboratořích molekulární biologie spolupracujících s genovými bankami, zejm. v Praze a v Kroměříži, dále v laboratořích šlechtitelských stanic, ÚKZÚZ a semenářských podniků. Kromě předání metodiky je Laboratoř genetické diverzity VÚRV, v.v.i. otevřena pro případné zaškolení pracovníků z jiných pracovišť. 13

V. Použitá a další doporučená literatura DE VIENNE D., SANTONI S. (1998): Les principales sources de marqueur moléculaires. In: de Vienne et al.: Les marqueur moléculaire en génétique et biotechnologies végétales. INRA, Paris, 1998: 15-47. GOLDSTEIN D.B., SCHLÖTTERER CH. (2000): Microsatellites: evolution and application. Oxford university press, New York, US, 2000. LEIŠOVÁ L., KUČERA L., DOTLAČIL L. (2007): Genetic resources of barley and oat characterised by microsatellites. Czech Journal of Plant Breeding 43(3): 97-104. LI C.D., ROSSNAGEL B.G., SCOLES G.J. (2000): The development of oat microsatellite markers and their use in identifying relationships among Avena species and oat cultivars. Theor Appl Genet 101: 1259-1268. Literatura: LIU Z.W., BIYASHEV R.M., SAGHAI MAROOF M.A. (1996): Development of simple sequence repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map. Theor Appl Genet 93: 869-873. NAGAOKA T., OGIHARA Y. (1997): Applicability o inter-simple sequence repeat polymorpisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theoretical and Applied Genetics 94: 597-602. ONDŘEJ M. (1992): Genové inženýrství kulturních rostlin. Academia, Praha 1992. PAL N., SNADHU J.S., DOMIER L.L., KOLB F.L. (2002): Development and characterisation of microsatellite and RFLP-derived PCR markers in oat. Crop Science 42: 912-918. RAMSAY L., MACAULAY M., IVANISSEVICH S., MACLEAN K., CARDLE L., FULLER J., EDWARDS K.J., TUVESSON S., MORGANTE M., MASSARI A., MAESTRI E., MARMIROLLI N., SJAKSTE T., GANAL M., POWELL W., WAUGH R. (2000): A simple sequence repeat-based linkage map of barley. Genetics 156: 1997-2005. RÖDER M.S., KORZUN V., WENDEHAKE K., PLASCHKE J., TIXIER M.H., LEROY P., GANAL M.W. (1998): A MICROSATELLITE MAP OF WHEAT. GENETICS 149: 2007-2023. ROUSSEL V., LEISOVA L., EXBRAYAT F., STEHNO Z., BALFOURIER F. (2005): SSR allelic diversity changes in 480 European bread wheat varieties released from 1840 to 2000. Theoretical and Applied Genetics 111: 162-170. RUSSEL J.R., FULLER J.D., MACAULAY M., HATZ B.G., JAHOOR A., POWELL W., WAUGH R. (1997): Direct comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs, AFLPs, SSRs and RAPDs. Theoretical and Applied Genetics 95: 714-722. 14

RUSSELL J., FULLER J., YOUNG G., THOMAS B., TARAMINO G., MACAULAY M., WAUGH R., POWELL W. (1997): Discriminating between barley genotypes using microsatellite markers. Genome 40: 442-450. SPOONER D., VAN TREUREN R., DE VINCENTE M.C. (2005): Molecular Markers for genebank management. IPGRI Technical bulletin no.10, IPGRI, Italy 2005. 15

VI. Seznam publikací, ze kterých metodika vychází LEIŠOVÁ L., KUČERA L., DOTLAČIL L. (2007): Genetic resources of barley and oat characterised by microsatellites. Czech Journal of Plant Breeding 43(3): 97-104. LEIŠOVÁ L., KUČERA L., DOTLAČIL L. (2007): Microsatellites as a tool to evaluate and characterise bread wheat core collection. In: BUCK H.T., NISI J.E., SALOMÓN N. (eds.): Wheat Production in Stressed Environments, Springer 2007, 12: 771-778. ROUSSEL V., LEISOVA L., EXBRAYAT F., STEHNO Z., BALFOURIER F. (2005): SSR allelic diversity changes in 480 European bread wheat varieties released from 1840 to 2000. Theoretical and Applied Genetics 111: 162-170. POLÁKOVÁ K., OVESNÁ J., LEIŠOVÁ L. (2001): Identification of Barley (Hordeum vulgare L.) cultivars using microsatellite analyses. Czech Journal of Plant Breeding 37: 23-28. LEIŠOVÁ L., OVESNÁ J. (2001): The use of microsatellite analysis for the identification of wheat varieties. Czech Journal of Plant Breeding 37: 29-33. 16

Příloha 1 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd pšenice (Triticum aestivum L.) SSR primer-značka Chrom o-zom Motiv opakování Tm ( C) Rozsah velikosti alel (bp) Xgwm 135-6-FAM 1A (GA)20 60 137-201 Xgwm 99-TET 1A (CA)21 60 98-142 Xgwm 11-TET 1B (TA)6CATA(CA)19(TA)6 60 189-217 Xgwm 413-TET 1B (GA)18 60 88-118 Xgwm 337-6-FAM 1D (CT)5(CACT)6(CA)43 55 163-209 Xgwm 642-HEX 1D (GT)14 60 189-209 Xgwm 312-TET 2A (GA)37 55 184-240 Xgwm 372-TET 2A (GA)>51 60 285-349 Xgwm 120-6-FAM 2B (CT)11 (CA)18 60 120-159 Xgwm 257-TET 2B (GT)30 60 193-199 Xgwm 261-FAM 2D (CT)21 60 165-219 Xgwm 539-HEX 2D (GA)27 60 123-185 Xgwm 2-TET 3A (CA)18 60 112-130 Xgwm 480-HEX 3A (CT)16 (CA)13 57 153-201 Xgwm 285-FAM 3B (GA)27 55 204-242 Xgwm 566-TET 3B (CA)21(GA)2(TA)8 60 118-132 Xgwm 341-HEX 3D (CT)26 60 124-162 Xgwm 664-TET 3D (GA)22 55 151-155 Xgwm 610-HEX 4A (GA)17imp 60 158-192 Xgwm 149-HEX 4B (GA)23imp 55 153-173 Xgwm 251-TET 4B (CA)28 55 81-123 Xgwm 194-6-FAM 4D (CT)32imp 60 116-137 Xgwm 186-6-FAM 5A (GA)26 55 101-157 Xgwm 415-TET 5A (GA)25imp 55 127-135 Xgwm 234-6-FAM 5B (CT)16(CA)20 55 202-247 Xgwm 408-HEX 5B (CA)>22(TA)(CA)7(TA)9 55 149-203 Xgwm 190-HEX 5D (CT)22 60 202-218 Xgwm 272-FAM 5D (CA)17 50 127-145 Xgwm 169-HEX 6A (GA)23 55 176-226 Xgwm 427-TET 6A (CA)31 (CA)22 50 192-230 Xgwm 219-HEX 6B (GA)35imp 60 149-219 Xgwm 626-6-FAM 6B (CT)5(GT)13 50 104-135 Xgwm 325-TET 6D (CT)16 60 135-151 17

Xgwm 469-TET 6D (CT)19(CA)10 60 160-190 Xgwm 233-TET 7A (CT)24 45 238-276 Xgwm 260-FAM 7A (GA)20 60 166-184 Xgwm 400-6-FAM 7B (CA)21 60 130-162 Xgwm 46-HEX 7B (GA)2GC(GA)33 60 146-188 Xgwm 437-HEX 7D (CT)24 60 91-127 Xgwm 44-6-FAM 7D (GA)28 60 164-192 18

Příloha 2 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd ječmene (Hordeum vulgare L.) SSR primer-značka Chromozom Zdroj * Motiv opakování Tm ( C) Rozsah velikosti alel (bp) BMS02-6-FAM 1H a (CA)21 60 190-228 BMS32-VIC 1H a (AT)5(CA)22 60 192-276 BMS90-NED 1H a (GA)8(AT)9(CA)20 60 187-237 HVM36-PET 2H b (GA)13 60 104-140 HVM54-6-FAM 2H b (GA)14 60 107-165 HVBKASI-VIC 2H b (C)10(A)11 60 178-200 Bmag0136-NED 3H c (AG)6-(AG)10-(AG)6 60 184-202 HVM60-PET 3H b (AG)11,(GA)14 60 107-120 HVM62-6-FAM 3H b (GA)11 60 235-265 HVM40-VIC 4H b (GA)6(GT)4(GA)7 55 131-161 HVM67-NED 4H b (GA)11 60 99-119 BLYRCAB-PET 4H a (AT)29 55 160-218 EBmac0906-6-FAM 4H c 55 131-157 Bmac0181-VIC 4H c (AC)20 55 158-184 Bmag0222-NED 5H c (AC)9(AG)17 50 148-184 Bmag0394-PET 5H c (AG)9CG(AG)4CG(A G)4 55 161-179 HVM30-6-FAM 5H b (CA)8 60 135-155 Bmag0500-VIC 6H c (AG)7C(AG)30-(AG)6 60 139-209 BMS18-NED 6H a (CT)9(CA)12 60 123-141 BMS40-PET 6H a (CA)21(GA)21 60 177-237 Bmag0021-6-FAM 7H c (CA)10AA(GA)28 55 99-169 Bmag0135-VIC 7H c (AG)10GG(AG)12 60 117-157 HVCMA-NED 7H b (AT)9 60 119-139 Bmag0496-6-FAM 6H c (CT)20 60 170-227 Bmag0807-VIC 6H c (TC)18 55 95-113 HVM74-NED 6H b (GA)13 55 168-246 * a - Russell et al., 1997; b - Liu et al., 1996; c - Ramsay et al., 2000 19

Příloha 3 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd ovsa (Avena sativa L.) SSR primerznačka Vazbová skupina Zdroj* Motiv opakování Tm ( C) Rozsah velikosti alel (bp) AM1-6-FAM 1 a (AG)21(CAGAG)6 60 157-225 AM2-VIC a (AG)24 50 129-163 AM3-NED a (AG)35 60 243-325 AM4-PET a (AG)34 60 133-227 AM6-6-FAM a (AG)20 60 205-329 AM13-VIC a (AG)15 46 182-206 AM14-NED a (AC)21 60 111-161 AM20-PET a (TG)10(CG)5 60 245-263 AM25-6-FAM 2 a (AC)8(AC)4(CT)4 60 215-233 AM40-VIC a (GAA)7 60 235-255 AM42-NED 3, 4 a (GAA)16 60 177-213 AM47-PET a (AC)14 60 255-273 AM53-6-FAM a (AC)10 60 245-323 AM54-VIC a (AC)9 60 177-181 AM61-NED a (TTTC)4..(CCT)6 60 206 AM83-PET 30 b (AC)11 46 187-197 AM84-6-FAM b (AC)9 46 116-192 AM87-VIC 24 b (AC)13 60 148-170 AM92-6-FAM b (AC)13 60 121-161 AM102-NED 22 b (AC)9 60 201-251 AM103-PET b (AC)16 46 189-193 AM104-6-FAM b (AG)36 60 185-223 AM107-VIC b (AC)3(AC)4 60 265-267 AM112-NED 2 b (AG)3(AC)9(AT)8 60 231-297 AM114-PET b (AG)24(AC)14 60 175-267 AM115-6-FAM 23 b (AC)9 60 209-213 * a - Li et al., 2000; b - Pal et al., 2002 20

Autoři: Název: Vydal: Náklad: RNDr. Leona Leišová, Ph.D., Ing. Ladislav Kučera,CSc., RNDr. Jaroslava Ovesná,CSc. Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně 20 ks Vyšlo v roce 2008 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autora: leisova@vurv.cz Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN 978-80-87011-76-8 2

Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. v Ústavu zemědělských a potravinářských informací Slezská 7, 120 56 Praha 2 2008