ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra ochrany rostlin

ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů Katedra ochrany rostlin Kvantitativní a indukovaná rezistence řepky ozimé k Leptosphaeria maculans disertační práce Autor: Školitel: Konzultant: Vladimír Šašek doc. Ing. Evženie Prokinová, CSc. doc. Ing. Lenka Burketová, CSc. Ústav experimentální Botaniky AV ČR, v.v.i. Praha 2 0 1 1

Marijánce k prvním narozeninám

V Praze dne 1. dubna 2011 Děkuji paní Lence Burketové za vytrvalou a všestrannou podporu a neomezený rozlet, který mi poskytla. Dále děkuji paní docentce Prokinové, profesoru Ryšánkovi a celé Katedře ochrany rostlin za skvělé vzdělání, podporu a ochotu vždy všechno rychle vyřešit paní Myrtě Pařízkové a Jitce Vidlákové za udržování bezchybného zázemí Shinichi Oidemu za všechno, co mě naučil Mirce Špácové, Lucii Ježkové, Lucii Lorkové a Martinu Jandovi za jejich nevídané nasazení pestrému kolektivu z Karlovky za rozptýlení, zvláště pak paní Kolčabové za její vlídná slova paní profesorce Valentové, Michale Klímové, Hance Hoffmeisterové, Daniele Kocourkové, Hance Návarové, Přemyslu Pejcharovi, Janu Martincovi a Tomáši Moravcovi za cenné rady Christině Dixelius, Peteru Ottovi a Károly Bókovi za možnost pobývat v jejich laboratořích mnohým vědcům z celého světa, kteří mi vždy laskavě poskytli materiál pro experimenty Zvláštní díky patří Jarmile, která opravila snad všechny moje hrupky Děkuji kamarádů, že vždy vydrželi alespoň několik minut líčení mých zážitků z labotoře, než utekli Velmi si cením opory a inspirace v široké rodině Rád vzpomínám na život v rodině Zevlounových, kde jesme strávili většinu času, kdy tato práce vznikala Ze všech nejvíc ale děkuju Janince, která se tolik načekala

Obsah 1. ÚVOD... 3 2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY... 4 2.2 IMUNITA ROSTLIN ZALOŽENÁ NA ROZPOZNÁNÍ MAMPS... 6 2.3 IMUNITA ROSTLIN ZALOŽENÁ NA ROZPOZNÁNÍ EFEKTORŮ (MONOGENNÍ REZISTENCE)... 7 2.4 ROSTLINNÉ HORMONY A JEJICH SIGNÁLNÍ DRÁHY ŘÍDÍCÍ IMUNITNÍ SYSTÉM... 9 2.5 INDUKOVANÁ REZISTENCE A PRIMING... 13 2.6 KVANTITATIVNÍ REZISTENCE... 14 2.7 BRASSICA NAPUS A LEPTOSPHAERIA MACULANS... 15 3. CÍLE... 19 4. METODY... 20 5. VÝSLEDKY A DISKUZE... 32 5.1 IDENTIFIKACE OBRANNÝCH REAKCÍ VYVOLANÝCH ROZPOZNÁNÍM GENU AVRLM1... 32 5.2 ELICITORY OBRANNÝCH REAKCÍ Z PATOGENA L. MACULANS... 51 5.3 SCREENING INDUKTORŮ REZISTENCE K L. MACULANS... 56 5.4 BABA ZMENŠUJE PŘÍZNAKY CHOROBY VYVOLANÉ L. MACULANS... 56 5.5 HYDROLYZÁTY ŽIVOČIŠNÝCH BÍLKOVIN... 63 6. ZÁVĚR... 72 7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 74 8. POUŽITÉ ZKRATKY... 83 9. PŘÍLOHY... 84

1. Úvod 1. Úvod I v novém tisíciletí zůstává lidská populace nadále závislá na produktech zemědělství. Ačkoliv jsme se jako Evropané v nedávné době často setkávali s opačným problémem, zemědělské produkce je na světě nedostatek a vzhledem k rychlému růstu populace se situace bude patrně nadále zhoršovat tak, jak předpovídal Thomas Malthus na konci 18. století. To, že se Malthusova apokalyptická vize dosud nenaplnila, nelze přičítat jeho špatnému odhadu, ale objevům, které zapříčinily zvýšení zemědělské produkce. Díky použití minerálních hnojiv a intenzivnímu šlechtění je k nasycení jednoho člověka potřeba desetkrát méně zemědělské půdy než před dvěma sty lety (TREWAVAS, 2002). Nevíme, co nám pomůže vyřešit současný nedostatek potravin, ale nezdá se, že by vhodnou cestou v našich podmínkách bylo další zvyšování intenzity zemědělské výroby. Pozornost se upírá zejména k zvýšení odolnosti rostlin k nepříznivým abiotickým podmínkám a parazitujícím organizmům. Jen původci chorob rostlin nás připraví nejméně o jednu desetinu světové produkce potravin (STRANGE a SCOTT, 2005). Zemědělci využívají celou řadu prostředků, aby omezili škody způsobené patogeny rostlin. Patří mezi ně přímá chemická a biologická ochrana, konvenční šlechtění na rezistenci, transgenóze a celá řada přímých i nepřímých agrotechnických opatření. Zásadní a nezastupitelnou roli hraje chemická ochrana. Již dlouhodobě je ale diskutován její negativní vliv na lidské zdraví (ALAVANJA et al., 2004) a životní prostředí, především pak půdní úrodnost a působení na necílové organismy (JOHNSEN et al., 2001). Všechny tyto skutečnosti jsou sice obtížně prokazatelné, nicméně v současnosti dochází z těchto důvodů k restrikci mnoha používaných pesticidů. Je tedy třeba hledat nové způsoby, jak snížit ztráty způsobené škůdci a patogeny a zároveň se vypořádat s omezením některých pesticidů. Šlechtění rezistentních odrůd probíhá zřejmě od počátků zemědělství. Současné šlechtění na rezistenci k chorobám sice využívá řadu nových metod, ale je stále založené pouze na posuzování fenotypu, případně využívá molekulární markery pro požadované znaky. I geneticky modifikované rostliny s rezistencí k bakteriálním a houbovým patogenů jsou téměř výhradně založeny na primitivním principu využití antimikrobiálních peptidů z různých organismů (COLLINGE et al., 2010). Zcela nový pohled na imunitní systém rostlin, který přinesly objevy posledních 20 let, však zcela zásadně promění možnosti vytváření rezistentních odrůd. V této práci jsme se pokusili objasnit mechanismy rezistence rostlin řepky (Brassica napus) k hospodářsky významnému patogenem Leptosphaeria maculans. Studovali jsme signalizaci v imunitním systému B. napus při rozpoznání genu avirulence AvrLm1. V laboratorních podmínkách jsme testovali řadu látek s potenciálem indukovat rezistenci v rostlinách proti L. maculans i jiným patogenům. 3

2. Současný stav řešené problematiky 2. Současný stav řešené problematiky Přestože jsou rostliny považovány za evolučně méně vyspělé organismy než jsou živočichové, nemají imunitní systém v pravém slova smyslu a nemohou před svým parazitem utéci, je jejich obranný systém pozoruhodně účinný. Joseph Kuć, průkopník indukované rezistence, v této věci napsal: Pokud je mi známo, žádný rostlinný druh nezmizel z povrchu zemského následkem choroby, ledaže bychom za ni považovali i lidské konání. (KUĆ, 2006). Rostliny mají jednak trvale přítomné - konstitutivní obranné mechanizmy a dále tzv. mechanizmy indukované, které se aktivují až v reakci na rozpoznání patogena, případně herbivora (AGRIOS, 1997). Konstitutivní obranné mechanizmy, zahrnující fyzické bariéry, např. v podobě silně hydrofobní kutikuly, nebo nízkomolekulární konstitutivně syntetizované toxické látky, nebyly předmětem této studie, a proto o nich zde nebude dále pojednáno. 2.1 Kořeny poznání imunitního systému rostlin V roce 1933 sepsal Kenneth S. Chester dodnes hojně citovaný přehledný článek (CHESTER, 1993). Shrnul v něm výsledky bezmála 200 původních prací zabývajících se získanou imunitou rostlin, tedy jevem, kdy se náchylná rostlina po určitém stimulu stane odolnou k infekci. Mezi citovanými autory nechybí ani známí českoslovenští fyziologové rostlin Bohumil Němec a Silvestr Prát. Němec ve svých pokusech inokuloval listy rostlin zelí bakterií Pseudomonas aeruginosa a pozoroval, že při následné inokulaci vzdálené části listu byly rostliny k infekci odolné. Tento fenomén pozoroval pouze na bílých odrůdách. Na červených odrůdách imunizace nefungovala. Dále je v textu popisována inokulace rostlin tabáku oslabenou formou viru bramboru, která vyvolávala rezistenci k následné infekci týmž virem. Někteří postoupili v experimentování ještě dál. Asi nejbizarnější přístup spočíval v terapii nemocných rostlin sérem králíka imunizovaného fytopatogenní bakterií. O pět let později publikoval Francis Holmes práci, ve které popsal výsledky křížení, které prováděl mezi rostlinami tabáku Nicotiana glutinosa a Nicotiana tabacum (HOLMES, 1938). N. glutinosa je rezistentní k infekci virem mozaiky tabáku (TMV). Křížením amfidiploidního tabáku N. glutinosa x N. tabacum s N. tabacum Holmes zjistil, že se rezistence přenáší jako jednoduše dědičný znak. Gen rezistence pojmenoval N. Tato z dnešního pohledu běžná záležitost byla v tehdejší době velkým objevem. Šlechtění na monogenně založenou rezistenci se stalo jednou z nejúspěšnějších strategií ochrany rostlin před patogeny. S přibývajícími poznatky se začala utvářet představa o genetických mechanismech řídících rezistenci. Vznikl koncept gen proti genu (FLOR, 1971). Podle něj existuje ke každému genu rezistence korespondující gen avirulence v genomu patogena. Pokud se setká rostlina nesoucí gen rezistence s patogenem nesoucím příslušný gen avirulence, dojde k inkompatibilní interakci, patogen je rozpoznán a spuštěním obranných mechanizmů je mu zabráněno v kolonizaci rostliny. Ve všech ostatních případech, kdy v interakci chybí jeden či oba korespondující 4

2. Současný stav řešené problematiky geny, dojde k rozvoji choroby. Taková interakce se pak nazývá kompatibilní. Ačkoliv je monogenní rezistence velmi účinná, často dojde k jejímu překonání. V takovém případě dojde v populaci v důsledku selekčního tlaku k eliminaci genu avirulence. Nutno však podotknout, že některé R-geny zůstávají v polních podmínkách nepřekonané již několik desetiletí (BENT a MACKEY, 2007). O obranných mechanismech, které stojí za projevy rezistence v rostlinách, se však nevědělo nic tehdy a ani o 30 let později nebyla situace výrazně lepší. V přehledném článku z roku 1966 je nejvíce pozornosti věnováno fytoalexinům. Zkoumání bylo značně omezeno dostupnými metodami. Proteiny byly sledovány jen z pohledu jejich aktivity. Analýza RNA byla omezena na stanovení jejího celkového množství. V náchylných rostlinách její množství během infekce rostlo, v rezistentních nikoliv (HARE, 1966). Krátce poté však VAN LOON a VAN KAMMEN (1970) využili v té době moderní metody polyakrylamidové elektroforézy, aby porovnali zastoupení proteinů v listech tabáku s genem rezistence N a náchylného tabáku při infekci TMV. K jejich úžasu se na gelu s proteiny z rezistentních rostlin po inokulaci objevily čtyři nové proužky. Prezentace těchto výsledků prvním posluchačům u nich prý vzbudila takový zájem, že diapozitiv pořízený z gelu se při dlouhé projekci zničil. V návaznosti na tento objev byly podobné proteiny popsány u řady dalších rostlin infikovaných avirulentními patogeny a vžil se pro ně název PR proteiny (Pathogenesisrelated proteins). Spekulovalo se, že jejich tvorba by v rostlinách mohla být řízena hormonem etylénem, protože jeho exogenní aplikace PR proteiny indukovala (VAN LOON, 1985). O funkci PR proteinů se ještě 15 let po jejich prvním objevu nevědělo nic. V roce 1988 byla u dvou PR proteinů popsána glukanázová a chitinázová aktivita. Tato funkce byla pochopitelná s ohledem na rezistenci k houbám, ale jak by tyto proteiny mohly pomáhat rostlinám k zastavení virové infekce, bylo nejasné (UKNES et al., 1993). V roce 1990 byla nezávisle dvěma skupinami vědců objevena kyselina salicylová jako hormon regulující expresi PR proteinů v rostlinách okurky a tabáku (MALAMY et al., 1990; MÉTRAUX et al., 1990). Tato látka byla popsána již o 11 let dříve jako chemický induktor PR proteinů (WHITE, 1979). Na myšlenku použít tuto látku k ošetření rostlin údajně navedla mladého vědce jeho babička, která přidávala do vody k řezaným květinám aspirin (kyselina acetylsalicylová), který prodlužoval jejich životnost. Ve stejné době, kdy van Loon objevil první PR proteiny, popsal Clarence Ryan inhibitory proteáz, které se v rostlinách indukovaly mechanickým poraněním, což přineslo důkaz o aktivní obraně rostlin proti herbivornímu hmyzu (GREEN a RYAN, 1972). Později tým stejného vědce popsal indukci týchž inhibitorů oligogalakturonidy uvolněnými z buněčné stěny rostliny hydrolytickými enzymy patogenů. V roce 1992 vyšlo najevo, že tyto obranné mechanizmy jsou řízeny kyselinou jasmonovou (FARMER a RYAN, 1992). 5

2. Současný stav řešené problematiky Tyto objevy odstartovaly rychlý rozvoj poznání imunitního systému rostlin. Kyselina salicylová, etylén a kyselina jasmonová v dnešní představě o spletité síti signálních drah zaujímají sice jen malé místo, ale stále výsadní. U většiny PR proteinů je dnes již známá jejich enzymová či biologická aktivita (Tab. 1), avšak i po tak dlouhé době, co uplynula od jejich nalezení, zůstává přesná funkce jednotlivých PR proteinů neobjasněna. Rodina Zástupce Vlastnosti PR-1 Tobacco PR-1a antifungální? PR-2 Tobacco PR-2 b-1,3-glukanáza PR-3 Tobacco P, Q chitináza, typ I,II,IV,V,VI,VII PR-4 Tobacco R chitináza, typ I,II PR-5 Tobacco S thaumatinu podobný protein PR-6 Tomato Inhibitor I inhibitor proteáz PR-7 Tomato P69 endoproteáza PR-8 Cucumber chitinase chitináza, typ III PR-9 Parsley PR1 peroxidáza PR-10 Tobacco ribonukleáze podobný protein PR-11 Tobacco class V chitinase chitináza, typ I PR-12 Radish Rs-AFP3 defensin PR-13 Arabidopsis THI2.1 thionin PR-14 Barley LTP4 lipid-transferový protein PR-15 Barley OxOa oxalát oxidáza PR-16 Barley OxOLP oxalát oxidáze podobný protein PR-17 Tobacco PRp27 neznámá funkce Tab. 1 Charakteristika rodin PR-proteinů podle TUZUN a SOMANCHI (2006). 2.2 Imunita rostlin založená na rozpoznání MAMPs Imunitní systém rostlin má dvě dobře odlišitelné složky. První složka imunitního systému odrážející útoky mikrobů je založena na receptorech umístěných na povrchu buněk. Tyto receptory rozpoznávají konzervované molekuly patogenů označované obecně jako MAMPs (microbe-associated molecular patterns). Tyto molekuly jsou zpravidla k nalezení u zástupců celých říší a organismy se bez nich jen těžce obejdou, tudíž patogen nemůže uniknout rozpoznání tím, že se této molekuly jednoduše zbaví (JONES a DANGL, 2006). Imunita vyvolaná MAPMs je zodpovědná za likvidaci většiny potenciálních parazitů. Patogeni jsou charakterističtí právě tím, že ji dokáží překonat. Rostliny nesoucí mutace v genech receptorů MAMPs a proteinů následných signálních kaskád jsou často náchylné k celé řadě patogenů, pro které jsou za normálních okolností nehostitelské (SCHWESSINGER a ZIPFEL, 2008). 6

2. Současný stav řešené problematiky Membránové receptory rostlin rozpoznávající MAMPs patří na základě své molekulové architektury do dvou skupin. Všechny mají LRR (leucine-rich repeat) doménu vázající rozpoznávaný motiv. Liší se však v přítomnosti kinázové domény. Svou funkcí i stavbou receptorů je tato část imunitního systému velmi podobná neadaptivní imunitě živočichů. Avšak zatímco genom člověka kóduje pouze 12 tzv. Toll-like receptorů, modelová rostlina Arabidopsis thaliana s poměrně malým genomem v sobě skrývá téměř 700 různých membránových receptorů (DODDS a RATHJEN, 2010). Některé receptory rostlin a živočichů rozpoznávají dokonce stejné molekuly, ale i přesto se předpokládá, že oba systémy se vyvinuly nezávisle (ZIPFEL a FELIX, 2005). Mezi nejlépe popsané MAMPs patří chitin jakožto hlavní složka buněčné stěny hub (MIYA et al., 2007) a flagelin, peptid utvářejí bičík mnoha fytopatogenních bakterií. Motiv 22 aminokyselin flagelinu je rozpoznáván membránovým receptorem FLS2 (GOMEZ-GOMEZ a BOLLER, 2000). Flagelin byl mezi prvními objevenými MAMPs a hned popřel jedno z hlavních dogmat. Přepokládalo se totiž, že patogen nemůže přímo uniknout rozpoznání membránovými receptory, protože daná molekula je pro něj životně nepostradatelná a rozpoznávaný motiv je natolik konzervovaný, že jeho sebemenší změna by ovlivnila funkci molekuly. Některé kmeny bakterie Xanthomonas campestris pv campestris vykazují záměnu v jedné z 22 aminokyseliny motivu flagelinu, která zabrání jeho rozpoznání receptorem FLS2, ale neovlivní růst ani virulenci (SUN et al., 2006). Jak ale bude uvedeno dále, tento případ je spíše výjimkou a patogeni tuto složku imunitního systému obcházejí jiným způsobem. 2.3 Imunita rostlin založená na rozpoznání efektorů (monogenní rezistence) Po naklonování a charakterizaci prvních genů avirulence se ukázalo, že většina z nich jsou malé sekretované proteiny. Brzy se ukázalo, že se jedná o efektory, které pomáhají patogenům zablokovat rozpoznání svých MAMPs. Experimentální důkazy se objevily především díky modelovému patosystému Arabidopsis thaliana Pseudomonas syringae pt. tomato. Tato bakterie injikuje do hostitelské buňky efektor AvrPtoB, který dokáže ubikvitinem označit kinázy vedoucí signál od receptoru flagelinu FLS2. Ubikvitinace má za následek degradaci kináz proteazomem rostliny (ROSEBROCK et al., 2007). Interakce těchto dvou organismů je samozřejmě komplexnější a podobných molekulárních soubojů se odehrává celá řada. Tento příklad ale jasně demonstruje mechanismy překonání imunity vyvolané rozpoznáním MAMPs. Když molekulární biologové obrátili své pohledy na rostliny, zjistili, že většina genů rezistence kóduje cytoplazmatické receptory, které navzájem sdílí identickou molekulovou strukturu zahrnující LRR doménu, jež se váže na cílovou molekulu a nukleotid vázající doménu (NB). Na rozdíl od efektorů rozpoznávajících MAMPs jsou NB-LRR receptory 7

2. Současný stav řešené problematiky lokalizované v cytosolu. Ukázalo se tedy, že proteiny kódované geny rezistence nepůsobí přímo proti patogenům, ale slouží pouze jako receptory efektorů patogena, po jejichž rozpoznání aktivují imunitní systém (BENT a MACKEY, 2007). Pro tuto složku imunitního systému rostlin se proto vžilo označení efektory vyvolaná imunita (z angl. effector-triggered immunity). Významově se překrývá s monogenní či rasově specifickou rezistencí. Některé NB-LRR interagují s Avr proteinem nepřímo. V takovém případě NB-LRR receptor kontroluje stav proteinu nebo jiné molekuly, které jsou cílem daného efektoru. Mezi rostlinou a jejím patogenem se odehrává nekonečný evoluční souboj. Efektory potlačující vrozenou imunitu mohou být rozpoznány NB-LRR receptory rostliny, které spustí další obranné mechanismy. Patogen se pak vyhne rozpoznání modifikací efektoru nebo jeho náhradou za jiný, a tak se interakce mezi rostlinou a patogenem neustále přesouvá od náchylnosti k rezistenci a zpět. Kvůli tomu získala tato hypotéza od svých autorů přiléhavé pojmenování cik-cak model (JONES A DANGL 2006). Tento model má však zásadní trhlinu. Těžko si jej lze představit v případě interakce s nekrotrofními patogeny. Z prostého důvodu. Dosud nebyl nalezen jediný NB-LRR receptor, který by zprostředkoval rezistenci k nekrotrofním patogenům. Jejich efektory jsou především toxiny a zdá se, že rostliny se před nimi snaží uniknout změnami nebo úplnou eliminací molekul, na které toxiny působí (OLIVER a SOLOMON, 2010). Situace tedy připomíná koncept gen proti genu, jen s obrácenými rolemi. 2.3.1 Hypersenzitivní reakce Efektory vyvolaná imunita se velmi často projevuje tzv. hypersenzitivní reakcí (HR). V tomto rostlinou řízeném procesu odumírají buňky v bezprostřední blízkosti patogena a vytvářejí se tak mikroskopické až okem viditelné ostrůvky nekrotického pletiva, ve kterých zůstává patogen uvězněn. Z tohoto důvodu je hypersenzitivní reakce účinná především proti biotrofním patogenům. Nekrotrofové mohou naopak celý mechanismus využívat ve svůj prospěch. Pomocí efektorů spouštějících hypersenzitivní reakci usmrcují buňky hostitele a následně na nich parazitují (LORANG et al., 2007). Na rozdíl od apoptózy u živočichů, která je spouštěna jednou centrální signální drahou, je HR rostlin velmi rozmanitý pochod výrazně se lišící napříč patosystémy. Klíčové regulační prvky v tomto procesu jsou především reaktivní formy kyslíku (ROS), oxid dusnatý, kyselina salicylová a změna koncentrace Ca 2+ v cytosolu. Propojení těchto prvků však není známo. Kromě buněčné smrti dochází při HR také k tvorbě značného množství sekundárních metabolitů s antimikrobiálními vlastnostmi (MUR et al., 2008). 8

2. Současný stav řešené problematiky 2.4 Rostlinné hormony a jejich signální dráhy řídící imunitní systém Pouhé rozpoznání patogena rostlinu před infekcí neochrání. Signál je od receptorů veden složitou spletí signálních drah, která zajistí přeprogramování transkriptomu. Baterie nových proteinů pak společným působením zabrání patogenu v infekci. Zatímco obě vrstvy imunitního systému jsou dobře odlišeny typem receptorů a molekul, které rozpoznávají, obranné mechanismy jsou pro obě složky totožné. Srovnání transkriptomických dat z rostlin ošetřených flagelinem a inokulovaných avirulentním patogenem ukázalo značný překryv v profilu indukovaných genů (NAVARRO et al., 2004). Podobně se i změny v transkriptomu rostlin ošetřených flagelinem z poloviny překrývají se změnami indukovanými chitinem, tedy molekulami pocházejícími ze zcela odlišných skupin patogenů (SCHWESSINGER a ZIPFEL, 2008). Klíčovou roli v přenosu signálu od receptorů hrají rostlinné hormony, zejména kyselina salicylová, etylén a kyselina jasmonová (PIETERSE et al., 2009). 2.4.1 Kyselina salicylová a Systémově získaná rezistence Kyselina salicylová (SA) je v rostlinách indukována zejména při napadení biotrofními patogeny a exogenní aplikace SA zvyšuje rezistenci rostlin proti této skupině patogenů (GLAZEBROOK, 2005). SA je v rostlinách syntetizována z isochorismátu, jehož syntéza je katalyzována enzymem isochorismát syntázou kódovanou v Arabidopsis dvěma geny ICS1 a ICS2. První z dvojice je indukován patogeny a je zřejmě zodpovědný za tvorbu většiny SA v rostlině (GARCION et al., 2008). Receptor, na který se SA váže, nebo jiný mechanismus vedoucí signál dále po své kaskádě zatím není znám. Avšak byla nalezena hlavní molekula regulující genovou expresi v odpovědi na SA. Protein NPR1 (NONEXPRESSOR OF PR GENES1) se za normálních podmínek nachází v cytosolu jako oligomer spojený disulfidickými můstky. Při zvýšení hladiny SA dojde zatím neznámým způsobem ke změně redoxního potenciálu, což způsobí redukci oligomeru NPR1 na monomerní formu. Při tom dojde k obnažení jaderného lokalizačního signálu, který nasměruje molekulu do jádra, kde interaguje s TGA transkripčními faktory (MOUA et al., 2003). Jejich přímým cílem jsou mimo jiné i WRKY transkripční faktory, které jsou zodpovědné za změnu exprese mnoha genů v odpovědi na SA. Protože se jedná o rodinu 74 genů, mnoho z nich je redundantních a je tedy těžké určit jejich funkci pomocí zkoumání rostlin s mutacemi v jednotlivých genech. Jsou mezi nimi ale i výjimky. Recesivní mutanti wrky18 a wrky58 mají slabší odezvu na ošetření induktorem rezistence benzothiadiazolem, z čehož vyplývá, že jsou pozitivními regulátory SA (WANG et al., 2006). Naproti tomu mutanti wrky38 a wrky62 mají zvýšenou expresi SA dependentních genů a zvýšenou rezistenci, tudíž se jedná o negativní regulátory SA signální dráhy (KIM et al., 2008). S kyselinou salicylovou je přímo spojen i fenomén Systémově získané rezistence. Právě při jejím studiu byla SA objevena. Rostliny po inokulaci zpravidla avirulentním patogenem 9

2. Současný stav řešené problematiky mohou i v částech vzdálených od místa inokulace vykazovat značnou míru rezistence k virulentním patogenům. Taková rezistence pak může v rostlinách přetrvávat po dlouhou dobu. Jméno tento jev získal na základě publikace z roku 1961 (ROSS, 1961), ale popsán byl již na počátku století, jak bylo zmíněno dříve. Pro aktivaci SAR je nezbytná SA a průběh SAR koreluje se syntézou PR-proteinu, o kterých se předpokládá, že se na této formě rezistence podílejí. Nejzajímavější otázkou SAR je signál, který zajištuje systémové šíření. Původně za něj byla považována SA, avšak toto tvrzení bylo experimentálně vyvráceno (DURRANT a DONG, 2004). Screening mutantů neschopných indukce SAR odhalil gen DIR1, který kóduje lipid-transferový protein (MALDONADO et al., 2002). Zdálo se, že signální molekulou tedy musí být lipid, ale od zveřejnění objevu v roce 2004 nebyla publikována žádná navazující práce. Nedávno byla nalezena devítiuhlíkatá dikarboxylová kyselina, jež se v rostlinách vytváří po napadení avirulentním patogenem. Tato látka se systémově šíří a indukuje rezistenci k patogenům. Nicméně neindukuje syntézu SA v rostlině a nemůže tedy být považována za systémový signál. S největší pravděpodobností se ale jedná o dílčí komponent SAR (JUNG et al., 2009). Manipulace SAR, ať již geneticky či chemicky, v sobě skrývá velký potenciál jako součást ochrany rostlin v zemědělství. 2.4.2 Kyselina jasmonová Kyselina jasmonová (JA) je indukována především nekrotrofními patogeny a herbivory (GLAZEBROOK, 2005; BROWSE a HOWE, 2008). Prekurzorem JA je kyselina α-linolenová, která vzniká hydrolýzou membránových fosfolipidů katalyzovanou fosfolipázou A. Mechanismus spouštějící tuto reakci zatím není znám. První část metabolické dráhy vedoucí k JA probíhá v chloroplastech a je katalyzována enzymy lipoxygenázou (LOX), allenoxid syntázou (AOS) a allenoxid cyklázou (AOC). Tyto enzymy jsou pravděpodobně regulačním místem signální dráhy JA, zejména pak AOS, která je v A. thaliana kódována jediným genem a je indukována patogeny i samotnou JA. Mutace v tomto genu zcela zablokuje produkci JA a vede k pylové sterilitě (PARK et al., 2002). Centrálním regulačním uzlem v signální dráze JA je COI1 (CORONATINE INSENSITIVE 1). Tento protein byl identifikován již počátkem 90. let, až nedávno bylo odhaleno, že je receptorem JA, přesněji jejích konjugátů s aminokyselinami. Navázáním konjugátu JA na COI1 dojde k zformování ubikvitinačního komplexu s dalšími proteiny. Následná označení transkripčních represorů z rodiny JAZ proteinů a jejich degradace proteazomem vede ke spuštění transkripce JA dependentních genů. Protože u žádného z 12 JAZ proteinů A. thaliana nebyla identifikována DNA vázající doména, předpokládá se, že expresi regulují nepřímo přes jiné transkripční faktory (KATSIR et al., 2008). Nedávno byl popsán ještě další nečekaný účastník této interakce. Pro navázáni konjugátu JA na COI1 je nezbytný inositol-5-fosfát (SHEARD et al., 2010). 10

2. Současný stav řešené problematiky Transkriptom signální dráhy JA má nejméně dvě oddělené větve. První z nich reguluje obranné mechanismy v reakci na nekrotrofní patogeny, metabolizmus tryptofanu a je charakteristická expresí markerových genů Pdf1.2 a HEL. Druhá větev reguluje obranné mechanismy proti herbivorům a oxidativnímu stresu, syntézu flavonoidů a antokyanů, inhibici růstu kořenů a je charakteristická expresí markerového genu VSP2. Transkripční faktor MYC2 negativně reguluje první větev a pozitivně druhou. Naopak transkripční faktor ERF1 řízený etylénem reguluje obě dráhy opačným způsobem (LORENZO et al., 2004). MYC2 v in vitro podmínkách interaguje s JAZ3 proteinem. Z toho vyplývá, že MYC2 je za normálních okolností reprimován JAZ3. Podobným mechanismem je pravděpodobně řízena většina procesů souvisejících se signální dráhou kyseliny jasmonové (CHICO et al., 2008). Výsledky TSAI et al. (2011) však činí celou situaci komplikovanější. Induktor rezistence kyselina β- aminomáselná (BABA) v rostlinách zablokuje působení bakteriálního efektoru koronatinu. Tento efektor napodobuje konjugát JA s isoleucinem (JA-Ile), nejaktivnější formu JA, a v rostlinách tak indukuje silnou expresi genů regulovaných JA signální dráhou. Doposud se zdálo, že účinek koronatinu a JA-Ile je naprosto stejný. Avšak BABA nedokáže zablokovat působení různých forem JA. Zdá se tedy, že aktivace signální dráhy JA může mít mnoho odlišných výstupů v závislosti na interakci různých forem JA s některým z JAZ proteinů a také na modulaci ostatními signálními drahami. 2.4.3 Etylén Plyn etylén (ET) je považován za hormon, který při obranných reakcích rostliny kooperuje s JA a společně antagonizují signální dráhu SA. Tento model je však zjednodušený a existují i opačné případy kooperace s SA. Etylén tedy ladí obranné mechanismy v závislosti na organismu, který rostlinu napadá a podílí se tak na obraně proti všem skupinám patogenů i škůdců (BROEKAERT et al., 2006). Nejvíce prostudovaná je však společná aktivace signálních drah ET s JA při napadení nekrotrofními patogeny (GLAZEBROOK, 2005). Signální dráha ET je stejně jako v případě SA a JA regulována zejména na úrovni syntézy hormonu. Výchozí látkou je metionin, který je přes meziprodukt S-adenozylmetionin konvertován na 1-aminocyklopropankarboxylovou kyselinu (ACC). Enzym katalyzující druhý krok reakce je ACC syntáza (ACS) (ARGUESO et al., 2007). V A. thaliana je kódován 9 geny (TSUCHISAKA et al., 2009). To je velký kontrast v porovnání s jedním genem regulujícím syntézu SA i JA. Syntéza ET je regulována právě skrz tento enzym a to na transkripční i proteinové úrovni. Exprese genů ACS je specificky indukována různými faktory. Gen ACS2 vykazuje vysokou expresi po napadení nekrotrofními patogeny (BROEKAERT et al., 2006). Stabilita proteinů je regulována fosforylací kinázami MPK6 a CDPK (ARGUESO et al., 2007). ACS je aktivní jako dimer. Jednotlivé proteiny mezi sebou vytváří 45 různých homo- a hetrodimerů z nichž 25 je aktivních (TSUCHISAKA et al., 2009). K čemu rostlině slouží takto složitý regulační systém, 11

2. Současný stav řešené problematiky nazývaný autory symfonický orchestr, není jasné. Vrcholným kouskem této publikace bylo vytvoření rostliny A. thaliana s mutacemi v 8 genech ACS. Protože se různými postupy nepodařilo vytvořit mutanta ve všech genech pravděpodobně kvůli jeho embryonální letalitě, spekuluje se, že samotná ACC by mohla v rostlinách působit jako biologicky aktivní látka. ET totiž není pro rostlinu životně důležitý (TSUCHISAKA et al., 2009). ET se v membráně endoplazmatického retikula a Golgiho aparátu váže na receptory, které přímo interagují s centrálním negativním regulátorem signální dráhy etylénu CTR1. Tato kináza negativně reguluje další dva v kaskádě uspořádané regulační proteiny EIN2 a EIN3. O proteinu EIN2 není známo takřka nic. EIN3 je klíčový transkripční faktor, řídící expresi mimo jiné i ERF1, o němž byla řeč dříve (KENDRICK et al., 2008). Pro zajímavost, aktivita kinázy CTR1 a její interakce s receptory etylénu je inhibována kyselinou fosfatidovou, o níž se diskutuje jako o významné signální molekule, avšak doposud bylo nalezeno jen málo přímých důkazů. Význam fosfolipidů v signální dráze ET není jasný, autoři pouze spekulují o roli kyseliny fosfatidové v iniciaci celé kaskády ET (TESTERINK et al., 2007). 2.4.4 Interakce mezi signálními drahami a další hormony Jak již bylo několikrát podotknuto, obranné signální dráhy neoperují samostatně, nýbrž se vzájemně pozitivně i negativně regulují. Dosavadní informace o propojení jednotlivých signálních drah jsou jen útržkovité a mnoho z nich si i vzájemně odporuje. Robustní analýza celého signálního komplexu, která byla provedena např. na dendritických buňkách myši (AMIT et al., 2009), u rostlin neexistuje. V této složité síti mají svou nezastupitelnou roli i auxiny, kyselina abscisová a další rostlinné hormony (PIETERSE et al., 2009). Hlubší náhled na tuto problematiku je mimo rámec této práce a dále je pojednáno jen o jednom konkrétním případu interakce mezi signálními drahami SA a JA, vztahující se částečně k této práci. Exprese markerových genů signální dráhy JA je inhibována ošetřením SA nebo při infekci biotrofním patogenem. Tento mechanismus je konzervovaný u 18 různých ekotypů A. thaliana, závisí na NPR1 proteinu a je spojen se změnami redoxního potenciálu (KOORNNEEF et al., 2008). Transkripční faktor WRKY70 je indukovaný SA a reprimovaný JA. Časná indukce tohoto genu je nezávislá na NPR1, ale pro maximální expresi je tento protein nezbytný. Konstitutivní exprese WRKY70 má za následek zvýšenou expresi SA-dependentních genů a naopak jeho umlčení způsobí zvýšenou expresi JA-dependentních genů (LI et al., 2004b). Mechanismus vzájemné interakce SA a JA by se tedy zdál být vyřešen, avšak velkou nejasnost do něj vnáší fakt, že pro potlačení JA není nezbytná monomerizace NPR1 (KOORNNEEF et al., 2008). 12

2. Současný stav řešené problematiky 2.5 Indukovaná rezistence a priming Ošetření rostlin patogenními i nepatogenními organismy, látkami pocházejícími z živých organismů, i chemikáliemi může v rostlinách vyvolat rezistenci. Zpravidla nedochází k úplné eliminaci patogena, ale k zmírnění příznaků choroby (HAMMERSCHMIDT, 1999). Tato ošetření zasahují na nejrůznějších místech do obranného systému rostliny. Mohou se vázat na receptory, spouštět nebo blokovat signální dráhy, mimikovat signální molekuly. Jejich účinek se může projevit aktivací stejných obranných mechanismů, jako vyvolává napadení patogenem. Metoda ochrany rostlin založená na stimulaci obranných mechanismů se označuje jako Indukovaná rezistence. Při studiu molekulárních mechanismů mnoha induktorů rezistence často nebyla pozorována indukce většího počtu genů i přes zjevný biologický účinek ošetření. Avšak při následné infekci patogenem došlo u rostlin ošetřených induktorem k rychlejší a intenzivnější obranné reakci. K tomuto fenoménu dochází jak po ošetření některými chemickými induktory, tak při indukci rezistence nepatogenními půdními bakteriemi a bývá označován termínem priming (BECKERS a CONRATH, 2007). Předpokládá se, že priming je založen na akumulaci nebo aktivaci několika málo regulačních uzlů, které nejsou schopny spustit obrannou reakci, ale při napadení patogenem umožní rychlejší odezvu. Jedním z příkladů jsou kinázy MPK3 a MPK6. Po ošetření induktory dochází k jejich zvýšené expresi, ale vzniklá kináza je inaktivní. Následná inokulace patogenem obě kinázy aktivuje. Rostliny s mutací v jednom nebo druhém genu jsou necitlivé k induktorům rezistence (BECKERS et al., 2009). Priming je přirozenou součástí obranného systému rostlin a uplatňuje se i na úrovni společenstev. Napadené rostliny mohou do svého okolí vypouštět těkavé signální molekuly, které spouštějí priming v jejích distálních částech i v okolních rostlinách (KESSLER et al., 2006). O induktorech rezistence bylo publikováno možná několik stovek prací zahrnujících širokou paletu látek od anorganických solí, přes nízkomolekulární organické látky, makromolekuly až po celé organismy. Jejich vyčerpávající přehled je uveden v přehledných článcích SCHREIBER a DESVEAUX (2008) a KÚC (2001) Praktické využití indukované rezistence je zatím u svého zrodu. V četných pokusech mnoho látek i mikroorganizmů průkazně snižovalo napadení patogeny, avšak ne vždy se tento efekt odrazil na výnosu, protože mnoho induktorů působí při účinných koncentracích fytotoxicky (VALLAD a GOODMAN, 2004). 2.5.1 Benzothiadiazol a kyselina β-aminomáselná Komerčně nejúspěšnějším induktorem je bezesporu benzothiadiazol (BTH). Tato látka působí buď jako funkční analog SA, nebo níže v signální kaskádě SA. Každopádně obě látky indukují shodné obranné mechanismy, ale BTH působí při podstatně nižší koncentraci (LAWTON et al., 1996). BTH v podobě komerčního produktu je pod různými názvy prodáváno po celém světě a jeho účinnost byla testována na nejrůznějších rostlinách proti všem 13

2. Současný stav řešené problematiky skupinám patogenů (VALLAD a GOODMAN, 2004). Další látkou, do které jsou vkládány velké naděje, je kyselina β-aminomáselná (BABA). Mechanismus jejího účinku je obtížně uchopitelný, protože v závislosti na rostlině a patogenu jsou vyžadovány různé komponenty signálních drah. Tato látka funguje na principu primingu. V rostlinách, které byly pouze ošetřeny, lze pozorovat jen velmi slabou aktivaci obranných mechanismů. Avšak po inokulaci patogenem dojde mnohem silnější reakci rostliny, než v neošetřených rostlinách (ZIMMERLI et al., 2000). Mechanismus rezistence indukované BABA proti B. cinerea spočívá v primingu SA signální dráhy. Ošetřené rostliny reagují na infekci B. cinerea vyšší expresí SA markerového genu PR-1. V mutantních rostlinách s narušenou SA signální dráhou je ošetření BABA neúčinné. Překvapivě nejsou nezbytné signální dráhy ET a JA (ZIMMERLI et al., 2001). B. cinerea je typickým zástupcem nekrotrofních patogenů, proti nimž působí obranné mechanismy regulované právě ET a JA (GLAZEBROOK, 2005). BABA působí v A. thaliana i proti dalším dvěma nekrotrofům, Alternaria alternata a Plectosphaerella cucumerina. V tomto případě není vyžadována ani funkční signální dráha SA. Avšak k indukci nedocházelo v rostlinách s mutacemi v regulátorech signální dráhy kyseliny abscisové. Exogenní aplikace ABA působila podobně jako BABA a obě látky výrazně zvyšovaly intenzitu ukládání kalózy v infikovaném pletivu (TON a MAUCH-MANI, 2004). Více světla vrhl na celou záležitost screening T-DNA mutagenizovaných rostlin. BABA vyvolává při vysokých koncentracích sterilitu rostlin. Mezi 90.000 mutantními rostlinami byly identifikovány tři rostliny s mutacemi v různých genech, které zůstaly i po ošetření fertilní. Mutant ibs1 má inzerci v genu kódujícím protein podobný cyklin-dependentní kináze a nedochází u něj k primingu SA signální dráhy. Mutant ibs2 je narušen v genu AtSAC6 kódujícím polyfosfoinositol fosfatázu a mutant ibs3 je deficientní v ABA1, klíčovém enzymu biosyntézy kyseliny abscisové. U mutantů ibs2 a ibs3 pro změnu nedocházelo k primingu kalózy a k zvýšené odolnosti k solnému stresu po ošetření BABA (TON et al., 2005). Na základě těchto výsledků se zdá, že BABA na rostliny působí dvěma oddělenými mechanismy. O šest let později se objevil mechanismu třetí. TSAI at al. (2011) zjistili, že BABA brání bakteriálním efektoru koronatinu v otevření průduchů napadené rostliny. Jednoduchým vysvětlením by byl antagonizmus SA signální dráhy stimulované BABA vůči JA signální dráze, skrz kterou koronatin působí. Avšak BABA blokovala otevírání průduchů i v rostlinách narušených v třech různých uzlech SA signální dráhy. 2.6 Kvantitativní rezistence Při šlechtění rostlin se kromě monogenní rezistence využívá i tzv. rezistence kvantitativní (QDR), jejíž fenotyp je dán působením vícero genů. Svým polygenním založením je QDR stálejší než kvalitativní, protože při překonání jednoho genu se nevytváří tak silný selekční 14

2. Současný stav řešené problematiky tlak na populaci patogena. POLAND et al. (2009) navrhují několik hypotéz o mechanismech účinku QDR. Geny podílející se na QDR mohou regulovat vývoj a morfologii rostlin. Mezi tyto faktory patří rychlost vývoje, četnost a tvar průduchů, velikost, tvar a úhel nasazení listů nebo výška rostliny. Jiné geny mohou být součástí imunity vyvolané MAMPs, neboť fenotyp mutací v FLS2 a CERK1 se projevuje jen jako částečné snížení odolnosti k patogenům. Takovéto mutace mohou být přítomny i v odrůdách, kde je jejich fenotyp maskován přítomností genu rezistence. Další možností je, že některé QDR geny mohou být zodpovědné za syntézu toxických sekundárních metabolitů nebo naopak za odbourávání toxinů produkovaných patogenem. QDR geny by mohly být i součástí obranných signálních drah. V rostlinách A. thaliana bylo popsáno několik mutací v regulátorech signálních drah, které ovlivnily rezistenci k patogenům. QDR může být založena také na slabších genech rezistence. U několika rostlin se lokusy QDR nacházely v blízkosti genů rezistence. Nedávno byly identifikovány dva geny z lokusů QDR proti rzím u pšenice. Jedním z nich je ABC transportér s vysokou homologií k PEN3 z A. thaliana. Tento protein se pravděpodobně podílí na transportu sekundárních metabolitů (KRATTINGER et al., 2009). Druhým genem je domnělá kináza s lipid-transferovou doménou. Tento gen není součástí genomu současně pěstovaných odrůd pšenice a předpokládá se, že má velký potenciál posílit rezistenci k Puccinia striiformis (FU et al., 2009) 2.7 Brassica napus a Leptosphaeria maculans Brukev řepka olejka (Brassica napus) společně s dalšími druhy rodu Brassica tvoří jednu z nejvýznamnějších skupin olejnin na světě a je i dominantní olejninou pěstovanou v České republice (POTMĚŠILOVÁ a ADAMEC, 2004). Leptosphaeria maculans je heterotalická, bipolární askomyceta, jejíž anamorfa Phoma lingam byla v polovině 19. století popsána jako původce choroby mnoha brukvovitých rostlin. Na základě agresivity byly izoláty řazeny do dvou skupin. Později byla skupina méně agresivních izolátů vyčleněna jako samostatný druh Leptosphaeria biglobosa (SHOEMAKER a BRUN, 2001). Přestože již v době svého objevu působil tento patogen mnoho škod na brukvovitých plodinách, více pozornosti se mu dostalo až v polovině minulého století, kdy se řepka stala dominantní olejninou v mnoha zemích světa. Epidemie fomové suché hniloby v 60. a 70. letech 20. století vedly téměř k zániku pěstování řepky v Austrálii a k velkým škodám v Severní Americe a Evropě (WEST et al., 2001). 2.7.1 Infekční cyklus L. maculans Infekce hostitele probíhá na podzim, kdy dochází k pohlavnímu rozmnožování jedinců L. maculans přežívajících na posklizňových zbytcích v půdě. Z plodniček se uvolňují askospory, které infikují děložní a pravé listy hostitelské rostliny. Rostoucí hyfy penetrují průduchy 15

2. Současný stav řešené problematiky a kolonizují mezibuněčné prostory uvnitř listu. Po několika dnech začne infikované pletivo nekrotizovat a ve vzniklých lézích se utvářejí pyknidy, jež jsou zdrojem sekundárního inokula. Následně patogen kolonizuje cévní svazky a zcela asymptomaticky prorůstá přes řapík a stonek až do kořenového krčku. Ke konci vegetace se na kořenovém krčku a stonku objevují nekrózy a v extrémním případě způsobí poléhání a předčasnou zralost rostlin. Po sklizni přežívá patogen na zbytcích rostlin a intenzivně je kolonizuje. V půdě může přežívat i několik let. Uvedený životní cyklus platí zejména pro Evropu a v ostatních částech světa se může výrazně lišit v závislosti na klimatických podmínkách a způsobu pěstování řepky (WEST et al., 2001). 2.7.2 Genetika rezistence B. napus k L. maculans Rezistence k časným fázím infekce L. maculans je založena monogenně, zatímco ve stádiu nekrózy kořenového krčku se uplatňuje polygenní rezistence. Právě monogenní rezistence se v minulosti stala hlavním nástrojem ochrany řepky před L. maculans, avšak ukázala se jako velmi nestálá. L. maculans rezistenci rychle překonává díky eliminaci genů avirulence v populaci patogena (ROUXEL a BALESDENT, 2005). Doposud bylo nalezeno 11 genů rezistence a 9 korespondujících genů avirulence (AvrLm1-9). Tři geny avirulence, AvrLm1 (GOUT et al., 2006), AvrLm6 (FUDAL et al., 2007) a AvrLm4-7 (PARLANGE et al., 2009), byly naklonovány. Všechny tři kódují malé proteiny s neznámou funkcí a predikovanou sekrecí z buňky. Vykazují konstitutivní expresi s nárůstem v počátečních fázích infekce. Nacházejí se v izolovaných lokusech obklopených nekódujícími sekvencemi repetetivní DNA. AvrLm1 je jediný gen v úseku 269 kb. Na stejně dlouhém úseku chromozomu se v A. thaliana nachází v průměru 46 genů. Rezistence založená na Rlm1 byla ve Francii překonána během tří let. Analýza 290 avrlm1 izolátů z celého světa nalezla u 90 % z nich podobnou, 260 kb dlouhou deleci a to i v izolátech pocházejících z doby před pěstováním Rlm1 odrůd. To potvrzuje domněnku, že překonání rezistence není založeno na nově vzniklých mutacích v Avr genech, ale pouze na rozšíření již existujících virulentních populací (GOUT et al., 2007). Produkt genu AvrLm4-7 je rozpoznáván nezávisle dvěma R-geny Rlm4 a Rlm7. Bodová mutace v AvrLm4-7 způsobila, že protein není nadále rozpoznáván proteinem Rlm4, avšak rozpoznání proteinem Rlm7 zůstalo zachováno (PARLANGE et al., 2009). AvrLm4-7 je pravděpodobně rozpoznáván přímo, protože kdyby byl rozpoznáván produkt jeho katalytické aktivity, musela by mutace způsobit i ztrátu specifity Rlm7. Lze se domnívat, že protein AvrLm4-7 je pro L. maculans nezbytný, a proto nebylo možné překonat rezistenci delecí celého genu jako v případě AvrLm1. Tuto myšlenku potvrzují i výsledky HUANG et al. (2010). Ztráta genu AvrLm4-7 vede ke značnému snížení schopnosti infikovat náchylné rostliny (bez genů Rlm4 a 7). Ztráta AvrLm1 má také analogický efekt, ale výrazně slabší. Tento fakt zároveň potvrzuje předpoklad, že geny avirulence AvrLm1 a AvrLm4-7 jsou efektory 16

2. Současný stav řešené problematiky napomáhající infekci. Nedávno byl odhalen fascinující mechanismus, který L. maculans využívá, aby unikla rozpoznání geny rezistence. Zároveň tento objev popírá výše uvedené tvrzení o mechanismech eliminace genů avirulence z populace patogena. VAN DE WOUW et al. (2010) porovnávali australské izoláty L. maculans z období kolem roku 2003, kdy v Austrálii došlo k prolomení rezistence založené na Rlm1. Zjistili, že kromě překonání rezistence založené na Rlm1 došlo i k překonání Rlm6, ačkoliv tento gen nebyl v odrůdách přítomný a tudíž na AvrLm6 nepůsobil selekční tlak. V izolátech odebraných po roce 2004 byly v genech AvrLm1 i AvrLm6 nalezeny bodové mutace, které nebyly detekovány v žádném ze 137 izolátu získaných před rokem 2003. Oba geny se společně s 5 dalšími nachází v jedné oblasti s bohatým zastoupení retrotranspozonů. Tyto elementy jsou cílem aparátu specifického pouze pro askomycety, který skrz metylaci nukleotidů indukuje bodové mutace. L. maculans zřetelně využívá tohoto atypického prostředí na chromozomu k indukci mutací v genech avirulence a nesmírným způsobem tak zrychluje jejich evoluci. Ve snaze vyšlechtit odrůdy se stabilnější rezistencí k L. maculans se v posledních letech využívá stále více kvantitativní rezistence. Několik odrůd, zejména Darmor a Jet Neuf, vykazují vysoký stupeň rezistence i při napadení virulentním izolátem (DELOURME et al., 2006). Jak již bylo zmíněno dříve, kvantitativní rezistence k L. maculans se projevuje až ve velmi pozdních fázích infekce, kdy dochází ke kolonizaci kořenového krčku. V průběhu podzimní infekce není mezi odrůdami s nízkou a vysokou úrovní kvantitativní rezistence rozdíl ani v počtu lézí, ani v množství mycelia v pletivu. Rozdíl v intenzitě kolonizace pletiva se objevuje až během dlouhé asymptomatické fáze kolonizace stonku (HUANG et al., 2009). Tato skutečnost komplikuje studium mechanismů podílejících se na kvantitativní rezistenci i samotné šlechtění, protože selekci je možné provádět až po sklizni hodnocením napadení kořenových krčků nebo během jarní vegetace metodou kvantifikace mycelia pomocí PCR (HUANG et al., 2009) 2.7.3 Obranné mechanismy podílející se na rezistenci k L. maculans Zatímco genetika rezistence B. napus k L. maculans je již dlouhou dobu intenzivně studována, o molekulárních mechanismech zprostředkujících rezistentní projev se neví takřka nic. Při obraně rostlin řepky proti L. maculans má důležitou úlohu signální dráha kyseliny salicylové. Ošetření rostlin benzothiadiazolem a preinokulace avirulentní bakterií zvyšuje odolnost rostlin jak k bakterii Pseudomonas syringae pv. maculicola, tak k L. maculans. Tento účinek trvá nejméně tři týdny. V obou případech byla zvýšená odolnost spojená s indukcí genů PR-1 a PR-2. Transgenní rostliny nesoucí bakteriální gen pro salicylát hydroxylázu, enzym hydrolyzující SA na katechol, nereagovaly na ošetření ani zvýšenou expresí, ani odolností vůči napadení (POTLAKAYALA et al., 2007). Mnohem více informací pochází ze studií na modelové rostlině Arabidopsis thaliana. Ze 168 testovaných 17

2. Současný stav řešené problematiky ekotypů L. maculans vykazuje mírné příznaky náchylnosti pouze jediný (An-1). Ani mutace v signálních dráhách SA, JA a ET nenarušují rezistentní fenotyp rostlin (BOHMAN et al., 2004). Křížením rezistentních ekotypů Col-0 a Ler byl získán jedinec náchylný k L. maculans zastoupený v F2 populaci v poměru 1:15, což indikovalo přítomnost dvou různých genů zodpovědných za rezistenci, z nichž každý byl přítomný pouze v jednom z ekotypů. Následným mapováním byly tyto geny identifikovány jako typické geny rezistence se strukturou NB-LRR, označené RLM1 a RLM2. Rezistence řízená těmito geny je založena především na depozici kalózy. Když byly do rostlin rlm1/rlm2 introdukovány mutace v uzlech signálních drah SA, ET a JA, byl podíl těchto drah na rezistenci již patrný. Signální dráha SA se neúčastní obranných reakcí ani v genetickém pozadí rlm1/rlm2, zatímco dráha JA se zdá být klíčovou. Mutace v hlavním regulátoru dráhy JA coi1 způsobila extrémně náchylný fenotyp. Naproti tomu ET reguluje obranné reakce negativně. Introdukce mutace ein2 do mutantů coi1 výrazně zmírnila náchylnost rostlin (PERSSON et al., 2009). Do rezistence A. thaliana k L. maculans je zapojena i signální dráha kyseliny abscisové. Několik mutantů s narušnou signalizací v této dráze vykazuje náchylný fenotyp i v genetickém pozadí ekotypu Col-0. (KALIFF et al., 2007) Od roku 2011 patří L. maculans mezi úzkou skupinu patogenů rostlin se známým genome (Rouxel et al., 2011). 18

3. Cíle 3. Cíle V této práci jsme chtěli odhalit molekulární mechanismy řídící rezistenci rostlin B. napus k patogenu L. maculans. Analýzou rostliných hormonů, sledováním genové exprese a farmakologickými experimenty jsme se pokusili identifikovat signální dráhy, které hrají klíčovou roli v regulaci obranných reakcí vyvolaných rozpoznáním genu avirulence AvrLm1. Pomocí reportérových genů a molekulárních metod kvantifikace patogena jsme chtěli detailně porovnat průběh infekce při kompatibilní a inkompatibilní interakci řepky s L. maculans. Současně jsme se snažili izolovat další látky produkované L. maculans, které rostlina rozpoznává a reaguje na ně aktivací obranných mechanismů. Druhým dílčím úkolem byl screening širokého spektra látek, které by řepce mohly indukovat rezistenci k L. maculans i dalším patogenům, s cílem praktického využití. Inokulačními testy v laboratorních podmínkách jsme testovali extrakty z rostlin, známé chemické induktory, či odpadní produkty potravinářského a kožedělného průmyslu. Poznatky získané ze studia interakce L. maculans s B. napus jsme chtěli využít pro objasnění mechanismu působení nalezených účinných látek. 19

4. Metody 4. Metody 4.1 Rostliny a Leptosphaeria maculans Rostliny řepky Brassica napus byly pěstovány hydroponicky v perlitu AGRO (Perlit Praha s.r.o.) a Steinerově živném roztoku (STEINER 1984) v režimu 14 hodin den (150 µe.m 2.s -1, 23 C), 10 hodin noc (18 C). Semena odrůdy Columbus poskytla firma Dekalb a odrůdy Westar a Hanna prof. Christina Dixelius (SLU Uppsala, Švédsko). Veškeré rostliny pro pokusy, ve kterých byly srovnávány izoláty JN2 a JN3, byly pěstovány v kultivačním boxu AR-36L3 (PERCIVAL) se stálou relativní vlhkostí 65 %. Pro ostatní pokusy byly rostliny pěstovány v kultivační místnosti bez řízené vlhkosti, která se pak pohybovala mezi 30-70 %. Rostliny Arabidopsis thaliana Col-0 byly pěstovány v rašelinových tabletách Jiffy 7 v režimu 8 hodin den (250 µe.m 2.s -1, 22 C), 16 hodin noc (22 C) v kultivačním boxu AR-36L3 (PERCIVAL) se stálou relativní vlhkostí 65 %. Izoláty Leptosphaeria maculans JN2 (v23.1.2) a JN3 (v23.1.3) poskytl Dr. Thierry Rouxel (INRA, Francie). Jejich charakteristika je popsána v Balesdent et al. (2001). Izolát hon č.40 poskytla Ing. Eva Plachká (VÚOl Opava). Životaschopnost izolátů byla zvýšena krátkodobou kultivací na děložním listu sterilně pěstované řepky položeném na plotně s agarem V8. Pro přípravu inokula bylo mycelium krátkodobě kultivováno na zpevněném živném médiu ze zeleninové šťávy V8. Příprava spor vychází z publikované metody (ANSAN-MELAYAH et al., 1995). Agar V8 s mladým myceliem byl nejprve rozmačkán skleněnou lopatkou a poté rozetřen na nové plotně s V8 agarem v co nejtenčí vrstvě. Následně byly plotny zalepeny prodyšnou chirurgickou páskou a inkubovány v kultivačním boxu při stejných podmínkách, jaké byly použity pro kultivaci řepky. Po 6 dnech byla chirurgická páska nahrazena parafilmem, aby nedošlo k úplnému vyschnutí agaru. Po 11 dnech byly plotny za sterilních podmínek převrstveny vodou a spory byly z pyknid uvolněny třením skleněnou lopatkou. Suspenze byla poté zfiltrována přes několik vrstev gázy do sterilní 50 ml zkumavky a doplněna vodou do 50 ml. Kvůli odstranění fytotoxických látek byla suspenze odstředěna 10 min při 1000 g a supernatant byl nahrazen 20 ml sterilní vody. Koncentrace spor byla spočítána v Bürkerově komůrce a suspenze byla naředěna na konečnou koncentraci 10 8 spor/ml. Spory určené k inokulaci rostlin byly uchovávány při -20 C po dobu nejdéle 6 měsíců. Spory pro inokulaci tekutého média a dlouhodobé uchování izolátů byly zmraženy v 20 % glycerolu a uloženy v -70 C. Před prvním použitím spor byla vždy ověřena jejich virulence na děložních listech řepky. Agar V8 zeleninová šťáva V8 CaCO 3 agar celkový objem 200 ml 3 g 20 g 1000 ml 20