Využití plynové chromatografie v kontrole léčiv IV

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv Využití plynové chromatografie v kontrole léčiv IV Diplomová práce Hradec Králové 2009 Eva Kratochvílová

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. V Hradci Králové dne 15.4.2009 podpis

Na tomto místě bych ráda poděkovala PharmDr. Radimovi Kučerovi, PhD. za odborné vedení, cenné rady a pomoc při vypracování této diplomové práce.

OBSAH 1. ÚVOD. 1 2. TEORETICKÁ ČÁST..2 2.1. Úvod k plynové chromatografii..3 2.2. Rozdělení plynové chromatografie.3 2.2.1. Klasifikace podle druhu stacionární fáze.3 2.2.2. Klasifikace podle pracovních technik..4 2.3. Popis chromatogramu.5 2.4. Části plynového chromatografu..9 2.4.1. Nosný plyn...9 2.4.2. Chromatografické kolony..10 2.4.3. Detektory...12 2.5. Kvalitativní analýza..14 2.6. Kvantitativní analýza 14 2.6.1. Metoda normalizace..14 2.6.2. Metoda kalibrační křivky...14 2.6.3. Metoda vnitřního standardu...15 2.6.4. Metoda vnějšího standardu 15 2.7. Validace analytické metody..16 2.7.1. Validační parametry..16 2.8. 1,3-butandiol a jeho vlastnosti..20 3. CÍL PRÁCE.21 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST..23 4.1. Použité chemikálie, přístroje, programové vybavení, pomůcky..24 4.2. Příprava pracovních roztoků.25 5. VÝSLEDKY A DISKUZE.26 5.1. Podmínky na koloně.27 5.2. Změna splitovacího (dělícího) poměru.31 5.3. Kvantifikace metody.33 5.3.1. Metoda vnitřního standardu...33

5.3.2. Metoda normalizace..36 5.4. Validace metody...39 5.4.1. Linearita.39 5.4.2. Přesnost..43 5.4.3. Reprodukovatelnost...45 5.4.4. Robustnost.48 5.4.5. Stabilita 1,3-butandiolu.58 5.4.6. Určení LOD a LOQ...59 6. ZÁVĚR 61 7. SOUHRN, SUMMARY..63 8. LITERATURA 66

1.ÚVOD

Chromatografické separační metody jsou vícestupňové separační metody, kde složky vzorku jsou rozdělovány mezi dvě fáze, z nichž jedna je stacionární a druhá je mobilní. Stacionární fází může být pevná látka nebo kapalina nanesená na tuhý nosič nebo gel. Stacionární fáze může být naplněna do kolon, rovnoměrně rozprostřena do vrstvy filmu atd. Mobilní fáze může být plynná, kapalná nebo kapalina v superkritickém stavu. 1. Chromatografické metody jsou široce využívány v analýze léčiv. Umožňují jak kvalitativní, tak kvantitativní hodnocení separovaných složek směsi, a to s vysokou selektivitou, citlivostí a v relativně krátkém čase. 18 Plynová chromatografie je separační metoda založená na rozdílu v distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze: mobilní fází je nosný plyn pohybující se skrz nebo podél stacionární fáze, která je umístěná v koloně. Je použitelná pro látky nebo jejich deriváty, které lze převést do plynné fáze za použitých teplot. Plynová chromatografie je založená na mechanismu adsorpce, rozdělování nebo vylučování. 1 Tato diplomová práce se zabývá nalezením optimálních podmínek pro stanovení čistoty vzorku 1,3-butandiolu (1,3-BD). A dále validací této metody. 1

2. TEORETICKÁ ČÁST 2

2.1. Úvod k plynové chromatografii Plynová chromatografie (GC) je separační metoda, která k separaci látek v plynné fázi využívá dvě heterogenní fáze. Mobilní fází je zpravidla inertní plyn. Stacionární fází je nejčastěji kapalina zakotvená na inertním nosiči, méně často povrchově aktivní adsorbent. Značnou výhodou plynové chromatografie vůči ostatním chromatografickým metodám je použití plynu jako mobilní fáze. Nosný plyn je málo viskózní a je stlačitelný. Difúzní koeficienty složek v plynech jsou mnohem větší než v kapalinách a interakce molekul v plynné fázi jsou ve většině případů podstatně menší než v kapalné fázi. 2 2.2. Rozdělení GC 2.2.1.Klasifikace podle druhu stacionární fáze Podle druhu heterogenní soustavy dělíme plynovou chromatografii na chromatografii systému plyn-tuhá fáze (GSC), kde stacionární fází je povrchově aktivní látka (např. aktivní uhlí, silikagel, molekulová síta, porézní skla) a na chromatografii plyn-kapalina (GLC), kde stacionární fází je kapalinový film zakotvený na inertním nosiči. Z hlediska konstrukce přístroje a pracovního postupu při analýze není zásadní rozdíl mezi oběma typy chromatografií. Podstatný rozdíl tkví ve způsobu separace, neboť v případě GSC je distribuce mezi obě heterogenní fáze založena na adsorpci, zatímco v případě GLC na rozpouštění. Stupeň distribuce mezi stacionární a mobilní fází lze vyjádřit distribuční konstantou K D KD c c s m c s..rovnovážná koncentrace látky v jediné definované formě v stacionární fázi c m.rovnovážná koncentrace látky v téže formě mobilní fáze Za daných pracovních podmínek při konstantní teplotě, tlaku a průtokové rychlosti je rychlost průchodu složek kolonou jednoduchou funkcí distribuční konstanty. Čím 3

vyšší je hodnota K D, tím silněji je složka vázána (adsorbována či absorbována) stacionární fází a zadržována v koloně. Pro separaci látek ze směsi je tedy jedním z důležitých faktorů požadavek, aby příslušné distribuční konstanty jednotlivých složek byly rozdílné. K D je závislá nejen na teplotě, ale většinou též na koncentraci sorbující se látky. Distribuce v celém koncentračním rozmezí je pro danou teplotu vyjádřena příslušnými adsorpčními resp. rozpouštěcími izotermami. Pro GC jsou vztahy mezi jednotlivými typy izoterem a chromatografickou křivkou velmi důležité a to jak pro analytickou aplikaci, tak pro fyzikálně chemická měření. Z analytické hlediska je užitečné srovnání 3 základních typů izoterem s tvary píků. Nejúčinnějšího chromatografického rozdělení lze dosáhnout v případě, kdy distribuce je dána lineárním průběhem izotermy, kterému odpovídá symetrická křivka. V tomto případě nedochází se změnou koncentrace sorbátu k posunu maxima křivky. Konkávnímu průběhu izotermy odpovídá nesymetrická chvostující křivka; poloha maxima této křivky závisí na velikosti dávkovaného vzorku. Konvexní izoterma je v úzkém vztahu k nesymetrickému píku, jehož přední frontální část je rozšířena. Také v tomto případě závisí poloha maxima křivky na koncentraci sorbátu. 3 2.2.2. Klasifikace podle pracovních technik Praktická měření lze provádět několika základními pracovními technikami, které se liší v postupu, jakým je realizován transport analyzované směsi kolonou. 2.2.2.1. Eluční metoda Eluční metoda je založena na vymývání jednorázově dávkovaného vzorku nosným plynem. Vzorek se dávkuje najednou do proudu nosného plynu před vstupem do kolony. Z kolony vychází nejdříve ta složka, která se nejméně zachycuje na stacionární fázi. Čas, za který složka vyjde z kolony, je za daných experimentálním podmínek pro ni charakteristický. Tato technika je zdaleka nejběžnější. 4

2.2.2.2. Frontální metoda Frontální metoda je založena na kontinuálním přivádění vzorku do kolony. První z kolony začne vycházet nejméně sorbovaná látka. Postupně se k ní přidávají další, až po nejvíce sorbovanou. Nakonec z kolony vychází směs vzorku s nosným plynem o původním složení. 2.2.2.3. Vytěsňovací metoda Vytěsňovací metoda je opět založena na jednorázovém dávkování vzorku do proudu nosného plynu před vstupem do kolony. Nosný plyn je sycen vytěsňujícím činidlem, což jsou páry látky, která se v koloně sorbuje silněji než kterákoliv složka vzorku. Vytěsňující činidlo tlačí tyto složky před sebou. V koloně se uspořádají za sebou zóny od nejméně se sorbující složky po vytěsňující činidlo. 4 2.3. Popis chromatogramu Chromatogram představuje grafický záznam odezvy detektoru, koncentrace eluované látky nebo jiné veličiny použité jako měřítko této koncentrace v závislosti na čase, objemu nebo vzdálenosti. Idealizovaný chromatogram představuje řada gaussovských píků na základní linii. 1 2.3.1. Retenční data 2.3.1.1. Retenční čas Celková doba, po kterou setrvává složka v koloně, se nazývá retenční čas t R t R t M t' R t M doba, kterou stráví molekula složky v mobilní fázi (mrtvý retenční čas) t R doba strávená molekulou složky ve stacionární fázi (korigovaný retenční čas) 5

2.3.1.2. Retenční objem Jestliže retenční čas vynásobíme objemovým průtokem nosného plynu F c, měřeným při teplotě kolony nebo na tuto teplotu korigovaným, získáme retenční objem V R VR tr F c Obdobně jako pro retenční čas platí i pro retenční objem V R V M V' R V M mrtvý retenční objem V M =t M F c V R redukovaný retenční objem 3 2.3.2. Chromatografická data 2.3.2.1. Faktor symetrie píku Faktor symetrie píku A s (nebo faktor chvostování píku) se vypočítá podle vzorce: As w 2d 0,05 w 0,05 šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky d..vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky. Hodnota faktoru symetrie 1,0 značí úplnou (ideální) symetrii píku. 1 2.3.2.2. Účinnost kolony a zdánlivý počet teoretických pater Účinnost chromatografické kolony se vyjadřuje bezrozměrnou veličinou N, která se nazývá počet teoretických pater. 2 Teoretické patro představuje jedno rovnovážné rozdělení složky mezi mobilní a stacionární fázi. Účinnost je kvalitativní termín používaný k vyjádření rozsahu počtu teoretických pater v koloně. 5 Čím větší je N, tím méně se zóna složky rozšíří během průchodu kolonou a tím je chromatografická kolona účinnější. 6

K porovnání kolon různých délek se používá výškový ekvivalent teoretického patra H: H L N L délka kolony Výškový ekvivalent teoretického patra má rozměr délky a lze jej označit jako délku kolony připadající na jedno teoretické patro. 2 Závislost výšky teoretického patra (HETP) na průměrné lineární rychlosti pro daný typ nosného plynu lze získat z van Deemterových grafů. 4 Obr. č.1 znázorňuje profily pro vodík, helium a dusík jako nosný plyn. Křivky znázorňují závislost HETP (délku kolony rozdělenou na celkový počet teoretických pater) na průměrné lineární rychlosti průtoku nosného plynu kolonou. Nejnižší bod křivky udává rychlost průtoku nosného plynu, při které je dosaženo nejvyšší účinnosti kolony. Vodík je nejrychlejší nosný plyn (u opt : 40cm/s) a má nejplošší van Deemterův profil. Helium má podobné vlastnosti jako vodík. Použití dusíku je nižší pro kapilární kolony a není příliš používán pro nízkou optimální rychlost průtoku (12cm/s). 6 Obr. č. 1- Závislost výšky teoretického patra na průměrné lineární rychlosti pro daný typ nosného plynu 7 7

2.3.3.Separační data 2.3.3.1.Rozlišení Podstatou problému v chromatografii je dosáhnout separace složek vzorku. Rozdělení může být dokonalé nebo neúplné a je vhodné tento stupeň kvantitativně vyjádřit. V praxi se používá míra relativní separace dvou sousedních píků j,i-rozlišení R ij. R ij trj tri 0, 5 Yj Yi t Rj, t Ri retenční časy složek j a i Y j,y i odpovídající šířky píků na úrovni nulové linie Rovnice definuje rozlišení jako vzdálenost vrcholů dvou sousedních píků dělenou průměrnou šířkou těchto píků na úrovni nulové linie. Rozlišení je veličina bezrozměrná. Větší hodnota rozlišení znamená lepší separaci dvou složek a naopak. 2 Teprve při hodnotě R ij =1,5 hovoříme o separaci na základní linii. 8 2.3.3.2. Přesnost kvantitativní analýzy Poměr signálu k šumu S/N, který ovlivňuje přesnost stanovení obsahu složek, se vypočítá podle vzorce: 2H S / N h H výška píku odpovídající dané složce na chromatogramu předepsaného porovnávacího roztoku měřenou od vrcholu píku k extrapolované základní linii signálu, který se sleduje na vzdálenosti rovné dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky h rozpětí šumu pozadí na chromatogramu získaného při slepé zkoušce a zaznamenávaného na vzdálenosti rovné dvacetinásobku šířky píku v polovině jeho výšky předepsaného porovnávacího roztoku, a to pokud možno rovnoměrně na obě strany od místa, kde by se měl nacházet sledovaný pík. 1 8

2.4. Části plynového chromatografu 2.4.1. Nosný plyn Mobilní fází v plynové chromatografii je inertní plyn nejčastěji helium, dusík a vodík, obecně označované jako nosný plyn. Na rozdíl od ostatních separačních metod se mobilní fáze, nosný plyn v plynové chromatografii, neúčastní slabých interakcí s analytem. 2 Nosný plyn má důležitý vliv na separaci, které chceme dosáhnout. Ze tří nejčastěji používaných plynů nabízí vodík 2 výhody- optimální lineární rychlost průtoku je vyšší než u helia a dusíku, umožní tedy kratší dobu separace, a vyšší průtoková rychlost má menší vliv na citlivost kolony než u helia a dusíku. 9 Hlavním kritériem výběru nosného plynu jsou požadavky měřícího systému. Zatímco optimální výběr nosného plynu z hlediska separačního procesu je určen potlačením difúzních dějů, je kritérium měřícího systému určeno podmínkou nejvyšší citlivosti měření. 10 Retenční čas dané složky a účinnost kolony závisí na průtokové rychlosti nosného plynu. Retenční čas je přímo úměrný délce kolony a rozlišení je úměrné druhé mocnině délky kolony. 1 Pro regulaci konstantního průtoku nosného plynu jsou používány regulátory mechanické a elektronické, regulující: konstantní vstupní tlak (konst.p i ), nebo konstantní hmotnostní průtok (konst. F). 10 Splitování, splitovací poměr Splitování je technika nástřiku, při které je směs vzorku a nosného plynu v injektoru rozdělena na dvě nestejné části. Menší část vstupuje na kolonu, větší část odchází do odpadu. 4 Používá se pro koncentrované, znečištěné vzorky, dostáváme ostrou zónu vzorku na koloně. Nelze sledovat stopové množství látky. 11 Splitovací poměr (split ratio) závisí na relativní velikosti průtoku splitovacím ventilem a kolonou. Nástřik bez splitu (splitless injection) se používá při stopové analýze. 9

2.4.2. Chromatografické kolony Plynová chromatografie je separační metoda, a proto je rozhodující součástí zařízení chromatografická kolona, ve které se vzorek rozděluje na složky. Chromatografické kolony lze charakterizovat jako: - kolony plněné chromatografickou náplní (tzv.náplňové kolony) - kolony kapilární Náplňové kolony lze rozdělit na klasické a mikronáplňové. Klasické náplňové kolony jsou trubice naplněné adsorbentem (GSC) nebo stacionární fází na inertním nosiči (GLC) pokrytou kapalnou fází. Jsou vyrobeny z oceli, skla, atd. Příklady náplní adsorbentů jsou silikagel, grafitizované saze, oxid hlinitý. Nosiče kapalné fáze pro rozdělovací chromatografii bývají na bázi křemeliny (oxid křemičitý). 4 Délka kolony se volí podle toho, jaký problém je třeba řešit, a zpravidla je v rozmezí 30 až 400 cm. Vnitřní průměr analytických kolon je 2 až 4 mm. Na preparativní účely se používají větší průměry. Mikronáplňové kolony se nejčastěji zhotovují ze skla. Délka kolon je zpravidla větší než u klasických náplňových kolon. Vnitřní průměr je asi 1 mm. 2 Kapilární kolony mohou být křemenné, ocelové, skleněné. Využívají jako nosiče stacionární fáze své vnitřní stěny. Pro většinu aplikací postačuje délka kapilární kolony 30 m. Vnitřní průměr bývá 0,2-0,75 mm. 4 Typy kapilárních kolon (viz. Obr. č.2): a- kolony s kapalinou zakotvenou na vnitřních stěnách kapilární trubice (typ WCOT). Tloušťka kapalného filmu bývá v rozmezí 0,01 μm až 5 μm. Vnitřní průměr tohoto typu kolon se pohybuje obvykle od 50 μm až do 1 mm. b- kolony s kapalinou zakotvenou na nosiči, který je zachycený na vnitřních stěnách kapiláry (typ SCOT). Tloušťka vrstvy náplně je 1 až 5 μm. 10

c- Kolony s adsorbentem, který je zachycen na vnitřních stěnách kapiláry ( typ PLOT 1 ). Tloušťka vrstvy adsorbentu závisí na způsobu výroby a může být v rozmezí 0,01 μm až 10 μm. 2 - jsou široce používány pro analýzu a separaci nízkomolekulárních uhlovodíků 12 Obr. č. 2 Kapilární kolony typu WCOT, SCOT, PLOT 11 Volba stacionární fáze je obvykle rozhodující pro výběr vhodné kolony pro konkrétní vzorek. Důležitá je polarita separovaných složek. Pro nejběžnější analýzy směsí alkanů se používají nepolární kapilární kolony. K separacím polárních molekul, které obsahují na uhlíkovém řetězci jeden nebo více atomů Cl, Br, F, N, O, P nebo S, a polarizovatelných molekul, které obsahují jednu nebo více násobných vazeb mezi uhlíky (alkeny, areny), použijeme středně polární kapilární kolony. 4 Na přípravu přípravu křemenných kapilárních kolon pro rozdělovací GC se používají inertní kapalné stacionární fáze, které řadíme mezi polysiloxany, polyglykoly, polyethylenethery a nepolární rozvětvené uhlovodíky. Stacionární fáze se fyzikálně nebo chemicky kotví na vnitřní stěnu kolon. 11

Typy stacionárních fází: - nepolární: např. (100%) dimethylpolysiloxan, (5%) difenyl-(95%)- dimethylpolysiloxan - semipolární: např. (35%) difenyl-(65%)-dimethyl-polysiloxan, (50%) kyanopropyl-fenyl-(50%)-dimethylpolysiloxan - polární: (100%) polyethylenglykol, (33%) kyanopropyl-methyl- (67%)- dimethylpolysiloxan 13 Kolona je umístěna v temperovaném prostoru. Teplota je důležitá proměnná v plynové chromatografii. Pokud je teplota během analýzy konstantní, jedná se o izotermální analýzu. Naproti tomu pro analýzu vzorků multikomponentních směsí látek z rozdílnými body varu je vhodné použití teplotního gradientu. Výhodou použití teplotního gradientu je zlepšení tvaru chromatografických píků ( zúžení signálu, vyšší citlivost) a výrazné zkrácení doby analýzy. 4 2.4.3. Detektory Detektory jsou zařízení, jejichž úkolem je detegovat v nosném plynu složky, které opouštějí chromatografickou kolonu. Od detektoru se vyžaduje rychlá odezva, velká citlivost a stabilita základního (nulového) signálu. Podle dějů, které probíhají při detekci, je možno detektory rozdělit na nedestrukční a destrukční. V nedestrukčních látka prochází detektorem bez toho, aby se chemicky změnila. 2 2.4.3.1.Tepelně vodivostní detektor (TCD) TCD detektor je univerzální, nedestruktivní detekční systém. Principem detekce je odvod tepla z rozžhaveného odporového vlákna. Změnou teploty vlákna se mění elektrický odpor, který se zaznamená měřícím zařízením. 2.4.3.2.Plamenově ionizační detektor (FID) FID je nejpoužívanějším detektorem v plynové chromatografii. K ionizaci molekul vymývaných z kolony dochází v plazmě vodíkového plamene, který hoří mezi dvěma 12

elektrodami. V čistém kyslíkovodíkovém plameni je jen velmi málo iontů (asi 10 7 iontů v 1 cm 3 ). Obsah iontů však velmi vzrůstá již za přítomnosti stopových množství uhlovodíků. Tepelnou energií, která se uvolňuje při hoření, se štěpí chemické vazby organických látek za vzniku radikálů, které reagují s vodíkem v redukční zóně plamene za vzniku radikálů CH iontů CHO+ a elektronů. CH... V oxidační zóně plamene se tyto radikály oxidují za vzniku FID není citlivý na sloučeniny, které termickým štěpením neposkytují radikály. Jeho odezva závisí tedy na počtu uhlíkových atomů v molekule. Heteroatomy v molekulách organických látek se uplatňují specifickými interakcemi, které zpravidla snižují odezvu detekce. 2.4.3.3. Termoionizační detektor (TID) Principem detekce je měření koncentrace iontů alkalického kovu v efektivním prostoru detektoru. Koncentrace iontů je úměrná proudu, který prochází mezi polarizovanými elektrodami. 2.4.3.4. Detektor elektronového záchytu (ECD) Principem detekce je zachycování elektronů elektronegativními atomy, funkčními skupinami nebo molekulami. Jestliže se zachycování elektronů realizuje v elektrickém poli, změní se v něm přenos náboje a zvýší se pravděpodobnost rekombinace iontů, což se projeví poklesem ionizačního proudu. 2 2.4.3.5. Hmotnostní spektrometr (MS) Principem MS je ionizace neutrálního atomu či molekuly za vzniku iontů a jejich fragmentů, které jsou dále separovány a detekovány na základě poměru m/z, kde m je hmotnost iontu a z je náboj iontu. MS patří mezi detektory s univerzální citlivostí 1ng až 10 pg. 14 13

2.5. Kvalitativní analýza Chromatografie je metoda separační a sama o sobě má omezené možnosti kvalitativní analýzy. Důkazem přítomnosti určité složky může být shodnost jejího retenčního času s retenčním časem určitého standardu. I když měření byla provedena za zcela stejných podmínek, nelze prostou shodu retenčních časů považovat za důkaz identity složky. Mnohem přesnější je spojení GC-MS. 2 2.6. Kvantitativní analýza Pro určení obsahu složky v analyzovaném vzorku se používá několik typů metod. 2.6.1. Metoda normalizace Obsah jedné nebo více složek zkoušené látky v procentech se vypočítá z plochy píku nebo píků jako procento celkové plochy všech píků, s výjimkou píků rozpouštědel nebo jakýchkoliv přidaných činidel a píků, jejichž plocha je pod limitem zanedbatelnosti. 1 Výhodou této metody je, že výsledky nezávisí na přesnosti objemu při nástřiku vzorku. 4 Předpokladem je stejná závislost odezvy na koncentraci (obsahu) pro všechny jednotlivé složky analyzované směsi. 15 2.6.2. Metoda kalibrační křivky Stanoví se vztah mezi měřeným a vyhodnocovaným signálem (y) a množstvím (koncentrace, hmotnost, atd.) stanovované látky (x) a vypočítá se kalibrační funkce. Výsledky analýzy se vypočítají ze změřeného nebo vyhodnoceného signálu stanovované látky pomocí inverzní funkce. 1 Protože u této metody je kritický objem nástřiku, závisí správnost metody na dobré reprodukovatelnosti dávkovaných objemů. 4 14

2.6.3. Metoda vnitřního standardu Ke zkoušenému roztoku a porovnávacímu roztoku se přidají stejná množství látky, kterou lze rozlišit od zkoušené látky (vnitřní standard). Vnitřní standard nesmí reagovat se zkoušenou látkou, musí být stálý a nesmí obsahovat nečistoty s retenčním časem podobným retenčnímu času zkoušené látky. Koncentrace zkoušené látky se stanoví porovnáním poměru ploch píků nebo výšek píků stanovované látky a vnitřního standardu pro zkoušený roztok a odpovídajícího poměru pro porovnávací roztok. 1 Výhodou této metody je, že není potřeba přesně znát dávkované množství do chromatografu, ale pouze relativní odezvu detektoru. 2 2.6.4. Metoda vnějšího standardu Tato metoda spočívá ve dvou krocích (dvojím dávkování). V prvním kroku se na kolonu nastříkne roztok analyzovaného vzorku a po registraci chromatografického záznamu se v druhém kroku nastříkne roztok vnějšího standardu a opět se registruje jeho chromatogram. Jako vnější standard se zpravidla používá u substancí standard stanovované látky, označovaný CRL (chemická referenční látka), nebo u složených lékových přípravků jedna z analyzovaných složek směsi. Koncentrace stanovovaných složek směsi se pak vypočítá z poměru ploch (výšek) píků jednotlivých stanovovaných látek a plochy píku vnějšího standardu. 18 15

2.7. Validace analytické metody Validace je proces, při němž se určuje vhodnost použití daného analytického systému pro získání relevantních dat. 16 Typy analytických metod pro validaci: - identifikační zkoušky - kvantitativní zkoušky na obsažené nečistoty - limitní zkoušky na obsah nečistot - kvantitativní zkoušky účinných látek ve vzorku léčivé látky nebo léčivého přípravku nebo dalších vybraných složek v léčivém přípravku 17 2.7.1. Validační parametry SPRÁVNOST (ACCURACY) Vyjadřuje shodu mezi získaným výsledkem a správnou hodnotou. Správnou hodnotu lze zjistit buď jinou nezávislou metodou s ověřenou správností, nebo se připraví modelový vzorek ze všech složek přípravku a přesně přidaného standardu. Nejsou-li k dispozici všechny složky přípravku, analyzuje se přípravek se známým přídavkem standardu. Správnost se obvykle zjistí analýzou nejméně šesti vzorků a vyjádří se jako rozdíl správné a získané hodnoty nebo jako výtěžnost (recovery): 100. nalezená hodnota recovery správná hodnota PŘESNOST (PRECISION) Přesnost je míra shody mezi jednotlivými výsledky metody opakovaně získanými s jedním homogenním vzorkem. Obvykle se tento vzorek nezávisle šestkrát analyzuje kompletním postupem včetně přípravy vzorku. Přesnost se vyjádří pomocí SD a RSD. 18 Výpočet SD a RSD: 19 SD 2 x x1... x xn n 1 2 1 2 16

x x1 x2 x3... xn n SD RSD 100 x Podle podmínek opakování se rozlišují tři úrovně přesnosti: - opakovatelnost (repeability) - metoda se opakuje stejným způsobem jedním pracovníkem se stejnými činidly na tomtéž přístroji - mezilehlá přesnost (intermediate precision) - metoda se provádí s různými činidly, analytiky i přístroji, v různý den, ale v jedné laboratoři a se stejným homogenizovaným vzorkem - reprodukovatelnost (reproducibility) - provedení je stejné jako u mezilehlé přesnosti s tím rozdílem, že probíhá v různých laboratořích 18 SELEKTIVITA (SPECIFITY) Selektivita je schopnost jednoznačně stanovit látku v přítomnosti ostatních složek vzorku, jejichž výskyt může být předpokládán. 15 To mohou být další účinné látky u složených přípravků, pomocné látky, nečistoty z výroby, rozkladné produkty, zbytková rozpouštědla. Tento parametr se doloží výsledky analýzy standardu, a dále např. vzorků bez analyzované látky obsahujících všechny složky přípravku, rozkladné produkty, nečistoty. 18 LIMIT DETEKCE (LIMIT OF DETECTION, LOD) Limit detekce jednotlivé analytické metody je nejmenší množství látky ve vzorku, které může být detekováno. 15 Vyjadřuje citlivost metody. U instrumentálních metod se může určit jako koncentrace analyzované látky s poměrem signálu k šumu s hodnotou 3. 18 17

LIMIT KVANTIFIKACE (LIMIT OF QUANTIFICATION, LOQ) Je též parametrem citlivosti metody. Je to nejnižší koncentrace látky, stanovitelná s přijatelnou přesností a správností. Za limitující relativní směrodatnou odchylku se považuje 10%, proto je možné LOQ vyjádřit jako koncentraci, při jejíž analýze se dosáhne této RSD. Často se vyjadřuje jako koncentrace s poměrem signálu k šumu s hodnotou 10. 18 LINEARITA (LINEARITY) Je to schopnost dávat výsledky přímo úměrné koncentraci stanovované látky. Obvykle se stanovuje minimálně pět různých koncentrací v rozmezí 80-120% deklarovaného obsahu. Pokud je metoda lineární, lze s výhodou určit směrnici z jednoho kalibračního bodu. Pokud není, je třeba výsledky vyhodnocovat z celé kalibrační křivky. 18,19 ROZSAH (RANGE) Tento parametr se obvykle odvozuje z linearity metody a rozumí se jím koncentrační hranice, v kterých může být metoda používána. Dolním limitem může být např. LOD a horní může být určen maximální odezvou, při jejímž překročení už přístroj nepracuje přesně. 18 ROBUSTNOST (ROBUSTNESS) Robustnost analytické metody je míra její kapacity k tomu, aby zůstala neovlivněna při malých, ale úmyslných změnách parametrů metody a udává její spolehlivost během běžného užívání. 15 Vyjadřuje míru vlivu proměnných podmínek na výsledky analýzy. Sbírají se poznatky z vývoje metody a cílem je upozornit na podmínky, které mohou ovlivnit výsledky. 18 18

TEST ZPŮSOBILOSTI (SYSTEM SUITABILITY TEST) Test způsobilosti systému představuje nedílnou součást metody a slouží k zajištění přiměřené účinnosti chromatografického systému. Pokud není v lékopisném článku stanoveno jinak, musí být splněny následující požadavky: - faktor symetrie hlavního píku má být v rozmezí 0,8-1,5 - maximální dovolená RSD ploch hlavního píku pro opakované nástřiky předepsaného porovnávacího roztoku nepřevyšuje hodnoty uvedené v tabulce- - mez detekce píku (odpovídající poměru signálu k šumu=3) je pod limitem zanedbatelnosti u zkoušky na příbuzné látky - mez stanovitelnosti píku (odpovídající poměru signálu k šumu=10) je nejvýše rovna limitu zanedbatelnosti u zkoušky na příbuzné látky 1 19

2.8. 1,3-butandiol a jeho vlastnosti 1,3-butandiol, bezbarvá, viskózní, hygroskopická kapalina Synonyma: [1,3-butylenglykol] Sumární vzorec: C 4 H 10 O 2, Molekulová hmotnost: Mr=90,123 Vlastnosti: t t =-50 o C t v =207,5 o C ρ 20 =1,0053 g/cm 3 20 20 n D 1,4410 Bezbarvá, hygroskopická, viskózní kapalina, neomezeně mísitelná s vodou, acetonem, éterem, nemísitelná s nevysychavými oleji. Je rozpouštědlem většiny esenciálních olejů. 21 1,3-Butandiol je prakticky netoxický a je dobře snášen na sliznicích. Ve farmaceutické přípravě se používá často jako náhrada glycerolu. 22 20

3. CÍL PRÁCE 21

Cílem této diplomové práce bylo: nalezení optimálních podmínek pro stanovení čistoty vzorku 1,3-butandiolu pomocí plynové chromatografie validace dané metody 22

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 23

4.1.Použité chemikálie, přístroje, programové vybavení, pomůcky Chemikálie - 1,3-butandiol: Celanese Ltd, Texas, USA - methanol: Kulich, Hradec Králové, ČR - propylenglykol: Kulich, Hradec Králové, ČR Přístroje -GC: GC-2010, Shimadzu, Japonsko -PC s chromatografickým softwarem GC solution Ver. 2.30.00SU7, Shimadzu, Japonsko - Autosampler AOC-5000, Shimadzu, Japonsko - Analytické digitální váhy AND, Japonsko Chromatografický materiál: - kolona- Supelcowax TM -10, Fused Silica Capillary Column, 30m x 0,53μm x 0,5μm film thickness, Sigma-Aldrich, ČR Pomůcky: - laboratorní sklo - pipety Chromatografické podmínky-tab.č.1 Tab. č. 1- Optimální chromatografické podmínky teplotní gradient teplota na koloně čas 90 C 4,5 min. 5 C/min 150 C 2 min. 24

4.2. Příprava pracovních roztoků 4.2.1. Příprava základního pracovního roztoku Zásobní roztok 1,3-butandiolu o koncentraci 5mg/ml byl připraven přesným navážením 500mg 1,3-BD do 100ml odměrné baňky a doplněním methanolu po rysku. 4.2.2. Příprava pracovních roztoků pro stanovení splitovacího poměru Zásobní roztoky 1,3-butandiolu o koncentracích 4mg/ml, 5mg/ml, 6mg/ml, 7mg/ml byly připraveny přesným navážením 400mg, 500mg, 600mg a 700mg 1,3-butandiolu do 100ml odměrné baňky a doplněním methanolu po rysku. 4.2.3. Příprava pracovních roztoků pro kvantifikaci nečistot pomocí IS Roztok vnitřního standardu-propylenglykolu o koncentraci 72mg/ml byl připraven přesným navážením 7,2g propylenglykolu do 100ml odměrné baňky a doplněním methanolu po rysku. Zásobní roztok 1,3-butandiolu a propylenglykolu byl připraven přesným navážením 600mg 1,3-butandiolu do 100ml odměrné baňky, přidáním 1ml roztoku propylenglykolu o koncentraci 72mg/ml a doplnění methanolem po rysku. 4.2.4. Příprava pracovních roztoků pro stanovení linearity Zásobní roztoky 1,3-butandiolu o koncentracích 0,25mg/ml, 0,5mg/ml, 1mg/ml, 2mg/ml, 4mg/ml, 5mg/ml, 6mg/ml byly připraveny přesným navážením 25mg, 50mg, 100mg, 200mg, 400mg, 500mg a 600mg 1,3-butandiolu do 100ml odměrné baňky a doplněním methanolu po rysku. 25

5. VÝSLEDKY A DISKUZE 26

5.1. Podmínky na koloně Stanovení ideálních teplotních podmínek na koloně je stěžejní pro dobrou separaci jednotlivých látek a pro přijatelnou dobu analýzy. Postupně se zkoušely jednotlivé podmínky, aby byly píky nečistot A, B a C rozdělené až na základní linii. U nečistoty A bylo důležité, aby byla dobře separována od hlavního píku 1,3-butandiolu. Byla měněna počáteční teplota na koloně, doba jejího trvání a dále bylo pracováno s teplotním gradientem, tedy s počtem stupňů, o které rostla teplota za minutu, až do hodnoty 150 o C. Vzorek byl analyzován při 8 různých metodách ( Metoda 01-08 ), všechny při splitu 1:3. Pro zkoušené podmínky byly sestaveny Tab. č. 2-9. Metoda 01 Tab. č.2- Parametry Metody 01 teplotní gradient teplota na koloně čas 100 C 4,5 min. 15 C/min 150 C 2 min. Metoda 02 Tab. č.3- Parametry Metody 02 teplotní gradient teplota na koloně čas 100 C 6 min. 15 C/min 150 C 2 min. Porovnáním chromatogramů Metod 01 a 02 (Obr. č.3) bylo zjištěno, že prodloužení doby trvání počáteční teploty na koloně ze 4,5 min. na 6 min. vede k lepší separaci nečistoty A od 1,3-BD a zároveň k prodloužení doby analýzy. 27

Obr. č. 3- Chromatogram srovnání Metod 01 a 02 5.0 uv(x1,000) Chrom atogram A 1,3-BD B C 2.5 0.0 01-2.5 02-5.0-7.5 6.00 6.25 6.50 6.75 7.00 7.25 7.50 7.75 8.00 8.25 8.50 8.75 m in Metoda 03 Tab. č.4- Parametry Metody 03 Teplotní gradient teplota na koloně čas 100 C 4,5 min. 5 C/min 150 C 2 min. V Metodě 03 (Obr. č. 4) byl vyzkoušen nižší teplotní gradient 5 o C/min, což vedlo k prodloužení doby analýzy až na 11 minut, ale zároveň k lepší separaci jednotlivých složek vzorku. Obr. č. 4- Chromatogram srovnání Metody 03 uv(x1,000) 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 03 0.0-1.0-2.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 m in 28

Metoda 04 Tab. č.5- Parametry Metody 04 Teplotní gradient teplota na koloně čas 110 C 6 min. 15 C/min 150 C 2 min. Metoda 05 Tab. č.6- Parametry Metody 05 Teplotní gradient teplota na koloně čas 110 C 6 min. 5 C/min 150 C 2 min. V Metodě 04 a 05 (Obr. č. 5) byla použita vyšší teplota na začátku měření 110 o C, což vedlo ke špatné separaci nečistoty A od hlavního píku 1,3-BD. Obr. č. 5- Chromatogram srovnání Metod 04 a 05 7.0 uv(x1,000) Chrom atogram 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 04 1.0 0.0 05-1.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 m in Metoda 06 Tab. č.7- Parametry Metody 06 teplotní gradient teplota na koloně čas 90 C 4,5 min. 15 C/min 150 C 2 min. 29

Metoda 07 Tab. č.8- Parametry Metody 07 teplotní gradient teplota na koloně čas 90 C 4,5 min. 5 C/min 150 C 2 min. Metoda 08 Tab. č.9- Parametry Metody 08 teplotní gradient teplota na koloně čas 90 C 4,5 min. 10 C/min 150 C 2 min. V těchto 3 metodách (Obr.č.6) byla zvolena nižší počáteční teplota na koloně 90 o C, a bylo pracováno pouze s teplotním gradientem, který ovlivňuje jednak separaci jednotlivých složek vzorku, a jednak celkovou dobu analýzy. Při nejnižším zkoušeném teplotním gradientu (5 o C/min) byla separace nečistot nejlepší. Obr. č. 6- Chromatogram srovnání Metod 06, 07 a 08 uv(x10,000) Chrom atogram 1.00 0.75 0.50 0.25 06 0.00 07-0.25 08 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 m in Na základě porovnání chromatografických záznamů byla vybrána Metoda 07, jako metoda s optimální separací jednotlivých píků a optimální dobou analýzy. S těmito podmínkami bylo pracováno při všech dalších měřeních. Ze získaných chromatogramů bylo zjištěno, že vliv na separaci jednotlivých látek měla hodnota počáteční teploty a rychlost nárůstu teplotního gradientu. 30

tailing faktor 5.2. Změna splitovacího (dělícího) poměru Cílem výběru splitovacího poměru bylo posoudit optimální citlivost měření a symetrii píku 1,3-BD (v rozmezí 0,8-1,5 dle ČL 2005). Ostatní píky jsou symetrické, ve vzorku jsou v minimálních koncentracích. Při výběru teplotních podmínek (viz. 5.1.) bylo pracováno se splitem 1:3, ale pro porovnání tohoto poměru proběhla ještě analýza vzorků při splitech 1:1, 1:2 a znovu při splitu 1:3. Měření bylo opakováno vždy 2krát, pro navážky v rozmezí 400-700mg., hodnoty byly porovnány v Tab. č.10 Tab. č.10- Hodnoty faktoru symetrie píku pro jednotlivé splitovací poměry split navážka (mg) 1:1 1:2 1:3 400 0,778 0,864 0,929 500 0,746 0,822 0,880 600 0,698 0,753 0,829 700 0,682 0,746 0,801 Obr. č.7-závislost faktoru symetrie píku na navážce pro jednotlivé splitovací poměry (1:1->Řada 1, 1:2->Řada 2, 1:3->Řada 3) Změna splitovacího poměru 1 0,95 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0 200 400 600 800 navážka (mg) Řada1 Řada2 Řada3 U výsledků měření (Obr. č.7 a 8) se porovnával faktor symetrie píku, u splitu 1:2 byl vyhovující pro navážky 400mg a 500mg. Pro split 1:3 byl faktor symetrie píku vyhovující pro všechny navážky, proto byl tento split vybrán jako optimální. 31

Obr. č.8- Chromatogram pro splitovací poměry 1:1, 1:2, 1:3 5.0 uv(x10,000) Chromatogram 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 1:3 2.0 1.5 1.0 1:2 0.5 0.0 1:1-0.5 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min 32

5.3. Kvantifikace metody 5.3.1. Metoda vnitřního standardu Jeden ze zvažovaných způsobů kvantifikace nečistot byla metoda vnitřního standardu. Jako vnitřní standard byl použit propylenglykol (Obr. č.9). Během tohoto měření byla zkoumána linearita odezvy. Jednotlivý vzorek byl měřen vždy třikrát a byla porovnávána plocha nečistoty ku ploše vnitřního standardu, vztaženo na navážku. Obr. č. 9- Chromatogram vzorku 1,3-BD a vnitřního standardu (IS) uv(x10,000) Chromatogram 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1,3-BD 1.0 0.5 IS D A E B C 0.0-0.5-1.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min Tab. č.11- Naměřené hodnoty pro nečistotu D, hodnoty plochy píku/ A nečd / ku ploše vnitřního standardu /A IS /, vztaženo na navážku vzorek A IS A nečd A nečd /A IS navážka A nečd /A IS / průměr SD RSD /g/ navážka VZ_1 16355 7276 0,4449 0,6223 0,7149 0,7365 0,0117 1,5851 VZ_1 15922 7395 0,4645 0,7463 VZ_1 15609 7269 0,4657 0,7483 VZ_2 14485 7191 0,4964 0,6082 0,8163 0,7955 0,0110 1,3771 VZ_2 15079 7203 0,4777 0,7854 VZ_2 15021 7169 0,4773 0,7847 VZ_3 14805 6953 0,4696 0,6070 0,7737 0,7749 0,0073 0,9407 VZ_3 14809 7079 0,4780 0,7875 VZ_3 15314 7098 0,4635 0,7636 VZ_4 15920 7093 0,4455 0,6159 0,7234 0,7411 0,0099 1,3347 VZ_4 16026 7450 0,4649 0,7548 VZ_4 15916 7303 0,4588 0,7450 VZ_5 14812 7545 0,5094 0,6093 0,8360 0,8315 0,0039 0,4681 VZ_5 14820 7533 0,5083 0,8342 VZ_5 14539 7301 0,5022 0,8242 VZ_6 15519 7339 0,4729 0,6083 0,7774 0,7697 0,0113 1,4616 VZ_6 15759 7506 0,4763 0,7830 VZ_6 15674 7137 0,4553 0,7485 33

Tab. č.12- Naměřené hodnoty pro nečistotu A, hodnoty píku / A neča / ku ploše vnitřního standardu /A IS /, vztaženo na navážku vzorek A IS A neča A neča /A IS navážka A neča /A IS / průměr SD RSD /g/ navážka VZ_1 16355 31657 1,9356 0,6223 3,1104 3,1927 0,0466 1,4586 VZ_1 15922 31815 1,9982 3,2110 VZ_1 15609 31634 2,0267 3,2567 VZ_2 14485 30933 2,1355 0,6082 3,5112 3,4315 0,0420 1,2248 VZ_2 15079 31071 2,0605 3,3879 VZ_2 15021 31020 2,0651 3,3954 VZ_3 14805 30113 2,0340 0,6070 3,3509 3,3829 0,0196 0,5798 VZ_3 14809 30702 2,0732 3,4155 VZ_3 15314 31442 2,0532 3,3825 VZ_4 15920 31978 2,0087 0,6159 3,2614 3,2574 0,0121 0,3722 VZ_4 16026 32324 2,0170 3,2748 VZ_4 15916 31722 1,9931 3,2361 VZ_5 14812 31334 2,1154 0,6093 3,4719 3,5033 0,0167 0,4772 VZ_5 14820 31740 2,1417 3,5150 VZ_5 14539 31208 2,1465 3,5229 VZ_6 15519 31910 2,0562 0,6083 3,3802 3,3371 0,0245 0,7350 VZ_6 15759 31929 2,0261 3,3307 VZ_6 15674 31467 2,0076 3,3003 Tab. č.13- Naměřené hodnoty pro 1,3-BD, hodnoty plochy píku / A 1,3-BD / ku ploše vnitřního standardu /A IS /, vztaženo na navážku vzorek A IS A 1,3-BD A neč1,3-bd /A IS navážka /g/ A neč1,3-bd / A IS / navážka průměr SD RSD VZ_1 16355 26223774 1603,4102 0,6223 2576,5872 2643,1892 48,2578 1,8257 VZ_1 15922 26391569 1657,5536 2663,5926 VZ_1 15609 26123318 1673,6061 2689,3880 VZ_2 14485 25640065 1770,1115 0,6082 2910,4102 2833,2456 54,5759 1,9263 VZ_2 15079 25643007 1700,5774 2796,0825 VZ_2 15021 25518443 1698,8511 2793,2442 VZ_3 14805 25009930 1689,2894 0,6070 2783,0139 2791,0251 11,8810 0,4257 VZ_3 14809 25239684 1704,3476 2807,8214 VZ_3 15314 25862583 1688,8196 2782,2399 VZ_4 15920 26180352 1644,4945 0,6159 2670,0674 2663,2431 7,8601 0,2951 VZ_4 16026 26328635 1642,8700 2667,4298 VZ_4 15916 25998940 1633,5097 2652,2320 VZ_5 14812 25743105 1737,9898 0,6093 2852,4369 2875,7804 25,8273 0,8981 VZ_5 14820 25853507 1744,5012 2863,1235 VZ_5 14539 25794339 1774,1481 2911,7808 VZ_6 15519 26151773 1685,1455 0,6083 2770,2539 2733,3462 26,1962 0,9584 VZ_6 15759 25998849 1649,7779 2712,1122 VZ_6 15674 25911633 1653,1602 2717,6725 34

Tab. č.14- Naměřené hodnoty pro nečistotu E, hodnoty plochy píku/ A neče / ku ploše vnitřního standardu /A IS /, vztaženo na navážku vzorek A IS A neče A neče /A IS navážka A neče /A IS / průměr SD RSD /g/ navážka VZ_1 16355 5663 0,3463 0,6223 0,5564 0,5528 0,0020 0,3602 VZ_1 15922 5453 0,3425 0,5503 VZ_1 15609 5358 0,3433 0,5516 VZ_2 14485 5486 0,3787 0,6082 0,6227 0,6090 0,0079 1,3015 VZ_2 15079 5572 0,3695 0,6076 VZ_2 15021 5452 0,3630 0,5968 VZ_3 14805 5050 0,3411 0,6070 0,5619 0,5777 0,0095 1,6461 VZ_3 14809 5333 0,3601 0,5933 VZ_3 15314 5373 0,3509 0,5780 VZ_4 15920 5719 0,3592 0,6159 0,5833 0,5687 0,0087 1,5298 VZ_4 16026 5605 0,3497 0,5679 VZ_4 15916 5441 0,3419 0,5551 VZ_5 14812 5566 0,3758 0,6093 0,6167 0,6090 0,0042 0,6951 VZ_5 14820 5479 0,3697 0,6068 VZ_5 14539 5345 0,3676 0,6034 VZ_6 15519 5724 0,3688 0,6083 0,6063 0,5850 0,0121 2,0727 VZ_6 15759 5576 0,3538 0,5817 VZ_6 15674 5405 0,3448 0,5669 Tab. č.15- Naměřené hodnoty pro nečistotu B, hodnoty plochy píku / A nečb / ku ploše vnitřního standardu /A IS /, vztaženo na navážku vzorek A IS A nečb A nečb /A IS navážka A nečb /A IS / průměr SD RSD /g/ navážka VZ_1 16355 18471 1,1294 0,6223 1,8148 1,8709 0,0331 1,7699 VZ_1 15922 18598 1,1681 1,8770 VZ_1 15609 18657 1,1953 1,9207 VZ_2 14485 19045 1,3148 0,6082 2,1618 2,1138 0,0261 1,2368 VZ_2 15079 19266 1,2777 2,1007 VZ_2 15021 18992 1,2644 2,0789 VZ_3 14805 17768 1,2001 0,6070 1,9772 2,0044 0,0186 0,9278 VZ_3 14809 18316 1,2368 2,0376 VZ_3 15314 18578 1,2131 1,9986 VZ_4 15920 18872 1,1854 0,6159 1,9247 1,9182 0,0186 0,9722 VZ_4 16026 19195 1,1977 1,9447 VZ_4 15916 18480 1,1611 1,8852 VZ_5 14812 16765 1,1319 0,6093 1,8576 1,9885 0,0694 3,4921 VZ_5 14820 18652 1,2586 2,0656 VZ_5 14539 18093 1,2444 2,0424 VZ_6 15519 18907 1,2183 0,6083 2,0028 1,9483 0,0324 1,6617 VZ_6 15759 18650 1,1835 1,9455 VZ_6 15674 18082 1,1536 1,8965 35

Tab. č.16- Naměřené hodnoty pro nečistotu C, hodnoty plochy píku / A nečc / ku ploše vnitřního standardu /A IS /, vztaženo na navážku vzorek A IS A nečc A nečc / A IS navážka /g/ A nečc / A IS / navážka průměr SD RSD VZ_1 16355 17270 1,0560 0,6223 1,6968 1,7294 0,0213 1,2336 VZ_1 15922 17103 1,0742 1,7261 VZ_1 15609 17146 1,0985 1,7652 VZ_2 14485 16783 1,1587 0,6082 1,9050 1,8549 0,0276 1,4905 VZ_2 15079 16905 1,1211 1,8433 VZ_2 15021 16594 1,1047 1,8164 VZ_3 14805 16357 1,1048 0,607 1,8202 1,8316 0,013 0,7104 VZ_3 14809 16687 1,1268 1,8564 VZ_3 15314 16903 1,1038 1,8184 VZ_4 15920 17279 1,0854 0,6159 1,7622 1,7551 0,0079 0,4499 VZ_4 16026 17400 1,0857 1,7628 VZ_4 15916 17060 1,0719 1,7403 VZ_5 14812 17000 1,1477 0,6093 1,8837 1,9013 0,0126 0,6618 VZ_5 14820 17122 1,1553 1,8962 VZ_5 14539 17044 1,1723 1,9240 VZ_6 15519 17282 1,1136 0,6083 1,8307 1,8066 0,0135 0,7463 VZ_6 15759 17131 1,0871 1,7871 VZ_6 15674 17182 1,0962 1,8021 Z výsledků měření byla prokázána linearita odezvy jednotlivých složek vzorku. Porovnáním ploch píků nečistot a 1,3-BD ku ploše vnitřního standardu (vztaženo na navážku) Tab. č. 11-16, se objevily odchylky mezi jednotlivými výsledky (hodnoty RSD). Z tohoto důvodu bylo od metody vnitřního standardu upuštěno. 5.3.2. Normalizační metoda Jako druhý způsob kvantifikace metody byla testována normalizační metoda. Metoda bude sice stále zatížena chybou, ale je méně náročnější než metoda vnitřního standardu. Hodnoty pro výpočet procentuálního zastoupení jednotlivých složek byly použity z předchozího měření. Hodnoty z tohoto měření jsou shrnuty v Tab. č. 17-22, vždy pro jednotlivé nečistoty a 1,3-BD, vyjádřené jako procentuální zastoupení. V Tab. č. 23 jsou výsledky shrnuty pro všechny složky vzorku. 36

Tab.č. 17 Procentuální zastoupení nečistoty D ve vzorcích VZ_1-VZ_6 Neč.D A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD VZ_1 0,0277 0,0279 0,0277 0,0278 0,0001 0,4163 VZ_2 0,0280 0,0280 0,0280 0,0280 0,0000 0,0752 VZ_3 0,0277 0,0280 0,0274 0,0277 0,0002 0,8908 VZ_4 0,0270 0,0282 0,0280 0,0277 0,0005 1,8893 VZ_5 0,0292 0,0290 0,0282 0,0288 0,0004 1,5189 VZ_6 0,0280 0,0288 0,0275 0,0281 0,0005 1,9397 Tab.č. 18 Procentuální zastoupení nečistoty A ve vzorcích VZ_1-VZ_6 Neč.A A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD VZ_1 0,1203 0,1202 0,1207 0,1204 0,0002 0,1870 VZ_2 0,1203 0,1208 0,1212 0,1207 0,0004 0,3091 VZ_3 0,1200 0,1213 0,1212 0,1208 0,0006 0,4672 VZ_4 0,1218 0,1224 0,1216 0,1219 0,0003 0,2690 VZ_5 0,1214 0,1224 0,1206 0,1215 0,0007 0,5974 VZ_6 0,1216 0,1224 0,1211 0,1217 0,0006 0,4583 Tab.č. 19 Procentuální zastoupení 1,3-BD ve vzorcích VZ_1-VZ_6 1,3-BD A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD VZ_1 99,6946 99,6964 99,6945 99,6952 0,0009 0,0009 VZ_2 99,6911 99,6889 99,6905 99,6902 0,0009 0,0009 VZ_3 99,6961 99,6915 99,6940 99,6938 0,0019 0,0019 VZ_4 99,6918 99,6896 99,6932 99,6915 0,0015 0,0015 VZ_5 99,6971 99,6895 99,6947 99,6938 0,0032 0,0032 VZ_6 99,6906 99,6902 99,6950 99,6919 0,0022 0,0022 Tab.č. 20 Procentuální zastoupení nečistoty E ve vzorcích VZ_1-VZ_6 Neč.E A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD VZ_1 0,0215 0,0206 0,0204 0,0209 0,0005 2,2983 VZ_2 0,0213 0,0217 0,0213 0,0214 0,0002 0,7672 VZ_3 0,0201 0,0211 0,0207 0,0206 0,0004 1,8665 VZ_4 0,0218 0,0212 0,0209 0,0213 0,0004 1,7624 VZ_5 0,0216 0,0211 0,0207 0,0211 0,0004 1,7376 VZ_6 0,0218 0,0214 0,0208 0,0213 0,0004 1,9663 Tab.č. 21 Procentuální zastoupení nečistoty B ve vzorcích VZ_1-VZ_6 Neč.B A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD VZ_1 0,0702 0,0703 0,0712 0,0706 0,0005 0,6430 VZ_2 0,0741 0,0749 0,0742 0,0744 0,0004 0,4982 VZ_3 0,0708 0,0723 0,0716 0,0716 0,0006 0,8654 VZ_4 0,0719 0,0727 0,0709 0,0718 0,0007 1,0339 VZ_5 0,0649 0,0719 0,0699 0,0689 0,0029 4,2685 VZ_6 0,0721 0,0715 0,0696 0,0711 0,0011 1,5094 37

Tab.č. 22 Procentuální zastoupení nečistoty C ve vzorcích VZ_1-VZ_6 Neč.C A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD VZ_1 0,0657 0,0646 0,0654 0,0652 0,0005 0,6899 VZ_2 0,0653 0,0657 0,0648 0,0653 0,0004 0,5584 VZ_3 0,0652 0,0659 0,0652 0,0654 0,0003 0,5253 VZ_4 0,0658 0,0659 0,0654 0,0657 0,0002 0,3082 VZ_5 0,0658 0,0660 0,0659 0,0659 0,0001 0,1211 VZ_6 0,0659 0,0657 0,0661 0,0659 0,0002 0,2619 Tab.č.23 Procentuální zastoupení jednotlivých složek vzorku Neč.D Neč.A 1,3-BD Neč.E Neč.B Neč.C VZ_1 0,0278 0,1204 99,6952 0,0209 0,0706 0,0652 VZ_2 0,0280 0,1207 99,6902 0,0214 0,0744 0,0653 VZ_3 0,0277 0,1208 99,6938 0,0206 0,0716 0,0654 VZ_4 0,0277 0,1219 99,6915 0,0213 0,0718 0,0657 VZ_5 0,0288 0,1215 99,6938 0,0211 0,0689 0,0659 VZ_6 0,0281 0,1217 99,6919 0,0213 0,0711 0,0659 průměr 0,0280 0,1212 99,6927 0,0211 0,0714 0,0656 SD 0,0004 0,0005 0,0017 0,0003 0,0016 0,0003 RSD 1,3868 0,4512 0,0017 1,3139 2,3006 0,4223 Výsledky získané normalizační metodou jsou méně variabilní než u metody vnitřního standardu. Tato metoda je pro kvantifikaci přesnější, hodnoty RSD se pohybují v rozmezí 0,0017-2,3006. 38

5.4. Validace metody 5.4.1. Linearita Jako první parametr validace metody byla měřena linearita. Pro měření byly použity navážky v rozmezí 100 600 mg. Měření jednotlivého vzorku bylo opakováno vždy třikrát, vzorek dvakrát ve stejné navážce. Mezi jednotlivými měřeními byla kolona vždy promývána methanolem, aby nedošlo k ovlivnění měření v případě, že by část vzorku zůstala v koloně. Linearita byla sledována pro nečistoty A,B,C a 1,3-BD. Výsledky měření jsou shrnuty v Tab. č.24-27 a pomocí grafů- Obr. č.10-13. Dále byly změřeny vzorky o navážce 25mg a 50mg, výsledky měření byly použity pro určení LOD a LOQ-viz 5.4.6 Tab.č. 24 Výsledky měření linearity pro nečistotu A Neč. A A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážk a (g) plocha/ navážka 100/1 2213,3 2056,1 1985,0 2084,80 116,8246 5,6036 0,0974 21404,5 100/2 2041,3 2118,5 1984,7 2048,17 67,1638 3,2792 0,0997 20543,3 200/1 4565,7 4270,8 4398,2 4411,57 147,9037 3,3526 0,1922 22953,0 200/2 4612,7 4457,4 4495,1 4521,73 81,0032 1,7914 0,1900 23798,6 400/1 9416,5 9307,9 9545,8 9423,40 119,1000 1,2639 0,3946 23880,9 400/2 9523,4 9399,3 11459,2 10127,30 1155,1270 11,4061 0,4006 25280,3 500/1 12793,0 11673,0 11686,0 12050,67 642,9124 5,3351 0,4901 24588,2 500/2 11936,1 11811,8 11872,9 11873,60 62,1530 0,5235 0,5008 23709,3 600/1 14235,5 14276,9 14142,7 14218,37 68,7210 0,4833 0,6035 23559,8 600/2 13955,2 14054,1 14101,9 14037,07 74,8186 0,5330 0,5911 23747,4 39

navážka [g] Obr. č. 10 Graf závislosti plochy píku na navážce pro nečistotu A 0,7 Neč.A y = 4E-05x + 0,0092 R 2 = 0,9971 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 plocha píku 40

navážka [g] Tab. č.25- Výsledky měření linearity pro 1,3-BD 1,3-BD A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD Navážka plocha/navážka [g] 100/1 1817178,5 1803774,9 1811623,8 1810859,07 5498,6505 0,3036 0,0974 18591982,2 100/2 1752726,1 1769956,2 1753938,5 1758873,60 7852,1970 0,4464 0,0997 17641660,98 200/1 3862586,0 3662271,6 3691896,7 3738918,10 88278,8150 2,3611 0,1922 19453267,95 200/2 3931322,2 3683376,6 3680531,0 3765076,60 117559,1312 3,1224 0,19 19816192,63 400/1 7887347,7 7837562,3 7828533,4 7851147,80 25861,2300 0,3294 0,3946 19896471,87 400/2 7962380,7 7889563,1 9406278,2 8419407,33 698456,0026 8,2958 0,4006 21016992,84 500/1 10733855,5 9782370,3 9757098,3 10091108,03 454608,1814 4,5050 0,4901 20589896,01 500/2 9962398,0 9998887,4 9960379,3 9973888,23 17696,2809 0,1774 0,5008 19915911,01 600/1 12079174,4 12009723,6 11963678,5 12017525,50 47472,6445 0,3950 0,6035 19913049,71 600/2 11717377,4 11889276,3 11848240,2 11818297,97 73301,7097 0,6202 0,5911 19993737,04 Obr. č. 11. Graf závislosti plochy píku na navážce pro 1,3-BD 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 1,3-BD y = 5E-08x + 0,0082 R 2 = 0,9981 0 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 plocha píku 41

navážka [g] Tab. č. 26- Výsledky měření linearity pro nečistotu B Neč. A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka plocha/navážka B (g) 100/1 851,6 1039,4 1015,7 968,90 102,2736 10,5556 0,0974 9947,6386 100/2 1014,7 1133,9 1040,9 1063,17 62,6419 5,8920 0,0997 10663,6576 200/1 2289,6 2217 2397,6 2301,40 90,8764 3,9487 0,1922 11973,9854 200/2 2363,9 2280,5 2465,9 2370,10 92,8554 3,9178 0,1900 12474,2105 400/1 5045,4 5048,1 5057,2 5050,23 6,1825 0,1224 0,3946 12798,3612 400/2 5178,8 4932,3 5943,6 5351,57 527,3217 9,8536 0,4006 13358,8783 500/1 6724 6063,3 6116,6 6301,30 367,0377 5,8248 0,4901 12857,1720 500/2 6348,6 6234,4 6316,8 6299,93 58,9387 0,9355 0,5008 12579,7391 600/1 7642,6 7641,3 7435,5 7573,13 119,1957 1,5739 0,6035 12548,6882 600/2 7481,6 7621 7419,7 7507,43 103,1065 1,3734 0,5911 12700,7838 Obr. č. 12- Graf závislosti plochy píku na navážce pro nečistotu B 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Neč.B y = 8E-05x + 0,0154 R 2 = 0,9976 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 plocha píku Tab. č.27- Výsledky měření linearity pro nečistotu C Neč. A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka plocha/navážka C (g) 100/1 1087,6 1056,2 1151,2 1098,33 48,4010 4,4068 0,0974 11276,5229 100/2 949,5 811,2 1009,6 923,43 101,7361 11,0172 0,0997 9262,1197 200/1 2242,9 2224,9 2428,5 2298,77 112,7123 4,9032 0,1922 11960,2844 200/2 2468,1 2382,0 2500,0 2450,03 61,0394 2,4914 0,1900 12894,9123 400/1 4909,7 5099,0 5065,9 5024,87 101,1011 2,0120 0,3946 12734,0767 400/2 5099,0 4957,3 5956,7 5337,67 540,7600 10,1310 0,4006 13324,1804 500/1 6993,7 6260,8 6236,4 6496,97 430,3566 6,6240 0,4901 13256,4103 500/2 6266,2 6310,8 6293,3 6290,10 22,4715 0,3573 0,5008 12560,1038 600/1 7616,9 7724,5 7498,7 7613,37 112,9415 1,4835 0,6035 12615,3549 600/2 7413,9 7429,4 7654,3 7499,20 134,5439 1,7941 0,5911 12686,8550 42

navážka [g] Obr. č. 13- Graf závislosti plochy píku na navážce pro nečistotu C 0,7 Neč.C y = 8E-05x + 0,0155 R 2 = 0,9963 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 plocha píku Ze získaných výsledků byly sestaveny grafy závislosti plochy píku na návážce a ze směrnice přímky vypočítána hodnota spolehlivosti R= 0,9971 pro nečistotu A, 0,9981 pro 1,3-BD, 0,9976 pro nečistotu B a 0,9963 pro nečistotu C. Z těchto výsledků je možno prokázat splnění linearity. 5.4.2.Přesnost Dalším validačním parametrem je přesnost, která vyjadřuje míru shody mezi jednotlivými výsledky. Celkem bylo připraveno 6 vzorků o koncentraci 5mg/ml, každý byl měřen třikrát. Z naměřených výsledků byly vyhodnocovány píky nečistot A, B, C a pík 1,3-butandiolu. Výsledky měření jsou shrnuty v Tab. č.28-31 jako procentuální zastoupení jednotlivých složek. Tab. č. 28- Výsledky měření pro pík nečistoty A Vz A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka [g] 1 0,1207 0,1189 0,1208 0,1201 0,0009 0,7267 0,4901 2 0,1202 0,1208 0,1201 0,1204 0,0003 0,2568 0,5008 3 0,1182 0,1190 0,1190 0,1187 0,0004 0,3176 0,4976 4 0,1187 0,1187 0,1196 0,1190 0,0004 0,3565 0,4968 5 0,1222 0,1201 0,1212 0,1212 0,0009 0,7078 0,5045 6 0,1199 0,1190 0,1214 0,1201 0,0010 0,8243 0,4948 43

Tab. č. 29- Výsledky měření pro pík 1,3-BD Vz A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka [g] 1 99,7526 99,7546 99,7503 99,7525 0,0018 0,0018 0,4901 2 99,7528 99,7550 99,7527 99,7535 0,0011 0,0011 0,5008 3 99,7483 99,7478 99,7521 99,7494 0,0019 0,0019 0,4976 4 99,7521 99,7443 99,7452 99,7472 0,0035 0,0035 0,4968 5 99,7500 99,7448 99,744 99,7463 0,0027 0,0027 0,5045 6 99,7480 99,7522 99,7467 99,7490 0,0023 0,0024 0,4948 Tab. č. 30- Výsledky měření pro pík nečistoty B Vz A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka [g] 1 0,0633 0,0635 0,0654 0,0641 0,0009 1,4771 0,4901 2 0,0638 0,0624 0,0637 0,0633 0,0006 1,0074 0,5008 3 0,0690 0,0698 0,0646 0,0678 0,0023 3,3720 0,4976 4 0,0650 0,0704 0,0702 0,0685 0,0025 3,6475 0,4968 5 0,0642 0,0709 0,0696 0,0682 0,0029 4,2515 0,5045 6 0,0678 0,0644 0,0679 0,0667 0,0016 2,4391 0,4948 Tab. č. 31- Výsledky měření pro pík nečistoty C Vz A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka [g] 1 0,0634 0,0630 0,0635 0,0633 0,0002 0,3413 0,4901 2 0,0631 0,0618 0,0635 0,0628 0,0007 1,1556 0,5008 3 0,0645 0,0634 0,0643 0,0641 0,0005 0,7468 0,4976 4 0,0642 0,0667 0,0649 0,0653 0,0011 1,6134 0,4968 5 0,0636 0,0642 0,0653 0,0644 0,0007 1,0937 0,5045 6 0,0643 0,0644 0,0679 0,0655 0,0017 2,5544 0,4948 Z hodnot měření byly vypočítány RSD pro jednotlivé složky vzorku, které se pohybují v rozmezí 0,0011-4,2515. Rozmezí RSD splňuje požadavky na přesnost měření. 44

5.4.3. Reprodukovatelnost Pro zjištění reprodukovatelnosti metody byla provedena stejná série měření- Tab. č. 32-35, jako pro přesnost. Měření bylo provedeno druhou osobou, se stejným vzorkem 1,3-BD a na stejném chromatografu. Tab. č. 32- Výsledky měření pro pík nečistoty A Vz A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka [g] 1 0,1206 0,1201 0,1192 0,1200 0,0006 0,4829 0,4901 2 0,1211 0,1198 0,1210 0,1206 0,0006 0,4896 0,5008 3 0,1200 0,1195 0,1193 0,1196 0,0003 0,2461 0,4976 4 0,1199 0,1200 0,1189 0,1196 0,0005 0,4153 0,4968 5 0,1194 0,1190 0,1200 0,1195 0,0004 0,3440 0,5045 6 0,1194 0,1208 0,1217 0,1206 0,0009 0,7845 0,4948 Tab. č. 33- Výsledky měření pro pík 1,3-BD Vz A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka [g] 1 99,7525 99,7525 99,7549 99,7533 0,0011 0,0011 0,4901 2 99,7523 99,7522 99,7509 99,7518 0,0006 0,0006 0,5008 3 99,7510 99,7521 99,7528 99,7520 0,0007 0,0007 0,4976 4 99,7523 99,7519 99,7538 99,7527 0,0008 0,0008 0,4968 5 99,7542 99,7523 99,7541 99,7535 0,0009 0,0009 0,5045 6 99,7539 99,7532 99,7514 99,7528 0,0011 0,0011 0,4948 Tab. č. 34- Výsledky měření pro pík nečistoty B Vz A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka [g] 1 0,0637 0,0626 0,0638 0,0634 0,0005 0,8579 0,4901 2 0,0627 0,0633 0,0644 0,0635 0,0007 1,1092 0,5008 3 0,0644 0,0642 0,0632 0,0639 0,0005 0,8133 0,4976 4 0,0640 0,0636 0,0629 0,0635 0,0005 0,7159 0,4968 5 0,0640 0,0640 0,0625 0,0635 0,0007 1,1136 0,5045 6 0,0634 0,0638 0,0639 0,0637 0,0002 0,3391 0,4948 Tab. č. 35- Výsledky měření pro pík nečistoty C Vz A/1 A/2 A/3 průměr SD RSD navážka [g] 1 0,0632 0,0648 0,0621 0,0634 0,0011 1,7494 0,4901 2 0,0639 0,0648 0,0638 0,0642 0,0004 0,7008 0,5008 3 0,0655 0,0642 0,0648 0,0648 0,0005 0,8194 0,4976 4 0,0639 0,0645 0,0644 0,0643 0,0003 0,4084 0,4968 5 0,0623 0,0647 0,0634 0,0635 0,0010 1,5456 0,5045 6 0,0634 0,0623 0,0630 0,0629 0,0005 0,7227 0,4948 45

Data získaná z přesnosti a reprodukovatelnosti byla vyhodnocena pomocí t-testu- Obr. č.14-17. Obr. č. 14- Výsledky t-testu pro nečistotu A Obr. č. 15- Výsledky t-testu pro 1,3-BD 46