FRVŠ 916/2012/G4 Materiály vznikly díky finanční podpoře FRVŠ
Tvůrčí práce studentů směřující k inovaci vzdělávací činnosti Zavedení techniky skenovacího elektrochemického mikroskopu do výuky oboru analytické biochemie Mgr. David Kovář Doc. RNDr. Petr Skládal, CSc. Mgr. Jana Mrázková
Skenovací elektrochemická mikroskopie - teoretický úvod
Na počátku... 1922 objev polarografie 1924 sestrojen polarograf Prof. Jaroslav Heyrovský (*1890-1967) 1959 Nobelova cena za chemii za objev a rozpracování analytické metody 4
Na počátku... Richard Phillips Feynman (*1918-1988) 1959 There's Plenty of Room at the Bottom Považován za zakladatele nanotechnologie (mikrotechnologie) 1974 NorioTaniguchi 1986 KimEricDrexler-Engines of Creation: The Coming Era of Nanotechnology if you want to make atomic-level manipulations, first you must be able to see what s going on
Mikroskopie skenující próbou Senzor Zpětná vazba Próba Interakce próby se vzorkem Vzorek 6
Mikroskopie skenující próbou (1972 Topografiner) 1981 STM 1985 AFM 1989 SECM 1992 SNOM 7
Princip STM STM hrot V 100 mv Tunelovací proud ~100 pa } 5 10 Å Vodivý vzorek
Druhy mikroskopií 9
Na počátku... 1981 Skenovací tunelová mikroskopie (Scanning tunneling microscopy) Gerd Binnig a Heinrich Rohrer 1986 Nobelova cena za fyziku
Mikroskopie skenující próbou Řada technik využívající skenující sondu/próbu Rastrovací pohyb -po řádcích ( line by line ) Obraz je zprostředkován digitálně Pohyb sondy ve výšce desítek stovek nanometrů nad zkoumaným povrchem Fyzikálně-chemická interakce mezi hrotem a povrchem topografie, specifická vlastnost povrchu (elektrická, magnetická, optická, atomární, )
Mikroskopie skenující próbou Skenovací tunelová mikroskopie (STM) Mikroskopie atomárních sil (AFM) Mikroskopie laterálních sil (LFM) Mikroskopie modulovaných sil (FMM) Mikroskopie magnetických sil (MFM) Mikroskopie elektrostatických sil (EFM) Skenovací tunelová spektroskopie (STS) Skenovací tunelovací potenciometrie (STP) Mikroskopie blízkého optického pole (NFSOM) Skenovací elektrochemická mikroskopie (SECM)
Úvod do elektrochemie základní jednotky Elektrický proud I -základní jednotka SI. Elektrický proud je roven celkovému množství elektrického náboje, které projde průřezem vodiče za jednotku času. Jednotkou je ampér (A): 1A je takový proud, který při průchodu dvěma rovnoběžnými přímkovými vodiči, nekonečně dlouhými, zanedbatelného kruhového průřezu, umístěnými ve vakuu ve vzájemné vzdálenosti 1m, vyvolá mezi těmito vodiči sílu rovnou 2 10-7 N (newton) na 1m délky. Proud vběžných elektrických rozvodech může být stejnosměrný nebo střídavý. Dohodnutý směr toku stejnosměrného proudu je od kladného pólu zdroje kzápornému. Skutečný směr toku elektronůvpevných vodičích je však opačný!!!
Úvod do elektrochemie základní jednotky Elektrické napětí U je definováno jako práce vykonaná elektrickou silou při přemístění kladného jednotkového elektrického náboje mezi dvěma body vprostoru. Lze ho chápat i jako rozdíl elektrických potenciálů vobou bodech v prostoru. Jednotkou je volt (V): 1V je takové napětí, které je mezi konci vodiče, do kterého konstantní proud 1A dodává výkon 1W. Odpor vodiče je vtomto případě 1Ω. Jednotka volt je odvozena zjednotek soustavy SI: V (volt) = m 2 kg s -3 A -1.
Úvod do elektrochemie základní jednotky Elektrický odpor R charakterizuje schopnost elektrických vodičů vést elektrický proud. Velikost odporu je dána materiálem, tvarem i teplotou vodiče. Velikost odporu je přímo úměrná délce vodiče a nepřímo úměrná průřezu vodiče, materiálu a teplotě. Odpor nabývá vždy kladných hodnot. Jednotkou je ohm (Ω). Také je jednotkou odvozenou: Ω (ohm) = V A -1 = m 2 kg s -3 A -2
Úvod do elektrochemie elektrody Elektroda (poločlánek)-soustava tvořená vodivými fázemi (l, s, g) ve vzájemném kontaktu. Na styku těchto fází (fázových rozhraních) i uvnitř těchto fází se mohou pohybovat ionty, elektrony i molekuly a mohou zde probíhat reakce (chemické, redoxní) případně výměna nabitých částic výsledkem je potenciálový rozdíl mezi fázemi. Vodivost jednotlivých fází je zpravidla odlišná.
Úvod do elektrochemie elektrody Polarizovatelné elektrody lze jim udělit z vnějšího zdroje určitý potenciál elektrody 1. druhu s malým povrchem Nepolarizovatelné elektrody udržují si svůj potenciál na konstantní hodnotě bez ohledu na zvnějšku vkládané napětí elektrody 2. druhu (proto se používají jako referentní) nebo elektrody 1. druhu svelkým povrchem. Depolarizátor -látka, která se při určitém potenciálu může oxidovat / redukovat (depolarizace elektrody) a elektrodou může téci proud
Úvod do elektrochemie elektrody Elektrody 1. druhu Kovové elektrody ponořené do roztoku svých iontů 0 RT E = E + ln a + M zf Elektrody 2. druhu Kovové elektrody potažené málo rozpustnou solí tohoto kovu ponořené do roztoku dobře rozpustné soli se společným aniontem E = E 0 + RT zf ln K a s - x
Úvod do elektrochemie elektrody Elektrody 3. druhu Oxidačně-redukční elektrody realizované ušlechtilým kovem (Pt, Au), nebo grafitem (uhlíková elektroda) ponořeným do roztoku obsahující Red i Oxformu dané látky. Potenciál těchto elektrod je odvislí od vzájemného poměru aktivit obou forem látky Ox+ ze Red E = E 0 + RT zf ln a a A A ox red
Úvod do elektrochemie elektrody Iontově-selektivní elektrody Roztok definované koncentrace iontu oddělen membránou od roztoku vzorku Přenos elektrického náboje v důsledku rozdílných koncentrací na obou stranách membrány membránový (Donnanův) potenciál Mechanismus iontové výměny zajišťuje výměnu iontů mezi vzorkem a membránou a to bez změny oxidačního čísla / RT I E = E + ln a zf
Úvod do elektrochemie - Voltametrie Lineární změna napětí vkládaného na elektrodu Proud vs. vložený potenciál V přítomnosti depolarizátoru (oxidace/redukce) dochází k průchodu elektrického proudu E I t E
Úvod do elektrochemie - Polarografie Voltametrie s pomalým nárůstem potenciálu Na elektrodě se stačí ustavit rovnováha odpovídající okamžitému potenciálu Měříme limitní difuzní proud - úměrný koncentraci analytu dané pouze difuzí k povrchu elektrody Voltametrie na rtuťové kapající elektrodě nebo rotující diskové elektrodě
Úvod do elektrochemie Cyklická voltametrie Lineární změna napětí z minima (E init ) přes maximum (E fin ) zpět do minima Dopředná a zpětná větev Poloha píku, půlvlnový potenciál, výška píku, E I Red Ox+ z e - > < t Ox+ z e - Red E
Úvod do elektrochemie - Amperometrie Odvozená voltametrická metoda stejná instrumentace Potenciál je v čase konstantní Hodnota potenciálu limitní proud v přítomnosti depolarizátoru úměrný koncentraci Proud v závislosti na čase E t
Úvod do elektrochemie 2E vs. 3E systém
SECM Scanning electrochemical microscopy Skenovací elektrochemická mikroskopie Allen J. Bard 26
Statistika publikační činnosti 100 80 SECM 60 40 20 0 800 600 STM 400 200 0 4000 3000 AFM 2000 1000 0 1985 1990 1995 2000 2005 2010 Rok
Hlavní autoři Bard, A.J. 81 Unwin, P.R. 62 Schuhmann, W. 54 Wittstock, G. 54 Matsue, T. 42 Shiku, H. 33 Mirkin, M.V. 28 Yasukawa, T. 23 Kranz, C. 21 Girault, H.H. 18 Heinze, J. 18 Macpherson, J.V., 17
SECM Pracovní schéma ME R C Bipotenciostat Zkoumaný vzorek PC
Hlavní součásti mikroskopu Mikroelektroda Různé typy a variace (kovové, ISE, kapilární) Velikost mikroelektrody ovlivňuje rozlišení metody Polohovací systém schopný pohybu ve 4D Spolu s ME udává rozlišení Bipotenciostat Kontroluje nastavení potenciálu Optika pro kontrolu polohy hrotu Digitální kamery Mikroskopy
Zvláštní druh elektrod Mikroelektrody Malé rozměry = potlačení kapacitních proudů na úkor faradických Velmi nízké proudy (na až pa) Zanedbatelný odpor = možnost rychlých potenciálních změn (až 10 6 V/s) Křehké!
Mikroelektrody Øhrotu obvykle méně než 25 µm Pt, Au, Ag, C Amperometrické Potenciometrické ISE skleněné ME ISE krystalické membrány ISE tekuté Elektroda Sklo
Charakterizace mikroelektrod Průměr elektroaktivního povrchu ME a Průměr ME včetně izolantu b Podíl poloměru RG = b/a RG je vždy větší než 1 (obvykle hodnoty 2-10) Cyklický voltamogram Ideálně provádět před skenováním i po něm
Charakterizace mikroelektrod Timerequired to attain a steady state(ustálený stav) velikost elektrody čím menší elektroda tím rychlejší je proces ustálení 34
Komerční mikroelektrody Kation Scientific 35
Komerční mikroelektrody Kation Scientific 36
Au-SPE 5 4 3 2 I [ma] 1 0-1 -2-3 -4-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 U [V]
Pt-ME (15 µm) 0,012 0,010 0,008 I [µa] 0,006 0,004 0,002 0,000-0,002-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 U [mv]
Přibližovací křivka Charakterizace tvaru hrotu Vzdálenost přiblížení ke vzorku Proud Vzdálenost hrotu od povrchu
SECM Módy Hrot v nekonečné vzdálenosti od povrchu Prostá difuse substrátu Proud úměrný koncentraci substrátu a průměru ME I = 4nFDca T, R -e - O
SECM Módy Oxidace blízko vodivého povrchu Pozitivní zpětná vazba Dochází k zacyklení substrátu Měřený proud výrazně narůstá - čím blíže je ME povrchu O O -e - +e - Vodič R R
SECM Módy Oxidace blízko nevodivého povrchu Negativní zpětná vazba Substrát nemůže k povrchu ME Proud klesá čím blíže je ME povrchu R R Nevodič
SECM Módy Elektrochemická částice generovaná ME a měřená povrchem TG/SC (Tip generation/surface collection) R R R R R Vodič
SECM Módy Elektrochemická částice generovaná povrchem a měřená ME SG/TC (Surface generation/tip collection) R R R R R Vodič
Zobrazování povrchů Režim konstantní výšky Hrot skenuje v konstantní výšce Problém s nakloněním roviny vzorku Chemické zobrazování Aktivita látky v určité oblasti Enzymy vázané na organely, Katalytická aktivita Rychlý sken vhodných kandidátů
SECM/AFM Kombinované techniky Výroba kombinovaných hrotů NSOM/SECM ECL/SECM OM/SECM
Komerční zařízení SECM SECM370 Scanning Electrochemical Microscope System (Uniscan Intruments)
Komerční zařízení SECM CHI900B Scanning Electrochemical Microscope(CH Instruments)
Komerční zařízení SECM Electrochemical probe scanner (HEKA)
SECM Home made
SECM Mikropolohovač MP-285
SECM Aplikace I. Zobrazování Charakterizace tvaru ultramikroelektrod Měření kinetiky Homogenní Heterogenní Studium dějů na mezifázi kapalina/kapalina Studium membrán a tenkých filmů Povrchové reakce (mikrokoroze) Studium povrchů polovodičů
SECM Aplikace II. Kinetika elektrochemických reakcí; palivové články Elektrochemie v malých objemech Studium biologických systémů Skenování spotřeby kyslíku - životaschopnost buněk Skenování vzniku kyslíku průběh fotosyntézy (Bio)senzorika
SECM Aplikace III. SECM koncentrace kyslíku kolem buňky. Měřený proud v pa.
SECM Aplikace IV. AC-SECM kontrola metabolismu živých buněk bez přídavku toxického redox-aktivního mediátoru
Hovězí chrupavka SECM Aplikace IV.
Série spotů antigen-protilátka
Spoty imobilizované GOx Published in: Dominik Schäfer, Monika Maciejewska, Wolfgang Schuhmann, SECM visualization of spatial variability of enzyme polymer spots: 1. Discretisation and interference eliminationusingartificialneuralnetworks, Biosensors andbioelectronics, Volume 22, Issues 9 10, 15 April2007, Pages1887-1895, ISSN 0956-5663, DOI: 10.1016/j.bios.2006.07.039 58
Spoty imobilizované peroxidasy SECM-AFM Published in: C Kranz, A Kueng, A Lugstein, E Bertagnolli, B Mizaikoff, Mapping of enzyme activity by detection of enzymatic products during AFM imaging with integrated SECM AFM probes, Ultramicroscopy, Volume 100, Issues 3 4, August 2004, Pages 127-134, ISSN 0304-3991, DOI: 10.1016/j.ultramic.2003.10.004. 59
Mřížka GOx technika Ink-jet 60
Odčerpávání elektronů - fotosyntéza Schematic of noncyclicpet and potential positioning of nanoelectrodes within chloroplasts. The inset depicts insertion of the nanoelectrode into a granal stack of thylakoid membranes. Published in: WonHyoungRyu; Seoung-Jai Bai; Joong Sun Park; ZubinHuang; Jeffrey Moseley; Tibor Fabian; Rainer J. Fasching; Arthur R. Grossman; Fritz B. Prinz; Nano Lett. 2010, 10, 1137-1143. DOI: 10.1021/nl903141j Copyright 2010 American Chemical Society 61
AFM image (constant force mode) SECM/AFM SECM image 62
SECM etching WLI images of etch pits produced in enamel by the application of a current of 100 nafor (a) 20 s and (b) 300 s. An optical micrograph of a series of etch pits at 100 nashowing pitsat 60, 120, 180, 240, and 300 s. Published in: Carrie-Anne McGeouch; Martin A. Edwards; Michael M. Mbogoro; Charles Parkinson; Patrick R. Unwin; Anal. Chem. 2010, 82, 9322-9328. DOI: 10.1021/ac101662h Copyright 2010 American Chemical Society 63
MEAM Microelectrode array microscope Developed in: Idaho National Laboratory(USA) 64
Co dokáže nanotechnologie...
Skenovací elektrochemická mikroskopie - praktické cvičení
Výroba mikroelektrod I. Do skleněné kapiláry s jedním zataveným koncem se vloží kovový drátek požadovaného průměru Kapilára se připojí na vakuum a umístí do smyčky z odporového drátu Smyčku připojíme ke zdroji a pozorujeme její rozžhavení Kontrolujeme zatavení konce kapiláry natavená část se nesmí příliš prohnout
Výroba mikroelektrod II. Vychladlou kapiláru brousíme do požadovaného tvaru aby drátek (budoucí ME) byl pokud možno ve středu a výsledný hrot měl symetrický tvar Tvar hrotu kontrolujeme mikroskopem Vybroušený hrot leštíme postupně pomocí leštících prášků (1 µm; 0,3 µm; 0,05 µm) Do kapiláry aplikujeme uhlíkovou vodivou pastu a vložíme drátek, který poslouží jako kontakt
Charakterizace ME Připravíme čerstvý roztok 3 mmk 4 [Fe(CN) 6 ] v 0,5 M KCl Provedeme měření CV v rozmezí potenciálu -100 mv +600mV Voltamogram má typický tvar V případě neideálního voltamogramu se povrch ME musí přeleštit!
Přibližovací křivka ME umístíme na nosné rameno mikroskopu a připojíme kontakt Ostatní elektrody si předem připravíme do Petriho misky a rovněž připojíme kontakty Hrot ME polohujeme do výšky cca 150 µm nad povrchem dle typu povrchu volíme hodnotu proudu, který nastavujeme v ovládacím SW I = I T pro negativní zpětnou vazbu, 0,25 I = I T pro pozitivní zpětnou vazbu, 1,25
Skenování SPE Do Petriho misky se umístí sítotisková elektroda a přelije se roztokem mediátoru Proměří se přibližovací křivka a zvolí se správná výška hrotu nad vzorkem V ovládacím swse nastaví skenovaná oblast a rychlost skenování Naměřená data se importují do analytického SW Origin a vynesou graficky
Skenování SPE-GOX SPE se odmastí 30 min v acetonu Na zlatou elektrodu se nanese roztok cysteaminu (20 mg/ml v DW) 2h RT Po oplachu následuje inkubace s glutaraldehydem 1h RT Enzym glukosaoxidasa se inkubuje přes noc v lednici Roztok pro měření: 50 mmglukosa v 0,150 M KCl Naměřená data se vyhodnotí v Originu
Děkuji za pozornost! 73