Obsah Úvod... 2 1 Teoretická část... 3 1.1 Historie... 3 1.2 Systematické zařazení... 3 1.3 Rozmnožování... 4 1.3.1 Princip rozmnožování... 4 1.3.2 Životní cyklus... 4 1.4 Laboratorní metody při určování plísní... 5 1.4.1 Izolační metody... 5 1.4.2 Kultivační metody... 5 1.4.3 Preparační metody... 5 1.5 Degradace materiálů... 6 1.5.1 Degradace stavebnin... 6 1.5.2 Degradace potravin... 6 2 Praktická část... 7 2.1 Cíl výzkumu... 7 2.2 Metodika výzkumu... 7 2.2.1 Odebírání vzorků... 7 2.2.2 Spady... 7 2.2.3 Stěry... 7 2.2.4 Kultivace plísní... 7 2.3 Výsledky výzkumu... 8 2.3.1 Vzorek č. 1... 8 2.3.2 Vzorek č. 2... 9 2.3.3 Vzorek č. 3... 10 2.3.4 Vzorek č. 4... 11 2.3.5 Vzorek č. 5... 12 2.3.6 Vzorek č. 6... 13 3 Diskuse... 14 4 Závěr... 16 Zdroje... 17 1
Úvod Tématem práce,,plísně v interiérech a exteriérech je studium mikroskopických hub vyskytujících se všude kolem nás. Naší motivací pro zvolení daného tématu byl zájem o plísně a jejich vliv na prostředí. V průběhu donekonečna se opakujícího koloběhu lidských životů jsme se naučili využívat plísně k našemu prospěchu (Penicillium chrysogenum atd.). Avšak valná většina společnosti si neuvědomuje, že plísně nenajdeme jen ve starém sýru, ale že jsou všude kolem nás. Cílem této práce je seznámit společnost s tímto faktem. Tato práce je rozdělena na dvě části teoretickou a empirickou. V teoretické části se zabýváme historií mykologie, rozmnožováním, životními cykly, degradací materiálů plísněmi, laboratorními metodami určování plísní. Empirická část obsahuje zpracované výsledky samotného výzkumu, což je identifikace plísní z různých interiérových a exteriérových prostor. 2
1 Teoretická část 1.1Historie O existenci plísní se vědělo již na začátku 19. století - první nákresy plísní z ovzduší nakreslili spolupracovníci Charlese Darwina v roce 1833. V polovině 19. století byla Pasteurem a dalšími vědci objevena podstata infekčních onemocnění u lidí a hospodářských zvířat. Bakterie a plísně se poté staly středem zájmu intenzivního studia. Zvýšenou pozornost si ale plísně zasloužily až po smrti deseti archeologů, kteří se zúčastnili otvírání hrobky krále Kazimíra v Polsku v roce 1973. Po dlouhém bádání se zjistilo, že v hrobce bylo mnoho plísní, které archeologové vdechovali dlouhou dobu v uzavřeném prostředí hrobky, byly následně odhaleny jako příčina onemocnění s následkem smrti. (http://www.tzb-info.cz/4775- historie-a-standardizace-hodnoceni-koncentraci-bakterii-a-plisni-v-ovzdusi) V současné době se plísně využívají v potravinářství (sýry, trvanlivé salámy atd.), farmaceutickém průmyslu, (antibiotika, enzymy, růstové látky a vitamíny), jako modelové organismy atd. 1.2 Systematické zařazení Plísně jsou mikroorganismy, které se řadí do samostatné říše hub. Věda zabývající se houbami se nazývá mykologie (z řeckého mykés = houby, logia = učení). Houby se člení na: oddělení: Myxomycota (hlenky) oddělení: Chytridiomycota oddělení: Hypochytridiomycota oddělení: Oomycota (řasohouby) oddělení: Eumycota a. třída: Zygomycetes b. třída: Trichomycetes c. třída: Endomycetes d. třída: Ascomycetes e. třída: Basidiomycetes f. pomocná třída: Deuteromycetes (fungi imperfecti) Houby též dělíme na makroskopické - houby vyšší s plodnicí viditelnou pouhým okem a mikroskopické kvasinkové houby a vláknité houby. Vláknité houby se nazývají plísně. (Paříková, 2001, s.8) 3
1.3 Rozmnožování 1.3.1 Princip rozmnožování Plísně jsou buněčné organismy. Základem jejich těla je vláknitý útvar, který se nazývá hyfa. Hyfy se větví a vytvářejí značně složitou spleť vláken, která se nazývá mycelium (podhoubí). Barva mycelia je hlavně způsobena jejich výtrusy, čili sporami. Spory jsou mikroskopické rozmnožovací částice plísní, které vznikají nepohlavním nebo pohlavním způsobem. Jsou lehké, vodoodpudivé a velice snadno se uvolňují z rozmnožovacích útvarů do okolního prostředí a kontaminují tak i další plochy a povrchy předmětů. Častější je nepohlavní rozmnožování a může se opakovat i mnohokrát do roka. Kromě toho se plísně mohou ještě rozmnožovat rozrůstáním hyf a jejich úlomků. (Paříková, 2001, s. 9) 1.3.2 Životní cyklus Životní cyklus plísní začíná vyklíčením spory. Klíček nejprve projde skrz buněčnou stěnu nebo jiný povrch substrátu a postupně se rozrůstá v hyfu a poté v mycelium. Mycelium se dále dělí na část vegetativní tvořenou hyfami a část reprodukční tvořenou rozmnožovacími orgány (pohlavními a nepohlavními) 1. spora 2. naklíčená spora 3. hyfa 4. mycelium 5. mycelium s rozmnožovacími orgány 6. rozmnožovací orgán s uvolňujícími se sporami 4
1.4 Laboratorní metody při určování plísní (Fassatiová, 1979, s. 17-29) 1.4.1 Izolační metody Vzorky substrátu, ze kterého izolujeme plísně, uchováváme ve skleněných nádobách (Petriho miskách nebo uzavřených zkumavkách). Ze vzorku substrátu odebíráme inokulum a dáváme ho do sterilní vody ve zkumavce. 1.4.2 Kultivační metody A. Kultivace Kultivace se provádí buďto na přirozeném substrátu nebo na syntetických živných půdách, které se zpevňují agarem. Při kultivaci zjišťujeme rozdíly mezi různými kultivovanými kmeny, které se rozdělují fyziologicky (např.: produkcí enzymů nebo toxinů) a morfologicky (např.: rozdíly ve zbarvení, charakteru porostu). B. Kultivační média Existuje velké množství živných půd přirozených, polosyntetických a syntetických. Z nich jsou zde vybrány pouze některé, vhodné pro kultivaci mnohých saprofytických plísní a vláknitých hub. C.Konzervování kultur Běžně uchovávané kultury hub ve sbírce je nutné 2krát až 3krát do roka přeočkovávat. Mnohdy při častém přeočkování dochází ke ztrátě některých charakteristických morfologických vlastností (struktura porostu, zbarvení, fyziologické změny) nebo i ke sterilitě. Proto konzervujeme kmeny tak, aby vydržely v dobrém stavu a podstatně nezměněny po delší období. Nutná je častá kontrola makro i mikroskopická. 1.4.3 Preparační metody A. Monosporické kultury Čistá kultura je prvním předpokladem pro přesné určení i pro další práci v taxonomii i fyziologii mikroskopických hub. Pro determinační praxi vystačíme s vícesporickými kulturami. Pro některé detailní práce taxonomické, a hlavně genetické, je zapotřebí pracovat s monosporickými kulturami tzn. s kulturami vypěstovanými z jedné spory. B. Sklíčkové kultury Mikrostruktury plísní a vláknitých hub se při preparaci velmi snadno poruší. Používáme proto často sklíčkové kultury v různých modifikacích, jejichž principem je pěstování houby v mikroprostředí přímo na speciálním objektivovém podložním sklíčku. C. Preparáty Plísně a vláknité houby nalezené v přírodě nebo jejich kultury pozorujeme nejprve pro posouzení celkového habitu pod binokulární lupou nebo při malém zvětšení mikroskopu. Pro podrobnější studium se ovšem neobejdeme bez mikroskopických preparátů. 5
1.5 Degradace materiálů 1.5.1 Degradace stavebnin Fyzikální degradace stavebnin jsou zapříčiněny opakovaným mrznutím a roztáváním vody přítomné v pórech zdiva, tudíž je omezeno odpařování ze zdí a vzniká vzdušná vlhkost v místnosti. Přitom ve vodě začínají růst mikroorganismy, které produkují různé korozivní látky, např.: organické kyseliny rozpouštějící vápno a uhličitan vápenatý v přítomných materiálech. Také se na stěnách tvoří skvrny způsobené růstem autotrofních řas a mikroskopických hub. Veškerý povrch staveb vystavený vzduchu přichází do styku s infekcí diasporami hub. Protože se do stavebních materiálů v minulosti přídávalo mnoho organických příměsí, např. hovězí srst, je jasné, že se zdivo stává téměř ideálním povrchem pro růst plísní. Na freskách a nástěnných malbách kostelů se používaly části rozsekané slámy, ječný plev a konopná vlákna, jelikož malby ztrácely svou barvu a vznikaly bělavé skvrny. (Řeháková, 1987, s. 8 11) 1.5.2 Degradace potravin Potraviny jsou pro plísně velice vhodným substrátem. Po kontaminaci potravin plísněmi dochází ke snížení obsahu vitamínů, minerálů a dalších živin, což snižuje biologickou hodnotu potravin. Podstatné ale je, že plísně kontaminují potraviny svými produkty- mykotoxiny= aflatoxiny, jež mají negativní vliv na zdraví člověka. 6
2 Praktická část 2.1 Cíl výzkumu Identifikace druhů plísní z několika interiérových a exteriérových povrchů. Určení výskytu nejpočetnějšího rodu plísní. 2.2Metodika výzkumu 2.2.1 Odebírání vzorků Vzorky jsme odebírali dvěma různými způsoby, které vám budou popsány v následujících oddílech. Vzorky jsme izolovali v různých lokalitách (interiérech a exteriérech). Při výběru lokalit jsme se snažili o to, aby lokality byly rozdílné a pro nás dostupné. Vzorky byly odebrány v následujících lokalitách: sklep rodinného domu používaný jako sklad jablek, obývací pokoj rodinného domu, sklad obchodu se smíšeným zbožím, vnitřní stěna terária obývaného vodní želvou, povrch na zahradě -složené hromady dřeva, vnitřní stěna boudy pro psa, zahrada rodinného domu na venkově, dlaždička na toaletě rodinného domu. 2.2.2 Spady Spad je odběrová metoda, při které se Petriho miska s agarem položí na zkoumané místo. Zde se nechá okolo jedné hodiny otevřená. Za tuto dobu expozice se na živnou půdu v misce zachycují zárodky plísní, které se následně použijí ke kultivaci. 2.2.3 Stěry Stěr je odběrová metoda, při které se k Petriho misce s agarem používá ještě zkumavka s destilovanou vodou a sterilním vatovým tamponem. Vatovým tamponem namočeným v destilované vodě se přejede po povrchu zkoumaného objektu. Tampon se vzorkem uložíme, jako zátku do zkumavky. Poté v laboratoři tampon vytáhneme a potřeme jím agar v Petriho misce. 2.2.4 Kultivace plísní Na kultivaci byly použity dva druhy agaru: sladinový a bramboro-mrkvový. Připravené přeočkované vzorky jsme uložili na sedm dní do termostatu a počkali, až začnou sporulovat. Jakmile vzorky přestaly být sterilní, začali jsme je určovat a zkoumat. 7
2.3 Výsledky výzkumu 2.3.1 Vzorek č. 1 Interiér- terárium Stěr Na vzorku se vyskytly: bakterie, kvasinky a z plísní rod Cladosporium. Výsledky byly na obou agarech z hlediska rodů plísní identické. Na obrázku číslo 1 můžete vidět výsledky jak na sladinovém agaru tak i na bramboromrkvovém. Na obrázku číslo 2 můžete vidět místo odběru. Obr.č.1 Autor: Karel Prášil CSc. Zde můžete vidět jak sladinový agar (nahoře) tak i bramboro-mrkvový agar (dole). Obr.č.2 Autor: Vojtěch Kratochvíl Zde můžete vidět zkoumané místo- -terárium 8
2.3.2 Vzorek č. 2 Exteriér- zahrada Spad Na sladinovém agaru narostlo 25 kolonií plísní. Podařilo se nám identifikovat rody plísní Basidium, Cladosporium, Alternaria. Na bramboro-mrkvovém agaru se vyskytl rod Fusarium. Obr.č.3 Zde můžete vidět kolonie na bramboro-mrkvovém agaru (nahoře) i kolonie na sladinovém agaru (dole). Autor: Karel Prášil, CSc. Obr.č.4 Zde je zachyceno zkoumané místozahrada Autor: Jakub Novák 9
2.3.3 Vzorek č. 3 Interiér- pokoj Spad Na slatinovém agaru se vyskytlo 9 kolonií plísní. 5 rodů jsme identifikovali Cladosporium, Basidium, Penicillium, Alternalia, Ulocladium. Zbytek jsme nedokázali určit. Na bramboro-mrkvovém agaru převládaly bakterie a kvasinky a z rodů plísní se vyskytl rod Cladosporium. Obr.č.5 Zde můžete vidět oba agary, nahoře bramboro-mrkvový a dole sladinový. Autor: Karel Prášil, CSc. Obr.č.6 Toto je zkoumané místo- pokoj Autor: Jakub Novák Obr.č.7 Ulocladium Mikroskopický preparát zvětšení: 64x Autor: Jakub Novák 10
2.3.4 Vzorek č. 4 Interiér- sklep Spad Na vzorku se vyskytlo široké spektrum druhů plísní- přes 50 kolonií. Dokázali jsme určit Rhizopus, Penicilium, Cladosporium, Alternaria. Zbytek jsme nedokázali určit. Na obou typech agaru byly výsledky podobné Obr.č.8 Zde můžete vidět oba agary: sladinový (nahoře) a bramboromrkvový (dole). Autor: Karel Prášil, CSc. Obr.č.9 Toto je zkoumané místo-sklep Autor: Jakub Novák 11
2.3.5 Vzorek č. 5 Exteriér- dřevo Stěr Na obou agarech se vyskytly kvasinky, bakterie a tyto rody plísní: Cladosporium, Trichoderma, Graphium- tento rod plísně se vyskytuje vždy u dřeva. Obr.č.10 Graphium Mikroskopický preparát zvětšení: 30x Autor: Karel Prášil, CSc Obr.č.11 Toto jsou kolonie na sladinovém agaru. Autor: Jakub Novák Obr.č.12 Zde je zkoumané místosložené dřevo na zahradě Autor: Vojtěch Kratochvíl 12
2.3.6 Vzorek č. 6 Interiér- sklad potravin Spad Na obou agarech se vyskytlo 30 kolonií plísní. Dokázali jsme určit Mucor, Cladosporium, Penicillium, Rhizopus. Zbytek jsme nedokázali určit. Obr.č.13 Zde je zachycen sladinový agar. Autor: Jakub Novák Obr.č.14 Rhizopus Mikroskopický preparát zvětšení: 64x Autor: Karel Prášil, CSc Obr.č.15 Zde je zachyceno zkoumané místo-sklad potravin Autor: Nguyen Binh Duong 13
3 Diskuse Cílem tohoto výzkumného šetření bylo zaměřit se především na výskyt plísní v interiérových a exteriérových prostorách. Plísně jsou heterotrofní organismy a jsou součástí prostředí, ve kterém žijeme. Na začátku našeho krátkého výzkumu jsme předpokládali, že více druhů plísní se bude vyskytovat v exteriérech, naše hypotéza se nepotvrdila, protože více druhu plísní se vyskytlo v interiérových prostorách. Domníváme se, že je to z důvodu vhodnějších životních podmínek, jako je teplota, vlhkost. Dále může hrát úlohu četnost odběrů, u exteriéru roční období atd. Nejrozšířenějším rodem plísní, co se týče vnějších i vnitřních prostor, je rod Cladosporium, vytváří olivově zelené až hnědé kolonie, které jsou vytvořené z jednoduchých nebo větvených řetězců. Některé druhy jsou rostlinné patogeny, jiné paraziti. Rod Cladosporidium se vyskytoval ve všech zkoumaných vzorcích. Další zkoumanou plísní byla plíseň z rodu Penicillinum, která se vyskytovala jenom u vzorků odebraných z interiérových prostor vzorek č. 3, č. 4 a č. 6. Rod Alternaria se vyskytoval ve vzorcích č. 2 (exterier) a č. 3 a č. 4 (interier). Zřídka se vyskytovaly rody Basidium (č. 3 a č. 2) a rod Rhisophus (č. 4 a č. 6). Rod Ulocladium a rod Cladosporium sa vyskytly na vzorku č. 3. Rod Trichoderma a rod Graphium se vyskytovaly na vzorku č. 5. Rod Mucor se objevil jenom na vzorku č. 6, rod Fusarium na vzorku č. 2. Na základě těchto poznatků jsme usoudili, že rody Fusarium, Trichoderma a Graphium se vyskytují na našich vzorcích pouze v exteriérech, rody Cladosporium, Ulocladium, Penicillium, Rhisophus a Mucor pouze v interieru. Rody Cladosporium, Basidium a Alternaria se vyskytují ve venkovních i vnitřních prostorách. Porovnáváním výzkumných vzorků jsme také zjistili, že více plísní se zachytilo na sladinovém agaru. U vzorku č. 1, č. 4, č. 5 a č. 6 byly zachyceny stejné plísně na obou živných půdách, na vzorcích č. 2 a č. 3 byly zachycené odlišné rody plísní. Na grafech dále můžete vidět, jak často se určité rody plísní vyskytovali v exteriérech a interiérech. Na grafu č. 1 v interiérech a na grafu č. 2 v exteriérech. 14
Graf č. 1: Četnost výskytu rodů plísní z interiérů Graf č. 2: Četnost výskytu rodů plísní z exteriérů 15
4 Závěr Zaměření této práce spočívá ve zjišťování a porovnání výskytu plísní v interiérech a exteriérech a v jejich identifikaci. Následně jsme získané vzorky vyhodnocovali co do četnosti rodů plísní. Prací jsme získali dovednost v odebírání vzorků a zlepšila se i naše manipulace s laboratorními nástroji a mikroskopem. Získali jsme překvapivé zkušenosti s opravdovým výzkumem. Celkově nám práce rozšířila naše obzory ve světě plísní a pochopili jsme, že plísně jsou opravdu všude a že některé mají své praktické využití. Také jsme získali důležitou zkušenost ve vytváření seminárních prací, získávání informací a prací s textem a jeho následným zpracováním. 16
Zdroje 1. http://www.tzb-info.cz/4775-historie-a-standardizace-hodnoceni-koncentraci-bakterii-aplisni-v-ovzdusi 2. FASSATIOVÁ Olga: Plísně a vláknité houby v technické mikrologii, Praha, SNTL 1979, s. 17-29, DT 663.1, 3. PAŘÍKOVÁ Jelena: Jak likvidovat plísně, Praha, GRADA PUBLISHING 2001, s. 8 10, ISBN 80-247-9029-7 4. PAŘÍKOVÁ Jelena: Jak likvidovat plísně, Praha, GRADA PUBLISHING 2001, s. 39-40, ISBN 80-247-9029-7 5. ŘEHÁKOVÁ Lenka: Diplomová práce, Praha 1987, s. 8-11 17