AMIKYSELIY becná struktura STAVEÍ AMIKYSELIVÉH SLŽEÍ BÍLKVI 1. IZLAE (jen v některých případech) 2. HYDLÝZA kyselá hydrolýza pomocí Hl ( c = 5 mol.dm -3 ) klasicky: 105-120, 18-24 h, inertní atmosféra, někdy přídavek thioglykolové kyseliny nově: mikrovlnný ohřev (trvá minuty) destrukce některých AA za podminek hydrolýzy - tryptofan, sirné aminokyseliny, amidy aminokyselin (částečně serin, threonin) Stanovení sirných aminokyselin Kyselá hydrolýza oxidace kyselinou permravenčí (kyselá hydrolýza) H 2 H H SH H 2 cystein 3 HH H-H H 2 H H - H-H S 3 H H 2 cysteová kyselina H 2 H 2 H H S H 3 H 2 methionin 2 HH H-H - 2 H-H H 2 H 2 H H S H 3 H 2 methioninsulfon 1
Stanovení tryprofanu po alkalické hydrolýze, nejčastěji Ba(H) 2 ( c = 5 mol.dm -3 ), 125-130, 24 hodin Stanovení asparaginu a glutaminu enzymovou hydrolýzou -pepsin -trypsin - papain - peptidasy SEPAAE A KVATIFIKAE AMIKYSELI hromatografie v plošném uspořádání KAPALIVÁ HMATGAFIE Plynová chromatografie Elektromigrační metody Dělení aminokyselin chromatografií na tenké vrstvě 2
DĚLEÍ AMIKYSELI PMÍ (HP)L ůzné é typy separačních mechanismů hromatografie (nízkotlaká) na měničích iontů silně kyselé katexy - mobilní fáze: pufry se vzrůstající hodnotou ph a iontovou sílou - nižší ph - neutrální a kyselé aminokyseliny -vzrůst ph - bazické aminokyseliny automatický analyzátor aminokyselin hromatografie v reverzní fázi často předkolonová derivatizace Iontově párová chromatografie typicky pokolonová derivatitace - snadná automatizace, snazší manipulace se vzorkem (B) A = εbc A = log P 0 /P A A = log 1/T A = log 100/%T A = 2 - log %T 3
tázka: jak detekovat aminokyseliny? absorbce v UV - jen aromatické aminokyseliny fluorescence - tryptofan změna indexu lomu (refraktometrie) - nespecifické, málo citlivé potřeba derivatizace 1. TVBA DEIVÁTŮ P (HP)L základní aspekty zvažované při volbě derivatizační metody Dobrá L separace analytů Snadnost přípravy derivátu, jeho stabilita, možnost automatizace itlivost a selektivita detekce A. Derivatizace před separací - prekolonová Požadována tvorba stabilních projektů A1. fluoreskující produkty S 2 l H 3 H 3 dansylchlorid + H 2 H H S 2 H H H H 3 H 3 dansylderivát S 3 H + H 2 H H S 2 H H H H 3 H 3 4-toluensulfonová kyselina tosylderivát AQ (6-aminoquinolyl - hydroxysuccinimidylcarbamate) - vznikají stabilní deriváty absorbující též v UV 4
A2. UV- absorbující produkty 2 F 2 + H 2 H H 2 H 2 H H + HF 2, 4-dinitrofluorbenzen 2, 4-dinitrofenylderivát Fenylisothiokyanát B. derivatizace po separaci - pokolonová musí být velmi rychlá, stabilita derivátu není rozhodující ejčastější činidla: PA (o- ftaldehyd), fluorescence (někdy i prekolonově) ninhydrin - produkty absorbující ve viditelné části spektra ejčastější činidla: PA (o- ftaldehyd), fluorescence (někdy i prekolonově) ninhydrin - produkty absorbující ve viditelné části spektra H H H H + -H= + H3 + + H 2 H H +2 ninhydrin (trioxohydrindenhydrát) H H + + H3 H H dioxohydroxyhydringen H + 3 H2 5
2. TVBA DEIVÁTŮ P G požadavek: těkavé produkty nutné derivatizovat obě funkční skupiny A. estery -acylaminokyselin esterifikační činidla (derivatizace( H): isopropanol, isobutanol, n-butanol, metanol, isobutanol + 3M Hl -acylační činidla (derivatizace( aminoskupiny): anhydridy kyselin - pentafluor- propionové, heptafluormáselné, trifluoroctové H H H 2 + H H () 2 H H 2 H + H B. Trimethylsilylestery -trimethylsilyl aminokyselin H H + (H3)3SiX H Si(H 3 ) 3 H H Si(H 2 3 ) 3 + HX AALÝZA AMIKYSELI - specielní aspekty volné - izolace po okyselení (obtíže s rozpustností leucinu, cysteinu aj.) Důkaz aminokyselin a) eakce s kovovými ionty barevné komplexy su 2+, Fe 3+ aj. H H 2 Me b) eakce s ninhydrinem (Streckerova degradace aminokyselin) 6
A. STAVEÍ ELKVÉH BSAHU AMIKYSELI Formolová titrace H H + H2= H 2 H H H H 2 H další produkty Titrace karboxylové skupiny alkalimetricky Manometrická van Slykeova metoda H H H H + H2 H H + 2 + H2 2 3 H 2 H 3 + 2 + H 2 2 + 2 + H 2 H 3 + H 2 H 2 + H 3 + 2 ah a 2 + a 3 + 2 H 2 4. Spektrofotometrické metody eakce s ninhydrinem - měření fialového zbarvení viz důkaz aminokyselin eakce s 2,4,6-trinitrobenzensulfonovou kyselinou 2 2 S 3 H + H 2 H H 2 2 2 S 2 H H H + H2 2 B. STAVEÍ ĚKTEÝH PTAVIÁŘSKY DŮLEŽITÝH AMIKYSELI Stanovení lysinu ELKVÝ BSAH Spektrofotometrická metoda -vznik komplexu s u (II) a derivatizace ε-aminoskupiny 2,4- dinitrofluorbenzenem, redukce vzniklého produktu 7
2 H 2 (H2) 3 H H H 2 H 2 u2+ - 2 H+ H H 2 (H 2 ) 4 H 2 u H (H 2 ) 4 H 2 H 2 + 2 2 2 F 2-2 HF 2 H H (H 2 ) 4 H 2 u H (H 2 ) 4 H H 2 2 2 2 2 H (H 2 ) 4 H H H 2 Enzymová metoda L-lysinkarboxylasa, E 4.1.1.18. (= lysindekarboxylasa) měření uvolněného oxidu uhličitého či kadaverinu H 2 (H 2 ) 3 H H H 2 (H 2 ) 3 H 2 H 2 H H2 2 H 2 lysin kadaverin + 2 HAAKTEIZAE EZYMVÝH METD reakce jsou specifické není třeba selektivně izolovat analyt ze vzorku jednoduché provedení specifita enzymu - ve vztahu k typu katalyzované reakce - pro daný substrát, který je konvertován nelze získat informaci o jednotlivých komponentách spektra sloučenin, měří se jednotlivé analyty 8
Využitelný lysin Spektrofotometrická metoda 2 H H (H 2 ) 4 H 2 + 2 F H H (H 2 ) 4 H 2 H2 (Hl) H H H (H 2 ) 4 H 2 2 2 Stanovení hydroxyprolinu Spektrofotometrická metoda H H H H22-2 H2 H 2 H H H H H H 3 H 3 - H2 H H H H 3 H 3 H H H H H H Využití: Stanovení obsahu kolagenu v masných výrobcích (příliš vysoký obsah kolagenu je známkou nadměrného obsahu pojivové tkáně) bsah kolagenu se získá vynásobením obsahu hydroxyprolinu faktorem 8.0 Stanovení tryptofanu Spektrofotometrická metoda měření intenzity zbarvení s, - dimethylaminobenzaldehydem v přítomnosti H 2 Stanovení glutamové kyseliny Enzymové metody Varianta A H 2 H 2 H H H H 2 L-glutamát 1-karboxylasa H 2 H 2 H 2 H H 2 + 2 možno stanovit 4-aminomáselnou kyselinu nebo 2 9
Varianta B H 2 H 2 H H H H 2 L-glutamát: AD oxidoreduktasa H 2 H 2 H H AD+, H2 H H 2 + ADH + H4 + možno stanovit 2- oxoglutarovou kyselinu nebo ADH (přímo v ultrafialové oblasti spektra nebo po následné enzymové reakci 1. ADH + H + + diaforasa-fad (red. AD: lipoamid oxidoreduktasa, E 1.6.1.3.) AD + + diaforasa-fadh 2 2. diaforasa-fadh 2 + tetrazolinová sůl diaforasa-fad + formazan 3 + 1 2 X- 2 H - XH 3 H 1 2 tetrazoliová sùl formazan H2 H2 H H H H 2 L-glutamát: FAD oxidoreduktasa FAD, 2, H2 H2 H2 H H H + FADH2 + H22 + H3 možno stanovit 2-oxoglutarovou kys., kyslík nebo peroxid vodíku Stanovení sirných aminokyselin Titrační argentometrická metoda 2 -SH + 2 Ag 3 -S-S- + 2 Ag + H 3 redukce disulfidů : -S-S- + a 2 S 3 + H 2 2 -SH + a 2 S 4 Spektrofotometrická metoda H H2 H2 H H H3 H2 + H3 H2 SH H H 2 H SH2 H H -ethylmaleinimid H2 redukce disulfidů: -S-S- + a + H 2 2 SH + a 10
Stanovení různých aminokyselin Prolin (ninhydrin, HH) Arginin (8-hydroxycholin, HH) Kreatin, resp. kreatinfosfát (biacetyl, 2-naftol; enzymové stanovení) Kreatinin (pikrová kyselina, enzymové stanovení) AALÝZA PEPTIDŮ Karnosin, anserin: histidylalaninové peptidy reakce s 2, 4-dinitrofluorbenzenem 2, 6-dioxopiperaziny ( cyklické dipeptidy) chromatografické metody Vyšší peptidy - chromatografické metody, L/MS Další dusíkaté sloučeniny nukleotidy (volné nukleotidy), nukleosidy, báze nukleových kyselin aminy, biogenní aminy dusitany, dusičnany Stanovení nukleotidů v hovězích játrech (HPL/UV, ionex) 11