N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie

ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie Název úlohy: Hydrobiologie: Biologický rozbor - Stanovení abiosestonu Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie PIGA číslo projektu Řešitel C_VŠCHT_2015_013 ifis číslo projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D. 217 17 5642 Spoluřešitelé Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová Rok zpracování: 2015 1

Hydrobiologie: Biologický rozbor - Stanovení abiosestonu Oblast použití: Stanovení slouží pro posuzování samočisticích procesů ve vodních tocích, pro zjišťování vlivu údolních nádrží, rybníků a jiných nádrží a zdrží na vodní tok nebo pro hodnocení účinnosti jednotlivých stupňů úpravy vody a čištění odpadních vod. Identifikace neživých částic pomáhá určit původ zdrojů znečištění a zátěže nejrůznějšího druhu. Stanovení ruší vyšší obsah živých organismů v řádu 10 4 až 10 5 jedinců v 1 ml zkoušené vody. Podstata zkoušky: Metoda je založena na stanovení pokryvnosti zorného pole mikroskopu částicemi zahuštěnými odstředěním určitého objemu vody. V některých případech se vzorek neodstřeďuje, např. u vzorku stěru, sedimentu, kalů apod. Přístroje a pomůcky: Centrifugační zkumavky na 10 ml kónicky zúžené, s ostrou špičkou s kalibrací na 0,1 ml; 0,2 ml; 0,5 ml; 1,0 ml a 10,0 ml. Laboratorní odstředivka s výkyvným rotorem Mikroskop s křížovým stolkem. Pasteurova pipeta (jednorázová plastová). Počítací komůrka Cyrus I (alternativně Cyrus II). Preparační jehla. Chemikálie: Používané chemikálie jsou stupně čistoty ch.č. nebo p.a. Voda se používá destilovaná nebo demineralizovaná bez specifických požadavků na jakost. Etanol. Pentahydrát thiosíranu sodného, Na 2 S 2 O 3 5H 2 O, roztok 1,8 % (hmotnostní zlomek). Lugolův roztok. Imerzní olej. Odběr a úprava vzorků: Vzorky se odebírají podle pokynů uvedených v ČSN EN ISO 5667-1, ČSN EN ISO 5667-3, ČSN ISO 5667-4, ČSN ISO 5667-5, ČSN ISO 5667-6, ČSN ISO 5667-10 a ČSN ISO 5667-11. Pokud se odebírají vzorky vody, která byla chlorována, musí vzorkovnice obsahovat činidlo k neutralizaci zbytků chloru. Do každé vzorkovnice se přidává na každých 100 ml jejího objemu 0,1 ml 1,8 % (m/m) roztoku pentahydrátu thiosíranu sodného (Na 2 S 2 O 3 5H 2 O). 2

Vzorkovnice se naplní do 4/5 objemu. Vzorek se zpracuje co nejdříve po odběru, nejpozději do 24 h. Dopravuje se v chladicí brašně a do doby zpracování se uchovává ve tmě při teplotě 1 C až 5 C. Postup zkoušky: Temperace vzorku: Před vlastním rozborem se vzorek, pokud je odebírán za nízkých teplot nebo uchováván v lednici, nechá vytemperovat na laboratorní teplotu 20 C až 25 C. K vytemperování obvykle stačí doba nutná pro přípravu pracovní plochy a všech pomůcek nutných ke zpracování vzorku. Promíchání vzorku: Vzorek se důkladně promíchá protřepáním tak, aby se do vzorku dostaly i ty částice, které se po dobu uchování a transportu usadily na dně nebo na stěnách vzorkovnice. Centrifugace: Do centrifugační zkumavky se odměří 10 ml důkladně promíchaného vzorku. Odstřeďuje se při 2 000 otáčkách/min po dobu 5 min při použití rotoru s poloměrem 0,08 m. Doběh odstředivky nesmí být brzděn. Při použití rotoru jiného poloměru, se počet otáček přepočte (viz stanovení biosestonu). Slití vzorku: Po odstředění se voda ze zkumavky slije do čisté nádoby rychlým otočením dnem vzhůru, bez zvíření sedimentu. Voda ulpělá na stěnách se spojí se zbytkem opakovaným krátkým odstředěním. Odstředěný zbytek se upraví Pasteurovou pipetou na vhodný objem (např. 0,1 ml až 1 ml). K úpravě objemu se použije voda po odstředění. Pro pitnou vodu se obvykle používá úprava odstředěného zbytku na objem 0,2 ml. Přenesení vzorku na rastr počítací komůrky: Obsah se důkladně ale opatrně promíchá opakovaným nasáváním Pasteurovou pipetou (ne probubláváním) nebo rychlou rotací preparační jehlou. Kapka homogenizovaného vzorku se Pasteurovou pipetou rychle přenese na mřížku počítací komůrky Cyrus předem vyčištěné etanolem a překryje krycím sklem, které se připevní svorkami. Přebytečná voda, uniklá do bočních kanálků, se odstraní vyfouknutím. Vzorek se ihned zpracuje pod mikroskopem. Určení částic a vyjádření procenta pokryvnosti: Sleduje se přítomnost větších částic. Provede se odhad pokryvnosti alespoň čtyř náhodně vybraných zorných polí. Jejich počet musí být vyšší v případech, kdy výsledky náhodně vybraných polí se vzájemné významně liší, např. kvůli výskytu velkých částic. Podle charakteru částic se volí jeden z dále uvedených způsobů odhadu pokryvnosti: Postup 1: Porovnání s odhadní stupnicí: K porovnání se použijí tabule s objekty, jejichž velikost a tvar nejlépe odpovídají částicím ve vzorku. Začíná se při 200násobném zvětšení. Pokud si však částice v zorném poli mikroskopu a objekty na tabulích velikostí neodpovídají, použije se k jejich lepšímu přiblížení jiný objektiv. Jsou-li zastoupeny převážně velké částice, doporučuje se provést odhad při 100násobném zvětšení. Jsou-li částice velmi malé, lze odhad provést při 400násobném zvětšení nebo odhad neprovádět pro celé zorné pole, ale pouze na ploše jednoho čtverce počítací komůrky. Výsledek se zaznamená v % pokryvnosti. Postup 2: Odhadem pokryvnosti jednotlivých částic. Tento postup se použije v případě, že se v zorném poli nacházejí částice, jejichž relativní velikost i při použití 100násobného zvětšení je mnohem větší než velikost objektů zobrazených na obrazové tabuli v přílohové části tohoto návodu. Pro tento postup je nutno znát, jak velkou část zorného pole v procentech představuje jedno pole počítací komůrky. Postup je založen na odhadu počtu polí počítací komůrky, které zabírají (pokrývají) přítomné částice. K tomu je vhodné si představit jejich přesun do jedné části zorného pole a odhadnout, kolik čtverců tyto částice zabírají (viz příklad 2). Kombinace postupu 1 a 2: Oba postupy lze kombinovat např. při odhadu pokryvnosti zorného pole mikroskopu při současném výskytu malých a velkých částic. V tomto případě se použije vzorec (5). Příklad výpočtu je uveden v přílohové části. 3

Postup 3: Analýza obrazu: Pro posouzení pokryvnosti lze v některých případech použít místo odhadu pokryvnosti analýzu obrazu. Výsledky získané analýzou obrazu a odhadem však zpravidla nejsou vzájemně srovnatelné. Proto není vhodné používat analýzu obrazu v případech, kdy jsou výsledky porovnávány s limitem, který je určen pro hodnocení pokryvnosti odhadem. Využití analýzy obrazu je vhodné např. v případech, kdy je potřebné postihnout menší kvantitativní změny v čase. Postup stanovení abiosestonu pomocí metody analýzy obrazu spočívá v převedení skutečného obrazu do šedé škály, následně převedení pixelů na černá a bílá pole a prostřednictvím vhodného programu spočítání procentuálního zastoupení černých a bílých pixelů, tedy stanovení pokryvnosti zorného pole mikroskopu. Příklad použití analýzy obrazu uvádí ve zkrácené podobě obr. 1 (v navazujících krocích). Vhodným programem pro určení procenta pokryvnosti abiosestonu je freeware UTHSCSA ImageTool (dostupný zcela zdarma na adrese http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html). Při pořizování snímků pro potřeby stanovení abiosestonu metodou analýzy obrazu je vhodné pořídit na rastru počítací komůrky několik fotografických snímků tak, aby bylo zachyceno procento pokryvnosti co nejpřesněji, např. 9 až 10 snímků, a dále zachytit pokryvnost i mimo rastr počítací komůrky (důvodem je nepřesnost při plnění komůrky vzorkem). Obr. 1. Příklad použití analýzy obrazu. 4

Vyhodnocení zkoušky: Přítomné částice abiosestonu se určí podle obrazových tabulí uvedených v normě ČSN 75 7713 (příklady zde uvádí obr. 2). Pozorované zorné pole mikroskopu pokryté částicemi se porovná s odhadní stupnicí uvedené na obrazové tabuli (viz obr. 3). Dále je možné postupovat na základě odhadu pokryvnosti jednotlivých částic. Pak je nutné zjistit, jakou velikost zorného pole mikroskopu představuje určité pole počítací komůrky. Velikost zorného pole mikroskopu musí být individuálně stanovena pro každý mikroskop. Tuto velikost lze proměřit objektivovým mikrometrem. Pro účely této normy je však dostatečné stanovení z čísla zorného pole a zvětšení používaného objektivu (je uvedené na okuláru za lomítkem údaje o zvětšení okuláru; použití a výpočty viz příklad 1). Velikost (průměr) zorného pole d v mm se potom vypočítá podle vzorce: d = z / M (1) kde z je číslo zorného pole v mm, M je zvětšení použitého objektivu. Pak se spočítá plocha S zorného pole mikroskopu, podle vzorce pro výpočet plochy kruhu: S = π (d / 2) 2 (2) Jelikož se pro počítání částic používá většinou počítací komůrka Cyrus I (délka strany čtverce 250 µm a délka strany malého čtverce 125 µm), je plocha čtvercových polí 62 500 µm 2 a 15 625 µm 2. Relativní velikost čtverců S rel vzhledem k zornému poli mikroskopu S se vypočítá podle vzorce: S rel =(62 500 / S) 100 (3) alternativně S rel =(15 625 / S) 100 (4) V případě, že se v zorném poli mikroskopu na rastru počítací komůrky vyskytují současně velké a malé částice a kombinují se výše uvedené 2 způsoby výpočtu procenta pokryvnosti porovnání s odhadní stupnicí a odhadem pokryvnosti jednotlivých částic, postupuje se při výpočtu výsledné pokryvnosti P podle vzorce: P = P v + [(100 P v ) / 100] P m (5) kde P v je pokryvnost velkými částicemi zjištěná na základě postupu odhadu pokryvnosti jednotlivých částic v procentech (viz postup 2), P m je pokryvnost malými částicemi zjištěná na základě postupu porovnání s odhadní stupnicí v procentech (viz postup 1). 5

Obr. 2 A: Příklady pylových zrn. 1 pyl borovice (Borovicovité), 2 pyl modřínu (Borovicovité), 3 pyl smrku (Borovicovité), 4 pyl břízy (Břízovité), 5 pyl olše (Břízovité), 6 pyl svídy (Dřínovité), 7 pyl dubu (Dubovité), 8 pyl hlohu (Růžovité), 9 pyl jabloně (Růžovité), 10 pyl jeřábu (Růžovité), 11 pyl třešně (Růžovité), 12 pyl trnky (Růžovité), 13 pyl švestky (Růžovité), 14 pyl střemchy (Růžovité), 15 pyl tamaryšku (Tamaryškovité). Poznámka: 1 světlý dílek na vyznačeném měřítku odpovídá 10 µm. 6

Obr. 2 B: Příklady pylových zrn. 1 pyl šeříku (Olivovníkovité), 2 pyl zlatice (Olivovníkovité), 3 pyl bezu (Zimolezovité), 4 pyl kaliny (Zimolezovité), 5 pyl pámelníku (Zimolezovité), 6 pyl zimolezu (Zimolezovité), 7 pyl vrby (Vrbovité), 8 pyl azalky (Vřesovcovité), 9 pyl magnólie (Šácholanovité), 10 pyl javoru (Javorovité), 11 pyl lípy (Lipovité), 12 pyl jírovce (Jírovcovité), 13 pyl brslenu (Jesencovité), 14 pyl jílku (Lipnicovité), 15 pyl sveřepu (Lipnicovité). Poznámka: 1 světlý dílek na vyznačeném měřítku odpovídá 10 µm. 7

Obr. 2 C: Příklady pylových zrn. 1 pyl řepky (Brukvovité), 2 pyl hořčice (Brukvovité), 3 pyl lnu (Lnovité), 4 pyl máku (Makovité), 5 pyl zemědýmu (Makovité), 6 pyl pastináku (Mrkvovité), 7 pyl jitrocele Jitrocelovité), 8 pyl kopřivy (Kopřivovité), 9 pyl slunečnice (Hvězdnicovité), 10 pyl podbělu (Hvězdnicovité), 11 pyl pcháče (Hvězdnicovité), 12 pyl kopretiny (Hvězdnicovité), 13 pyl opletníku (Svlačcovité), 14 pyl topolovky (Slézovité), 15 pyl tykve (Tykvovité). Poznámka: 1 světlý dílek na vyznačeném měřítku odpovídá 10 µm. 8

Obr. 2 D: Příklady škrobů a rostlinných zbytků. 1 bramborový škrob, 2 pšeničný škrob, 3 žitný škrob, 4 kukuřičný škrob, 5 rýžový škrob, 6 ovesný škrob, 7 ječný škrob, 8 fazolový škrob, 9 hrachový škrob, 10, 11 a 12 rostlinné zbytky. Poznámka: 1 světlý dílek na vyznačeném měřítku odpovídá 10 µm. 9

Obr. 2 E: Příklady živočišných zbytků. 1, 2, 3, 4, 5 a 6 příklady motýlích šupin, 7, 8 a 9 zbytky korýšů, 10, 11 a 12 - příklady štětin máloštětinatců, foceno na rastru počítací komůrky Cyrus I. při 20 zvětšení objektivu. 13, 14 a 15 příklady zbytků ptačího peří, 1 světlý dílek na měřítku odpovídá 10 µm. 10

Obr. 2 F: Příklady sloučenin železa, manganu a přítomných bakterií. 1 železité sraženiny, 2 vysrážené sloučeniny železa ze železité vody, 3 sediment při odkalování (sraženina dvojmocného železa), 4 oxidace sedimentu (3), 5 černé sloučeniny manganu, 6 pochvy železitých bakterií Leptothrix ochracea, 7 a 8 - produkty železité bakterie Gallionella, 9 a 10 pochva železité bakterie Leptothrix ochracea, 11 a 12 produkty železité bakterie Toxothrix trichogenes. 11

Obr. 2 G: Příklady anorganických částic, oleje a vláken. 1 vysrážený uhličitan z balené vody prošlé varem, 2, 3 a 4 vysrážený uhličitan z vodovodní sítě, 5, 6, 7 a 8 úlomky sklad ze zábrusu vzorkovnice, 9 písek z vodovodní sítě, 10 vzduchová bublina (NENÍ ABIOSESTON), 11 olejové krůpěje, 12 vlákna buničiny, 13 vlákna bavlny, 14 vlákna vlny. 12

2 5 4 1 3 6 7 10 9 8 14 13 16 12 15 11 Obr. 2 H: Příklady nejběžnějších částic abiosestonu na perokresbách. 1 - vlákna bavlny, 2 - vlákna vlny, 3 - olejové krůpěje, 4 - ptačí peří, 5 - motýlí šupiny, 6 - štěpiny křemičité horniny, 7 - detritus, tj. neidentifikovatelné organické zbytky, 8 - škrobová zrna brambor, 9 - vzduchová bublina, 10 - zbytky chitinu hmyzu, 11 - vlákna rostlinného pletiva, 12 - pylové zrn borovice, 13 - list s průduchy, 14 - sraženina železa, 15 - saze, 16 - krysí chlupy. 13

Obr. 3. Příklady pokryvnosti zorného pole mikroskopu v % abiosestonu. 14

Uvádění výsledků: Pokryvnost zorného pole mikroskopu se vyjádří v procentech. Výsledek se zaokrouhluje na celá procenta. Ze všech odhadnutých zorných polí v rámci jednoho vzorku se vypočítá aritmetický průměr a také se zaokrouhlí na celá procenta. V případě vzorků zahuštěných z 10 ml na jiný objem než 0,2 ml nebo u nezahuštěných vzorků se provede přepočet. U hodnot vyšších než 100 % závisí způsob vyjádření výsledků na účelu stanovení; uvede se buď vyšší než 100 % ( > 100 % ), nebo konkrétní číselná hodnota větší než 100 %. Pro speciální účely je možné množství abiosestonu vyjádřit i kvantitativně (počtem určených částic v 1 ml), viz ČSN 75 7712. 15

Příloha 1 Příklad výpočtu velikosti zorného pole mikroskopu a relativní velikost plochy polí mřížky počítací komůrky Cyrus I Velikost zorného pole mikroskopu musí být individuálně stanovena pro každý mikroskop. V mikrobiologické laboratoři se používá mikroskop f. Lambda s okulárem typu 10x/18 a mikroskop f. Olympus s okulárem typu 10x/20. Nejprve se vypočítá průměr zorného pole mikroskopu d a pak plocha zorného pole S, viz tabulka 1. Tabulka 1. Postup výpočtu d a S Okulár 10x/18 Průměr zorného pole d Plocha zorného pole S Objektiv 10x 18/10 =1,8 mm = 1 800 µm 3,14 (1 800/2) 2 = 2 543 400 µm 2 Objektiv 20x 18/20 =0,9 mm = 900 µm 3,14 (900/2) 2 = 635 850 µm 2 Objektiv 40x 18/40 =0,45 mm = 450 µm 3,14 (450/2) 2 =158 963 µm 2 Okulár 10x/20 Průměr zorného pole d Plocha zorného pole S Objektiv 10x 20/10 =2,0 mm = 2 000 µm 3,14 (2 000/2) 2 = 3 140 000 µm 2 Objektiv 20x 20/20 =1,0 mm = 1 000 µm 3,14 (1000/2) 2 = 785 000 µm 2 Objektiv 40x 20/40 =0,5 mm = 500 µm 3,14 (500/2) 2 = 196 250 µm 2 Pak se spočítá relativní velikost plochy polí počítací komůrky S rel, viz tabulka 2 a 3, podle vzorců (3) a (4). Tabulka 2. Relativní velikost plochy počítací komůrky Cyrus I (v případě okuláru 10x/18) Zvětšení objektivu Průměr zorného pole d µm Plocha zorného pole S µm Relativní velikost polí komůrky S rel Velký čtverec (250x250 µm) Malý čtverec (125x125 µm) 10x 1 800 2 543 400 2,46 0,61 20x 900 635 850 9,83 2,46 40x 450 158 963 39,32 9,83 Tabulka 3. Relativní velikost plochy počítací komůrky Cyrus I (v případě okuláru 10x/20) Zvětšení objektivu Průměr zorného pole d µm Plocha zorného pole S µm Relativní velikost polí komůrky S rel Velký čtverec (250x250 µm) Malý čtverec (125x125 µm) 10x 1 800 3 140 000 1,99 0,5 20x 900 785 000 7,96 1,99 40x 450 196 250 31,85 7,96 16

Příloha 2 Příklad odhadu pokryvnosti při současném výskytu malých a velkých částic Na níže uvedeném obrázku je na snímku vlevo příklad zorného pole mikroskopu se zachycenými částicemi abiosestonu pozorované při zvětšení objektivu 20x na mikroskopu f. Lambda. U takového zorného pole zabírá 1 malý čtverec komůrky Cyrus I 2,46 % jeho plochy a 1 velký čtverec 9,83 % (viz tabulka 2). Obrázek příkladu odhadu pokryvnosti abiosestonem při současném výskytu malých a velkých částic. Snímek vlevo je reálný stav při pozorování v mikroskopu. Snímek vpravo je představa examinátora a posun polí s velkými částicemi do komplexu. Vysvětlivky jsou uvedeny v textu přílohy 2. Nejprve se odhadne postupem 1 procento pokryvnosti v porovnání s odhadní stupnicí (viz obr. 3). V tomto případě je přibližně odhadovaná pokryvnost malými částicemi, P m = 3 %. Poté se odhadne, kolik čtverců počítací komůrky pokrývají velké částice. Proto je nutné si představit přesun polí do jednoho komplexu, jak uvádí snímek vpravo na výše demonstrovaném obrázku. Zde velké částice zabírají přibližně 1 velký čtverec a 2 malé čtverce. Odpovídající procento pokryvnosti plochy se zjistí z tabulky 2, tj. 9,83 % a 4,92 % (2 2,46). Obě hodnoty se sečtou, P v = 14,75 %. Celková pokryvnost zorného pole mikroskopu malými a velkými částicemi se vypočítá dle vzorce (5), tj. P = P v + [(100 P v ) / 100] P m. Zde P = 14,75 + [(100 14,75) / 100] 3 = 17 % Použitá literatura: Říhová Ambrožová, J. 2008. Mikrobiologie v technologii vod. Skriptum VŠCHT Praha, 252 pp., ISBN 978-80-7080-676-0 (2. přepracované vydání), AA 26,32 ČSN 75 7713 Kvalita vod Biologický rozbor Stanovení abiosestonu, 2015. 17