GMO problematika a možnosti testování Jiří Macura, 7.3.2018 jiri.macura@romerlabs.com
RomerLabs součásterbergroup
Světový partner
Naše řešení Mycotoxins AgraQuant ELISA Pathogens AgraStrip LFD RapidChek Allergens FluoroQuant MycoSep /MultiSep GMO MycoSpin StarLine VDR Biopure Equipment Analytical Service
Kontrola kvality
GMO problematika a možnosti testování
Proč GMO? Historie šlechtění, ozařování, popis DNA 1952, 1985, 1994 Populace za 40let navýšení cca 70% spotřeby Výnos plocha, urbanizace, krmiva Škůdci, plevele, hnojiva, nemoci I.sk Abiotické faktory II.sk Čerstvost, doprava, nutriční hodnota Biopaliva, farmacie GMO - živočichové
Co je GMO?
Co je vlastně GMO? GMO biotechnologie Vložení DNA materiálu z jiného organismu do DNA sekvence rostliny Transgenoze přenos genů Důvody: resistence na herbicidy a pesticidy Nejčastě pěstované GMO komodity -sója, kukuřice, bavlna, řepka...
Co je gen v DNA rostliny? Resistence herbicidů a insekticidů vložením genů do rostliny promoter gene terminator..gen rostiny..vložený, přidaný gen protein Rostlina produkuje protein se specifickou funkcí
Rezistence
Rezistence Rezistence na herbicidy Exprese modifikovaného EPSPS enzymu (Ag.tumefaciens CP4) nebo zvýšení exprese tohoto enzymu,vede k toleranci na Glyfosáty Pole oseté rostlinami s odolností na Glyfosáty mohou být ošetřeny herbicidy
Resistence Příklad RUR kukuřice RUR je herbicide, který ničí všechny rostliny RUR kukuřice obsahuje protein zodpovědný za resistenci na herbicid Postřik usmrtí všechny rostliny kromě RUR kukuřice
Rezistence Hmyz/ rezistence na pesticidy Tvořen inzercí genu(ů)(bacillus thuringiensis, Bt toxin) zprostředkovaná odolnost vůči škůdcům. Zavíječ kuk. Tvorba incekticidu samotnou rostlinou. Specifický pro dané škůdce Neškodný pro jiné organismy Méně škůdců zdravější rostliny, vyšší výnosy Další vlastnosti Odolnost vůči suchu,...
Globalizace světový obchod GMO & Obchod
GMO & Globální obchodování Světový přehled Obchod: 90% sóji, 80% kukuřice, 70% řepky jsougmo Většina sóji a jejich derivátů používaných v EU pochází z importu Většina kukuřice, řepky olejky je domácí produkce ( non-gmo)
GMO & Obchodování
GMOs obchod source: European Commission
GMO & Trade
GMO v EU
GMO v ČR VývojGM kukuřicev ČR Rok Ploch(ha) Počet pěstitelů Zdroj: MZe 2005 150 51 2006 1290 82 2007 5000 126 2008 8380 167 2009 6480 121 2010 4680 82 2011 5090 64 2012 3050 41 2013 2560 31 2014 1754 18 2015 997 11 2016 75 1 - Klesající tendence, 2017 0ha
Trend non-gmo v EU GMO v EU Potraviny produkce a dovoz do EU, vždy musí být vyznačeno Krmiva výživa a výkrm hosp. zvířat http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm rostlinnéolejeobsahujícígm sóju, v menšímířepakpopcorn, crackery, smažené brambůrky, majonézu či čokoládu.
Trend non-gmo v EU Poptávka po non-gmo potravinách Ochrana trhu Marketing, trendy ve výživě Zdavotní rizika
Legislativa Zákon č. 78/2004 Sb., o nakládání s geneticky modifikovanými organismy a genetickými produkty, ve znění zákona č. 346/2005 Sb. základní právní předpis v ČR upravující obecně jakékoliv nakládání s GMO (laboratorní výzkum, polní pokusy, tržní produkce GMO apod.) EU Nařízení EP a R č. 1829/2003 o geneticky modifikovaných potravinách a krmivech postuppro schvalovánínovýchgm potravina krmivv EU hranice tolerance pro povinné označování produktů GMO 0,9 % Nařízení EP a R č. 1830/2003 o sledovatelnosti a označování geneticky modifikovaných organismů a sledovatelnosti potravin a krmiv vyrobených z geneticky modifikovaných organismů a o změně směrnice EP a R 2001/18/ES systém sledovatelnosti a označování GMO a jejich produktů v EU Směrnice EP a R 2001/18/ES o záměrném uvolňování geneticky modifikovaných organismůdo životníhoprostředía o zrušenísměrniceep a R 90/220 EHS základní právní předpis v EU upravující obecně jakékoliv nakládání s GMO Nařízení EP a R č. 1946/2003 o příhraničních pohybech geneticky modifikovaných organismů dovoz a vývoz GMO z/do třetích zemí
Legislativa Směrnice EP a R 2001/18/ES o záměrném uvolňování geneticky modifikovaných organismůdo životníhoprostředía o zrušenísměrniceep a R 90/220 EHS základní právní předpis v EU upravující obecně jakékoliv nakládání s GMO Nařízení EP a R č. 1946/2003 o příhraničních pohybech geneticky modifikovaných organismů dovoz a vývoz GMO z/do třetích zemí Nařízení Komise č. 619/2011, kterým se stanoví metody odběru vzorků a laboratorního zkoušení pro úřední kontrolu krmiv z hlediska přítomnosti geneticky modifikovaného materiálu, u nějž probíhá proces povolování nebo u nějž uplynula platnost povolení hranice 0,1 % pro příměsi nepovoleného GM materiálu v krmivech Prováděcí rozhodnutí Komise 2013/287/EU o mimořádných opatřeních týkajících se nepovolené geneticky modifikované rýže v produktech z rýže pocházejících z Číny a o zrušení rozhodnutí 2008/289/ES odběrvzorkůze100 % zásilekrýžea rýžovýchproduktůz Číny (zdroj:mze) Tento produkt obsahuje geneticky modifikované organismy
Testování? Kde? Kdo?
Kdo testuje? Semenářský průmysl Kvalita osiva Zemědělství rostlinná výroba Non-GMO vyšší cena, kontaminace Potravinářský průmysl Marketing, export, import, živočišná výroba
LIMITY GMO Značení GMO v EU: produkty z GMO nebo příměsy Tento produkt obsahuje geneticky modifikované organismy Obsah GMO: > 0,9 % GMO Pozor!!! -Limity na složku v krmivu Př: sója ve směsi Norsko 2%, Autrálie a NZ 1% Japonsko 5%, Maďarsko? (0,5%)
Rizika kontaminace GMO Osivo, sklizeň úniky, záměna DOPRAVA lodě, vlaky, auta nedostatečné čištětí,... SKLADOVÁNÍ navážka sila, prašnost, poškození obalů,... VÝROBA prašnost, nedostatečné čištění, střídání GMO a nongmo,...
TESTOVÁNÍ
TESTOVÁNÍ U GMO schválených EU (dodatek 2) je důležité potvrdit správné označení uvedený na obalu nebo v souvisejících dokumentech a zajistit, aby produkt nebyl kontaminován geneticky modifikovanými organismy schválenými mimo EU. U konvenčních produktů je přípustné, že GMO má až 1% GMO schválené v EU, zatímco GMO neschválené mimo EU (dodatek 3) nemohou být přítomni (tj. Nulová úroveň) podle nařízení Komise (ES) ) Č. 49/2000. U ekologických produktů není vůbec přítomno GMO; Takže je nutná nulová úroveň. Tyto úrovně přijatelného obsahu GMO odpovídají za GMO schválené EU. Smyslem směrnice 2001/18 / EHS je však možnost stanovit prahové hodnoty pro technicky nevyhnutelnou nebo náhodnou přítomnost malých množství GMO. Nulová úroveň, která je v praxi nemožná, je navržena Vědeckým výborem pro rostliny na úrovni 0,1% v souladu s nejnižším vědecky obhájitelným prahem pro kvantifikaci GMO metodami založenými na PCR (viz oddíl 3.2. 1.2).
EU registr autorizovaných GMOs
DetekceGMO veu Kompendium všech validovaných metod GMO.
Příprava vzorku Primární pro pro správnou detekci Identifikace modifikace, komodita, matrix Reprezentativní odběr vzorku Zpracování vzorku čištění, sušení, mletí, zpracování Kontaminace skladování, zpracování
Přehled metod pro GMO Testování ELISA Lateral Flow Assays PCR/RT-PCR AgraQuant AgraStrip Rapid Test Analytický servis
Immunologická Detekce Detekce vložené DNA PCRmetoda polymerázová řetězová reakce (RT-PCR), vyžaduje přístrojové vybavení, laboratorní podmínky Nejvyúživanější metoda - akreditace, přesnost, různá matrix Kvantifikace, cena Exprese proteinu Protilátky pro danou detekci ELISA Bez nutnosti drahého vybavení Lateral Flow Strip Test pro přímé použití, rychlost, jednoduchost,
Kritéria testování Detekce - ano / ne, PCR, RT-PCR,ELISA,FLD ( S35 promotor, NOS Terminator) Identifikace jaký transgen, RUR, Bt Kvantifikace množství, > 0,9 %
Typické použití genů v GMO promoter gene terminator p35s promoter (startér) CaMV (Cauliflower mosaic virus) gene EPSPS PAT CRY. tnos terminator Agrobacterium nopalin synthase gene p35sa tnosjsou dva konstantní faktory=> velmi důležité pro GMO testování
Vložení do rostliny 1 2 rozstřižení DNA
PCR analytický servis Nejčastěji používaná metoda Screening, kvantifikace Limit detekce, různá matrix Přesnost Akreditace ISO 17025
PCR metodika DNA dvoušroubovice je složená z nukleotidůa, T; C, G klíč fungování PCR plant 35S promoter EPSPS nos terminator plant model
PCR metodika obvykle30 až45 cyklů!
Strategie testování GMOs Screening Konstrukce genové specifikace Event, trait(modifikace) specifikace
Report analýzy GMO
Evropská regulace (1829/2003) V levo: 0.6% MON810 kukuřiceand 0.7% MON603kukuřice: musím označit V pravo:0.7% MON810 kukuřicea 0.6% MON4032 sóji: nemusíme značit
AgraQuant GMO TM TM
Immunologická Detekce Specifická Antigen-Antibody-Reakce Antigens Antigenbinding site Antibody- protilátka princip klíč zámek
ELISA Enzyme Linked Immunosorbant Assay Sandvičová ELISA Enzyme labeled Antibody Kompetitivní ELISA Transgenic Protein Enzyme Substrate Kvantitativní metoda Anti-GMO Protein Specific Antibody
ELISA Enzyme linked immunosorbant assay Mikrodestička je pokryta specifickou protilátkou Vzniká protilátka + enzym = vazba V přítomnosti enzymu v substrátu dochází k zabarvení Optical Density(OD) Percent GMO
AgraStrip GMO - testovací proužky TM Subtitle Verdana 24p Grey 80% Verdana is the only font to be used For normal text, do not use another color than grey 80% Font size can be reduced from 24p but do not go below 16p Please keep your text/pictures aligned Do not cover the warrow with pictures/tables If you use pictures please copy the warrow below over your picture The position of the Slide Title should not be changed (only one line!), TM
AgraStripGMO FLD testovací proužky Semi-kvantitativní Intenzita zabarvení pozitivního testu se liší v závislosti na koncentraci GMO ve vzorku. Sendvičový LFD formát- testovací linie je tmavší s vyšší koncentrací Intenzita zabarvení se detekuje pomocí čtečky - readeru. Test Line Control Line
Lateral Flow Technologie Absorční část Negativní Pozitivní Anti-GMO Protein Specific Antibody Gold konjunkce Kontrolní linie anti-species AB Testovací linie anti-target AB Nitrocelulézová membrána Transgenní Protein Anti-species protilátka Konjugační membrána Au Testovací část Anti-GMO Protein specifická protilátka
Strip test zpracování vzorku Vážení Mletí Extrakce ve vodě Extrakce
Semikvantitativní Metoda TM
Semikvantitativní Metoda Detekce proteinu v dané Matrix CP4 EPSPS soy & corn Cry3Bb corn Cry1F corn Cry34Ab1 corn PAT corn Cry1A (Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105) corn Vip3A corn Corn Comb
Semikvantitativní Metoda Rozsah měření příkladrur sója <0.1% GMO 0.1 0.5% GMO 0.5 1.0% GMO 1.0 4.0% GMO >4.0% GMO
Krmiva fokus výroba Suroviny dodavatel, doprava, skladování, testování před vztupem do výroby Eliminace rizik kontaminace cesty ve výrobě, prach, obaly... Plánování výroby promytí, GMO a nongmo výrobní posloupnost... Vzorkování a testování správnost, postup...
Testování krmiv vhodná metoda Orientační test čištění, nakládky do sila, kontrola surovin levný, rychlý, jen komodity eliminace reklamace Screening PCR- volba co chci testovat (krmivo, surovinu) ANO NE cena, přesný, akreditace
Testování krmiv -na co se zaměřit Sója hlavní potenciální kontaminant GMO (kukuřice, řepka, cukr. řepa malé riziko) ne vždy lze nahradit (řepka) Použití zpracovaných sojových bobů šroty, extrakce... Změna proteinu ve výrobě tlak, teplota, extrakce,vit.,léky (proto nelze přesně utčit GMO ve směsi v kompl. krmivu) Přes 90% jde o RUR sóju Monsanto Výrobci sojových šrotů by měli poskytnout informaci o jakou jde - modifikace, GMO, nongmo, původ (zpracování)
Testování krmiv -na co se zaměřit Sója rychlý test zpracovaných bobů testovací proužky, ELISA kit AGRASTRIP RUR TOASTED MEAL STRIP TEST TRAITCHEK Ovlivňuje ph, zbůsob zpracování bobů - extrakce Orientační metoda ANO, NE lze použít u směsí pro kontrolu kontaminace v praxi, pro účinnost čištění linky Ověření v laboratoři následně, potvrzení výsledku
Vybavení pro testování Mixér Váha Odměrný válec Lžičku Kádinku Hodinky minutky Destilovanou vodu Plastovou zkumavku, kyvetu 50ml Soupravu kit AgraStrip
Postup testu Homogenizuju vzorek mixér Navážím - 10g Přidám extrakční pufr - 35ml (1:10) Protřepu cca 1.min
Postup testu Nechám sedimentovat - 5min Odběr 0,5 ml do mikrozkumavky Vložím testovací proužek Po 10 min odečítám výsledek
Informace ke stažení https://www.romerlabs.com/ https://www.romerlabs.com/en/products/analytical-service/gmo/ http://eur-lex.europa.eu/legal-content/en/all/?uri=celex:32003r1829 http://ec.europa.eu/food/plant/gmo/authorisation_en http://eagri.cz/public/web/mze/ http://www.bezpecnostpotravin.cz/stranka/geneticky-modifikovaneorganismy-%28gmo%29.aspx https://www.szif.cz/cs/lpis-evidence_pestovani_gmo
Závěr Nelze detekovat v mase a mléce Mohu diagnostikovat krmivo Kontrola kvality idividuální přístup v rámci provozu Kontaminace - možná rizika přetrvávají Legislativa non-gmo EU Mohu úspěšně vyřešit!!!
Otázky?
Děkuji za pozornost! www.romerlabs.com