Rekombinantní příprava receptorů potkaních NK buněk v expresním systému HEK293T

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra biochemie Rekombinantní příprava receptorů potkaních NK buněk v expresním systému HEK293T Diplomová práce Petra Celadová Školitel: Mgr. Ondřej Vaněk Vedoucí diplomové práce: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. Praha 2010

Poděkování Ráda bych zde poděkovala především svému školiteli Mgr. Ondřeji Vaňkovi, za odborné vedení, trpělivost a cenné rady, a Prof. RNDr. Karlu Bezouškovi, DSc., za moţnost vypracování diplomové práce a odborné vedení. Děkuji Mgr. Danielu Kavanovi a Mgr. Petru Pompachovi, Ph.D. za změření a interpretaci hmotnostních spekter a RNDr. Kateřině Hofbauerové, Ph.D. a RNDr. Vladimíru Kopeckému, Ph.D. za změření a vyhodnocení DCDR spekter. Všem členům Laboratoře architektury proteinů MBÚ AV ČR bych ráda poděkovala za vytvoření příjemného pracovního prostředí a ochotu kdykoliv pomoci a poradit. V neposlední řadě děkuji také svým rodičům, za jejich podporu v době mého studia. 2

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením svého školitele Mgr. Ondřeje Vaňka a všechny pouţité prameny jsem řádně citovala. V Praze dne...... PETRA CELADOVÁ 3

SUMMARY Natural killer cells play a significant role in the immune response against tumor and infected cells. NK cells express a wide variety of surface receptors, including NKRP1, a C-type lectin-like family of both activating and inhibitory receptors. Recently, ligands have been found for some of these previously orphan molecules, some of them lying within the same family. This is also the case of rat Clr-b as a cognitive ligand for rat NKRP1B. It has been shown that in rat, this inhibitory NKRP1B-Clr-b mutual receptor system is subverted by rat cytomegalovirus protein RCTL, a viral version of Clr-b, which serves as a decoy ligand for NK cells. The aim of my diploma thesis was cloning and production of the above mentioned C-type lectin-like proteins based on transient transfection of HEK293T cell line in a suspension culture. This expression system allows us not only to obtain proteins of our interest with a satisfactory yield but also in their native conformation, removing the need for time consuming and often fruitless refolding procedures required in case of using the E. coli expression system. Success was achieved in case of Clr-b and NKRP1B receptors from both WAG and SD strains. Proteins were purified using IMAC followed by gel filtration, identified by mass spectrometry and characterized by disulfide mapping, analytical ultracentrifugation and Raman spectroscopy. (In Czech) 4

OBSAH SEZNAM ZKRATEK... 7 1. LITERÁRNÍ ÚVOD... 10 1.1. Imunitní systém... 10 1.1.1. Imunitní mechanismy... 10 1.1.2. Buňky imunitního systému... 11 1.2. NK buňky... 13 1.2.1. Funkce NK buněk... 13 1.2.2. NK buněčné rozpoznávání... 14 1.2.3. Mechanismus cytotoxicity NK buněk... 15 1.2.4. Strategie úniku virů před NK buňkami... 16 1.3. Receptory NK buněk... 17 1.3.1. Geny receptorů NK buněk... 18 1.3.2. Receptory imunoglobulinové nadrodiny... 19 1.3.3. Receptory lektinového C-typu... 20 1.3.3.1. Rodina receptorů Ly-49... 23 1.3.3.2. Rodina receptorů NKG2 a CD94... 25 1.3.3.3. Receptor KLRF1... 26 1.3.3.4. Receptor KLRG1... 26 1.3.3.5. Receptor CD69... 26 1.3.3.6. Rodina receptorů NKRP1... 27 1.3.3.7. Molekuly z rodiny Clr... 28 1.4. Zkoumaný systém: NKRP1B WAG, NKRP1B SD, Clr-b WAG, RCTL... 30 2. CÍLE PRÁCE... 32 3. MATERIÁL... 33 3.1. Přístroje a pomůcky... 33 3.2. Chemikálie... 34 3.2.1. Enzymy... 36 3.2.2. Bakteriální kmeny a buněčné linie... 36 3.2.3. Vektory... 36 3.2.4. Primery pro PCR... 36 3.2.5. Roztoky a média... 37 4. METODY... 40 4.1. Příprava expresního vektoru... 40 4.1.1. PCR amplifikace... 40 4.1.2. Agarosová elektroforéza... 41 4.1.3. Extrakce DNA sráţením ethanolem... 41 4.1.4. Příprava inzertů a linearizace plazmidu phlsec/phlsec-fchis... 41 4.1.5. Preparativní elektroforéza... 41 4.1.6. Extrakce DNA z gelu a přečištění inzertů... 42 4.1.7. Ligace inzertů do vektoru phlsec/phlsec-fchis... 42 4.1.8. Transformace kompetentních buněk Escherichia coli tepelným šokem... 42 4.1.9. Selekce klonů... 43 4.1.9.1. PCR z kolonií ( colony PCRˮ)... 43 4.1.9.2. Izolace plazmidové DNA ( Easy Prepˮ)... 43 4.1.10. Izolace plazmidové DNA pomocí kitu... 44 4.1.11. Orientační stanovení koncentrace plazmidů pomocí agarosové elektroforézy... 44 4.1.12. Sekvenování DNA... 44 4.1.13. Příprava zásobního mnoţství plazmidu... 45 4.1.14. Stanovení koncentrace DNA... 45 4.2. Příprava proteinů... 46 4.2.1. Kultivace HEK293T buněčné linie... 46 5

4.2.1.1. Rozmraţení a zamraţení buněk... 46 4.2.1.2. Suspenzní kultivace... 46 4.2.1.3. Počítání buněk... 47 4.2.2. Expresní test... 47 4.2.2.1. Transfekce v 24-jamkových destičkách... 47 4.2.2.2. SDS elektroforéza... 48 4.2.2.3. Elektropřenos proteinu na membránu... 48 4.2.2.4. Imunodetekce... 49 4.2.3. Velkoobjemová produkce proteinu... 49 4.2.3.1. Transfekce v čtyřhranných lahvích... 49 4.2.3.2. Sklizení produkčního média... 50 4.3. Purifikace proteinů... 50 4.3.1. Chelatační chromatografie... 50 4.3.2. Zkoncentrování proteinů... 51 4.3.3. Gelová chromatografie... 51 4.3.4. Stanovení koncentrace proteinů... 51 4.3.5. Chromatografie na reverzní fázi... 51 4.4. Příprava 3C proteasy a odštěpení Fc fragmentu... 52 4.4.1. Příprava zásobního mnoţství 3C proteasy... 52 4.4.2. Odštěpování Fc fragmentu 3C proteasou... 53 4.5. Identifikace proteinů... 53 4.5.1. Metoda peptidového mapování... 53 4.5.2. Proteinové sekvenování... 53 4.6. Charakterizace proteinů... 54 4.6.1. Mapování disulfidických můstků... 54 4.6.2. Analytická ultracentrifugace... 54 4.6.2.1. Metoda sedimentační rovnováhy... 54 4.6.2.2. Metoda sedimentační rychlosti... 55 4.6.3. Měření Ramanova rozptylu... 55 5. VÝSLEDKY... 56 5.1. Konstrukty v plazmidu phlsec... 56 5.1.1. Příprava expresních vektorů... 56 5.1.2. Produkce proteinů... 61 5.1.3. Purifikace proteinů... 62 5.1.4. Identifikace proteinů... 65 5.1.5. Charakterizace proteinů... 65 5.2. Konstrukty v plazmidu phlsec-fchis... 66 5.2.1. Příprava expresního vektoru... 66 5.2.2. Produkce proteinů... 69 5.2.3. Purifikace proteinů... 69 5.2.4. Štěpení proteinů pomocí 3C proteasy... 71 5.2.5. Identifikace... 72 5.2.6. Charakterizace... 75 5.2.6.1. Mapování disulfidických můstků... 75 5.2.6.2. Analytická ultracentrifugace... 76 5.2.6.3. Měření Ramanova rozptylu... 80 6. DISKUZE... 84 7. ZÁVĚR... 91 8. SEZNAM CITOVANÉ LITERATURY... 92 6

SEZNAM ZKRATEK Sacharidy a aminokyseliny jsou označeny standardními zkratkami dle doporučení IUPAC. ADCC AICL APS bp BSA CD buněčná cytotoxicita závislá na protilátce (antibody dependent cell cytotoxicity) označení povrchového leukocytárního receptoru (activation-induced C-type lectin) peroxisíran amonný (ammonium persulfate) pár bazí (jednotka délky řetězce DNA, base pair) hovězí sérový albumin (bovine serum albumin) označení povrchových molekul leukocytů (cluster of differentiation) CBB R-250 barva Coomassie Brilliant Blue R-250 Clr rodina proteinů obsahujících podobný motiv jako lektiny typu C (C-type lectin related) = Ocil CRD CTLD DCDR DAP12 ddh 2 O DMEM DMSO dntp EDTA FBS Fc FcγRIII FcεRIγ lektinová doména vázající sacharid (carbohydrate-recognition domain) doména podobná lektinům C-typu (C-type lectin-like domain) Ramanova spektroskopie kapkově nanášených povlaků (drop coating deposition Raman) 12kDa protein aktivující DNAX (DNAX-activating protein of 12 kda) dvakrát deionizovaná voda kultivační médium pro tkáňové kultury (Dulbecco's modified Eagle medium) dimethylsulfoxid směs deoxynukleotidtrifosfátů kyselina ethylendiamintetraoctová fetální hovězí sérum (fetal bovine serum) část molekuly protilátky (Fragment, crystallizable) receptor III pro Fc část IgG (Fc gamma receptor type III) vysokoafinitní receptor pro IgE (Fc epsilon receptor type I gamma chain) H-2 hlavní myší histokompatibilní komplex H-60 antigen menšího myšího histokompatibilního komplexu HEK293 HLA HPLC označení buněčné linie lidských embryonálních ledvinných buněk číslo 293 (human embryonic kidney 293) hlavní lidský histokompatibilní antigen (human leukocyte antigen) vysokoúčinná kapalinová chromatografie (high performance liquid chromatography) 7

IFN Ig IL interferon imunoglobulin interleukin ILT2 imunoglobulinový transkript 2 (Ig-like transcript 2) ITAM ITIM KARAP kb KIR KLRB KLRF1(G1) LB LIR-1 LRC imunoreceptorový tyrosinový aktivační motiv (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) imunoreceptorový tyrosinový inhibiční motiv (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) protein asociovaný s aktivačními receptory zabíječských buněk (killer activating receptor associated protein), = DAP12 kilobaze (jednotka délky řetězce DNA) imunoglobulinový receptor zabíječských buněk (killer cell Ig-like receptor) označení povrchového leukocytárního receptoru (killer cell lectin-like receptor subfamily B) C-lektinový receptor zabíječských buněk F1 (G1) (killer cell lectin-like receptor F1 (G1)) název média podle Luria-Bertaniho imunoglobulinový receptor leukocytů (leukocyte immunoglobulin-like receptor) komplex genů pro receptory leukocytů (leukocyte receptor complex) Ly-49 rodina receptorů C-lektinového typu (lymphocyte antigen 49) MBP M-CSF MHC gp I MICA(B) NCR NEA NK NKC maltosu vázající protein (maltose binding protein) faktor stimulující tvorbu osteoklastů (macrophage colony-stimulating factor) glykoproteiny hlavního histokompatibilního komplexu I. třídy (major histocompatibility complex type I glycoproteins) proteiny podobné MHC gp I (MHC-class-I-like chain A(B)) skupina aktivačních receptorů z imunoglobulinové nadrodiny (natural cytotoxicity receptor), = NKp roztok neesenciálních aminokyselin (non-essential amino acids) přirozený zabíječ (natural killer) NK genový komplex (NK-gene complex) NKG2 rodina C-lektinových receptorů NK buněk (natural killer group 2) NKp30 receptor ze skupiny NCR (natural killer cell p30-related protein) NKRP1 rodina C-lektinových receptorů NK buněk (natural killer cell receptor protein 1) NKT Ocil PCR NK-T-lymfocyty (natural killer T cells) lektin inhibující formaci osteoklastů (Osteoclast inhibitory lectin), = Clr polymerasová řetězová reakce (polymerase chain reaction) 8

RANKL SDS SDS-PAGE faktor stimulující tvorbu osteoklastů (receptor activator of nuclear factor kappa B ligand) dodecylsulfát sodný SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza SHIP inositol polyfosfát 5'-fosfatasa (SH2-domain containing inositol polyphosphate 5' phosphatase) SHP TAE T C TE TEMED TNF TES T H Tris ULBP proteinová tyrosinová fosfatasa (SH2-domain-containing protein tyrosine phosphatase) Tris-acetátový pufr s EDTA cytotoxický T-lymfocyt (T cytotoxic cell) Tris pufr s EDTA N,N,N',N'-tetramethylethylendiamin faktor nekrotizující nádory pufr s N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonovou kyselinou, EDTA a solí pomocný T-lymfocyt (T helper cell) tris(hydroxymethyl)aminomethan protein vázající UL16 (UL16 binding protein) 9

1. LITERÁRNÍ ÚVOD 1.1. Imunitní systém Imunitní systém je vysoce komplexní homeostatický mechanismus, který se u organismů vyvinul na obranu před škodlivinami z vnějšího i vnitřního prostředí 1, 2. Funkce imunitního systému se projevuje jako obranyschopnost schopnost rozpoznat a eliminovat vnější škodliviny (patogenní mikroorganismy a jejich toxické produkty), autotolerance schopnost rozpoznat vlastní tkáně organismu a udrţovat vůči nim toleranci a imunitní dohled schopnost rozpoznat a odstranit vnitřní škodliviny (staré, poškozené nebo zmutované buňky) 1. 1.1.1. Imunitní mechanismy Součástí imunitního systému je velké mnoţství buněk a molekul, jejichţ vzájemnými interakcemi jsou zprostředkovány imunitní reakce 2. Ty jsou dvojího typu: nespecifické (neadaptivní, vrozené) a antigenně specifické (adaptivní) 1. Pro obranu organismu mají zásadní význam také neporušený povrch kůţe a sliznic a přirozené neimunitní obranné mechanismy, jako jsou pohyb řasinek, nízké ph ţaludku, teplota nebo různé chemické mediátory 1, 2. Evolučně starší nespecifické mechanismy jsou zaloţeny na molekulách a buňkách, které jsou v organismu připraveny předem a rozpoznávají obvykle velké mnoţství patogenů podle strukturních nebo funkčních rysů, jeţ jsou jim společné 1. Nespecifické imunitní mechanismy jsou zprostředkovány jednak buněčnými sloţkami (fagocytující buňky a přirozeně cytotoxické buňky, tzv. NK buňky, natural killer), jednak sloţkami humorálními (komplementový systém, interferony, lektiny a jiné sérové proteiny). Sloţky vrozené imunity reagují na přítomnost patogenů rychle, řádově v minutách 1. Antigenně specifické imunitní systémy jsou evolučně mladší, reakce na cizorodou strukturu je zaloţena na její reakci s vysoce specifickými molekulami v případě humorální sloţky adaptivní imunity se jedná o molekuly protilátek, u buněčně zprostředkovaných mechanismů o antigenně specifické receptory T-lymfocytů. Mechanismy adaptivní imunity se aktivují aţ po setkání s daným antigenem. K úplnému 10

rozvinutí specifické imunitní reakce je potřeba několik dní aţ týdnů. Charakteristickým rysem mechanismů adaptivní imunity je imunologická paměť, coţ je schopnost urychlené odpovědi při opětovném setkání s daným patogenem 1, 3. 1.1.2. Buňky imunitního systému Na imunitní odpovědi organismu se podílejí především různé druhy leukocytů (bílých krvinek), které jsou přítomné v krvi, lymfě a lymfatických orgánech (např. mízní uzliny, slezina) 2, 3. Všechny druhy leukocytů vznikají z pluripotentních kmenových buněk 1, 2. Ty se nalézají po celý ţivot v malém počtu v kostní dřeni a jejich úbytek v důsledku diferenciace na různé typy leukocytů (způsobenou vlivem určitých růstových faktorů a cytokinů) je kompenzován dělením 1, 2. Z kmenových buněk vznikají dvě linie buněk lymfoidní a myeloidní 1, 2 (Obr. 1.1 na str. 12). Další diferenciace buněk myeloidní linie dává vznik třem druhům granulocytů: neutrofilům, eozinofilům a bazofilům (tkáňovou formou posledně jmenovaných jsou ţírné buňky mastocyty); monocytům (cirkulují v krvi a diferencují se na makrofágy) a dendritickým buňkám. Buňky myeloidní linie tvoří základ nespecifické části imunitního systému většina z nich má schopnost fagocytovat, produkuje cytokiny a další rozpustné signální látky 1. Kromě toho však některé (hlavně dendritické buňky, ale i monocyty a makrofágy) působí také jako antigen prezentující buňky pro T-lymfocyty, čímţ se stávají spojkou mezi antigenně specifickou a vrozenou částí imunitního systému. Z myeloidní linie vznikají také červené krvinky (erytrocyty) a krevní destičky (trombocyty), jejichţ hlavní funkce nespočívají v imunitních reakcích organismu (ač se na některých podílejí zejm. při zánětu) 1. Z lymfoidní linie vznikají diferenciací NK buňky a lymfocyty B a T 1, 2. B-lymfocyty se nejprve vyvíjejí v kostní dřeni 1, 3. Následně putují do sekundárních lymfoidních orgánů, kde po setkání s antigenem dojde k jejich diferenciaci do konečného stádia plazmatických buněk (plazmocytů), které produkují protilátky 1. Vývoj většiny T- lymfocytů probíhá v brzlíku (thymus) 1, 3 aţ do chvíle, kdy z nich vzniknou buňky patřící do jedné ze dvou fenotypicky odlišných subpopulací: prekurzory pomocných T-buněk (T H ), nesoucí na svém buněčném povrchu receptor CD4, a prekurzory cytotoxických 11

Obr. 1.1: Diferenciace různých druhů leukocytů z kmenové buňky. Z pluripotentních kmenových buněk vznikají dvě základní linie myeloidní a lymfoidní. Diferenciací buněk myeloidní linie vznikají tři druhy granulocytů (neutrofily, eozinofily, bazofily), monocyty, trombocyty, erytrocyty a některé dendritické buňky. Buňky lymfoidní linie se diferencují na NK buňky, všechny druhy T- a B-lymfocytů a některé dendritické buňky. 2 T-buněk (T C ) s receptorem CD8 1. Po setkání s vhodným antigenem T H prekurzory diferencují na zralé efektorové T H, jejichţ hlavní funkcí je produkce cytokinů regulujících jiné buňky, T C prekurzory pak dávají vznik efektorovým T C buňkám, které jsou schopné cytotoxicky zabíjet jiné buňky 1. 12

1.2. NK buňky NK buňky byly objeveny v roce 1975 a pojmenovány podle jejich schopnosti zabíjet nádorové buňky in vitro bez předchozí senzitizace, tj. bez nutnosti stimulace, proliferace a diferenciace (natural killers přirození zabíječi) 4, 5. Do té doby byly známy pouze dva druhy lymfocytů B a T. Nově objevené buňky se od nich lišily absencí antigenně specifických receptorů, neměly klonálně distribuovanou specifitu ani imunologickou paměť proto byly NK buňky vymezeny jako samostatná skupina lymfocytů 6. Morfologicky jsou to velké granulární lymfocyty, které neexprimují na svém povrchu sadu markerů typických pro T-lymfocyty (tzn. CD3 nebo některý z receptorových řetězců T buněk, např.,, nebo ) 2, 6. Markery NK buněk jsou u člověka CD16 (FcγRIII, nízkoafinitní receptor pro Fc část IgG) a NKH-1 (Leu19) 6, u myši potom NK-1.1 7, 8 /NK- 2.1 9. Mezi další povrchové antigeny NK buněk patří např. CD56 (adhezní molekula), CD2 a CD8 (adhezní molekuly zprostředkovávající přenos signálu do buňky) 2. NK buňky vznikají diferenciací lymfoidních progenitorů v kostní dřeni 10 diskontinuálně přes jednotlivá stádia. Důleţitým faktorem pro jejich růst a vývoj je interleukin 15 (IL-15) 11. Jsou vývojově bliţší T-lymfocytům neţ B-lymfocytům 1. O tom svědčí také existence tzv. NKT buněk, které koexprimují některé NK-buněčné (CD16, NKRP1) a některé T- lymfocytární receptory 2, 12. Zastoupení NK buněk v porovnání s ostatními druhy lymfocytů je obecně niţší (u člověka představují NK buňky 15 % všech lymfocytů) 13. Nejčastěji se vyskytují v nelymfoidních tkáních, jako jsou plíce a játra; v periferní krvi tvoří 5-10% všech lymfocytů. NK buňky se dále vyskytují také ve slezině, kostní dřeni, mízních uzlinách a brzlíku 2, 14. 1.2.1. Funkce NK buněk NK buňky jsou schopné rozpoznat a zabít některé nádorové, virem infikované, protilátkami pokryté, transplantované nebo stresované buňky 1, 8, 15. Vzhledem k jejich schopnosti rychle zabíjet takto poškozené buňky představují spolu s dalšími sloţkami přirozené imunity první vlnu obrany organismu proti infekcím a nádorům 2, 14, 15. Aktivita NK buněk je významně stimulována interferony α a β (ty jsou produkovány různými virově infikovanými buňkami) 1 ; míra přirozeného zabíjení můţe být ovlivněna nejrůznějšími 13

membránovými proteiny, jako jsou CD2, 2B4, CD11a-CD18 a CD69, a také cytokiny (stimulační efekt mohou mít např. IL-12, IL-15 nebo IL-18; jako tlumiče NK buněčného zabíjení naopak mohou působit TGF- β nebo IL-10). Tato citlivá regulace přispívá k tomu, aby NK buňky mohly efektivně vykonávat imunitní dozor 16, 17. NK buňky mají i důleţité regulační funkce: produkují látky, které ovlivňují diferenciaci efektorových T H -buněk a hematopoézu (cytokiny IFN-γ, IL-3, M-CSF a některé další) 1. 1.2.2. NK buněčné rozpoznávání Po dlouhou dobu zůstávalo záhadou, jak je moţné, ţe NK buňky nemají antigenně specifické receptory a přesto jsou schopné rozpoznávat nezdravé buňky. Ve své doktorské práci navrhl K. Kärre hypotézu, ţe NK buňky jsou schopné rozlišit napadené a poškozené buňky na základě nepřítomnosti určitých povrchových molekul běţných pro zdravé buňky spíše neţ na základě přítomnosti abnormálních molekul (tzv. missing-self hypotéza) 18. Později byla tato hypotéza dále upřesněna a dnes je známo, ţe rozpoznávání je zaloţeno na inhibičních receptorech, jejichţ ligandy jsou v převáţné většině MHC glykoproteiny I. třídy (MHC gp I) 15, 11, 19. MHC gp I jsou přítomny ve velkém mnoţství na povrchu všech zdravých jaderných buněk organismu (na somatických buňkách několik tisíc, na různých druzích leukocytů řádově více). Jejich základní funkcí je vázat peptidové fragmenty proteinů produkovaných (popř. pohlcených) buňkou a vystavovat je na buněčném povrchu. Peptidy jsou ve většině případů nutné pro stabilitu MHC gp I a jejich vzájemná interakce umoţňuje dlouhodobou expresi komplexu na buněčný povrch, kde mohou být peptidové fragmenty potenciálně rozpoznány T-lymfocyty. Před tímto rozpoznáním (a následným napadením T C lymfocytem) se nádorové i některé virově infikované buňky brání potlačením exprese povrchových MHC gp I 1. Narozdíl od T-lymfocytů rozpoznávají NK buňky komplex MHC gp I s navázaným peptidem jako celek, nikoli jednotlivé peptidové fragmenty. V případě, ţe se na povrchu cílové buňky vyskytuje normální mnoţství MHC gp I, aktivace NK buňky (zprostředkovaná některým z jejích stimulačních receptorů) je inhibována. Naopak sníţené mnoţství těchto molekul nebo jejich nepřítomnost sniţuje míru inhibice signálů vedoucích 14

k cytotoxické aktivitě NK buňky, coţ výrazně zvyšuje pravděpodobnost, ţe cílová buňka bude zabita 11, 19 (Obr. 1.2). Obr. 1.2: Rozpoznávání cílových buněk NK buňkami na základě chybějících MHC gp I ( missingselfˮ hypotéza). Obrázek vlevo ukazuje, ţe pakliţe se NK buňka prostřednictvím některého inhibičního receptoru (zde Ly-49a) naváţe na MHC gp I (zde konkrétně H-2D d ) na povrchu jiné buňky, NK cytotoxické mechanismy jsou inhibovány. Obrázek vpravo ukazuje nezdravou buňku, u níţ virová infekce vedla k zastavení povrchové exprese MHC gp I. NK buňka není inhibována signály vznikajícími vazbou inhibičních receptorů na MHC gp I a je tedy moţné, aby NK buňka cílovou buňku zabila. CRD doména rozpoznávající MHC gp I (carbohydrate recognition domain); α 1, α 2, α 3 extracelulární domény těţkého (α) řetězce MHC gp I; β 2 m - β 2 mikroglobulin, běţně se vyskytující lehký řetězec MHC gp I molekul. Červeně jsou vyznačeny oligosacharidy H-2D d. 19 1.2.3. Mechanismus cytotoxicity NK buněk NK buněčná cytotoxicita můţe být aktivována třemi způsoby. V cytoplazmě NK buněk je přítomno velké mnoţství cytotoxických granulí, které obsahují perforin a granzymy. Po rozeznání cílové buňky pomocí povrchových stimulačních receptorů a adhezivních molekul dochází k migraci cytotoxických granulí k plazmatické membráně NK buňky a následně k degranulaci jejich obsahu do úzké štěrbiny mezi oběma 15

buňkami. Perforin se začleňuje do membrány cílové buňky a v přítomnosti Ca 2+ iontů polymeruje a vytváří tak cylindrické póry (podobně jako komplementový protein C9). Tyto póry pak slouţí pro vstup granzymů do cytoplazmy cílové buňky, kde štěpí prekurzory proteas ze skupiny kaspas, které jsou tím aktivovány. Kaspasy pak působí na další cytoplazmatické proteiny a spouští tak kaskádu reakcí vedoucí k apoptotické smrti buňky 1, 2. Dalším spouštěcím mechanismem NK buněčné cytotoxicity je systém Fas-FasL (Fas ligand). FasL je protein z rodiny TNF nacházející se na povrchu NK buněk (a také T C lymfocytů). Po setkání se svým receptorem Fas (CD95), vyskytujícím se na povrchu mnoha různých buněk, dochází k aktivaci kaspas, která opět vede k apoptotické smrti buňky. Tato cesta není závislá na přítomnosti Ca 2+ iontů 1, 20, 21. Stejně jako další buňky vykazující cytotoxickou aktivitu exprimují NK buňky na svém povrchu membránový receptor CD16, který specificky rozpoznává Fc fragment molekuly protilátky. V případě, ţe se NK-lymfocyt setká s buňkou opsonizovanou protilátkami typu IgG, receptor CD16 rozpozná jejich Fc části, coţ způsobí agregaci receptorů. Ta vede k aktivaci proteinových tyrosinových kinas ze skupiny Src, která vede ke spuštění kaskády vedoucí k zahájení cytotoxické aktivity NK buňky. Tento jev se nazývá cytotoxická reakce závislá na protilátkách (ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity; Obr. 1.3) 1, 22, 23. Obr. 1.3: ADCC. NK buňky nesou na svém povrchu Fc receptor (CD16), pomocí kterého rozpoznávají cílové buňky opsonizované protilátkami typu IgG. 2 1.2.4. Strategie úniku virů před NK buňkami Viry si vyvinuly mnoho mechanismů jak uniknout jednotlivým sloţkám imunitního systému hostitele. Některé jsou schopny regulovat apoptózu, modulovat koncentraci cytokinů a chemokinů, narušovat správnou funkci dendritických buněk. Proti NK buňkám se viry brání především prostřednictvím ligandů pro jejich receptory. Mohou působit sníţení exprese ligandů pro aktivační receptory NK buněk (imunoregulačními proteiny 16

nebo pomocí regulační RNA) nebo kódovat rozpustné ligandy, které tyto receptory blokují. Viry sniţují míru povrchové exprese MHC gp I, aby se vyhnuly zabití T- lymfocyty, a absenci těchto molekul nahrazují expresí náhradních ligandů pro inhibiční receptory NK buněk. Virové strategie jsou zkoumány především na modelu cytomegaloviru (CMV) 24. 1.3. Receptory NK buněk NK buněčné rozpoznávání je zaloţeno na expresi mnoha různých receptorů na buněčný povrch. Jsou to jednak receptory stimulační (aktivační), jednak inhibiční. 1, 8, 11, 16. Jednotlivé receptory se na povrchu cílové buňky setkávají se svými ligandy a kaţdá takováto vazba dává vznik signálu, který je veden dovnitř NK buňky. Výsledná akce je pak výsledkem integrace všech signálů 25. Vliv inhibičních receptorů obecně převaţuje nad vlivem aktivačních receptorů 16, 26. Mechanismus inhibice NK buněčného zabíjení souvisí s přítomností inhibičního motivu ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, Val/Ile-Xaa-Tyr-Xaa-Xaa- Leu/Val, kde Xaa značí libovolnou aminokyselinu). Jedna nebo více kopií této sekvence byly objeveny v cytoplazmatických doménách všech dobře prozkoumaných inhibičních receptorů NK buněk 16, 25, 26. Po navázání ligandu je tyrosin z ITIM motivu fosforylován tyrosinovou kinasou z rodiny Src, coţ aktivuje některé fosfatasy obsahující SH2-domény v závislosti na daném receptoru to mohou být proteinové tyrosinové fosfatasy SHP1 nebo SHP2, popř. fosfatasa SHIP (inositol polyfosfát-5'-fosfatasa). Tyto aktivované fosfatasy ruší fosforylační signalizační dráhy zahájené stimulačními receptory a vedoucí k aktivaci NK buněk 16, 25. Aktivace SHP1 a SHP2 vede ke sníţení fosforylace mnoha různých intracelulárních signálních proteinů, např. FcεRIγ, ZAP70, Syk, PLCγ 1, PLCγ 2, Shc, atd. SHIP fosfatasa degraduje fosfatidylinositol-3,4,5-trisfosfát na fosfatidylinositol-3,4- bisfosfát, čímţ zabraňuje signalizaci závislé na Ca 2+ iontech 25. Tyto tři fosfatasy nejsou asociovány jen s inhibičními receptory, ale také s různými receptory pro antigeny, Fc fragment, růstové faktory a cytokiny, a pomáhají tak stanovit práh citlivosti pro dané molekuly a předejít neţádoucí aktivaci buňky 27. Mezi inhibiční receptory se řadí např. Ly-49A, NKRP1B, většina receptorů z rodiny KIR a LIR nebo KLRG1 16. 17

Mnohé aktivační receptory NK buněk mají podobné extracelulární domény jako inhibiční receptory, ale postrádají intracelulární motiv ITIM 16, 26, 28. V transmembránové doméně však místo toho velmi často obsahují nabité aminokyselinové zbytky, které usnadňují nekovalentní asociaci se signálními řetězci (adaptorovými molekulami). Jedná se o transmembránové proteiny, které jsou často vyţadovány pro optimální povrchovou expresi aktivačních receptorů. Tyto adaptorové molekuly obsahují aktivační motiv ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif, Asp/Glu-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Xaa- Leu/Ile-Xaa (6-8) -Tyr- Xaa-Xaa-Leu/Ile) 16, 28. NK buňky exprimují tři adaptorové proteiny obsahující motiv ITAM: DAP12 (DNAX-activating protein of 12 kda, známý také jako KARAP killer activating receptor associated protein), FcεRIγ a CD3ξ. Po navázání ligandu na stimulační receptor dojde k fosforylaci tyrosinu v motivu ITAM, coţ vede k aktivaci tyrosinových kinas Syk a ZAP70 a následně ke spuštění kaskády intracelulárních dějů vedoucích k NK buněčné aktivaci 16, 28, 25. Dalším signálním řetězcem, se kterým asociují některé aktivační receptory NK buněk, je DAP10, který ve své intracelulární doméně místo ITAM motivu obsahuje krátkou sekvenci aminokyselin Tyr-Xaa-Xaa-Met. Fosforylací tyrosinu v této sekvenci se vytvoří aktivační místo pro fosfatidylinositol-3'- kinasu, která pak dále aktivuje regulátor G-proteinů Vav1, GTPasy z rodiny Rho a fosfolipasu C. Celá signalizační kaskáda opět vrcholí aktivací NK buňky 29, 30. Jedná se např. o CD16, nejlépe prozkoumaný aktivační receptor NK buněk, který asociuje s FcεRIγ u myši a s FcεRIγ a/nebo CD3ξ u člověka 25, dále o NKG2D, který tvoří komplex s DAP10 29, 30, nebo o lidský receptor KIR, asociující s DAP12 31, 32. Mezi další aktivační receptory patří Ly-49D, některé NKRP1, NKp46, NKp44 a NKp30 11. 1.3.1. Geny receptorů NK buněk Geny pro receptory NK buněk, ať jiţ inhibiční či stimulační, jsou v genomu uloţeny na dvou různých místech: v NK genovém komplexu (NKC, natural killer receptor gene complex; nalézá se na chromozómu 6 u myši, 4 u potkana a 12p13 u člověka) 15, 16, 26 a v komplexu genů pro receptory leukocytů (LRC, leukocyte receptor complex; u člověka se nalézá na chromozómu 19q13.4, u myši na chromozómu 7) 11, 16, 26. Mezi společné vlastnosti těchto dvou genových komplexů patří např. vysoká míra polymorfismu, která zajišťuje vyšší rezistenci proti infekcím 26 ; molekuly kódované v obou oblastech se však od sebe navzájem zřetelně liší 16. Receptory kódované v LRC patří do imunoglobulinové 18

nadrodiny 11, 16, 26, receptory, jejichţ geny jsou uloţeny v NKC, patří do nadrodiny lektinů typu C 15, 11. 1.3.2. Receptory imunoglobulinové nadrodiny Receptory imunoglobulinové nadrodiny nejsou exprimovány pouze na NK buňkách, ale i na různých jiných hematopoetických buňkách 16. Jedná se např. o rodinu lidských receptorů KIR (killer cell Ig-like receptor), membránové glykoproteiny I. typu se dvěma (KIR2D) nebo třemi imunoglobulinovými doménami (KIR3D) v extracelulární části molekuly. KIR jsou kódovány 15 různými geny a exprimovány na NK buňkách a T-lymfocytech. Inhibiční KIR specificky rozpoznávají MHC gp I (především klasické MHC molekuly, tj. HLA-A, HLA-B a HLA-C); aktivační KIR nejsou tak běţné a jejich výskyt můţe souviset s některými autoimunitními onemocněními 25, 33. Další rodinou imunoglobulinových receptorů jsou ILT (Ig-like transcript 2, neboli LIR-1, leukocyte immunoglobulin-like receptor, neboli CD85), které specificky rozpoznávají MHC gp I 16. ILT jsou mimo jiné přítomny také na povrchu některých druhů leukocytů, kde pravděpodobně pomáhají tlumit jejich přílišnou aktivitu 1. Do imunoglobulinové nadrodiny dále patří i skupina aktivačních receptorů, tzv. NCR (natural cytotoxicity receptors), které souvisí s přirozenou cytotoxicitou NK buněk konkrétně jde o NKp46, NKp44 a NKp30. Vyskytují se pouze na NK buňkách; jejich přirozené ligandy nebyly zatím objeveny, ale bylo zjištěno, ţe NKp46 a NKp44 rozpoznávají některé virové proteiny 34. Do této skupiny patří také CD16, nízkoafinitní receptor pro Fc fragment IgG, o kterém bylo pojednáno výše v souvislosti s ADCC. CD16 se skládá z řetězce α, který ve své extracelulární doméně nese vazebné místo pro IgG a v membráně asociuje s homodimerem řetězce γ, který ve své cytoplazmatické části obsahuje motiv ITAM 23. 19

1.3.3. Receptory lektinového C-typu Receptory lektinového C-typu patří do velké a rozmanité skupiny lektinů. Lektiny jsou strukturně velmi různorodou skupinou proteinů, které spojuje schopnost vázat sacharidy s vysokou specifitou. Tato vazba můţe zajišťovat řadu biologických funkcí 35, 36. Prvním objeveným lektinem byl vysoce toxický ricin; izoloval ho Stillmark koncem 19. století ze semen skočce obecného (Ricinus communis) 37. Velkou roli ve výzkumu lektinů hrál také objev a následná izolace konkanavalinu A ze semen bobovité rostliny Canavalia ensiformis (J. Sumner, 1919) a fytohemaglutininu ze semen fazole Phaseolus vulgaris (Peter C. Nowell, 1960). Tyto rostlinné lektiny působí jako mitogeny váţí se na sacharidové řetězce lymfocytárních receptorů, čímţ způsobují jejich agregaci vedoucí k aktivaci lymfocytů 1, 37. Se zástupci lektinů je moţno se setkat u nejrůznějších organismů virů, bakterií, kvasinek, rostlin, a ţivočichů 35. Často se jedná o komplexní, multidoménové proteiny, ale za vazbu sacharidu je ve většině případů zodpovědná pouze jediná doména, tzv. sacharid rozpoznávající doména neboli CRD (carbohydrate-recognition domain). Lektiny obsahující CRD se dají rozdělit do dvou velkých kategorií. Do první kategorie se řadí lektiny vyskytující se především intracelulárně, v luminálních kompartmentech. Podílejí se na transportu, posttranslačních modifikacích a třídění glykoproteinů v sekrečních i jiných biochemických cestách. Jedná se o kalnexinovou skupinu lektinů (patří sem především kalnexin a kalretikulin, které se specificky váţí na terminální glukosové zbytky při N- glykosylaci a zadrţují nesprávně poskládané glykoproteiny v endoplazmatickém retikulu), lektiny L-typu (CRD strukturně podobná lektinům hojně se vyskytujícím v semenech bobovitých rostlin lat. Leguminosae) a P-typu (specificky rozpoznávají a váţí manosa- 6-fosfát). Druhá velká kategorie zahrnuje takové lektiny, které fungují mimo buňku a jsou tedy buď sekretované, nebo lokalizované na buněčném povrchu a zakotvené v plazmatické membráně. Jde o lektiny C-typu (pro specifickou vazbu sacharidu je většinou nutná také účast Ca 2+ iontů), galektiny (váţí -galaktosidy), lektiny I-typu (v oblasti CRD se podobají imunoglobulinům) a R-typu (CRD podobná jako u ricinu). Tento výčet není zcela kompletní, zahrnuje pouze nejlépe prozkoumané skupiny lektinů 36, 38. 20

Lektiny C-typu jsou nejvíce různorodou skupinou v rámci ţivočišných lektinů. Obecně se jedná o multidoménové proteiny, které získaly název podle toho, ţe rozpoznávání sacharidů u nich bylo shledáno závislým na přítomnosti Ca 2+ iontů. Vazba CRD na sacharid zprostředkovává řadu různých biologických funkcí, např. adhezi, endocytózu nebo neutralizaci patogenů 38, 39. C-lektinové CRD jsou součástí širší skupiny proteinových domén označovaných jako CTLD (C-type lectin-like domain). Jedná se o kompaktní domény sloţené ze 110-130 aminokyselinových zbytků s charakteristickou strukturou dvojité smyčky, která je tvořena dvojřetězcovým antiparalelním -listem tvořeným N- a C- koncovými aminokyselinovými zbytky a propojena dvěma -helixy a trojřetězcovým antiparalelním -listem (Obr. 1.4). Doména je stabilizována dvěma aţ třemi vysoce konzervovanými disulfidickými můstky a obsahuje čtyři potenciální vazná místa pro Ca 2+ 40, ionty 41. Dalším vysoce konzervovaným znakem CTLD je motiv WIGLˮ na 2 řetězci. Druhá, delší smyčka (tzv. long loop region ) je strukturně i evolučně flexibilní a podílí se na dimerizaci některých CTLD a především pak na vazbě sacharidů nebo jiných ligandů 41 - mnohé CTLD místo sacharidů specificky rozpoznávají a váţí jiné proteiny nebo lipidové části molekul; některé z těchto interakcí nejsou závislé na vazbě vápníku 38, 42. Obr. 1.4: Typická struktura CTLD skládající se ze dvou smyček. Modrou barvou je vyznačena delší z obou smyček ( long loop region ), oranţovou barvou disulfidické můstky (mezi cysteiny C1 a C4 a mezi C2 a C3; disulfidický můstek mezi C0 a C0' je specifický pro tzv. prodlouţenou formu CTLD). Jedná se o antigen CD209 (DC-SIGN1, dendritic cell-specific ICAM- 3-grabbing non-integrin 1). 41 Lektiny C-typu jsou buď exprimovány jako transmembránové proteiny na povrch buňky, nebo sekretovány jako rozpustné molekuly. Drickamer ve svém review z roku 1993 21

rozdělil tehdy známé proteiny obsahující CTLD podle jejich doménové architektury a fylogenetické příbuznosti do sedmi skupin 43 : I. Proteoglykany II. Transmembránové receptory II. typu III. Kolektiny IV. Selektiny V. Receptory NK buněk VI. Mannosové receptory makrofágů VII. Volné sacharid vázající domény V roce 2002 Drickamer klasifikaci sám doplnil o sedm dalších skupin 44. Další a prozatím poslední tři skupiny byly doplněny Zelenskym a Greadym v roce 2004 45. Dnes se tedy lektiny C-typu dělí celkem do 17 skupin (Obr. 1.5, str. 23), mezi kterými jsou např. také (IX) tetranektin, (X) polycystin, (XI) attraktin, (XIV) thrombomodulin a (XV) BIMLEC 41, 40. V. skupina zahrnuje transmembránové proteiny II. typu, které tvoří homodimery (a v některých případech heterodimery) stabilizované disulfidickými můstky. Jejich CTLD se částečně liší od struktury typických C-lektinových CTLD, coţ zřejmě souvisí s faktem, ţe tyto proteiny většinou specificky rozpoznávají a váţí MHC gp I, popř. jiné proteinové ligandy. Vazba se uskutečňuje i bez účasti vápenatých iontů 41, 40. Ač tato skupina nese název Receptory NK buněkˮ, mnohé z těchto receptorů nejsou exprimovány výhradně na NK buňkách (např. CD72 se nalézá na povrchu B-lymfocytů, CD69 je exprimován celou škálou hematopoetických buněk, KLRG1/MAFA je produkováno bazofily a NK buňkami, atd.) 41. Jedná se o evolučně mladou skupinu, která je u myší reprezentována např. receptorovou rodinou Ly-49, CD94, NKG2-A, -C, -D a E nebo NKRP1, u lidí se jedná např. o receptory CD69, NKRP1, CD94, AICL, MAFA, LLT1, stimulační receptor KLRF1 a inhibiční KLRG1 11, 19, 16, 40. 22

Obr. 1.5: Jednotlivé skupiny lektinů C-typu a struktura jejich domén. Na obrázku je 17 skupin, které byly definovány na základě fylogenetické příbuznosti a strukturní podobnosti; proteiny některých skupin jsou rozpustné, jiných transmembránové (a). Kolektiny (skupina III) tvoří oligomerické struktury, např. kříţovou (surfaktant SP-D, konglutinin nebo CL-46) či buketovou (MBP nebo surfaktant SP-A, b). 40 1.3.3.1. Rodina receptorů Ly-49 Ly-49 je nejlépe prozkoumanou rodinou receptorů C-lektinového typu, kterou představuje celkem asi 23 genů (Ly-49A-W) vyskytujících se u myší a vykazujících značnou míru alelického polymorfismu 25, 46. Jedná se o transmembránové homodimerní glykoproteiny; 23

kaţdý z řetězců se skládá z CTLD, která je k plazmatické membráně připojena -helixem tvořeným přibliţně 70 aminokyselinovými zbytky 46. Většina receptorů z této rodiny je inhibiční ve své cytoplazmatické doméně obsahují motiv ITIM a jejich ligandy jsou MHC gp I (konkrétně různé allotypy molekul H-2 11 ). Na příkladu inhibičního Ly-49A byla Yokoyamou a kolegy poprvé demonstrována missingselfˮ hypotéza (NK buňky izolované z myšího kmene C57BL/6 aktivované IL-2 exprimující Ly-49A nebyly schopné zabít buňky s povrchovou expresí H-2D d ) 47. Ly-49A byl také prvním NK receptorem, pro který byla získána krystalová struktura s jeho MHC gp I ligandem 48. Mezi inhibiční Ly-49 se řadí např. také Ly49-B, C, E, F nebo G 46. Struktura dvou inhibičních izoforem Ly-49 s jejich MHC gp I ligandy na na Obr. 1.6. Obr. 1.6: Struktura dvou izoforem Ly-49 v komplexu s jejich MHC gp I ligandy. Domény těţkého řetězce MHC gp I (α1, α2 a α3) jsou vyznačeny fialově; β-2-mikroglobulin oranţově; peptid šedivě; molekuly Ly-49 zeleně. (a) Struktura Ly-49A v komplexu s H-2D d ; (b) Struktura Ly-49C v komplexu s H- 2K b. 49 Aktivační Ly-49 mají ve své transmembránové doméně kladně nabitý arginin, který zprostředkovává interakci s negativně nabitou asparagovou kyselinou v molekule DAP12; v její nepřítomnosti nejsou Ly-49 stabilně exprimovány na buněčný povrch 25. Jedná se např. o Ly-49D, H a L 46. V lidském genomu byl nalezen jediný analog myších Ly-49; jedná se o pseudogen, který je přepisován jen ve velmi malé míře 25. 24

1.3.3.2. Rodina receptorů NKG2 a CD94 Geny pro CD94 a NKG2 je moţno najít u člověka, potkana i myši. Kódují receptory, které rozpoznávají neklasické MHC gp I (u člověka HLA-E a u myši Qa-1b). Narozdíl od Ly- 49, CD94 a NKG2 (ani jejich ligandy) nejsou výrazně polymorfní; známé malé alelické variace nemají vliv na funkci těchto receptorů. V genomu člověka i myši je znám pouze jediný gen pro CD94, který je umístěn v těsné blízkosti genů pro některé NKG2 25. Receptory z rodiny NKG2 jsou transmembránové proteiny II. typu tvořící disulfidicky spojené heterodimery s CD94, který je nezbytný pro jejich správnou funkci 11, 16. Lidské NKG2A a NKG2B, produkt alternativního sestřihu téhoţ genu) obsahují motiv ITIM; heterodimery CD94/NKG2A a -B fungují jako inhibiční receptory 50. CD94/NKG2C přes lysin v transmembránové doméně asociuje s adaptorovým proteinem DAP12, nezbytným pro jeho stabilní povrchovou expresi a pro jeho funkci jako aktivačního receptoru 51. Lidské NKG2F má sice v transmembránové doméně segment obsahující nabité aminokyselinové zbytky, můţe tedy asociovat s DAP12, ale postrádá část extracelulární domény tvořící CTLD, nemůţe tak tvořit dimer s CD94 a proto ač je exprimován, jeho výskyt je omezen na intracelulární kompartmenty 52. Myší CD94/NKG2A je inhibiční receptor 53, CD94/NKG2C i CD94/NKG2E asociují s DAP12 a mají tedy aktivační funkci 54. Inhibiční CD94/NKG2A i aktivační CD94/NKG2C mají zdánlivě stejné ligandy. CD94/NKG2A se na ně ale váţe s vyšší afinitou; dále bylo prokázáno, ţe rozpoznávání ligandů můţe být u těchto receptorů ovlivněno peptidy vázanými na HLA-E, resp. Qa-1b. Po expresi na buněčný povrch zde tyto receptory nejsou stabilně udrţovány (jako je tomu v případě Ly-49, ale jejich mnoţství je modulováno koncentrací cytokinů v okolním prostředí (jejich expresi indukují např. IL-15, TGF- nebo IL-12) 25. Disulfidicky spojené homodimery CD94 mohou být exprimovány na buněčný povrch, ale neváţí ani HLA-E ani Qa-1b, a není pravděpodobné, ţe by zprostředkovávaly nějaký signál, protoţe postrádají intracelulární doménu 25. Ze skupiny se poněkud vymyká NKG2D, který je exprimován nejen na NK buňkách, kde funguje jako stimulační receptor, ale i na T-lymfocytech, kde pravděpodobně hraje roli kostimulační molekuly 16. Gen pro NKG2D nevykazuje ţádný polymorfismus. Je exprimován ve formě kovalentního homodimeru; netvoří heterodimery s CD94. Myší NKG2D můţe asociovat jednak s DAP10, jednak s DAP12, zatímco lidské NKG2D 25

asociuje pouze s DAP10. NKG2D rozpoznává povrchové glykoproteiny podobné MHC gp I, ale většina těchto molekul není kódována v MHC genovém komplexu a nefunguje jako struktury prezentující antigen T-lymfocytům. Mezi jeho ligandy patří u člověka stresové proteiny MICA a MICB a dále ULBP (protein vázající UL16, glykoprotein lidského cytomegaloviru), u myši molekuly H-60, RAE1 a MULT1 16, 55. NKG2D hraje pravděpodobně funkci jak v obraně proti virům, tak proti nádorům 25. 1.3.3.3. Receptor KLRF1 KLRF1 (killer cell lectin-like receptor F1, NKp80) je exprimován na zralých leukocytech, NK buňkách a NKT buňkách. Zesítění těchto receptorů stimuluje jak klidové, tak aktivované NK buňky. Molekula má nezvyklou primární strukturu v transmembránové části neobsahuje ţádné nabité aminokyselinové zbytky a v intracelulární doméně nebyl nalezen ani ITAM, ani ITIM motiv 16. KLRF1 se aktivuje vazbou na jiný C-lektinový receptor, AICL (activation-induced C-type lectin) 56. 1.3.3.4. Receptor KLRG1 KLRG1 (killer cell lectin-like receptor G1, MAFA mast cell function-associated antigen) byl identifikován jako inhibiční receptor na mastocytech potkana. U člověka a myši se s ním setkáváme na NK buňkách a T lymfocytech 16. Jeho ligandy jsou kadheriny (důleţité adhezní molekuly exprimované širokým spektrem buněk) 57. 1.3.3.5. Receptor CD69 CD69 je disulfidicky spojený homodimer, k jehoţ povrchové expresi dochází krátce po aktivaci lymfocytů (včetně NK buněk) a je proto vyuţíván i jako marker jejich aktivace 58. Jeho zesítění (např. monoklonálními protilátkami v přítomnosti forbolesterů) dále přispívá k cytotoxické aktivaci lymfocytů 16, 58. Jeho přirozený ligand dosud nebyl identifikován. 26

1.3.3.6. Rodina receptorů NKRP1 Rodina NKRP1 (natural killer receptor-protein 1 = KLRB1, killer cell lectin-like receptor subfamily B, member 1 = CD161) zahrnuje stimulační a inhibiční receptory NK buněk C- lektinového typu 59. Do skupiny patří mj. také polymorfní antigen NK1.1 (NKRP1C), nejlepší známý sérologický marker NK buněk myšího kmene C57BL/6 16, který spolehlivě identifikuje i NK buňky mnoha jiných myších kmenů (CE, NZB, C58, FVB atd.) 8. Geny pro receptory NKRP1 se nalézají na centromerickém konci NKC 59, blízko genu pro CD69 16. První molekula z rodiny NKRP1 byla nalezena u potkana jednalo se o aktivační receptor NKRP1A, který se podařilo identifikovat pomocí monoklonální protilátky 3.2.3. Jde o vůbec první popsaný receptor z C-lektinové nadrodiny 60. Na buněčný povrch je NKRP1A exprimován jako disulfidickým můstkem spojený homodimerní transmembránový glykoprotein II. typu 61. Potkaní NKRP1C, který je selektivně exprimován Ly-49 - NK buňkami, byl identifikován pomocí monoklonální protilátky STOK27; blokace rnkrp1c touto protilátkou vedla k mírnému zvýšení cytotoxicity NK buněk vůči allogenickým a syngenickým lymfoblastům nezávisle na jejich MHC haplotypu, coţ nasvědčuje jeho inhibiční funkci 59. Jako NKRP1B byly původně označeny nezávisle na sobě dvě různé sekvence. První z nich, které označení zůstalo, obsahuje v intracelulární doméně motiv ITIM a slouţí jako inhibiční receptor NK buněk 28. Druhá sekvence byla později pro odlišení označena jako NKRP1D (resp. NKRP1B*). NKRP1D postrádá motiv ITIM, nejvíce se podobá myšímu NKRP1F 28 a odhaduje se, ţe má aktivační funkci 62. U myší jsou jiţ po dlouhou dobu známy receptory NKRP1A, B a C 63 ; v nedávné době byly dále identifikovány receptory NKRP1D, E a F 64. NKRP1A, C a F ve své transmembránové doméně obsahují kladně nabitý arginin, kterým asociují s adaptorovou molekulou FcεRIγ 65, coţ naznačuje, ţe tyto molekuly jsou pravděpodobně stimulační receptory: u NKRP1C byla stimulační funkce přímo dokázána 66, 67, 68. V sekvenci myšího NKRP1B je naopak obsaţen motiv ITIM, tento receptor je inhibiční 69, 70. NKRP1D, jehoţ gen je pravděpodobně alelou NKRP1B 8, obsahuje ITIM motiv a má tedy pravděpodobně také inhibiční funkci 28. NKRP1E je patrně pseudogen (gen, který v buňce jiţ není přepisován, je však příbuzný jiným, funkčním genům) 28. 27

V lidském NKC je kódována jen jediná molekula z rodiny NKRP1 71. S myším NKRP1 je její aminokyselinová sekvence homologní z 46%. Lidský NKRP1 je exprimován pouze na jednom podtypu zralých NK buněk a na T-lymfocytech 16. Molekula neobsahuje ve své intracelulární doméně motiv ITIM a v transmembránové ţádné nabité aminokyselinové zbytky. Ligandem pro hnkrp1 je LLT1 (lectin-like transcript-1), který je exprimován na NK buňkách a interakcí se svým receptorem inhibuje cytotoxickou aktivitu NK buněk 72, 73, a také nedávno objevená transmembránová molekula PILAR (proliferation-induced lymphocyte-associated receptor) 74. 1.3.3.7. Molekuly z rodiny Clr Ligandy pro NKRP1 zůstávaly po dlouhou dobu neznámé. Teprve nedávno bylo zjištěno, ţe některé z těchto receptorů specificky rozpoznávají a váţí molekuly z rodiny Clr/Ocil (C-type lectin-related molecule/osteoclast inhibitory lectin) 75, 76. První objevenou molekulou z této rodiny byl myší mocil/clr-b 77. Tento transmembránový protein II. typu, jehoţ řetězec čítá 207 aminokyselinových zbytků a v extracelulární doméně obsahuje podobný C-lektinový motiv jako CD69, byl nejdříve popsán jako faktor inhibující formaci osteoklastů (mnohojaderných buněk, které se odvozují z linie makrofágů pocházejících z kostní dřeně 75 a jsou zodpovědné za resorpci kosti) 77. Bylo dokázáno, ţe Clr-b in vitro inhibuje tvorbu osteoklastů (při aplikaci dostatečné dávky) v proliferativní fázi úplně, ve fázi diferenciační ze 70 %, a to i v případech, kdy jsou v kulturách přítomny také RANKL a M-CSF faktory zásadní pro formaci osteoklastů 77. Zjištěním této funkce se alespoň částečně osvětlil důvod přítomnosti Clr-b na osteoblastech; tento lektin je však exprimován na povrchu téměř všech hematopoetických buněk (kromě erytrocytů) 76, coţ od začátku poukazovalo na fakt, ţe inhibice tvorby osteoklastů není pravděpodobně funkcí jedinou. Velmi brzy po objevu Clr-b byly u myši identifikovány dvě další molekuly vykazující významnou podobnost s mocil, jak ve struktuře, tak i v jejich tkáňové distribuci a ve schopnosti in vitro inhibovat tvorbu osteoklastů 78. Tato redundance u Clr molekul pravděpodobně poukazuje na společného předchůdce. Molekuly, z nichţ kaţdá je kódována jiným, byť velmi podobným genem, nesou názvy mocilrp1 (Clr-d) a mocilrp2 (její izoformou, lišící se o 4 aminokyseliny, je mocilrp2b neboli Clr-g) 78. Později byl 28

nalezen také lidský homolog myšího Clr, hocil, který má srovnatelné efekty na vývoj osteoklastů jako mocil a kromě toho je schopen inhibovat resorpci kosti jiţ vyvinutými osteoklasty odvozenými od nádorových buněk 79. Dále bylo ukázáno, ţe Ocil je schopný vázat různé fyziologicky důleţité glykosaminglykany a ţe tato vazba neovlivňuje jeho inhibiční funkci v osteoklastogenezi 80. V nedlouhé historii rodiny molekul Clr se průlomovým stalo zjištění, ţe tyto proteiny C- lektinového typu jsou specifickými ligandy pro některé z NKRP1 receptorů 75, 76. Konkrétně se jedná o molekulu Clr-g, která je specificky rozpoznávána a vázána stimulačním receptorem NKRP1F 75, a dále o Clr-b, jeţ je specifickým ligandem pro inhibiční receptory NKRP1B a NKRP1D 75, 76. V později zmíněném případě se v určitém smyslu jedná o novou, jinou formu missing self rozpoznávání místo MHC gp I zde vystupuje molekula Clr-b, která se vyskytuje na povrchu mnoha různých buněk, ale její povrchová exprese je často sníţena u buněk nádorových (podobně jako MHC gp I) 76. Geny pro Clr se nalézají na stejném místě jako geny pro NKRP1 jsou s nimi propleteny na centromerickém konci NKC 59, 75 (viz Obr. 1.7). Pořadí genů je značně konzervované a daná oblast se vyznačuje velmi nízkým alelickým polymorfismem 75. Mezi geny pro Clr a NKRP1 je potlačena rekombinace, coţ spolu se skutečností, ţe spolu tyto geny velmi blízce sousedí, zaručuje, ţe specifické dvojice ligand-receptor jsou děděny společně 59, 75. Obr. 1.7: Organizace genů pro NKRP1 a Clr molekuly v centromerické části NKC. Diagram se vztahuje ke genomu myší kmene C57BL/6, v tomto úseku je genomická organizace stejná i u myší kmene 129. Obdélníky geny, šipky směr transkripce. 75 29

1.4. Zkoumaný systém: NKRP1B WAG, NKRP1B SD, Clr-b WAG, RCTL Jedním z produktů potkaního cytomegaloviru (RCMV) je RCTL (RCMV C-type lectinlike), který je exprimován v druhé části časné a během pozdní fáze replikačního cyklu tohoto viru. Jedná se o protein o velikosti 20 kda obsahující CTLD a sdílející významnou homologii s potkaními i myšími Clr molekulami 81 (z 50 % stejná aminokyselinová sekvence s myším Clr-b, ze 48 % s myším Clr-g, ze 60 % s potkaním Clr-b). Zajímavé je, ţe také intron-exonová struktura genu pro RCTL je podobná struktuře genů pro Clr, coţ poukazuje na pravděpodobné převzetí tohoto genu virem od hostitele během replikačního cyklu; mezi oběma geny však existují jisté rozdíly introny byly v genu pro RCTL zkráceny a region kódující intracelulární doménu byl zkrácen a pozměněn (Obr. 1.8). Předpokládá se, ţe tyto změny vedou v důsledku k moţnosti regulaci exprese a funkce RCTL nezávisle na Clr-b. Pomocí monoklonální protilátky R3A8 (specifické pro RCTL a rclr-b) bylo zjištěno, ţe infekce RCMV způsobuje ztrátu povrchové exprese rclr-b, která by vedla k eliminaci virem napadených buněk NK-lymfocyty. Ztráta fyziologického ligandu je ale rychle nahrazena expresí RCTL, pravděpodobně ve formě homodimeru; tento náhradní ligand přímo interaguje s NKRP1B a tak inhibuje NK buněčnou cytotoxickou aktivaci 82. Obr. 1.8: Intron-exonová struktura genů pro mclr-b, RCTL a rclr-b. Šipky představují směr transkripce, obdélníky exony a přímky introny. Uvedena je také délka kaţdého z genů. 82 Geny pro NKRP1B u jednotlivých potkaních kmenů vykazují vyšší míru alelického polymorfismu neţ ostatní izoformy NKRP1. Významně se liší např. alely NKRP1B u potkaních kmenů SD, BN, F344, BS, PVG, WAG a TO. Identické jsou rnkrp1b BS/PVG a rnkrp1b WAG, od nichţ se odlišují rnkrp1b RNK,SD,BN,F344 (které jsou si vzájemně dosti podobné); rnkrp1b TO se odlišuje od obou výše uvedených skupin (srov. Obr. 1.9 na str. 31). Byla zkoumána interakce rnkrp1b RNK a rnkrp1b WAG jednak s rclr-b, jednak s RCTL. Zatímco rnkrp1b WAG rozpoznával jak rclr-b, tak RCTL, rnkrp1b RNK specificky vázal pouze rclr-b. Tento fakt výrazně nasvědčuje hypotéze, ţe alelická 30

divergence hlodavčích NKRP1 receptorů můţe být důsledkem evoluce genomu hostitele pod selekčním tlakem ve snaze vyhnout se diskutované virové strategii. Tyto objevy zároveň odhalují neredundantní roli inhibičního systému NKRP1B-Clr-b 82. Obr. 1.9: Fylogram sekvencí kódujících molekuly z rodiny NKRP1 u různých druhů a kmenů a sekvence virového proteinu RCTL. Měřítko naznačuje divergenci aminokyselinového sloţení. 82 31

2. CÍLE PRÁCE příprava expresních vektorů kódujících potkaní geny rclr-b WAG, rnkrp1b WAG, rnkrp1b SD a virové RCTL rekombinantní příprava a purifikace těchto proteinů ověření správnosti připravených proteinů biofyzikální charakterizace získaných proteinů 32

3. MATERIÁL 3.1. Přístroje a pomůcky Adhezívní podloţka na třepačku Sticky Pad Analytická ultracentrifuga Proteomelab XL-I Analytické váhy Automatické pipety Centrifuga Allegra X-22R Centrifuga Avanti J-26 XP Centrifuga VSMC-13 Centrifuga PK110 Centrifuga Spectrofuge 16M Filtry pro sterilizaci 0,22 μm Filtry PVDF 0,22 μm, 45 mm průměr Fotoaparát Olympus SP-500 UZ Fotografický film MEDIX XBU Hemocytometr HPLC systém ÄKTAbasic Inkubátor pro tkáňové kultury IGO 150 Cell life JETQUICK Gel Extraction Spin Kit JETQUICK Plasmid Miniprep Spin Kit Kahan Fireboy Eco Kolony Econo 1,5 x 50 cm Kolona Superdex 200 10/300 GL Kolona PLRP-S 300 Å Koncentrátory Amicon Ultra Láhve čtverhranné s prodyšnými víčky Laminární box MSC 12 Magnetická míchačka MM 2A Membrána pro elektropřenos BioTrace Mikroskop inverzní IM3 Mrazící box (-20 C) Mrazící box (-80 C) Bio Freezer Mrazící kontejner Mr. Frosty New Brunswick Scientific, USA Beckman Coulter, USA AND, USA Gilson, USA Beckman Coulter, USA Beckman Coulter, USA Shelton scientific, USA ALC, Itálie Edison, USA TPP, Švýcarsko Sigma-Aldrich, USA Olympus, Japonsko Foma Bohemia, ČR Marienfeld, Německo Amersham Biosciences,Švédsko Jouan, Francie Genomed, Německo Genomed, Německo Integra Biosciences, Švýcarsko Bio-Rad, Německo GE Healthcare, Švédsko Polymer Laboratories, Velká Británie Millipore, USA P-LAB, ČR Jouan, Francie Lab.přístroje Praha, ČR Pall Corporation, USA Intraco Micro, ČR Zanussi, Itálie Forma scientific, USA Sigma, USA 33

NoEndo JETSTAR 2.0 Plasmid Maxiprep Kit Nosič pro chromatografii Talon ph metr Φ 200 Pipetovaní nástavec Pipetus AKKU Plastik pro tkáňové kultury Předváţky HF-1200 G Rotační vakuová odparka Souprava pro agarosovou elektroforézu Souprava pro elektropřenos Souprava pro filtraci za sníţeného tlaku Souprava pro SDS-PAGE Spektrofotometr DU-70 Termocykler Termostat BT 120M Třepačka Třepačka Orbit 1000 Ultrazvuková sonda Sonoplus HD 3100 Ultrazvuková lázeň Ultrasonic LC 30H UV prosvěcovací lampa Vodní lázeň Vortexový mixér Zdroj deionizované vody Milli Q Zdroj napětí BM 551 Genomed, Německo Clontech, USA Beckman, USA Hirschmann Laborgeräte, Německo TPP, Švýcarsko AND, USA Trigon, Francie Sigma, USA Biometra, Německo Sigma-Aldrich, USA Bio-Rad, Německo Beckman, USA Eppendorf, Německo Laboratorní přístroje Praha, ČR VELP Scientifica, Itálie Labnet, USA Bandelin, Německo Elma, Německo UltraLum, USA Memmert, Německo VELP Scientifica, Itálie Millipore, USA Tesla, ČR 3.2. Chemikálie Všechny použité chemikálie byly minimálně čistoty p.a. Agar Agarosa Akrylamid Ampicilin Azid sodný Bromfenolová modř BSA Coomassie Brilliant Blue R-250 Cystamin Oxoid, Anglie Jersey Lab Supply, USA Sigma, USA Biotika, SR Serva, USA Lachema, ČR New England Biolabs, USA Serva, USA Sigma, USA 34

Činidlo dle Bradfordové DMEM médium DMEM médium bez vápníku DMSO dntp DTT EDTA Ethidiumbromid ExCELL293 médium FBS L-glutamin GAM IgG protilátka konjugovaná s HRP Glycin Glycerol IPTG Kvasničný extrakt Lipofectamine 2000 2-merkaptoethanol N,N -methylen-bis-akrylamid MgSO 4 NEA PEI 25 kda lineární Penta-His protilátka Pluronic F-68 Ponceau Red SDS Standard pro agarosovou elektroforézu Standard pro SDS-PAGE Sušené odtučněné mléko LAKTINO TEMED Tetracyklin Tris Triton X-100 Trypanová modř Trypton Tween 20 Bio-Rad, Německo Přípravna médií ÚMG AV ČR, v.v.i., ČR Přípravna médií ÚMG AV ČR, v.v.i., ČR Sigma, USA Top-Bio, ČR Serva, USA Jersey Lab Supply, USA Jersey Lab Supply, USA Sigma, USA Gibco, USA Přípravna médií ÚMG AV ČR, v.v.i., ČR Abcam, Velká Británie Fluka, Švýcarsko Lach-Ner, ČR Sigma, USA Imuna Pharm, ČR Invitrogen, USA Sigma, USA Sigma, USA Lach-Ner, ČR Přípravna médií ÚMG AV ČR, v.v.i., ČR Polysciences, USA Qiagen, Německo Sigma, USA Sigma, USA Jersey Lab Supply, USA New England Biolabs, USA Serva, USA PROMIL, ČR Serva, USA Lab scientific, USA Serva, USA Serva, USA Sigma, USA Oxoid, Anglie Sigma, USA 35

Ustalovač Vývojka Ostatní běţné chemikálie: Kodak, USA Kodak, USA Lach-Ner, ČR 3.2.1. Enzymy AgeI Deep Vent DNA polymerasa (2000 U/ml) KpnI Lysozym RNasa A (10 mg/ml) T4 DNA ligasa (1000 U/μl) New England Biolabs, USA New England Biolabs, USA New England Biolabs, USA Fluka, Švýcarsko Serva, USA Fermentas, Kanada 3.2.2. Bakteriální kmeny a buněčné linie E. coli: DH5α E. coli: BL21 GOLD HEK293T Marek Ingr, Praha, ČR Stratagene, USA A. Radu Aricescu, Oxford, Velká Británie 3.2.3. Vektory phlsec (1 μg/μl) phlsec-fchis (1 μg/μl) pmbp-3c (0,01 μg/μl) A. Radu Aricescu, Oxford, Velká Británie A. Radu Aricescu, Oxford, Velká Británie Olga V. Moroz, York, Velká Británie 3.2.4. Primery pro PCR RCTL_I38_FW 5' - AAAAAAACCGGTATCCTTTCTGCTCAACGATCGAT - 3' RCTL_T180_REV 5' - AAAAAAGGTACCTGTAGAACAAAGCTGGCAACGGA - 3' rclrbwag_v65_fw 5' - AAAAAAACCGGTGTAAAAATGACACCACAGATCTCA - 3' rclrbwag_m207_rev 5' - AAAAAAGGTACCCATAGGAGAAAAAGGAGTTTTGCA - 3' 36

rnkrp1bwag_v78_fw 5' - AAAAAAACCGGTGTTCAAGAGAACAGGACAAAAACA - 3' rnkrp1bwag_s223_rev 5' - AAAAAAGGTACCGGAGCCATTACACATGCATTCACA - 3' rnkrp1bsd_s223_rev 5' - AAAAAAGGTACCGGAGTCATTGCACGTGCTTTC - 3' RCTL_H51_FW 5' -AAAAAAACCGGTCATAACTATGCCATTTGTCCAAAAG - 3' RCTL_T170_REV 5' -AAAAAAGGTACCTGTAGACTTGCTGCAGGACCA - 3' rnkrp1bsd_s88_fw 5' -AAAAAAACCGGTAGTCCAGCTAAGTTAAAGTGCCC - 3' rnkrp1bsd_k215_rev 5' -AAAAAAGGTACCTTTTAGTTCCTTTTGGCAGATCCA - 3' phlsec_fw 5' - GCTGGTTGTTGTGCTGTCTCATC - 3' phlsec_rev 5' - CACCAGCCACCACCTTCTGATAG - 3' 3.2.5. Roztoky a média AA: 30 % akrylamid, 1 % N,N -methylen-bis-akrylamid Barvicí roztok pro SDS-PAGE: 45 % methanol, 10 % kyselina octová, 0,25 % CBB R-250 Blokovací pufr pro imunodetekci: 3% BSA, 10 mm Tris, 150 mm NaCl, ph = 7,5 DMEM médium: připraveno ze zásobních roztoků (Přípravna médií ÚMG AV ČR, v.v.i., ČR) ve standardním sloţení varianty obsahující 4,5 g/l glukosy, 3,7 g/l NaHCO 3 a 4 mm L-glutamin a bylo dále doplněno NEA (výsl. konc. 1x) a případně FBS dle potřeby 37

DMEM médium bez vápníku: připraveno ze zásobních roztoků (Přípravna médií ÚMG AV ČR, v.v.i., ČR) s vynecháním CaCl 2 v jinak standardním sloţení varianty obsahující 4,5 g/l glukosy, 3,7 g/l NaHCO 3 a 4 mm L-glutamin a bylo dále doplněno NEA (výsl. konc. 1x) a Pluronic F-68 (výsl. konc. 0,1%) ECL1: 2,5 mm luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazindion), 0,1 M Tris, ph = 8,8 ECL2: 5,4 mm H 2 O 2, 0,1 M Tris, ph = 8,8 Elektrodový pufr pro SDS-PAGE 10 x koncentrovaný: 3 % Tris, 14,4 % glycin, 1 % SDS, ph = 8,3 EP pufr: 10 mm Tris (ph = 8,0), 1 mm EDTA, 15 % sacharosa, 2 mg/ml lysozym, 0,2 mg/ml RNasa, 0,1 mg/ml BSA ExCELL293 médium: zakoupeno hotové médium (Sigma, USA) a před pouţitím doplněno o L-glutamin (výsl. konc. 4 mm) LB agar: 1,5 % agar v LB médiu LB médium: 1 % trypton, 0,5 % kvasničný extrakt, 1 % NaCl, ph = 7,4 - pouţité koncentrace antibiotik: ampicilin 100 μg/ml (zásobní koncentrace 100 mg/ml) tetracyklin 12,5 μg/ml (zásobní koncentrace 5 mg/ml) Mobilní fáze A pro RP-HPLC: 0,1 % kyselina trifluoroctová Mobilní fáze B pro RP-HPLC: 95 % acetonitril, 5 % mobilní fáze A NEB1 pufr 1 x koncentrovaný: 10 mm bis-tris-propan, 10 mm MgCl 2, 1 mm DTT, ph = 7,0 (New England Biolabs, USA) Odbarvovací roztok pro SDS-PAGE: 35 % ethanol, 10 % CH 3 COOH PBS pufr: 50 mm Na 2 HPO 4, 300 mm NaCl, 10 mm NaN 3, ph = 7,0 PBS pufr s imidazolem: 50 mm Na 2 HPO 4, 300 mm NaCl, 10 mm NaN 3, 250 mm imidazol, ph = 7,0 PBS-TK pufr: 10 mm Na 2 HPO 4, 150 mm NaCl, 2 mm KCl, 2 mm KH 2 PO 4, ph = 7,0 PCR pufr Thermo pol, 1 x koncentrovaný: 10 mm KCl, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 20 mm Tris, 2 mm MgSO 4, 0,1 % Triton X-100, ph = 8,8 (New England Biolabs, USA) Pufr pro agarosovou elektroforézu TAE pufr, 1 x koncentrovaný: 40 mm Tris, 20 mm CH 3 COOH, 1 mm EDTA Pufr pro elektropřenos: 80% elektrodový pufr pro SDS-PAGE, 20% methanol Pufr pro gelovou chromatografii: 10 mm Tris, 150 mm NaCl, 10 mm NaN 3, ph = 7,0 Pufr pro gelovou chromatografii bez azidu: 10 mm Tris, 150 mm NaCl, ph = 7,0 Pufr pro inkubaci s primární protilátkou: 3% BSA, 10 mm Tris, 150 mm NaCl, ph = 7,5 38

Pufr pro inkubaci se sekundární protilátkou: 10% odtučněné sušené mléko, 10 mm Tris, 150 mm NaCl, ph = 7,5 Pufr pro T4 DNA ligasu 1 x koncentrovaný: 50 mm Tris, 10 mm MgCl 2, 10 mm DTT, 1 mm ATP, 25 μg/ml BSA, ph = 7,5 (Fermentas, Kanada) Roztok E1, G1: 50 mm Tris (ph = 8,0), 10 mm EDTA, 100 μg/ml RNasa A (Genomed, Německo) Roztok E2, G2: 200 mm NaOH, 1 % SDS (Genomed, Německo) Roztok E3: 3,1 M octan sodný, ph = 5,5 (Genomed, Německo) Roztok E4: 100 mm octan sodný (ph = 5,0), 600 mm NaCl, 0,15% Triton X-100 (Genomed, Německo) Roztoky ENDO-1 a ENDO-2: chráněné sloţení (Genomed, Německo) Roztok E5: 100 mm octan sodný (ph = 5,0), 800 mm NaCl (Genomed, Německo) Roztok E6: 100 mm octan sodný (ph = 5,0), 1500 mm NaCl (Genomed, Německo) Roztok G3: guanidin hydrochlorid, octan sodný (Genomed, Německo) Roztok GX: guanidin hydrochlorid (Genomed, Německo) Roztok G4: ethanol, NaCl, EDTA, Tris (Genomed, Německo) Roztok L1: NaClO 4, octan sodný, TBE (Genomed, Německo) Roztok L2: ethanol, NaCl, EDTA, Tris (Genomed, Německo) STOP pufr: 30 % glycerol, bromfenolová modř, TE pufr TBS: 10 mm Tris, 150 mm NaCl, ph = 7,5 TBS-Tween/Triton: 20 mm Tris, 500 mm NaCl, 0,05% Tween 20, 0,2% Triton X-100, ph = 7,5 TE pufr: 10 mm Tris, 0,5 mm EDTA, ph = 8,0 TES pufr: 10 mm Tris, 2 mm EDTA, 150 mm NaCl, 10 mm NaN 3, ph = 8,0 Vzorkový pufr pro SDS-PAGE neredukující 2 x koncentrovaný: 100 mm Tris, 20 % glycerol, 4 % SDS, 0,2 % bromfenolová modř, ph = 6,8 Vzorkový pufr pro SDS-PAGE redukující 2 x koncentrovaný: 100 mm Tris, 20 % glycerol, 4 % SDS, 0,2 % bromfenolová modř, 100 mm DTT, ph = 6,8 39

4. METODY 4.1. Příprava expresního vektoru 83 4.1.1. PCR amplifikace V 0,5 ml polypropylenových zkumavkách bylo smícháno vţdy 30,5 μl ddh 2 O, 5 μl PCR pufru (10 x koncentrovaný), 1,5 μl 10 mm dntp, 1,5 μl 100 mm MgSO 4, 5 μl 5 μm přímého primeru a 5 μl 5 μm reverzního primeru (viz Tab. 1), 1 μl templátu a 0,5 μl Deep Vent DNA polymerasy. PCR proběhla v termocykleru, zvolen byl následující termální profil: 1) 5 min - 94 C 2) 35 cyklů: 30 s 94 C 30 s 52 C 1 min 72 C 3) 10 min - 72 C Teplota v termocykleru se poté sníţila na 4 C, kde byla udrţována, dokud nebyly zkumavky vyjmuty. Výsledný produkt PCR byl detekován pomocí agarosové elektroforézy. Vzorek byl připraven smícháním 5 μl PCR produktu a 1 μl STOP pufru. Tab. 1: Primery pro amplifikaci jednotlivých konstruktů. konstrukt přímý primer reverzní primer R1 RCTL_I38_FW RCTL_T180_REV C1 rclrbwag_v65_fw rclrbwag_m207_rev W1 rnkrp1bwag_v78_fw rnkrp1bwag_s223_rev S1 rnkrp1bwag_v78_fw rnkrp1bsd_s223_rev R2 RCTL_H51_FW RCTL_T180_REV R3 RCTL_H51_FW RCTL_T170_REV S2 rnkrp1bsd_s88_fw rnkrp1bsd_k215_rev 40

4.1.2. Agarosová elektroforéza Gel pro agarosovou elektroforézu byl připraven rozpuštěním 0,6 g agarosy v 60 ml TAE pufru, tato směs byla povařena a ponechána zchladnout asi na 50 C. Následně do ní bylo přidáno 60 μl ethidium bromidu o koncentraci 0,5 mg/ml. Gel byl po ztuhnutí vloţen do elektroforetické aparatury s TAE pufrem a do jednotlivých jamek byly pipetovány analyzované vzorky a standard. Elektroforéza byla ponechána probíhat 30 min při 110 V. K vizualizaci DNA byla vyuţita fluorescence komplexu DNA s interkalovaným ethidium bromidem po ozáření UV lampou při vlnové délce 254 nm. 4.1.3. Extrakce DNA srážením ethanolem Ke zbylému PCR produktu byla přidána 1/10 objemu 3 M roztoku octanu sodného (ph = 5,2) a 2,5-násobek objemu 100% ethanolu. Roztok byl promíchán a umístěn na 30 min do mrazícího boxu (-20 C). Následovala centrifugace při 22000 x g, 5 min, 0 C. Supernatant byl odstraněn, k peletě bylo přidáno 50 μl 70% ethanolu na opláchnutí, roztok byl centrifugován při stejných podmínkách jako v předchozím případě, supernatant byl opět odstraněn, peleta byla ponechána vyschnout v rotační vakuové odparce a následně rozpuštěna ve 14 μl ddh 2 O. 4.1.4. Příprava inzertů a linearizace plazmidu phlsec/phlsec-fchis Ke 14 μl inzertu byly přidány 2 μl NEB1 pufru (10 x koncentrovaný), 2 μl BSA o c = 1 μg/μl, 1 μl enzymu AgeI a 1 μl enzymu KpnI. Směs byla promíchána a ponechána inkubovat 30 min při 37 C. Následně byly enzymy inaktivovány inkubací vzorků při 65 C po dobu 20 min. Vektor byl linearizován analogickým postupem: 3 μl roztoku plazmidu o c = 3 μg/μl byly smíchány s 2 μl NEB1 pufru (10 x koncentrovaný), 2 μl BSA o c = 1 μg/μl, 1 μl enzymu AgeI, 1 μl enzymu KpnI a 11 μl ddh 2 O. Následovala inkubace při 37 C po dobu 30 min. 4.1.5. Preparativní elektroforéza K 20 μl směsi linearizovaného plazmidu bylo přidáno 5 μl STOP pufru a takto připravený vzorek byl nanesen do jamky agarosového gelu (viz odstavec 4.1.2.). Elektroforéza byla 41

ponechána probíhat 45 min při 110 V. Výsledek byl detekován pod dlouhovlnnou UV lampou a část gelu obsahující linearizovaný plazmid byla vyříznuta a přenesena do 1,5 ml polypropylenové zkumavky. 4.1.6. Extrakce DNA z gelu a přečištění inzertů Extrakce DNA z gelu byla provedena pomocí soupravy JETQUICK Gel Extraction Spin Kit dle manuálu dodavatele. Ke vzorku vyříznutému z gelu bylo přidáno 300 μl roztoku L1 na kaţdých 100 mg gelu a následovala inkubace při 50 C po dobu 15 min, přičemţ byl vzorek kaţdé 3 min promíchán. Vzorek byl pipetován na kolonku vloţenou do mikrozkumavky a centrifugován při 13000 x g, 1 min. Kolonka byla promyta 500 μl roztoku L2, poté opět následovala centrifugace při 13000 x g, 1 min, která byla opakována ještě jednou pro odstranění všech zbytků roztoku L2. Plazmidová DNA byla eluována 50 μl ddh 2 O zahřáté na 65 C odstředěním při 13000 x g, 2 min. Inzerty byly přečištěny pomocí stejného kitu: ke 20 μl inzertu s odštěpenými konci bylo přidáno 500 μl roztoku L1 a směs byla promíchána, další postup byl analogický jako u přečišťování DNA vyříznuté z gelu. 4.1.7. Ligace inzertů do vektoru phlsec/phlsec-fchis Ligační směs byla vytvořena smícháním 8 μl ddh 2 O, 2 μl pufru pro T4 DNA ligasu (10 x koncentrovaný), 1 μl T4 DNA ligasy, 4 μl linearizovaného plazmidu a 6 μl inzertu. Ligace byla ponechána probíhat 30 min při laboratorní teplotě. 4.1.8. Transformace kompetentních buněk Escherichia coli tepelným šokem Kompetentní buňky E. coli kmen DH5α uchovávané při -80 C byly ponechány roztát na ledu. Kaţdá ligační směs byla přidána vţdy k 80 μl těchto buněk. Následovala 30 min inkubace na ledu. Poté byla směs ponořena na 1 min do vodní lázně o teplotě 42 C a ihned umístěna zpět na led. Dále byl přidán 1 ml sterilního LB média a směs byla inkubována 1 hod při 37 C. Následně byla směs odstředěna při 1500 x g, 5 min a většina supernatantu byla odstraněna. Ve zbývajících cca 100 μl supernatantu byly pelety resuspendovány a 42

naneseny na Petriho misku obsahující LB agar, do kterého byl přidán ampicilin. Bakterie byly inkubovány 16 hod při 37 C. Misky s vyrostlými koloniemi byly uchovávány v chladničce při 4 C. 4.1.9. Selekce klonů Od kaţdého konstruktu byly vybrány čtyři kolonie. Kaţdá z nich byla resuspendována v 50 μl ddh 2 O. 10 μl této suspenze bylo pouţito na zaočkování 5 ml LB média s ampicilinem, které bylo ponecháno třepat rychlostí 220 ot./min po dobu 14 hod při 37 C. 4.1.9.1. PCR z kolonií ( colony PCRˮ) Zbývajících 40 μl bakteriální suspenze bylo 5 min povařeno a centrifugováno při 22000 x g, 5 min. K 10 μl supernatantu bylo přidáno 31 μl ddh 2 O, 5 μl PCR pufru (10 x koncentrovaný), 1,5 μl 10 mm dntp, 1,5 μl 100 mm MgSO 4, 0,25 μl 0,1 mm přímého primeru phlsec_fw, 0,25 μl 0,1 mm reverzního primeru phlsec_rev a 0,5 μl Deep Vent DNA polymerasy. V termocykleru byla provedena PCR (protokol viz 4.1.1., teplota nasedání primerů změněna na 50 C, jinak analogický postup). PCR produkty byly detekovány pomocí agarosové elektroforézy, vzorek byl připraven smícháním 20 μl PCR produktu a 4 μl STOP pufru. 4.1.9.2. Izolace plazmidové DNA ( Easy Prepˮ) Bakteriální kultury byly uloţeny v chladničce při 4 C. Byl odebrán 1 ml kultury a odstředěn při 12000 x g, 5 min. K peletám bylo přidáno 30 μl EP pufru (z angl. easy prep), ve kterém byly pipetou resuspendovány. Suspenze byly ponechány inkubovat 10 min na ledu, 5 min povařeny a poté odstředěny při 22000 x g, 10 min. K 5 μl supernatantu bylo přidáno 10 μl ddh 2 O, 2 μl NEB1 pufru (10 x koncentrovaný), 2 μl BSA o c = 1 μg/μl, 1 μl enzymu AgeI a 1 μl enzymu KpnI. Roztoky byly ponechány inkubovat 30 min při laboratorní teplotě, poté k nim byly přidány 3 μl STOP pufru. Vzorky byly analyzovány pomocí agarosové elektroforézy (viz 4.1.2.). Byly vybrány buněčné klony s plazmidy obsahujícími inzert. 43

4.1.10. Izolace plazmidové DNA pomocí kitu Vybrané bakteriální kultury byly odstředěny při 13000 x g, 2 min. Z pelety byla izolována DNA pomocí komerčně dodávané soupravy JETQUICK Plasmid Purification Spin Kit. Peleta byla resuspendována v 250 μl roztoku G1, k suspenzi bylo přidáno 250 μl roztoku G2, směs byla opatrně promíchána a ponechána inkubovat 5 min při laboratorní teplotě. Následně bylo přidáno 350 μl roztoku G3, směs byla opět opatrně promíchána a odstředěna při 13000 x g, 10 min. Supernatant byl převeden do kolonky vloţené do mikrozkumavky a odstředěn při 13000 x g, 1 min. Na kolonku bylo aplikováno 500 μl roztoku GX, roztok byl odstředěn při 13000 x g, 1 min. Poté bylo na kolonku pipetováno 500 μl roztoku G4 a odstředěno při 13000 x g, 1 min a ještě jednou odstředěno pro odstranění všech zbytků roztoku G4. Na závěr byly plazmidy z kolonek vymyty 75 μl ddh 2 O zahřáté na 65 C, odstředěny při 13000 x g, 2 min. Roztoky byly uchovávány při - 20 C. 4.1.11. Orientační stanovení koncentrace plazmidů pomocí agarosové elektroforézy Přibliţná koncentrace plazmidů byla stanovena pomocí agarosové elektroforézy. Ke 2 μl roztoku plazmidu bylo přidáno 14 μl ddh 2 O, 2 μl BSA o c = 1 μg/μl (10 x koncentrované), 2 μl NEB1 pufru (10 x koncentrovaný) a 0,5 μl enzymu KpnI. Směs byla ponechána inkubovat po dobu 30 min při 37 C. Následně byly přidány 4 μl STOP pufru a vzorky byly analyzovány pomocí elektroforézy na 1% agarosovém gelu. Porovnáním se známým mnoţstvím DNA ve standardu byla poté orientačně stanovena koncentrace připravených plazmidů. 4.1.12. Sekvenování DNA Sekvenace získaných plazmidů byla provedena Dr. Jürgenem Felsbergem, CSc. na MBÚ AV ČR, v.v.i. pomocí automatického sekvenátoru ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Pro další práci byly vybrány plazmidy, u kterých nebyla nalezena ţádná chyba v aminokyselinové sekvenci. 44

4.1.13. Příprava zásobního množství plazmidu Pro přípravu zásobního mnoţství plazmidu byla nejprve provedena transformace bakterií kmene DH5α vybranými plazmidy (protokol viz 4.1.8.). Po 16 hod inkubace při 37 C bylo na kaţdou Petriho misku s narostlými bakteriálními koloniemi pipetováno 5 ml LB média, v němţ byly bakterie resuspendovány a následně převedeny do 0,5 l LB média s ampicilinem. Kultury byly ponechány třepat rychlostí 220 ot./min po dobu 12 hod při 37 C, poté byly aţ do dalšího zpracování uchovávány při 4 C. Následovalo odstředění kultur při 1700 x g, 20 min, 4 C. Pelety byly resuspendovány v 20 ml TES pufru a centrifugovány při 13000 x g, 20 min, 4 C. Pro izolaci plazmidové DNA bylo vyuţito komerčně dodávané soupravy NoEndo JETSTAR 2.0 Plasmid Maxiprep Kit od firmy Genomed. Bylo postupováno dle návodu výrobce. Kaţdá peleta byla resuspendována v 10 ml roztoku E1 (obsahujícího RNasu o koncentraci 100 μg/ml). Dále bylo přidáno 10 ml rozoku E2, směs byla důkladně promíchána a ponechána inkubovat 5 min za laboratorní teploty. Následně bylo přidáno 10 ml roztoku E3, směs byla opět důkladně promíchána a poté centrifugována při 20000 x g, 10 min. Mezitím byla ekvilibrována kolona 30 ml roztoku E4. Supernatant získaný při centrifugaci byl smíchán s 1/10 objemu roztoku ENDO-1, směs byla důkladně promíchána a aplikována na ekvilibrovanou kolonu. Následovalo promytí nejdříve 30 ml roztoku ENDO-2, poté 30 ml roztoku E5 a nakonec eluce 15 ml roztoku E6. DNA byla z eluátu precipitována pomocí 0,7 násobku objemu isopropanolu, směs byla inkubována 30 min při -20 C a odstředěna při 20000 x g, 30 min, 4 C. Peleta byla opláchnuta 5 ml 70% ethanolu a znovu odstředěna při 20000 x g, 10 min, 4 C. Supernatant byl odstraněn, peleta dosušena na rotační vakuové odparce a následně rozpuštěna v 1 ml ddh 2 O. 4.1.14. Stanovení koncentrace DNA Koncentrace a čistota DNA byly stanoveny spektrofotometricky, roztok byl 300 x naředěn ddh 2 O. Byla změřena absorbance roztoků při vlnové délce 260 nm a 280 nm. Koncentrace DNA byla vypočítána z empirického vztahu, podle kterého má roztok dvouvláknové DNA o koncentraci 50 μg/ml absorbanci rovnou 1. Poměr A 260 /A 280 je u čisté DNA roven přibliţně 1,8. 45

4.2. Příprava proteinů 4.2.1. Kultivace HEK293T buněčné linie 4.2.1.1. Rozmražení a zamražení buněk Alikvot zmraţených buněk obsahující 1 ml buněčné suspenze o hustotě 5.10 6 ml -1 byl rozmraţen ve vodní lázni předehřáté na 37 C a ihned přenesen do 15 ml sterilní zkumavky s víčkem, v níţ bylo předem připraveno 10 ml ExCELL293 média, promíchán a centrifugován při 200 x g, 3 min. Supernatant byl odstraněn a buňky resuspendovány v 10 ml ExCELL293 média a přeneseny na 10 cm Petriho misku. Po 2-3 dnech kultivace při 37 C, 5% CO 2 následovala první pasáţ (viz 4.2.1.2.). Pro zamraţení buněk byla nejprve buněčná suspenze spočítána, následně centrifugována v 50 ml sterilních zkumavkách s víčkem při 200 x g, 3 min a resuspendována v takovém objemu mrazícího média, aby výsledná hustota byla 5.10 6 ml -1. Mrazící médium sestávalo z 45% objemu z pouţitého a 45% čerstvého ExCELL293 média a 10% DMSO. Suspenze byla rozdělena po 1 ml do kryozkumavek a umístěna v mrazícím kontejneru Mr. Frosty (kontrolovaný pokles teploty rychlostí -1 C za minutu) do -80 C, kde byly zmraţené buňky i nadále skladovány; pro dlouhodobé skladování byly přeneseny do -150 C. 4.2.1.2. Suspenzní kultivace Buňky byly rutinně kultivovány v inkubátoru při 37 C, 5% CO 2 v ExCELL293 médiu a pasáţovány ředěním čerstvým médiem tak, aby se jejich hustota pohybovala přibliţně mezi 0,2 a 2.10 6 ml -1 a to jak na Petriho miskách, tak ve čtverhranných láhvích na třepačce. Běţný postup vypadal následovně: 2-3 dny po rozmraţení buňky na 10 cm Petriho misce dosáhly hustotu kolem 2.10 6 ml -1, byly rozmíchány 10 ml pipetou pomocí pipetovacího nástavce a pasáţovány 1:3 na celkem 3 x 10 cm Petriho misky. Další 2-3 dny poté byly buňky stejným postupem převedeny do 100 ml média ve 250 ml čtverhranné láhvi s víčkem s prodyšným filtrem a třepány na orbitální třepačce (Orbit 1000, Labnet, USA) vybavené adhezívní podloţkou (Sticky Pad, New Brunswick Scientific, USA) rychlostí 135 ot./min (rotační průměr 19 mm) uvnitř inkubátoru, optimální objem média je za těchto podmínek 30-40% objemu láhve. O další 2-3 dny později byla suspenze přenesena do 1000 ml čtverhranné láhve a zředěna na 400 ml čerstvým médiem a jakmile buněčná hustota dosáhla poţadované hodnoty pro transfekci (1-2.10 6 ml -1 ), byla provedena 46

transfekce (viz 4.2.3.), nebo byla suspenze pasáţována dále. Pro produkci proteinů byly pouţity kultury mladší deseti pasáţí. 4.2.1.3. Počítání buněk Buňky byly počítány manuálně pomocí hemocytometru. Bylo odebráno 20 μl buněčné suspenze a v mikrozkumavce smícháno s 20 μl 0,4% roztoku trypanové modři v PBS-TK a po 5 min inkubaci bylo 20 μl směsi pipetováno do hemocytometru. Ţivé (průhledné) i mrtvé (modré) buňky byly spočítány ve všech devíti čtvercích zvlášť, průměrná hodnota pro jeden čtverec vynásobená faktorem 2.10 4 pak odpovídá buněčné hustotě v jednotkách 10 6 ml -1 ; procento ţivých buněk (viabilita) odpovídá podílu počtu ţivých buněk a součtu všech buněk vynásobeného stem (% ţivých buněk = 100 x [ţivé]/[ţivé + mrtvé]). 4.2.2. Expresní test 4.2.2.1. Transfekce v 24-jamkových destičkách Buňky rostoucí v zásobní kultuře byly nejprve spočítány a následně byl odebrán příslušný objem suspenze tak, aby byl získán dostatečný počet buněk pro transfekci. Odebrané buňky byly centrifugovány při 200 x g, 3 min a resuspendovány v 6 ml DMEM média bez FBS. Nově vzniklá buněčná suspenze o hustotě 2.10 6 ml -1 byla rozdělena do jamek po 0,2 ml. Pro kaţdou jamku byl připraven transfekční komplex podle následujícího postupu: 1) 1 μg plazmidové DNA (viz 4.1.10.) byl zředěn v 25 μl DMEM média bez FBS, směs byla promíchána. 2) 2 μl činidla Lipofectamin 2000 byly smíchány s 25 μl DMEM média bez FBS. 3) Roztok DNA a roztok Lipofectaminu byly smíchány a ponechány inkubovat 20 min za laboratorní teploty. 4) Ke směsi bylo přidáno 150 μl DMEM média bez séra. 200 μl takto připravených transfekčních směsí bylo přidáno do jamek na destičce k 200 μl buněčné suspenze. Obsah jamek byl promíchán jemným zatřesením celou destičkou. Buňky byly inkubovány 4 h a poté bylo do kaţdé jamky přidáno 0,4 ml DMEM média se 4% FBS. Obsah jamek byl opět jemně promíchán. Následovala inkubace po dobu 72 h. 47

4.2.2.2. SDS elektroforéza 84 15% separační gel byl připraven pipetováním 1,8 ml ddh 2 O, 4 ml 30% AA, 2 ml 1,5 M Tris o ph = 8,8, 80 μl 10% SDS, 80 μl 10% APS a 4 μl TEMED. Později byl místo 15% gelu pouţíván 12,5% gel, který se připravoval smícháním 2,5 ml ddh 2 O, 3,3 ml 30% AA, 2 ml 1,5 M Tris o ph = 8,8, 80 μl 10% SDS, 80 μl 10% APS a 4 μl TEMED. Zaostřovací gel byl připraven pipetováním 1,4 ml ddh 2 O, 0,5 ml 30% AA, 0,25 ml 1 M roztoku Tris o ph = 6,8, 20 μl 10% SDS, 20 μl 10% APS a 3 μl TEMED. Mnoţství jsou uvedena vţdy pro 2 gely. Vzorky pro SDS elektroforézu byly připraveny následovně: médium z kaţdé jamky bylo odebráno do polypropylenové mikrozkumavky tak, aby nedošlo k narušení vrstvy adherovaných buněk, a odstředěno při 20000 x g, 5 min. Redukující vzorek byl připraven smícháním 20 μl supernatantu s 20 μl 2 x koncentrovaného redukujícího vzorkového pufru, neredukující vzorek smícháním 20 μl supernatantu s 20 μl 2 x koncentrovaného neredukujícího vzorkového pufru. Buňky adherované na destičku byly resuspendovány ve 100 μl ddh 2 O a přeneseny do čisté mikrozkumavky, bylo k nim přidáno 100 μl 2 x koncentrovaného redukujícího vzorkového pufru a směs byla promíchána. Následně byly vzorky 5 min povařeny a odstředěny při 22000 x g, 5 min za laboratorní teploty. 15 μl takto připravených vzorků se nanášelo na gel společně s 5 μg standardu. Elektroforéza byla ponechána probíhat při napětí 200 V po dobu 50 min. V případě, ţe po skončení elektroforézy nenásleduje elektropřenos proteinů na membránu, jsou gely barveny 10 min v barvicí lázni a následně odbarveny v odbarvovací lázni do úplného odbarvení pozadí gelu. V tomto případě se gely nebarvily, postup pokračoval elektropřenosem. 4.2.2.3. Elektropřenos proteinu na membránu Gel z SDS-PAGE po jejím ukončení a nitrocelulosová membrána byly na 10 min ponořeny do pufru pro elektropřenos. Na jednu stranu aparatury pro elektropřenos bylo vloţeno 6 filtračních papírů navlhčených pufrem pro elektropřenos, poté membrána, gel a opět vrstva vlhčených filtračních papírů; vše bylo přikryto vrchní částí aparatury pro elektropřenos, která byla následně upevněna, a byly zapojeny elektrody (v orientaci gel ke katodě). Elektropřenos probíhal při 50 ma na jednu nitrocelulosovou membránu po dobu 48

75 min. Membrána byla barvena 2 min roztokem barviva Ponceau Red a odbarvována destilovanou vodou do odbarvení. 4.2.2.4. Imunodetekce Celý postup probíhal za laboratorní teploty. Membrána byla oplachována dvakrát po dobu 10 min v TBS. Poté byla inkubována 1 hod v blokovacím pufru (3% BSA v TBS), oplachována dvakrát po dobu 10 min v TBS-Tween/Triton a jedenkrát po dobu 10 min v TBS. Následovala inkubace membrány v roztoku 3% BSA v TBS s primární protilátkou (Penta-His mab v ředění 1:1000) a dva 10 min oplachy v TBS-Tween/Triton a jeden 10 min oplach v TBS. Poté byla membrána inkubována v 10% roztoku odtučněného sušeného mléka v TBS se sekundární protilátkou (Goat polyclonal to Mouse IgG Ab konjugovaná s HRP v ředění 1:2000) a oplachována TBS-Tween/Triton čtyřikrát vţdy po dobu 10 min. Poté byla provedena chemiluminiscenční detekce v temné komoře. Kaţdá membrána byla vţdy umístěna na tvrdou podkladovou destičku, 3 ml roztoku ECL1 byly bezprostředně před detekcí smíchány s 3 ml roztoku ECL2. Tato směs byla promíchána a poté jí byla přelita membrána na podkladové destičce. Po minutové inkubaci byl roztok slit, membrána osušena a i s podloţkou byla obalena do potravinové fólie, aby bylo zabráněno navlhčení fotografického filmu. Destička s membránou byla vloţena do fotografické kazety, překryta fotografickým filmem, kazeta byla uzavřena a byla provedena nejprve krátká expozice (0,5 1 min), poté jedna delší (5-7 min) a v některých případech ještě 30 minutová expozice. Fotografický film byl vţdy po ukončení expozice inkubován ve vývojce (dokud se neobjevily prouţky a nedosáhly poţadované výraznosti, 2-5 min) a poté v ustalovači (cca 10 min). Nakonec byl film opláchnut pod tekoucí vodou a ponechán vyschnout. 4.2.3. Velkoobjemová produkce proteinu 4.2.3.1. Transfekce v čtyřhranných lahvích Uvedený postup je při dodrţení vzájemných poměrů objemu láhve, objemu média, buněčné hustoty, mnoţství plazmidové DNA a PEI pouţitelný pro různé výsledné objemy produkce, jako příklad je zde uvedena produkce ve 400 ml média v 1000 ml láhvi, která byla prováděna nejčastěji. Buňky rostoucí ve 400 ml ExCELL293 média v 1000 ml čtverhranné láhvi s prodyšným víčkem na třepačcce (viz. 4.2.1.2.) byly spočítány a poté 49

byl odebrán takový objem suspenze, aby v kaţdých 100 ml výsledného produkčního objemu bylo 10 8 buněk. Buňky byly postupně centrifugovány ve 4 x 50 ml zkumavkách při 200 x g, 3 min. Buněčný pelet byl resuspendován v takovém mnoţství čerstvého DMEM média bez vápníku, aby výsledná buněčná suspenze měla hustotu 2.10 6 ml -1 (při produkci ve 400 ml média ve 200 ml DMEM média bez vápníku). Transfekční směs byla připravena smícháním plazmidové DNA s polyethyleniminem (25 kda lineární PEI, zásobní roztok o c = 1 mg/ml) v hmotnostním poměru 1:4, přičemţ mnoţství pouţité DNA se odvíjelo od počtu transfekovaných buněk 1 μg DNA na 10 6 buněk. V případě produkce ve 400 ml média bylo 400 μg DNA zředěno do 10 ml PBS-TK pufru, promícháno a sterilizováno filtrací přes 0,22 μm filtr injekční stříkačkou do čisté zkumavky. Poté bylo přidáno 1,6 ml zásobního roztoku PEI, směs byla intenzivně protřepána, inkubována 30 min a poté přidána k připravené buněčné suspenzi, která byla následně inkubována 4 hod na třepačce v inkubátoru. Poté byla suspenze zředěna na hustotu 1.10 6 ml -1 přidáním stejného objemu ExCELL293 média (v případě produkce ve 400 ml bylo přidáno 200 ml ExCELL293 média). Produkce probíhala následujících 4-6 dní, jako vodítko pro ukončení produkce byla sledována viabilita buněk, pokud klesla pod 70% ţivých buněk v suspenzi, produkce byla ukončena. 4.2.3.2. Sklizení produkčního média Médium bylo centrifugováno při 13000 x g, 30 min, 4 C. K supernatantu byl přidán azid sodný do výsledné koncentrace 10 mm. Médium bylo zmraţeno a uchováváno při -20 C nebo ihned dále zpracováno. 4.3. Purifikace proteinů 4.3.1. Chelatační chromatografie Pro chelatační chromatografii byl pouţit kobaltnatými ionty nabitý nosič (TALON Metal Affinity Resin, Clontech, USA), který byl předem promyt destilovanou vodou a poté PBS. Médium z produkce bylo zfiltrováno přes filtrační papír, byl přidán PBS v poměru 1:1 a byla zkontrolována (a popř. upravena) hodnota ph na 7,0. Do této směsi byl přidán nosič a suspenze byla třepána v 2 l Erlenmeyerových láhvích při 110 ot./min 45 min za laboratorní teploty. Suspenze byla aplikována na kolonu s fritou (kolona Econo, Bio-Rad, Německo), 50

po zachycení veškerého nosiče byla následně promyta PBS. Eluce byla provedena 4 x 5 ml PBS s 250 mm imidazolem. 4.3.2. Zkoncentrování proteinů Frakce byly spojeny a zkoncentrovány pomocí koncentrátorů Amicon Ultra, s membránou propustnou pro molekuly o M r < 10000, v centrifuze při 3000 x g a 20 C na objem 200 μl. Nové koncentrátory byly před prvním pouţitím promyty vodou, mezi pouţitím byly naplněny vodou, aby membrána nevysychala. 4.3.3. Gelová chromatografie HPLC systém byl promyt destilovanou vodou a při průtoku 0,5 ml/min byla připojena kolona Superdex 200 10/300 GL, která byla promyta destilovanou vodou, 1 M NaOH, opět destilovanou vodou a pufrem pro gelovou chromatografii. Vzorek připravený zakoncentrováním frakcí z chelatační chromatografie byl aplikován na ekvilibrovanou kolonu. Jímané frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE (viz 4.2.2.2.), frakce o dostatečné čistotě s obsahem stejného produktu byly smíchány. Kolona i systém byly po promytí uchovávány ve 20 % čistém ethanolu. 4.3.4. Stanovení koncentrace proteinů 85 Koncentrace přečištěného proteinu byla orientačně stanovena metodou dle Bradfordové. Stanovení bylo provedeno na 96 jamkové destičce, k 5 μl roztoku proteinu bylo vţdy přidáno 200 μl činidla dle Bradfordové a směs byla ponechána inkubovat 5 min za laboratorní teploty. Pomocí roztoků BSA v rozmezí koncentrací 0-1 mg/ml byla sestrojena kalibrační řada, stanovení přibliţné koncentrace proteinu bylo provedeno vizuálně porovnáním s kalibrační řadou. 4.3.5. Chromatografie na reverzní fázi HPLC systém byl promyt destilovanou vodou a při průtoku 1 ml/min byla připojena polymerní kolona PLRP-S 300 Å pro chromatografii na obrácené fázi, která byla promyta vodou, 1 M NaOH, 1 M kyselinou octovou, destilovanou vodou, mobilní fází B pro RP- 51

HPLC a mobilní fází A pro RP-HPLC. Následovalo provedení několika prázdných gradientů (0-100 % B za 10 min), aby z kolony byly vymyty všechny nečistoty. Následně byla kolona ekvilibrována v mobilní fázi A a byl na ní aplikován vzorek. Eluce byla provedena za pouţití následující metody: 1 min při 0% B, za 5 min do 30% B, za 15 min do 40% B, za 5 min do 50% B, za 5 min do 100% B. Následně byla kolona promyta několika prázdnými gradienty a nakonec promývána mobilní fází B, ve které také byla zakonzervována, a systém byl promyt 20% čistým ethanolem. Z jímaných frakcí byl odpařen ve vakuové odparce acetonitril a následovala analýza pomocí SDS elektroforézy, která ukázala, které frakce obsahují protein. Tyto frakce byly smíchány a zkoncentrovány. 4.4. Příprava 3C proteasy a odštěpení Fc fragmentu 4.4.1. Příprava zásobního množství 3C proteasy Byla provedena transformace kompetentních buněk E. coli kmene BL21 GOLD pomocí 100 μl plazmidu pro fúzní protein MBP-3C proteasa, postupovalo se podle odstavce 4.1.8., pouţity byly misky s LB agarem s přidaným ampicilinem. Po 16 hod inkubace při 37 C bylo na kaţdou Petriho misku s narostlými bakteriálními koloniemi pipetováno 5 ml LB média, v němţ byly bakterie resuspendovány a následně převedeny do 0,5 l LB média s ampicilinem a tetracyklinem. Kultury byly ponechány třepat rychlostí 220 ot./min při 37 C do optické density (A 550 ) 0,85. Následně bylo přidáno 0,25 ml induktoru IPTG (do výsledné koncentrace 0,5 mm). Produkce probíhala za třepání při 220 ot./min, 15 C po dobu 15 hod. Poté bylo médium odstředěno při 3000 x g, 20 min, 4 C. Peleta byla resuspendována v PBS pufru a odstředěna při 13000 x g, 20 min, 4 C. Supernatant byl odstraněn a peleta zmraţena a uchovávána při -80 C. Pro purifikaci byla peleta rozmraţena a resuspendována v 25 ml PBS pufru s přidaným β- merkaptoethanolem (výsledná koncentrace 5 mm) pomocí vortexového mixéru. Následně byla provedena homogenizace ultrazvukovou sondou 5 x 30 s vţdy s 30 s přestávkou na ledu. Poté byla směs odstředěna při 13000 x g, 1 hod, 4 C. Supernatant byl zfiltrován přes 0,22 μm filtr. Následovala chelatační chromatografie na koloně ekvilibrované v PBS provedena byla předeluce pomocí PBS s 20 mm imidazolem, poté eluce pomocí PBS s 250 mm imidazolem. Frakce byly zkoncentrovány na výsledný objem 350 μl a aplikovány 52

na kolonu Superdex 200 10/300 GL ekvilibrovanou v pufru pro gelovou chromatografii. Jednotlivé frakce byly poté analyzovány pomocí SDS elektroforézy. Frakce s obsahem 3C proteasy byly poté spojeny a zkoncentrovány do výsledné koncentrace 2 mg/ml. Tento roztok byl zředěn glycerolem na výslednou koncentraci 1 mg/ml (50% glycerol) a uchováván při -20 C. 4.4.2. Odštěpování Fc fragmentu 3C proteasou 3C proteasa byla pouţita na odštěpování Fc fragmentu z fúzních proteinů. Nejdříve byla provedena optimalizace štěpení touto proteasou. 3C proteasa byla k proteinu W1-FcHis přidána v různých poměrech (1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100), štěpení probíhalo 20 hod při 4 C. Dále byla 3C proteasa smíchána s proteinem C1-FcHis v poměru 1:5 a štěpení bylo ponecháno probíhat při teplotách 4 C, 37 C a za laboratorní teploty vţdy 3 a 20 hod. Následně bylo 5 μg všech studovaných proteinů smícháno s 1 μl zásobního roztoku 3C proteasy, štěpení probíhalo 20 hod a vzorky byly následně analyzovány SDS elektroforézou. Poté bylo C1-FcHis pomocí 3C proteasy naštěpeno v zásobním mnoţství za pouţití poměru 1:5. 4.5. Identifikace proteinů 4.5.1. Metoda peptidového mapování 86 Analýza hmotnostním spektrometrem MALDI-TOF (BIFLEX II, Bruker, Německo) i příprava vzorku pro toto měření byla provedena Mgr. Danielem Kavanem na MBÚ AV ČR. Vybraný prouţek proteinu byl z polyakrylamidového gelu vyříznut a nakrájen na malé kostičky. Kousky gelu byly odbarveny a poté k nim byl přidán roztok trypsinu. Následně byly peptidy extrahovány acetonitrilem a vzorek byl smíchán s matricí, nanesen na terčík a ponechán vykrystalizovat. Naměřené hodnoty m/z získaných peptidů byly vloţeny do databáze Mascot a porovnány s peptidy známých proteinů. 4.5.2. Proteinové sekvenování 87 Stanovení deseti koncových aminokyselin od N-konce proteinu bylo prováděno na automatickém sekvenátoru Procise 491. Vzorky proteinů byly přečištěny a odsoleny 53

chromatografií na obrácené fázi, zkoncentrovány odpařením ve vakuu a pro analýzu bylo pouţito vţdy přibliţně 100 pg daného proteinu. Toto mnoţství bylo zředěno do 15 μl ddh 2 O a naneseno na precyklovaný terčík a vloţeno do sekvenátoru. Analýzu provedl p. Jiří Janovský, PřF UK Praha. 4.6. Charakterizace proteinů 4.6.1. Mapování disulfidických můstků Analýza vzorků byla proveda hmotnostním spektrometrem MALDI-TOF/TOF (ULTRAFLEX III, Bruker, Německo). Měření zahrnuje, stručně shrnuto, následující kroky. Příslušný prouţek proteinu byl z polyakrylamidového gelu vyříznut a nakrájen na malé kostičky. Po odbarvení byl přidán roztok trypsinu, popř. Asp-N endoproteasy, po inkubaci byly peptidy extrahovány a následně byl vzorek smíchán s matricí, nanesen na terčík a ponechán vykrystalizovat. Naměřené hodnoty m/z získaných peptidů byly porovnány s teoretickými tryptickými, popř. Asp-N peptidovými štěpy vytvořenými programem GPMAW. Dále pro určení cystinových peptidů byl vyuţit speciální program Linksˮ volně přístupný na stránkách http://www.ms3d.org/. Analýzu vzorků a vyhodnocení získaných výsledků provedl Mgr. Petr Pompach, Ph.D. 4.6.2. Analytická ultracentrifugace 4.6.2.1. Metoda sedimentační rovnováhy Měření bylo provedeno na analytické ultracentrifuze Proteomelab XL-I. Pro měření C1 byl pouţit roztok proteinu v pufru pro gelovou chromatografii o koncentraci 0,1 mg/ml. Do šestikomorové cely bylo pipetováno 110 μl proteinu a 130 μl pufru-reference (rotor An-50Ti, Beckman Coulter, USA). Měření probíhalo při 12-15-18-21-24000 ot./min, 4 C, 1. snímek poprvé po 34 hod, další po 18 hod, sedimentace vzorku byla sledována pomocí absorbanční optiky při 280 nm. Pro měření C1-FcHis, S1-FcHis a jejich směsi byly pouţity roztoky o koncentraci 1 mg/ml v jinak stejném provedení při rychlostech 6-7-8-9- 10-11-12000 ot./min, 20 C, 300 nm, 1. snímek po 24 hod, 2.-4. snímek po 20 hod, 5.-7. snímek po 19 hod. Data byla vyhodnocena pomocí programů Sedfit a Sedphat, přičemţ hustota pufru a parciální specifické objemy proteinů byly predikovány ze znalosti sloţení pufru, resp. aminokyselinových sekvencí proteinů v programu SEDNTERP. Měření a jeho vyhodnocení provedl Mgr. Ondřej Vaněk. 54

4.6.2.2. Metoda sedimentační rychlosti Při této metodě byla vyuţita dvoukomorová cela. Do jednoho sektoru bylo pipetováno 400 μl roztoku proteinu, do druhého sektoru 400 μl pufru-reference. Měření probíhalo se stejnými vzorky proteinů o stejných koncentracích jako v metodě sedimentační rovnováhy (viz. 4.6.2.1.), v případě C1 při rychlosti 45000 ot./min, 280 nm, v případě proteinů s Fc fragmentem při 36000 ot./min, 300 nm, v obou případech při 20 C a bylo sbíráno 60 snímků po 5 min. Měření a jeho vyhodnocení (viz 4.6.2.1.) provedl Mgr. Ondřej Vaněk. 4.6.3. Měření Ramanova rozptylu Příprava vzorků pro DCDR měření zahrnovala chromatografii na reverzní fázi a následnou gelovou chromatografii, kterou byly proteiny převedeny do pufru bez NaN 3 (10 mm Tris, 150 mm NaCl). Dále byly 2 μl roztoku kaţdého proteinu (koncentrace 0,3 1 mg/ml) napipetovány na nitrocelulosovou membránu pro mikrodialýzu (0,025 μm, Millipore, USA) a dialyzovány proti ddh 2 O po dobu 30 min za laboratorní teploty. Následně byl předialyzovaný roztok proteinu přenesen na standardní DCDR destičku SpectRIM (Tienta Sciences, USA) a byl ponechán vyschnout za laboratorní teploty (cca 20 min). Na destičku byl dále napipetován 1 μl roztoku proteinu v původním pufru 88. Ramanova spektra byla měřena z krouţků získaných vyschnutím kapek roztoků jednotlivých proteinů pomocí Ramanova mikrospektometru LabRAM HR800 (Horiba Jobin Yvon, USA) za pouţití laserového svazku o vlnové délce 632,82 nm a výkonu 20 mw, který byl fokusován do průměru přibliţně 2 μm na krouţek vzorku za pouţití objektivů mikroskopu se zvětšením 50x a 100x. Svazek byl rozloţen na mříţce s 600 vrypy/mm a snímán CDD detektorem chlazeným kapalným dusíkem (1024 x 256 pixelů). Rozlišení spekter bylo přibliţně 4 cm -1. Měření a vyhodnocení DCDR spekter provedli RNDr. Kateřina Hofbauerová, Ph.D. a RNDr. Vladimír Kopecký, Ph.D. z Fyzikálního ústavu MFF UK. 55

5. VÝSLEDKY 5.1. Konstrukty v plazmidu phlsec 5.1.1. Příprava expresních vektorů Pro kaţdý protein, který je součástí této studie, byl nejprve navrţen jeden konstrukt. Navrhování konstruktů vycházelo především ze znalostí o rozloţení jednotlivých domén a konzervovaných cysteinových párů (viz Obr. 5.1, který zároveň ukazuje srovnání primární struktury rclr-b a RCTL, a Obr. 5.2 na str. 57, který ukazuje srovnání aminokyselinové sekvence rnkrp1b WAG a rnkrp1b SD ). Intracelulární doména Transm.d. rclr-b MSAKKASQPMLNTTGSLQEGEMGKMFHGKCLRIVSPESPAKLYCCYGVIMVLSVAVVALS 60 RCTL ------------------------MAHEDYIRFASVDSNTKLYCCYVVIFLLTVVIITLS 36 Extracelulární doména rclr-b VALSVKMTPQISTINTYAACPRNWIGVGNKCFYFSEYASNWTFSQTFCKAQEAELARFDT 120 RCTL TILSAQRSIDPPIVHNYAICPKDWIGLTDTCYYFSNSTTNWTFAQTLCKGNNSNLAHFNT 96 rclr-b EEELNFLSRYKGSFDYWIGLHRESSEHPWKWTDNTQYNYSLSIRGVERYAYLNDIGISSA 180 RCTL EEQYNFLSRYKGNFDYWIGIHRESSEHPWKWADNTTYNYSLSIRGVEKYAYLNDLGISSA 156 rclr-b RVYADKRWSCSRLNSYSLQCKTPFSPM 207 RCTL RVYADKRWSCSKS-TDSLRCQLCST 180 Obr. 5.1: Srovnání aminokyselinové sekvence rclr-b a RCTL. Šipkami jsou vyznačeny jednotlivé domény, modře konstrukt C1 (Val 65 Met 207 ), hnědě konstrukt R3 (His 51 Thr 170 ), červeně sekvence, kterou má R2 (His 51 Thr 180 ) navíc oproti R3, zeleně sekvence, kterou má R1 (Ile 38 Thr 180 ) navíc oproti R2 a R3. Ţlutě jsou označeny cysteiny tvořící disulfidické můstky, šedivě potenciální místa N-glykosylace. U rclr-b se jednalo o konstrukt C1, kódující sekvenci tohoto proteinu od Val 65 k Met 207 (viz Obr. 5.1, vyznačeno modře). Pro virový protein RCTL byl navrţen velice podobně vymezený kostrukt R1 kódující sekvenci RCTL od Ile 38 po Thr 180 (na Obr. 5.1 je tato sekvence sloţená ze zelené, hnědé a červené části). U rnkrp1b WAG se jednalo o 56

konstrukt W1, který zahrnoval sekvenci tohoto proteinu od Val 78 po Ser 223 (modrá část sekvence na Obr. 5.2) a pro rnkrp1b SD byl navrţen analogický konstrukt S1 začínající také Val 78 a končící Ser 223 (hnědá a zelená část sekvence na Obr. 5.2). Později byly navrţeny další konstrukty pro RCTL a rnkrp1b SD. U RCTL se konkrétně se jednalo o konstrukt označený jako R2, zahrnující část sekvence mezi His 51 a Thr 180 (hnědá a červená část sekvence na Obr. 5.1 na předchozí stránce) a konstrukt R3 začínající His 51 a končící Thr 170 (hnědá část sekvence na Obr. 5.1 na předchozí stránce). Pro NKRP1B SD byl navrţen konstrukt S2, kódující sekvenci tohoto proteinu od Ser 88 po Lys 215 (zelená část sekvence, Obr. 5.2). Intracelulární doména Transm.d. rnkrp1b_s MDTAVVYADLHLARTGEPKREPPPSLSPDTCQCPRWHRLALKLGCACLILLVLSVIGLGV 60 rnkrp1b_w MDTAVVYADLHLARTGEPKHKSPPSLSPDTCQCPRWHRLALKLGCACLILLVLSVIGLGV 60 Extracelulární doména rnkrp1b_s LVLTLLQKPLIQNSPADVQENRTKTTDSPAKLKCPKDWHSHQDKCFHVSQTSITWKGSLA 120 rnkrp1b_w LVLTLLQKPLIQNSPADVQENRTKTTDSPTKLKCPKDWHSHQDKCFHVSQAPNTWNKSLA 120 rnkrp1b_s DCGGKGATLLLVQDQEELRFLRNLTKRISSSFWIGLSYTLSDEKWKWINGSTLNSDALNI 180 rnkrp1b_w DCGGKGATLLLIQDQEELRFLRNLTKGKDRSFWIGLNYTLPDKNWKWINSSTLNSDVLSI 180 rnkrp1b_s TGDTEKDSCASVSQDKVLSESCDSDNIWICQKELKRESTCNDS 223 rnkrp1b_w FGDTKQNSCASISQDKVLSESCDSDNLWICQKELKCECMCNGS 223 Obr. 5.2: Srovnání aminokyselinové sekvence rnkrp1b WAG a rnkrp1b SD. Šipkami jsou vyznačeny jednotlivé domény, modře konstrukt W1 (Val 78 Ser 223 ), zeleně konstrukt S2 (Ser 88 Lys 215 ), hnědě sekvence, kterou má S1 (Val 78 Ser 223 ) navíc oproti S2. Ţlutě jsou označeny cysteiny tvořící disulfidické můstky, šedivě potenciální místa N-glykosylace. Prvním krokem při přípravě expresních vektorů byla PCR amplifikace zvolených DNA sekvencí. Jako templát pro polymerasovou řetězovou reakci byly pouţity cdna obsahující poţadované nukleotidové sekvence, které byly laskavě darovány Sebastianem 57

Voigtem 82. Pouţité dvojice primerů jsou uvedeny v kapitole 4.1.1., jejich sekvence v sekci 3.2.4. Připravené produkty byly analyzovány agarosovou elektroforézou. Velikost jednotlivých konstruktů se pohybuje od 360 bp (R3) do 438 bp (W1, S1), coţ bylo ověřeno porovnáním se standardem (PCR produkty R2, R3 a S2 jsou na Obr. 5.3). Získané PCR produkty byly vysráţeny ethanolem v kyselém prostředí. S 1 2 3 4 5 6 7 1000 bp 500 bp 400 bp 300 bp Obr. 5.3: Výsledek PCR na agarosovém gelu. V dráze 5 je PCR produkt R2, v dráze 6 R3, v dráze 7 konstrukt S2. V drahách 1-4 byly analyzovány nesouvisející vzorky. DNA fragmenty získané při PCR byly v dalším kroku vloţeny do produkčního vektoru phlsec. Plazmid byl laskavým darem od A. Radu Aricescu z Oxfordské univerzity 89. Vektor phlsec byl připraven modifikací jiného plazmidu, plexm (viz Obr. 5.5 na str. 59), a upraven tak, aby následná produkce proteinu probíhala sekrecí do média. Tento vektor poskytuje buňkám ampicilinovou rezistenci. Okolí klonovacího místa bylo upraveno zavedením několika nových znaků, viz Obr. 5.4. Jedná se o tzv. Kozakovu sekvenci, dále o sekreční signální sekvenci a C-terminální histidinovou kotvu. Konstrukty mohou být do tohoto vektoru vloţeny pomocí dvojice restrikčních enzymů AgeI a KpnI. EcoRIHindIII Kozak M G I L P S P G M P A L L S GAATTCAAGCTTGCCACCATGGGGATCCTTCCCAGCCCTGGGATGCCTGCGCTGCTCTCC L V S L L S V L L M G C V A E T G CTCGTGAGCCTTCTCTCCGTGCTGCTGATGGGTTGCGTAGCTGAAACCGGT...inzert G T K H H H H H H * * XhoI...GGTACCAAGCACCACCATCACCATCACTAATGATCACTCGAG Obr. 5.4: Okolí klonovacího místa v plazmidu phlsec. Zeleně je označena Kozakova sekvence, akvamarinově sekreční signální sekvence, červeně C-terminální histidinová kotva. Růţově je vyznačeno štepné místo pro enzym AgeI, fialově štěpné místo pro enzym KpnI. 58

Obr. 5.5: Mapa vektoru plexm. 89 Pomocí výše uvedené dvojice enzymů byl jednak linearizován vektor phlsec, jednak s nimi byly upraveny konce inzertů, čímţ byly získány kompatibilní konce pro ligaci. Linearizovaný phlsec byl přečištěn pomocí agarosové gelové elektroforézy, výsledek viz Obr. 5.6, a po extrakci plazmidu z gelu a přečištění upravených inzertů byla připravena ligační směs s T4 DNA ligasou. 1 2 3 4 5 6 S 10,0 kb 3,0 kb 2,0 kb 1,0 kb 0,5 kb Obr. 5.6: Linearizovaný phlsec. Vektor byl štěpen pomocí enzymů AgeI a KpnI. V dráze 1 je neštěpený phlsec, v dráze 2 linearizovaný plazmid (původní inzert byl vyštěpen). Dráha S označuje standard. Ostatní dráhy obsahují nesouvisející vzorky. 59

Ligační směsí byly posléze transformovány bakterie E. coli (kmen DH5α). Transformace byla provedena metodou tepelného šoku, bakterie byly vysety na misky s LB agarem obsahujícím ampicilin. Na miskách vyrostlo několik aţ několik desítek kolonií, selekce byla provedena postupem uvedeným v odstavci 4.1.9. Na Obr. 5.7 je zobrazen výsledek restrikčního štěpení, které bylo prováděno pomocí dvojice enzymů AgeI a KpnI pro plazmidy obsahující R1, C1, W1 a S1. Pro další práci byly vybrány klony R1-1, C1-1, W1-2, S1-1. Na Obr. 5.8 je výsledek PCR z kolonií, na jejímţ základě byly pro další práci vybrány klony R2-2 a S2-2. Pro R3 byl později získán pozitivní klon R3-1 (obrázek neuveden). S 1 2 3 4 5 6 7 8 S 1 2 3 4 5 6 7 8 1000 bp 1000 bp 500 bp 400 bp 300 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp Obr. 5.7: Kontrolní restrikční štěpení. Štěpení probíhalo s enzymy AgeI a KpnI. V dráze S je standard. V drahách 1 a 2 se nachází klony R1-1 a -2, dráhy 3 a 4 obsahují C1-1 a -2, dráhy 5 a 6 W1-1 a -2, v drahách 7 a 8 se nachází S1-1 a -2. Obr. 5.8: PCR z kolonií. Dráha S představuje standard. V drahách 2, 3 a 4 je vzorek z PCR z kolonií pro R2-1, -2 a -3, v dráze 5 pro R3, v drahách 6, 7 a 8 pro S2-1, - 2 a -3. Dráha 1 obsahuje nesouvisející vzorek. Z vybraných klonů byla pomocí soupravy od firmy Genomed izolována plazmidová DNA, která byla předána Dr. Jürgenu Felsbergovi na sekvenaci. Nukleotidové sekvence získané sekvenací inzertů byly potom porovnávány se známými nukleotidovými sekvencemi studovaných genů publikovaných v databázi GenBank. Kromě případu S2-2 potvrdilo sekvenování správnost všech připravených inzertů. 60

Následně bylo připraveno zásobní mnoţství plazmidu dle kapitoly 4.1.13. Pro určení čistoty a mnoţství získané plazmidové DNA byla měřena absorbance při vlnové délce 260 nm a 280 nm, výsledky jsou shrnuty v Tab. 2. Tab. 2: Velkoobjemová příprava plazmidů phlsec_r1, phlsec_r2, phlsec_c1, phlsec_w1 a phlsec_s1. Naměřené hodnoty A 260, A 280, koncentrace zásobního roztoku plazmidu a jeho čistota vyjádřená poměrem A 260 /A 280. plazmid A 260 A 280 c [μg/μl] A 260 /A 280 phlsec_r1 0,286 0,157 4,3 1,82 phlsec_r2 0,198 0,120 3,0 1,65 phlsec_c1 0,240 0,131 3,6 1,83 phlsec_w1 0,243 0,134 3,65 1,81 phlsec_s1 0,223 0,122 3,35 1,83 5.1.2. Produkce proteinů To, zda jsou suspenzní HEK293T buňky schopné produkovat studované proteiny po transfekci připravenými plazmidy, ev. v jaké míře, bylo zjišťováno pomocí tzv. expresních testů. Z kultury narostlé do hustoty 2.10 6 ml -1 bylo odebráno 6 ml suspenze a centrifugováno. Buněčná peleta byla následně resuspendována v 6 ml DMEM média bez FBS a rozdělena po 0,2 ml do kaţdé ze 24 jamek na destičce. Následovala transfekce podle odstavce 4.2.2.1. Po třech dnech produkce byly odebrány vzorky z média a připraveny neredukující vzorky. Následovala SDS elektroforéza, elektropřenos proteinů na nitrocelulosovou membránu a imunodetekce podle odstavců 4.2.2.2.-4. pomocí primární protilátky rozpoznávající sekvenci histidinové kotvy a sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidasou umoţňující následnou chemiluminiscenční detekci. Výsledky tohoto postupu jsou ukázány na Obr. 5.9 na str. 62. Konstrukty C1, W1 a S1 se podle expresního testu produkují poměrně dobře, R2 je produkováno velmi slabě, R3 o něco silněji neţ R2, i kdyţ ne tak silně jako například C1. Konstrukt R1 není produkován vůbec. 61

Po transfekci v malém měřítku byla s proteiny, které byly podle expresního testu dobře produkovány, provedena velkoobjemová produkce. Nejlépe se osvědčilo na produkci pouţívat 400 ml suspenzní buněčné kultury o hustotě 1.10 6 ml -1 kultivované v 1000 ml čtyřhranné láhvi na orbitální třepačce. Pro transfekci byl potom pouţit poměr DNA:PEI 1:4 nebo 1:5, tzn. v případě transfekce 4.10 8 buněk bylo pouţito 0,4 mg DNA a 1,6-2 ml zásobního rozktoku PEI. Toto jsou výsledky optimalizace, na které také pracoval v rámci své bakalářské práce Jan Bláha. Produkce byly sklízeny zpravidla po 5 dnech. kda 66 44 29 24 14 A S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 kda 66 44 29 24 14 B Obr. 5.9: Expresní testy. Fotografie A byla pořízena 1 min expozicí, fotografie B 7 min expozicí. Na fotografii A v dráze 2 médium z produkce R1, ve dráze 3 z C1, ve dráze 4 z W1, v dráze 5 z S1. Na fotografii B jsou důleţité dráhy 5 a 6, v první z nich produkce R2, v druhé R3. Dráha 7 neobsahuje původně předpokládaný S2, ale jiný protein. Dráhy S označují standard. Ostatní dráhy obsahují nesouvisející vzorky. 5.1.3. Purifikace proteinů Při purifikaci proteinů byla pouţita metoda chelatační chromatografie, zaloţená na principu reverzibilní interakce histidinového postranního řetězce s Co 2+ ionty, imobilizovanými na agarosových kuličkách. Výhoda této metody spočívá v její relativně vysoké specifitě, díky které je moţno v jednom kroku odstranit většinu nečistot ze vzorku (proteiny se na nosič váţí prostřednictvím šesti histidinů své C-koncové histidinové kotvy). Ekvilibračním a promývacím pufrem byl PBS, pufrem pro eluci PBS s 250 mm imidazolem. Frakce získané touto purifikační metodou byly smíchány a zkoncetrovány, aby mohl být výsledný preparát aplikován na kolonu Superdex 200 10/300 GL ekvilibrovanou v pufru o sloţení 10 mm Tris (ph = 7,0), 150 mm NaCl, 10 mm NaN 3. Průběh chromatografie byl 62

monitorován měřením absorbance při 280 nm, příkladem je záznam z gelové chromatografie rclr-b (C1) na Obr. 5.10 (chromatogramy pro ostatní proteiny neuvedeny). ma280 450.00 400.00 350.00 300.00 250.00 200.00 150.00 100.00 50.00 0.00 V 0 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 V [ml] C1 Obr. 5.10: Záznam z gelové chromatografie proteinu rclr-b (konstrukt C1). C1 je protein rclr-b, V 0 mrtvý objem kolony. Pro některá stanovení, například hmotnostní spektrometrii při měření hmoty intaktního proteinu nebo proteinový sekvenátor, je nutné převést protein do pufru bez soli: v takových případech byly frakce z gelové chromatografie zkoncentrovány, orientačně byla zjištěna koncetrace proteinu podle Bradfordové a poţadované mnoţství proteinu bylo aplikováno na kolonu s reverzní fází. Tato chromatografická metoda umoţňuje rozdělovat molekuly na základě rozdílu síly jejich interakce s hydrofobní stacionární fází. Vzorek se nastřikuje na kolonu ekvilibrovanou v pufru A (0,1% TFA). Eluce probíhá pomocí pufru B (95% CH 3 CN, 5% A), v případě studovaných proteinů přibliţně při 35 % B (chromatogram pro C1 je na Obr. 5.11 na str. 64, chromatogramy pro ostatní proteiny nejsou uvedeny). Na Obr. 5.12 na str. 64 je pak srovnána čistota vzorku po gelové chromatografii a po chromatografii na reverzní fázi v redukujícím a neredukujícím prostředí pro C1. Pro C1 byly provedeny dvě produkce, z kaţdé byl získán asi 1 mg čistého proteinu. Pro ostatní proteiny byla provedena vţdy jedna produkce, u S1 se podařilo získat 0,25 mg proteinu, u R2 byla produkce pravděpodobně velmi nízká a tento protein se získat 63

%B nepodařilo. Při gelové chromatografii W1 vyšlo ve dvou elučních vrcholech, z nichţ první odpovídal pravděpodobně dimeru a druhý monomeru. Bylo získáno cca 0,22 mg W1 v monomerní formě a cca 0,35 mg W1 v dimerní formě. Dlouhodobě byly připravené proteiny skladovány v pufru pro gelovou chromatografii při 4 C a po ověření, ţe zmraţení proteinů nevede k jejich denaturaci (pomocí elektroforézy a gelové chromatografie po rozmraţení) byly uchovávány při -20 C. ma280 45.00 40.00 35.00 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00-5.00 ma 280 %B C1 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 V [ml] 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 Obr. 5.11: Záznam z chromatografie proteinu rclr-b (konstrukt C1) na reverzní fázi. C1 je protein rclr-b, modrá křivka vyznačuje absorbanci při 280 nm, červená křivka koncentrační gradient v procentech pufru B. kda 66 44 29 24 S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 14 Obr. 5.12: Analýza vzorků proteinu rclr-b (konstrukt C1) z gelové chromatografie a chromatografie na reverzní fázi. Ve dráze S je standard. Ve drahách 1 a 6 jsou vzorky z gelové chromatografie, ve drahách 2 a 7 vzorky z chromatografie na reverzní fázi, dráha 1 a 2 jsou redukující vzorky, dráhy 6 a 7 neredukující. V ostatních drahách jsou nesouvisející vzorky. 64

5.1.4. Identifikace proteinů Pro ověření identity proteinů byla vyuţita metoda peptidového mapování. Analýzu hmotnostním spektrometrem MALDI-TOF i přípravu vzorků pro toto měření provedl Mgr. Daniel Kavan. Bylo změřeno hmotnostní spektrum tryptických štěpů studovaných proteinů a porovnáním změřených hodnot m/z s velikostí teoretických peptidů daných proteinů byla potvrzena jejich identita. N-terminální sekvence byla ověřena pomocí proteinového sekvenátoru, u všech analyzovaných proteinů byla signální sekvence pro sekreci proteinů do média odštěpena a sekvence proteinů začínala v souladu s očekáváním aminokyselinami ETG, které pocházejí z klonovacího místa AgeI plazmidu phlsec, následovaly aminokyseliny jednotlivých konstruktů. Analýzu provedl p. Jiří Janovský. 5.1.5. Charakterizace proteinů Pro mapování disulfidických můstků byl do vzorků proteinů pro SDS elektroforézu přidán 0,2 mm cystamin, v této koncentraci byl rovněţ přidán do polymerační směsi při přípravě gelu a byl přítomen i při všech následujících krocích postupu (účelem je vytvořit mírně oxidativní prostředí a zabránit rozpojení disulfidických můstků). Gely byly poté předány Mgr. Petru Pompachovi, Ph.D., který je podrobil mapování disulfidů za pomoci hmotnostní spektrometrie. Bylo zjištěno, ţe protein C1 má všechny disulfidické můstky správně spojené (tzn. Cys 80 Cys 91, Cys 108 Cys 190, číslování dle sekvence celého rclr-b), a to včetně můstku tvořícího kovaletní dimer (tzn. Cys 200 Cys 200, identifikován dipeptid LNSYSLQCK). Navíc bylo zjištěno, ţe protein je glykosylován v místě Asn 100 a Asn 158. V případě proteinů S1 a W1 nebylo mnoţství proteinu na gelu, resp. kvalita získaných hmotnostně spektrometrických dat dostatečná, aby umoţnila jednoznačné přiřazení disulfidických můstků, avšak na základě porovnání s výsledky analýz jiných produkovaných proteinů z rodiny NKRP1 lze předpokládat, ţe i v tomto případě jsou disulfidické můstky správně spárovány (viz 6. Diskuze). 65

5.2. Konstrukty v plazmidu phlsec-fchis 5.2.1. Příprava expresního vektoru Protoţe u proteinů produkovaných pomocí plazmidu phlsec aţ na výjimku C1 nebylo moţno zjistit, zda jsou v jejich molekulách správně vytvořeny disulfidické můstky, a navíc minimálně část kaţdého z připravených proteinů existovala v roztoku ve formě monomeru, hledal se způsob, jak tento problém vyřešit. Jednou z moţností, které se nabízely, bylo vloţení inzertů kódujících studované proteiny do plazmidu phlsec-fchis, který byl získán od A. Radu Aricescu z Oxfordské univerzity 89. Jeho součástí je Fc fragment lidského IgGγ1, který má ve své molekule několik dimerizačních disulfidických můstků, které se při produkci v savčích buňkách bezproblémově a správně tvoří. Správná dimerizace Fc fragmentu by pak mohla podpořit i kovalentní dimerizaci fúzních proteinů - našich konstruktů; účelem je zde napodobení přirozeného stavu při produkci lektinových receptorů NK buňkou v celé své délce (a nikoli jen lektinové domény), kdy ty části řetězce receptorů, které nesou cysteiny zodpovědné za tvorbu intermolekulových disulfidických můstků, nejsou volné, ale strukturně či prostorově vázáné zbytkem řetězce molekuly, nachází se ve vzájemné blízkosti a můţe tedy dojít k jejich spojení a vzniku kovalentní vazby. Inzerty je do plazmidu phlsec-fchis moţno vkládat opět pomocí dvojice restrikčních endonukleas AgeI a KpnI, stejně jako u plazmidu phlsec. Narozdíl od phlsec však u druhého plazmidu za štěpným místem pro KpnI následuje sekvence kódující štěpné místo pro 3C proteasu, sekvence Fc fragmentu a poté teprve sekvence kódující C-terminální histidinovou kotvu (Obr. 5.13 na str. 67). Plazmidem phlsec-fchis byly transformovány bakterie E. coli kmene DH5α podle kapitoly 4.1.8. Koloniemi, které na misce narostly, bylo zaočkováno 10 ml LB média s ampicilinem, které bylo 16 hod třepáno při 37 C; následovala izolace plazmidové DNA podle odstavce 4.1.10. Získaný plazmid byl uchováván při -20 C. Pro kaţdý studovaný protein byl zvolen jeden konstrukt, který byl vloţen do plazmidu phlsec-fchis. Jednalo se o konstrukty R2, C1, W1 a S1 (sekvence inzertů viz Obr. 5.1 na str. 56 a Obr. 5.2 na str. 57). Amplifikace DNA sekvencí jednotlivých inzertů, jejich analýza a úprava konců pomocí restrikčních enzymů AgeI a KpnI, linearizace vektoru phlsec-fchis, ligace, transformace, selekce pozitivních klonů, izolace plazmidové DNA i sekvenace byly provedeny analogickým způsobem jako v případě klonování do vektoru 66

phlsec (viz kapitoly 4.1. a 5.1.1.). Jednotlivé plazmidy byly označeny jako phlsec- FcHis_R2, phlsec-fchis_c1, phlsec-fchis_w1 a phlsec-fchis_s1. EcoRIHindIII Kozak M G I L P S P G M P A L L S GAATTCAAGCTTGCCACCATGGGGATCCTTCCCAGCCCTGGGATGCCTGCGCTGCTCTCC AgeI L V S L L S V L L M G C V A E T G CTCGTGAGCCTTCTCTCCGTGCTGCTGATGGGTTGCGTAGCTGAAACCGGT......inzert... KpnI G T L E V L F Q G P K S C D K T H T C P GGTACCCTGGAGGTGCTGTTCCAGGGCCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P CCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCC L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q CTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG V Y T L P P S R D E L T K N Q V S L T C GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG E N N Y K A T P P V L D S D G S F F L Y GAGAACAACTACAAGGCCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAC S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V AGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA H H H H H H * * XhoI CACCACCATCACCATCACTAATGATCACTCGAG Obr. 5.13: Okolí klonovacího místa v plazmidu phlsec-fchis. Zeleně je označena Kozakova sekvence, akvamarinově sekreční signální sekvence, ţlutě štěpné místo pro 3C proteasu, modře Fc fragment, červeně C-terminální histidinová kotva. Růţově je vyznačeno štepné místo pro enzym AgeI, fialově štěpné místo pro enzym KpnI. Celá sekvence je ukončena štěpným místem pro XhoI, které je moţné vyuţít při restrikčním štěpení. 67

Na Obr. 5.14 je pro ilustraci uveden výsledek preparativní agarosové elektroforézy linearizovaného plazmidu phlsec-fchis. Na Obr. 5.15 je naznačen proces selekce pozitivních klonů na příkladu plazmidu phlsec-fchis_r2. Pro všechny konstrukty se podařilo najít alespoň jeden pozitivní klon, který nesl správnou sekvenci inzertu. S 1 2 3 4 5 10,0 kb 3,0 kb 2,0 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,5 kb Obr. 5.14: Linearizovaný phlsec-fchis. Vektor byl štěpen pomocí enzymů AgeI a KpnI. Dráhy 2 a 3 obsahují linearizovaný plazmid (původní inzert byl vyštěpen), v dráze 5 je pro srovnání neštěpený phlsec- FcHis. Dráha S označuje standard. A S 1 2 3 4 5 6 7 8 S 1 2 3 4 5 6 7 8 B 1000 bp 500 bp 100 bp 1000 bp 500 bp 100 bp Obr. 5.15: (A) Kontrolní restrikční štěpení 8 klonů phlsec-fchis_r2 a (B) PCR z kolonií pro stejné klony. Restrikční štěpení probíhalo s enzymy AgeI a KpnI. Pro PCR z kolonií byly pouţity primery phlsec_fw a phlsec_rev. V dráze S je standard. Všechny tři pozitivní klony v dráhách 2, 4 a 5 byly ověřeny DNA sekvenováním a bylo zjištěno, ţe klon 2 obsahoval více kopií insertu, klon 4 pravděpodobně jednu mutaci a klon 5 byl zcela v pořádku a proto byl vybrán pro další práci. 68

Bylo připraveno zásobní mnoţství plazmidů podle odstavce 4.1.13. Pro určení čistoty a mnoţství získané plazmidové DNA byla změřena absorbance při vlnové délce 260 nm a 280 nm, ze kterých byla posléze vypočítána koncentrace a čistota připravených roztoků DNA. Výsledky jsou shrnuty v Tab. 3. Tab. 3: Velkoobjemová příprava plazmidů phlsec-fchis_r2, phlsec-fchis_c1, phlsec-fchis_w1 a phlsec-fchis_s1. Naměřené hodnoty A 260, A 280, koncentrace zásobního roztoku plazmidu a jeho čistota vyjádřená poměrem A 260 /A 280. plazmid A 260 A 280 c [μg/μl] A 260 /A 280 phlsec-fchis_r2 0,213 0,123 3,2 1,73 phlsec-fchis_c1 0,242 0,136 3,6 1,78 phlsec-fchis_w1 0,307 0,178 4,6 1,72 phlsec-fchis_s1 0,193 0,166 4,4 1,77 5.2.2. Produkce proteinů Pro kaţdý z proteinů R2-FcHis, C1-FcHis, W1-FcHis a S1-FcHis byla bez předchozích expresních testů provedena jedna produkce v 1 l čtyřhranných lahvích v suspenzní kultuře buněčné linie HEK293T o počáteční hustotě 1.10 6 buněk.ml -1. R2-FcHis bylo produkováno celkem v 2 x 400 ml média, C1 ve 400 ml média, W1 v 500 ml média a S1 v 2 x 500 ml výsledného objemu produkčního média. Transfekce byla prováděna pomocí směsi DNA:PEI v poměru 1:4 v DMEM médiu bez vápníku. Po 4 hod inkubaci bylo přidáno ExCELL293 médium v poměru 1:1. Produkce byly sklizeny vţdy po 5 dnech od transfekce. Poté buď bezprostředně navazovala purifikace proteinů z média, nebo bylo médium zmraţeno na -20 C a uchováváno do doby, neţ bylo zpracováno. 5.2.3. Purifikace proteinů Purifikace proteinů s Fc fragmentem byla provedena stejným způsobem jako purifikace proteinů bez Fc fragmentu (viz sekce 4.3. a 5.1.3.). Po afinitní chromatografii byly proteiny zkoncentrovány a nastříknuty na kolonu Superdex 200 10/300 GL. Průběh gelové chromatografie byl monitorován měřením absorbance při 280 nm, chromatogram z gelové 69

filtrace W1-FcHis je na Obr. 5.16, následná analýza frakcí SDS elektroforézou je na Obr. 5.17. Frakce 3 a 4 pravděpodobně obsahují trimer, tetramer nebo agregát W1-FcHis. Frakce 6, 7 a 8 byly smíchány a zkoncentrovány na finální objem 110 μl o koncentraci 5 μg/μl. ma280 500 400 300 200 100 0-100 1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25 V [ml] Obr. 5.16: Záznam z gelové chromatografie W1-FcHis. Čísla značí jednotlivé frakce. kda 66 44 29 S Ch 1 2 3 4 5 6 7 8 Obr. 5.17: Analýza frakcí W1- FcHis z gelové chromatografie. Ve dráze S je standard, ve dráze označené jako Ch vzorek W1-FcHis po chelatační chromatografii. Dráhy 1-8 obsahují vzorky z frakcí 1-8 (srov. Obr. 5.16). Všechny vzorky jsou neredukující. Pro S1-FcHis byl získán velice podobný chromatogram jako pro W1-FcHis. Chromatogram pro C1-FcHis se podobá chromatogramu pro C1 (viz Obr. 5.10 na straně 63), s tím rozdílem, ţe před hlavním vrcholem je patrný ještě jiný, malý vrchol, jako je tomu u W1-FcHis. Tento vrchol pravděpodobně opět obsahuje oligomery vyššího neţ druhého řádu nebo agregáty C1-FcHis. Chromatogram z gelové filtrace R2-FcHis i analýza získaných frakcí pomocí SDS elektroforézy ukázaly, ţe se podařilo připravit jen velice malé mnoţství tohoto proteinu. C1-FcHis, W1-FcHis a S1-FcHis byly zakoncentrovány na zásobní roztoky o koncentraci 5 mg/ml, R2-FcHis bylo zakoncentrováno na roztok o výsledné koncentraci 1 mg/ml. Celkové výtěţky pro jednotlivé proteiny shrnuje Tab. 4 na str. 71. Krátkodobě byly připravené proteiny skladovány v pufru pro gelovou chromatografii při 4 C, dlouhodobě při -20 C. 70

Tab. 4: Výtěţky z produkce proteinů R2-FcHis, C1-FcHis, W1-FcHis a S1-FcHis. protein V prod. média [ml] výtěţek [mg] výtěţek na 1 l prod. média [mg] R2-FcHis 800 0,05 0,06 C1-FcHis 400 1,80 4,50 W1-FcHis 500 0,60 1,20 S1-FcHis 1000 1,63 1,63 5.2.4. Štěpení proteinů pomocí 3C proteasy Pro odštěpení Fc fragmentu z připravených proteinů byla pouţita 3C proteasa. Tento enzym byl připraven podle odstavce 4.4., průběh přípravy byl zdokumentován pomocí SDS elektroforézy (Obr. 5.18). Pro optimalizaci poměru proteasy a proteinu ve směsi byl pouţit protein W1-FcHis; bylo zjištěno, ţe optimální poměr 3C proteasy a proteinu je 1:5. Při zachování tohoto poměru bylo pak smícháno vţdy 5 μg C1-FcHis a 1 μl zásobního roztoku 3C proteasy a byla provedena časová a teplotní optimalizace. Bylo zjištěno, ţe 3C proteasa štěpí prakticky stejně dobře při 4 C a za laboratorní teploty a ţe pro optimální výsledek štěpné reakce není nutné prodluţovat inkubaci na dobu přesahující 3 hod. S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 kda 66 44 29 Obr. 5.18: Příprava 3C proteasy. Ve dráze S je standard. Dráha 1 obsahuje vzorek z bakterií, dráha 2 vzorek proteinu před chelatační chromatografií, dráha 3 je frakce, která se nezachytila na nosič při chelatační chromatografii. Ve dráze 4 je vzorek z promývání kolony PBS (3C proteasa pravděpodobně přetekla z vedlejší dráhy), ve dráze 5 vzorek proteinu z předeluce pomocí PBS s 20 mm imidazolem, ve dráze 6 vzorek proteinu vymytý z kolony pomocí PBS s 250 mm imidazolem. Dráhy 7, 8 a 9 představují frakce z gelové chromatografie. Všechny vzorky jsou redukující. 71

Následně bylo 5 μg všech připravených proteinů smícháno s 1 μl zásobního roztoku 3C proteasy, štěpení probíhalo 16 hod při 4 C a vzorky byly následně analyzovány SDS elektroforézou (Obr. 5.19). Je patrné, ţe štěpení probíhá nejlépe u C1-FcHis, zatímco u ostatních proteinů štěpení není kvantitativní a výtěţky proteinů s odštěpeným Fc fragmentem jsou malé. 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A B C Obr. 5.19: Štěpení (A), (B) C1-FcHis a S1-FcHis a (C) R2-FcHis a W1-FcHis pomocí 3C proteasy. (A) a (B): dráha 1 obsahuje 5 μg 3C proteasy, dráha 3 neštěpené C1-FcHis, dráha 4 C1 s odštěpeným Fc fragmentem, dráha 5 S1-FcHis neštěpené, dráha 6 S1 s odštěpeným Fc fragmentem. (A) jsou neredukující vzorky, (B) redukující vzorky. (C): dráhy 1 a 6 obsahují neštěpené W1-FcHis, dráhy 2 a 7 jsou W1 s odštěpeným Fc fragmentem, dráhy 3 a 8 neštěpené R2-FcHis, dráha 4 a 9 jsou R2 s odštěpeným Fc fragmentem. Dráha 5 obsahuje 5 μg 3C proteasy. 1-4 jsou redukující vzorky, 5-9 neredukující vzorky. Nakonec bylo C1-FcHis pomocí 3C proteasy naštěpeno v zásobním mnoţství. Protein byl přečištěn pomocí chelatační chromatografie následovanou gelovou filtrací, která poskytla prakticky stejný chromatogram jako gelová chromatografie proteinu C1 (proteinu produkovaného bez Fc fragmentu), srov. Obr. 5.10 na str. 63. 5.2.5. Identifikace Pro identifikaci připravených proteinů byla pouţita metoda peptidového mapování. Vzorky připravil a měření provedl Mgr. Daniel Kavan. Pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie bylo změřeno hmotnostní spektrum tryptických štěpů studovaných proteinů a následným porovnáním změřených hodnot m/z s velikostí teoretických peptidů pro jednotlivé proteiny byla potvrzena identita připravených proteinů. Na Obr. 5.20 na str. 73 je hmotnostní spektrum tryptických štěpů proteinů C1-FcHis, S1-FcHis, W1-FcHis a R2- FcHis. Na Obr. 5.21 na str. 74 je MALDI-TOF hmotnostní spektrum tryptických štěpů 72

proteinů C1-FcHis, C1 s odštěpeným Fc fragmentem a odštěpeného Fc fragmentu. Zeleně je na obrázku vyznačen peptid TPFSPMGTLEVLFQ, pocházející částečně z rclr-b a částečně ze štěpného místa pro 3C proteasu, které zůstane po odštěpení Fc fragmentu z větší části na studovaném proteinu. Výskyt tohoto peptidu (ve spektru pro C1-FcHis a pro C1 s odštěpeným Fc fragmentem) i celkové pokrytí sekvencí dokazuje, ţe byl Fc fragment odštěpen a ţe přečištěním roztoku štěpné reakce byl získán čistý preparát. C1-FcHis S1-FcHis W1-FcHis R2-FcHis C1-FcHis: S1-FcHis: W1-FcHis: R2-FcHis: Obr. 5.20: MALDI-TOF hmotnostní spektrum tryptických štěpů proteinů C1-FcHis, S1-FcHis, W1- FcHis, R2-FcHis. Červeně jsou vyznačeny části sekvencí, jejichţ přítomnost byla dokázána nalezením hodnot m/z odpovídajícím takovýmto peptidům. Tyto peptidy (označené číslem počáteční a konečné aminokyseliny) jsou přiřazeny k jednotlivým vrcholům ve spektru. 73

Obr. 5.21: MALDI-TOF hmotnostní spektrum tryptických štěpů proteinů C1-FcHis, C1(-FcHis) po odštěpení Fc fragmentu a Fc fragmentu. Červeně jsou vyznačeny části sekvencí, jejichţ přítomnost byla dokázána nalezením hodnot m/z odpovídajícím takovýmto peptidům. Zeleně je označen ion, jehoţ hodnotu m/z se podařilo přiřadit teoretické hmotě peptidu TPFSPMGTLEVLFQ pocházejícího částečně z rclr-b a částečně ze štěpného místa pro 3C proteasu, které zůstane po odštěpení Fc fragmentu z větší části na studovaném proteinu. Pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byla také změřena intaktní hmota fúzních proteinů, byly pouţity vzorky proteinů přečištěné a odsolené chromatografií na reverzní fázi. Pro konstrukt C1-FcHis byla změřena hmota 100773 Da, S1-FcHis 111553 Da a pro W1-FcHis 113545 Da, přičemţ přesnost stanovení se pohybuje v řádu několika set Da. Ze šířky vrcholů signálu m/z v hmotnostních spektrech lze usuzovat na stupeň heterogenity glykosylace připravených proteinů, který se pravděpodobně pohybuje v řádu několika tisíc Da. Rozdíl mezi teoretickou hmotou proteinu samotného a skutečnou hmotou vypovídá o rozsahu glykosylace samotné (viz téţ sekce 5.2.6.2.). 74

5.2.6. Charakterizace 5.2.6.1. Mapování disulfidických můstků Analýzu vzorků a vyhodnocení získaných výsledků provedl Mgr. Petr Pompach, Ph.D. Tryptické a Asp-N peptidové štěpy byly analyzovány hmotnostním spektrometrem MALDI-TOF/TOF. Mezi naměřenými hodnotami m/z peptidů získaných tryptickým štěpením proteinů C1-FcHis i C1 po odštěpení FcHis kotvy byla nalezena hodnota 2108,03, která odpovídá cystinovému peptidu o sekvenci LNSYSLQCK LNSYSLQCK. To dokazuje správnou dimerizaci rclr-b jak ve formě fúzního proteinu, tak i v molekule po odštěpení Fc fragmentu (Obr. 5.22). Také intramolekulární můstky jsou vytvořeny správně, tj. mezi Cys 80 a Cys 91 a mezi Cys 108 a Cys 190 (číslování dle sekvence celého rclrb). Obr. 5.22: MALDI-TOF/TOF hmotnostní spektrum tryptických štěpů proteinů (A) C1-FcHis a (B) C1(-FcHis) po odštěpení Fc fragmentu. Hodnota m/z 2108,03 odpovídá cystinovému peptidu LNSYSLQCK LNSYSLQCK. Naopak pro molekulu R2-FcHis nebyly nalezeny ţádné hodnoty m/z svědčící o přítomnosti peptidů, které by dokazovaly správné vytvoření disulfidických můstků. V případě proteinů W1-FcHis a S1-FcHis dopadla analýza podobně jako v případě 75

konstruktů v plazmidu phlsec. Podařilo se identifikovat první disulfidický můstek mezi Cys 94 a Cys 105, ale nepodařilo se rozřešit párování ostatních disulfidů, včetně dimerizačních. To pravděpodobně souvisí s faktem, ţe u těchto proteinů nebylo ani moţno dobře odštěpit Fc fragment pomocí 3C proteasy a poukazuje to na moţné nesprávné párování dimerizačních cysteinů v této oblasti. Pokud jde o Fc fragment samotný, u všech proteinů byly jeho vlastní intramolekulární disulfidické můstky snadno identifikovány jako správně uzavřené, zatímco jeho dimerizační cysteiny leţící v pantové oblasti nebyly pozorovány (viz 6. Diskuze). 5.2.6.2. Analytická ultracentrifugace Analýzu vzorků pomocí analytické ultracentrifugy ProteomeLab XL-I metodami sedimentační rychlosti a sedimentační rovnováhy a vyhodnocení výsledků provedl Mgr. Ondřej Vaněk. V případě proteinů produkovaných v plazmidu phlsec byl sedimentační analýze podroben pouze konstrukt C1, ostatních proteinů jiţ nebylo v době provádění analýzy k dispozici dostatečné mnoţství. Byl proveden sedimentačně rychlostní experiment (Obr. 5.23 na str. 77), zjištěná hodnota sedimentačního koeficientu 3,04 ± 0,2 S jednoznačně poukazuje na dimer proteinu, přičemţ pro jeho teoretickou hmotu 36423 Da (+ glykosylace, celkem přibliţně 40 kda) naznačuje spíše protáhlý tvar molekuly, např. válec či elipsoid o přibliţných rozměrech 9-11 x 3-4 nm - zde je nutno si ovšem uvědomit, ţe jak sedimentační koeficient, tak odhad velikosti a tvaru částice je ovlivněn glykosylací proteinu, a tyto odhady je tedy třeba brát s rezervou. Dále byl proveden sedimentačně rovnováţný experiment (Obr. 5.24, str. 77), který přímo určil hmotu proteinu jako 40837 ± cca 500 Da, coţ dobře odpovídá očekáváné hmotě dimeru (2 x 18211 = 36422 Da + glykosylace na min. dvou místech, viz 5.1.5.), bez náznaku přítomnosti monomerní formy proteinu. V případě proteinů produkovaných v plazmidu phlsec-fchis byly sedimentační analýze podrobeny konstrukty C1-FcHis, S1-FcHis a jejich směs, s cílem zachytit jejich moţnou interakci a tvorbu komplexu. S roztoky proteinů o koncentraci 1 mg/ml jednotlivě i ve směsi (odpovídající přibliţně 10 μm koncentraci jednotlivých proteinů) byl proveden sedimentačně rychlostní (Obr. 5.25, str. 78) i rovnováţný (Obr. 5.26, str. 79) experiment. 76

Obr. 5.23: Sedimentační profil proteinu C1, metoda sedimentační rychlosti. Roztok proteinu o koncentraci 0,2 mg/ml byl centrifugován při 45000 ot./min a jeho sedimentace sledována při 280 nm jako závislost absorbance na poloměru otáčení v čase. Pro jednoduchost zobrazen pouze kaţdý pátý snímek, časová prodleva mezi zobrazenými snímky je tedy 25 min. Obr. 5.24: Sedimentační profil proteinu C1, metoda sedimentační rovnováhy. Roztok proteinu o koncentraci 0,1 mg/ml byl centrifugován při 12-15-18-21-24000 ot./min a jeho sedimentace sledována při 280 nm jako závislost absorbance na poloměru otáčení v rovnováze pro dané otáčky. 77

A B C Obr. 5.25: Sedimentační profil proteinů C1-FcHis (A), S1-FcHis (B) a jejich směsi (C), metoda sedimentační rychlosti. Roztoky proteinů o koncentraci 1 mg/ml byly centrifugovány kaţdý zvlášť i ve směsi v poměru 1:1 (celková koncentrace 2 mg/ml) při 36000 ot./min a jejich sedimentace sledována při 300 nm jako závislost absorbance na poloměru otáčení v čase. Pro jednoduchost zobrazen pouze kaţdý pátý snímek, časová prodleva mezi zobrazenými snímky je tedy 25 min. 78