DIPLOMOVÁ PRÁCE. Petr Pospí²il. Samoorganizace a p enos excita ní energie v bakteriochlorofylových agregátech

Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikální fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE Petr Pospí²il Samoorganizace a p enos excita ní energie v bakteriochlorofylových agregátech Katedra chemické fyziky a optiky Vedoucí diplomové práce: doc. RNDr. Jakub P²en ík, Ph.D. Studijní program: Fyzika, biofyzika a chemická fyzika

Děkuji T.S. Balabanovi a V. L. Horhoiu (Institute for Nanotechnology, Forschungszentrum Karlsruhe) za poskytnutí derivátů azulenu. Dále děkuji doc. RNDr. Daně Gáškové, CSc. a RNDr. Romanu Chaloupkovi, Ph.D. za laskavé poskytnutí aparatur Fluoromax 2 a Fluoromax 3. Nejvíce bych chtěl poděkovat doc. RNDr. Jakubovi Pšenčíkovi, Ph.D. za čas a zájem, který mi věnoval během uplynulých dvou let. Konzultace s ním posouvaly nejen mou práci ale i mé znalosti celkově vpřed. Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci napsal samostatně a výhradně s použitím citovaných pramenů. Souhlasím se zapůjčováním práce. V Praze dne Petr Pospíšil

Obsah 1. Úvod... 4 2. Živé organismy a fotosyntéza... 5 2.1 Živé organismy... 5 2.2 Fotosyntéza... 6 2.3 Světlosběrné antény... 7 2.3.1. Absorpce fotonu... 8 2.3.2. Přenos energie... 11 2.4 Chlorosomy... 13 2.4.1. Bakteriochlorofylové pigmenty a jejich optické vlastnosti... 16 3. Metody a materiály... 23 3.1 Absorpce... 23 3.2 Fluorescenční excitační spektra... 24 3.3 Pigmenty a agregáty... 27 4. Výsledky... 30 Závěr... 49 Literatura... 50

Název práce: Samoorganizace a přenos excitační energie v bakteriochlorofylových agregátech Autor: Petr Pospíšil Katedra: Katedra chemické fyziky a optiky Vedoucí diplomové práce: doc. RNDr. Jakub Pšenčík, Ph.D. E-mail vedoucího: psencik@karlov.mff.cuni.cz Abstrakt: Bakteriochlorofyl c (BChl c) je jedním z fotosyntetických pigmentů, který se vyskytuje ve světlosběrných anténách zelených fotosyntetických bakterií ve formě samoorganizovaných agregátů. BChl c agregáty lze připravit i in vitro ve vodných roztocích za přítomnosti některých nepolárních molekul (např. lipidy nebo karotenoidy). V této práci bylo k přípravě BChl c agregátů využito derivátu azulenu. Agregace BChl c s azulenem vede ke zvýšení absorpce výsledných agregátů v blízké UV oblasti. Ke studiu účinnosti přenosu energie z azulenu na BChl c byla využita fluorescenční spektroskopie. Pracovní postup byl založen na měření fluorescenčních excitačních spekter a jejich porovnávání s absorpčními 1 T spektry. V průběhu měření bylo třeba řešit celou řadu problémů, jako například anomální fluorescence azulenu, ke které nedochází z S 1 stavu, jako u většiny ostatních pigmentů, ale ze stavu S 2. Ukázalo se také, že referenční dioda v použitém fluorescenčním spektrometru nekoriguje správně měřený signál na intenzitu excitačního záření v blízké UV oblasti, kde absorbuje azulen. Tento problém se podařilo částečně odstranit vytvořením nových korekčních souborů pomocí série laserových barviv. Z excitačních spekter je patrné že k přenosu energie z azulenu na BChl c dochází, ale jeho účinnost se tak zatím nepodařilo uspokojivě vyhodnotit. Klíčová slova: Bakteriochlorofyl, azulen, přenos energie, fluorescenční excitační spektrum Title: Self-assembly and excited energy transfer in bacteriochlorophyll aggregates Author: Petr Pospíšil Department: Department of Chemical Physics and Optics Supervisor: doc. RNDr. Jakub Pšenčík, Ph.D. Supervisor's e-mail address: psencik@karlov.mff.cuni.cz Abstract: Bacteriochlorophyll c (BChl c) belongs among photosynthetic pigments. It is found in lightharvesting complexes of green photosynthetic bacteria in the form of self-assembled aggregates. It is possible to prepare BChl c aggregates also in vitro in aqueous solutions, in the presence of certain non-polar molecules (e.g. lipids or carotenoids). In this work, artificial light-harvesting antenna was prepared composed of BChl c and selected azulene derivative. The aggregation of BChl c with azulene enhances the absorption in the near UV region compared to BChl c. Fluorescence spectroscopy was used to study an efficiency of energy transfer from azulene to BChl c. The procedure used was based on fluorescence excitation spectra measurement, and a comparison with absorption 1 T spectra. The measurements were complicated by anomalous fluorescence of azulene, which occurs from the S 2 state. Furthermore, the reference diode in the fluorescence spectrometer did not correct properly the signal in the near UV region, where azulene absorbs. The problem was partially solved by preparing the new correction files using selected laser dyes. Excitation spectra demonstrate the presence of the energy transfer from azulene to BChl c, however, it was not yet possible to satisfactorily quantify its efficiency. Keywords: Bacteriochlorophyll, azulen, energy transfer, fluorescence excitation spectra

1. Úvod Fotosyntéza je velmi starý proces, který se na Zemi objevil podle některých odhadů už před 3,5 miliardami let. Během této doby se nejen vyvinul ve velmi účinný způsob získávání energie, ale hlavně se díky němu na Zemi vytvořily podmínky k životu složitějších organismů včetně člověka. Fotosyntéza je tak naprosto zásadní pro život jak jej známe dnes. Už jen proto si zaslouží podrobnější zkoumání a studium. Avšak studium tak složitého a komplexního procesu jako je fotosyntéza, zasahuje snad do všech přírodovědných oborů. Není tedy v možnostech této práce popsat detailně celý proces fotosyntézy se vším, co se k němu pojí. V této práci bude na začátku pouze ukázáno, v čem tkví tak zásadní postavení fotosyntézy v přírodě a budou stručně představeny jednotlivé fáze fotosyntézy. Poznávání jednotlivých fází fotosyntézy inspirovalo k myšlence, že by se některé procesy odehrávající se v určitých fázích fotosyntézy mohli využít pro výrobu elektrické energie. Začalo se tak usilovat o využití procesů záchytu a přenosu energie probíhající ve fotosyntetických organismech při konstrukci fotovoltaických článků na bázi umělé fotosyntézy, které by byly přinejmenším méně nákladné na výrobu a recyklaci, než současné křemíkové fotovoltaické články. Pro zachycení a přenos světelné energie jsou fotosyntetické organismy vybaveny světlosběrnými anténami. Experimentální výzkum se zabývá různými druhy světlosběrných antén. V této práci jsme se zabývali světlosběrnými anténami zelených bakterií, které se nazývají chlorosomy. Chlorosomy obsahují fotosyntetické pigmenty ve formě samoorganizovaných agregátů, které mají jednu velkou výhodu: jsou velmi dobře připravitelné in vitro a je možné je připravit i s různými druhy pigmentů, které by mohly zlepšit schopnost záchytu sluneční energie. Náplní této práce bylo připravit umělou světlosběrnou anténu podobnou chlorosomům, konkrétně šlo o dvousložkovou umělou světlosběrnou anténu na bázi bakteriochlorofylu a azulenu. Po úspěšné přípravě antény následovalo studium účinnosti přenosu energie z jedné složky na druhou. 4

2. Živé organismy a fotosyntéza 2.1 Živé organismy Živé organismy se od neživé hmoty liší v mnoha směrech. Jedním z nich je ten, že se živé organismy během svého života nenacházejí ve stavu termodynamické rovnováhy. Termodynamická rovnováha nebo také stav s největší pravděpodobností v jakém se může nacházet neživá hmota za daných podmínek, znamená pro živé organismy smrt. Aby se z živých organismů nestala mrtvá hmota, musí neustále obnovovat svou vnitřní uspořádanost a zajišťovat důležité životní procesy. To ale stojí energii, kterou organismy musí někde získávat. Existují dva hlavní způsoby, jakým mohou nám známé živé organismy získávat energii. Tím prvním a nejdůležitějším je přeměna energie ze slunečního záření, která se nazývá fotosyntéza. Fotosyntéza je proces, při kterém je energie slunečního záření zachycena a s velkou účinností přeměněna na jiné formy energie, které jsou pak následně využity na udržování a chod buněčných procesů. Organismy využívající fotosyntézu, jako jsou například rostliny nebo i některé druhy bakterií, se nazývají fototrofní organismy. Druhým způsobem získávání energie je oxidace chemických sloučenin. Organismy, které získávají touto cestou energii, se nazývají chemotrofní organismy. Podle typu chemických sloučenin můžeme chemotrofní organismy rozdělit ještě na dvě skupiny. Lithotrofní (také chemolithotrofní) organismy jsou organismy, které získávají energii pomocí oxidace anorganických látek. Mezi tyto organismy patří například sirné bakterie. Druhou skupinou jsou organotrofní (také chemoorganotrofní) organismy, které získávají energii pomocí oxidace organických látek jako je například glukóza. Mezi tyto organismy patří většina mnohobuněčných organismů včetně člověka [1]. Glukóza, ale i jiné organické látky, ze kterých organotrofní organismy získávají energii, jsou, na rozdíl od anorganických látek, energeticky bohatší chemické sloučeniny a vznikají pouze jako produkty metabolických procesů zejména v buňkách fototrofních organismů, hlavně rostlin. Takže organotrofní organismy také využívají sluneční energii ale pouze nepřímo. Na Zemi je tedy jen velmi málo organismů, které nejsou na fotosyntéze závislé, ať už přímo nebo nepřímo. 5

2.2 Fotosyntéza Fotosyntéza probíhá v buňkách některých prokaryotních i eukaryotních organismů. Prokaryotní organismy jsou jednobuněčné organismy, například bakterie. Od okolí jsou chráněni cytoplasmatickou polopropustnou membránou. Fotosyntetické komplexy jsou umístěny převážně v cytoplasmatické membráně. V buňkách eukaryotních organismů, jako jsou například rostliny, jsou fotosyntetické aparáty umístěny ve speciálních organelách, které se nazývají chloroplasty. Fotosyntetické aparáty jednotlivých organismů se od sebe liší zejména strukturou světlosběrných antén, která je dána zejména životními podmínkami organismů. Proces fotosyntézy můžeme rozdělit na čtyři části, které jsou u všech fotosyntetických organismů stejné. Tyto čtyři části jsou: 1) Zachycení a přenos energie. Fotosyntetické organismy mají pro zachycení energie vybudované důmyslné aparáty, které se nazývají světlosběrné antény. Jsou složeny z molekul různých pigmentů, jako je například chlorofyl, které absorbují světelné záření zejména v modré a blízké ultrafialové (UV) oblasti a také v červené a blízké infračervené (IČ) oblasti. To je také důvod, proč fotosyntetický aktivní části organismů jsou zelené, např. listy u rostlin. Po absorpci fotonu se molekula pigmentu nachází v excitovaném stavu. Excitační energie je pak velmi rychle přenesena do reakčního centra, kde dochází k dalším procesům [2]. 2) Separace elektronu a primární elektronový přenos v reakčních centrech. Reakční centrum je pigment-proteinový komplex usazený v membráně. Poté, co je excitační energie přenesena do reakčního centra, zde dochází k separaci a přenosu elektronu. 3) Energetická stabilizace elektronu pomocí sekundárních procesů. Molekuly reakčního centra se po ztrátě elektronu snaží ihned vrátit zpět do neutrálního stavu. Aby nedošlo k zpětné rekombinaci, je elektron odveden rychlými sekundárními procesy, které elektron prostorově separují od reakčního centra. Excitační energie se tak mění v energii separovaného náboje elektronu [1]. Energie elektronu je využita k pumpování protonů přes membránu, které vytvoří protonový gradient. Reakční centrum ochuzené o jeden elektron má silnou tendenci tento elektron získat zpět. To se projeví na jeho redoxním potenciálu, který má vysokou kladnou hodnotu. U rostlin má redoxní potenciál oxidovaného reakčního centra fotosystému II větší hodnotu než redoxní potenciál vody. Reakční centrum je tak schopné chybějící elektron získat oxidací vody. Čtyřnásobnou oxidací vody vzniká kyslík O 2 (oxygenní fotosyntéza). 4) Syntéza a export produktů. Tato fáze je také někdy označována zavádějícím tradičním názvem temnostní fáze. V této fázi dochází k syntéze molekul, které obsahují energeticky významné (makroenergetické) vazby, jako je například ATP, NADPH (oxygenní fotosyntéza) nebo NADH (anoxygenní fotosyntéza). V dalších fázích dochází ke štěpení vazeb těchto molekul a vzniklá energie je 6

použita na syntézu energeticky méně bohatých molekul, jako je například glukóza. Glukóza je syntetizována rostlinami z atmosférického oxidu uhličitého. Temnostní fáze zahrnuje procesy, které ke svému průběhu světlo nepotřebují. Ve skutečnosti ale probíhá s největší intenzitou za světla kdy je produkce substrátů těchto reakcí nejvyšší, proto je tradiční označení procesů fotosyntézy na světelné a temnostní fáze poněkud zavádějící [3]. Celý proces fotosyntézy pro rostliny bychom tak mohli vystihnout obecnou rovnicí: 6CO + 6H O (CH O) + 6O hv 2 2 2 6 2 (1. 1) Některé fotosyntetické organismy používají jiný donor elektronů než je H 2 O (voda), například H 2 S (sulfan). Obecná rovnice fotosyntézy pro všechny fotosyntetizující organismy tak může být zapsána v následující podobě: CO + H D (CH O) + H O + 2D hv 2 2 2 2 (1. 2) kde H 2 D je obecný donor elektronů. 2.3 Světlosběrné antény Světlosběrné antény jsou až na jednu výjimku pigment-proteinové komplexy, kde protein slouží jako lešení, na které jsou pigmenty navázány. Výjimku představují pigmentpigmentové komplexy přítomné výhradně ve fotosyntetických aparátech zelených bakterií. Tyto komplexy se nazývají chlorosomy a jsou složené hlavně ze samoorganizovaných pigmentových oligomerů. Proteiny jsou v chlorosomech rovněž přítomny, ale nacházejí se pouze v obálce chlorosomů. Důvod proč organismy disponují velkými komplexy převážně pigmentů, je ten, že jedna molekula pigmentu má velmi malý účinný průřez vzhledem ke svojí velikosti. Kdyby pro záchyt světelné energie sloužilo pouze reakční centrum, účinnost záchytu světelné energie by poklesla a reakční centrum by většinu času nepracovalo. Světlosběrné antény můžeme také rozdělit podle toho, kde se nacházejí. Integrální membránové antény obsahují proteiny, které jsou zabudované v lipidové dvojvrstvé membráně a prostupují tuto membránu (buněčnou nebo organely). Periferní membránové anténní komplexy jsou přichyceny k membráně pomocí proteinů, které jsou v membráně zabudované. Tyto antény však membránou neprostupují [3]. Energie zachycená periferními anténami je přenášena do antén v membráně nebo přímo do reakčních center (Obr. 1). Přenos energie od momentu absorpce fotonu až po zachycení excitační energie v reakčním centru se nejčastěji odehrává v časovém rozmezí od stovek femtosekund do stovek pikosekund. 7

Obr. 1 Schematické znázornění přenosu energie ve světlosběrné anténě a její následná přeměna na energii separovaného náboje. (zdroj:podklady k přednášce NBCM 033 Pšenčík, Hála: Fyzikální základy fotosyntézy) 2.3.1. Absorpce fotonu K absorpci fotonu molekulou nacházející se v základním stavu může dojít jen tehdy, když má foton energii rovnou rozdílu základní energetické hladiny a nějaké vyšší energetické hladiny molekuly. V případě absorpce fotonu o energii E = hv molekulou, platí vztah: hv = En- E 0 = E (1. 3) kde E 0 je energie základního stavu molekuly a E n je energie nějakého excitovaného stavu molekuly. Pravděpodobnost absorpce fotonu molekulou je čistě kvantově mechanický jev, který se popisuje pomocí časové poruchové teorie. Oscilující elektromagnetické pole působí na molekulu jako slabá porucha, přičemž lze tuto poruchu popsat pomocí přimíšení vzbuzených stavů k výchozímu neporušenému stavu molekuly. Pravděpodobnost přechodu do některého z excitovaných stavů v tomto případě je tedy nenulová, protože vlnová funkce obsahuje právě tyto excitované stavy molekuly. Tato pravděpodobnost je úměrná době t, po kterou porucha působí, proto se zavádí veličina, která charakterizuje pravděpodobnost přechodu za jednotku času W, nebo také rychlost přechodu. Rychlost přechodu W molekuly ze stavu m do stavu n se řídí Fermiho zlatým pravidlem: 2π W = V δ(ω ) (1. 4) n m mn kde V je poruchový operátor, charakterizující působení poruchy na molekulu. Delta funkce s argumentem ω mn zahrnuje do rovnice (1.4) fakt, že dochází pouze k přechodům indukovaným elektromagnetickým polem o energii odpovídající rozdílu energií stavu m a n (viz rovnice 1.3) [4]. Poruchový operátor charakterizující přechod mezi základním a excitovaným stavem je možné vyjádřit jako moment přechodu: 8

M = ˆ (1. 5) kde čárka značí excitovaný stav a ˆ reprezentuje vektorový operátor dipólového momentu. Moment přechodu je tedy také vektorová veličina (má směr). Molekuly pigmentů světlosběrných antén často nemají žádný stálý dipólový moment, pouze přechodový dipólový moment vyvolaný oscilujícím elektromagnetickým polem dopadajícím na molekulu. Tento přechodový dipólový moment lze rozdělit do dvou složek, protože s elektromagnetickým polem interagují dva systémy nabitých částic: záporně nabité elektrony a kladně nabitá atomová jádra. Jedna složka operátoru přechodového dipólového momentu tedy závisí na souřadnicích elektronů ( ˆ e ) a druhá na souřadnicích jader ( ˆn ) [4]. Protože jádra atomů jsou mnohonásobně těžší než elektrony, je možné využít aproximace známé jako Born- Oppenheimerova aproximace a oddělit tak od sebe popis jader a elektronů. Vlnovou funkci ψ pak můžeme napsat jako: es v (1. 6) kde ψ es je celková elektronová vlnová funkce a ψ v je vibrační (jaderná) vlnová funkce, která charakterizuje vibrace jader. Moment přechodu pak můžeme vyjádřit ve tvaru: M ˆ ˆ (1. 7) es es v n v v v es e es kde: = 0 es es (1. 8) protože vlnové funkce ψ es a ψ es jsou ortogonální. První člen součtu na pravé straně v rovnici (1.7) je tedy nulový. Celkovou elektronovou funkci ψ es je možné ještě rozdělit na elektronovou orbitální vlnovou funkci ψ e a elektronovou spinovou vlnovou funkci ψ s. Moment přechodu lze poté napsat ve tvaru: M ˆ (1. 9) v v e e e s s 1 2 3 Jednotlivé členy vedou k výběrovým pravidlům přechodů mezi jednotlivými energetickými hladinami molekuly. První člen v rovnici (1. 9) se nazývá Franck-Condonův faktor. Jeho velikost určuje míru překryvu vibračních vlnových funkcí dvou energetických stavů. Nejpravděpodobnější přechody mezi vibračními hladinami dvou energetických stavů jsou tedy ty, pro které je překryv vibračních vlnových funkcí největší. Tento člen určuje tzv. vibrační výběrové pravidlo. Členy 2 a 3 vedou na orbitální a spinová výběrová pravidla. Mezi jednotlivými energetickými hladina dochází k tzv. vertikálním přechodům. Tento princip je označován jako Franck-Condonův princip. Podstatou tohoto principu je, že elektrony jsou několikanásobně lehčí než atomová jádra a reagují tak několikanásobně rychleji na případnou poruchu, vyvolanou oscilujícím elektromagnetickým polem. Základní 9

energetický stav má své stabilní rozložení elektronové hustoty, které se při přechodu do vyššího energetického stavu ihned mění. Přechod ze základního energetického stavu do energeticky vyššího stavu molekuly je řádově v rozmezí 10-15 s. Atomová jádra se ale díky své hmotnosti během elektronového přechodu prakticky nehnou ze své původní polohy. Dochází k tzv. vertikálním přechodům, protože jádra reagují až se zpožděním na nové uspořádání elektronové hustoty okolo sebe (Obr. 2) [4]. Na obrázku 2 je také znázorněna fluorescence. Fluorescence je spinově dovolená emise světla z vyšších energetických stavů E n do základního stavu E 0 [4]. Molekuly pigmentů ve světlosběrných anténách vykazují fluorescenci z teplotně rovnovážného stavu E 1. Teplotně rovnovážný stav je určen i vlivem okolí, ve kterém se molekula nachází a reprezentuje ho zpravidla nejnižší vibrační hladina. Často nastává případ, jaký je ukázán na obrázku 2, že dochází k absorpci na vyšší vibrační hladiny stavu E 1. Molekula se tedy nachází ve vyšším energetickém stavu, který má dobu života řádově mnohem kratší než stav charakterizovaný nejnižší vibrační hladinou. Energie odpovídající rozdílu těchto dvou vibračních hladin je téměř okamžitě rozptýlena v podobě tepla do okolí. Tento jev se nazývá vibrační relaxace. Emitovaný foton má potom nižší energii než absorbovaný foton. Ve spektru molekuly tak dochází k tomu, že maximum fluorescenčního pásu je posunuto do červené oblasti vzhledem k maximu absorpčního pásu. Rozdíl energií mezi maximy fluorescenčního a absorpčního pásu se nazývá Stokesův posuv [5]. V případě, že je molekula excitována do vyššího energetického stavu než je stav E 1, dochází až na výjimky k tzv. vnitřní konverzi, nezářivému přechodu mezi tímto stavem a stavem E 1, ze kterého pak dochází k emisi fotonu. Vnitřní konverze je izoenergetický nezářivý přechod mezi dvěma stavy téže multiplicity [4]. Pravděpodobnost nezářivého přechodu mezi dvěma stavy závisí na energetickém rozdílu mezi nimi a na velikosti Franck-Condonova faktoru (rovnice 1. 9). Fluorescence a vnitřní konverze jsou tedy dva konkurenční procesy, které obecně mohou nastat při deexcitaci molekuly. U molekul pigmentů světlosběrných antén dochází zpravidla k vnitřní konverzi z vyšších energetických hladin do stavu E 1, odkud poté dochází k emisi fotonu. 10

Obr. 2 Franck-Condonův princip. Obrázek ukazuje řez potenciálovou hyperplochou dvou energetických stavů. Na vodorovné ose jsou vyneseny souřadnice jader molekuly q. Tento obrázek ilustruje případ, kdy první excitovaný stav E 1 má jiné jaderné souřadnice než stav E 0. Při absorpci fotonu dochází k elektronovému přechodu ze stavu E 0 do stavu E 1. Jádra ale podle Franck-Condonova principu během elektronového přechodu nestihnou zareagovat a dochází tedy k vertikálnímu přechodu (modrá šipka). Na tomto obrázku dochází k přechodu mezi vibrační hladinou v = 0 základního stavu a vibrační hladinou v = 2 stavu E 1, které mají největší překryv vibračních vlnových funkcí. Ty jsou znázorněny barevnou vlnovkou na jednotlivých hladinách a ilustrují tak vibrace jader a jejich amplitudu výskytu, podobně jako u harmonického oscilátoru. Na obrázku je také dobře patrné, že s rostoucí vibrační hladinou se vibrační vlnová funkce blíží klasickému kmitavému pohybu, kdy největší výskyt částice je v tzv. bodech obratu, které jsou v průsečíku potenciálové křivky a vibrační hladiny. Zelená šipka reprezentuje fluorescenci z nejnižší vibrační hladiny stavu E 1. Černá tečkovaná šipka znázorňuje vibrační relaxaci. (zdroj:wikipedie) 2.3.2. Přenos energie Po absorpci fotonu molekulou pigmentu ve světlosběrných anténách dochází k přenosu energie do reakčního centra. Molekula pigmentu, která je excitována světelným zářením, se nazývá donor. Molekula, na kterou je excitační energie přenášena, se nazývá akceptor. Symbolicky tento proces můžeme zapsat: * * D + A D + A (1. 10) Existují tři fyzikální popisy přenosu energie. Mezi molekulami pigmentů světlosběrných antén dochází pouze ke dvěma typům přenosu energie, které fungují na bázi elektrostatického působení mezi jednotlivými molekulami a jedná se o tzv. Försterův a excitonový přenos. Tyto přenosy probíhají na vzdálenosti větší než je velikost molekuly. Ke třetímu typu přenosu energie, tzv. Dexterovu přenosu, dochází až při menší vzdálenosti mezi molekulami, kde je dostatečný překryv vlnových funkcí donoru a akceptoru a může docházet k výměně elektronů mezi jednotlivými molekulami. K Dexterovu typu přenosu ve světlosběrných anténách nedochází. 11

Försterův přenos energie se dobře hodí na popis přenosu energie mezi slaběji vázanými molekulami mezi sebou. Pokud jsou molekuly pigmentů u sebe blíže a pevněji vázané, používá se pro popis přenosu energie excitonový model. V této práci budeme věnovat pozornost Försterovu přenosu. Jedná se o nezářivý isoenergetický děj. Rychlost přenosu energie je možné opět popsat Fermiho zlatým pravidlem (rovnice 1. 4). Poruchou, která působí na akceptor, však v tomto případě není oscilující elektromagnetické pole světelné vlny, ale indukovaný přechodový dipólový moment donoru (rovnice 1. 5). Přechodový dipólový moment donoru může indukovat přechodový dipólový moment akceptoru. V případě, že je přechod u akceptoru dipólově povolený, molekula akceptoru se excituje na úkor deexcitace molekuly donoru. Interakce mezi oběma molekulami se nazývá dipól-dipólová interakce. Konstanta popisující rychlost přenosu energie se dá vyjádřit jako: 6 1 R 0 k ET = (1. 11) τ D r kde τ D je doba života fluorescence donoru za nepřítomnosti akceptoru a r je vzdálenost mezi molekulou donoru a akceptoru. R 0 je označováno jako kritická vzdálenost přenosu, při níž se rychlost přenosu excitační energie rovná rychlosti deaktivace donoru intramolekulárními procesy. Uvádí se také, že ve vzdálenost R 0 dochází k přenosu energie mezi molekulou donoru a akceptoru s 50% úspěšností [3]. Přenosu energie konkurují svou rychlostí ještě další procesy jako již zmíněná fluorescence nebo nezářivé přechody. Rychlosti jednotlivých přechodů mohou ovlivnit průběh a směr přenosu energie ve světlosběrných anténách. Důležitou roli v ovlivnění směru přenosu energie hraje vibrační relaxace. Pokud je rychlost přenosu energie větší než rychlost vibrační relaxace (k ET > k VR ), jedná se o reverzibilní proces přenosu energie, kdy je excitace delokalizována na donoru a akceptoru (Obr. 3A). Pokud je však rychlost přenosu energie menší než vibrační relaxace (k ET < k VR ), jde o ireverzibilní proces přenosu energie a nemůže k němu docházet v případě, že elektronová excitační energie je menší než elektronová excitační energie akceptoru (E D < E A ) (Obr. 3B). Ireverzibilní přenos energie je mnohem častější ve světlosběrných anténách a díky vnitřnímu uspořádání fungují světlosběrné antény jako energetický trychtýř, ve kterém excitační energie putuje po energetickém spádu až do reakčních center (Obr. 4). 12

Obr. 3 Přenos energie donoru (E D ) na akceptor (E A ), A reverzibilní k ET > k VR, E D < E A, B ireverzibilní k ET < k VR, E D > E A. Obr. 4 Princip energetického trychtýře světlosběrných antén. Energie je přenášena od pigmentů, které absorbují v modré oblasti, k pigmentům absorbující na větších vlnových délkách, od nich pak do reakčního centra. 2.4 Chlorosomy Chlorosomy jsou světlosběrné antény přichycené k buněčné membráně zelených fotosyntetických bakterií. Existují dvě čeledi zelených bakterií: zelené sirné bakterie (Chlorobiaceae) a zelené nesirné bakterie (Chloroflexaceae). Přestože patří do skupiny zelených bakterií, mají toho velmi málo společného. Mají odlišná reakční centra, odlišný metabolismus i místo výskytu. Podle porovnání části ribozomální sekvence RNA známé jako 16S rrna, jde o velmi vzdálené linie bakterií, které se ale vyvinuli ze stejného předka. Jejich hlavní společnou charakteristikou je právě přítomnost chlorosomů ve fotosyntetických aparátech. V zelených sirných bakteriích je k chlorosomům připojen ještě protein obsahující bakteriochlorofyl a známý jako Fenna-Matthews-Olson protein (FMO). Chlorosomy obsahují molekuly pigmentů bakteriochlorofylu (BChl) c, d a e, které si jsou strukturně velmi podobné (Obr. 5). BChl c je přítomen v chlorosomech zelených sirných i 13

nesirných bakterií. Zatímco chlorosomy nesirných bakterií jsou tvořeny téměř výhradně BChl c, chlorosomy zelených sirných bakterií jsou tvořeny BChl c, d a e. Každý organismus patřící mezi zelené sirné bakterie obvykle obsahuje mix různých homologů jednoho konkrétního pigmentu. Bakteriochlorofyl c d e R 1 Me H Me R 2 Me Me CHO R 3 Me, Et, npr, Et, npr, ibu Et, npr, ibu ibu neopent neopent R 4 Me, Et Me, Et Et R 5 Stearyl, Farn., jiné Farn., jiné Farn., jiné R nebo S chiralita pro číslování pyrrolového kruhu je použit systém IUPAC Obr. 5 - Strukturní schéma bakteriochlorofylů c, d a e (zdroj: [6]). Existuje několik různých teorií, které vysvětlují uspořádání pigmentů BChl v chlorosomech. V jedné věci se však tyto teorie shodují, a to sice na způsobu, jakým se dvě molekuly pigmentů BChl váží k sobě. Zásadní úlohu v tom hraje 3 1 C OH skupina jedné molekuly BChl, která se naváže koordinační vazbou na centrální atom hořčíku (Mg) druhé molekuly BChl. Skupina 3 1 C OH má zároveň tu schopnost, že může vytvořit vodíkový můstek s vhodnou skupinou jiné molekuly. Vhodnou skupinou je skupina 13 1 C = O. Nyní se teorie rozchází podle toho, jak jsou molekuly uspořádány. Jedna teorie předpokládá syn-anti paralelní uspořádání, druhá tzv. piggy-back antiparalelní uspořádání (Obr. 6 a Obr. 7). BChl má samoorganizační schopnosti a např. za přítomnosti karotenoidů vytváří vrstevnaté BChl agregáty, které jsou uspořádány do zakřivených lamelárních struktur (Obr. 8). 14

Obr. 6 Schematické znázornění piggy-back uspořádání BChl pigmentů v chlorosomech (zdroj:[7]). Obr. 7 Schematické znázornění syn-anti paralelního uspořádání BChl pigmentů v chlorosomech (zdroj: [7]). Obr. 8 Model lamelárního uspořádání BChl agregátů v chlorosomech. Molekuly BChl uvnitř chlorosomů jsou uspořádány v různě pokroucených lamelárních strukturách (zdroj:[8, 9]). 15

Absorbance (a.u.) 2.4.1. Bakteriochlorofylové pigmenty a jejich optické vlastnosti Jednotlivé druhy pigmentů BChl nacházejících se v chlorosomech i jejich uspořádání můžeme od sebe odlišit in vivo i in vitro podle maxim dvou hlavních pásu absorpce. V blízké UV oblasti je to Soretův pás a v červené oblasti pás Q y (Obr. 9). 1,1 1,0 0,9 BChl c BChl d BChl e 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 Obr. 9 Absorpce BChl pigmentů v metanolu. Spektra jsou normována na Soretův pás. Absorpční maxima BChl c: Soretův pás 435 nm, Q y 669 nm; BChl d: Soretův pás 427 nm, Q y 655 nm; BChl e: Soretův pás 470 nm, Q y 655 nm. (zdroj: http://www.bio.ku.dk/nuf/resources/scitab/chlabs/index.htm). Jednotlivé pásy jsou způsobeny charakteristickými optickými přechody vždy mezi dvěma energetickými 1 hladinami, které jsou teoreticky popsány pomocí molekulových orbitalů. Pro fyzikální popis optických přechodů monomerů BChl jsou důležité π-molekulové orbitaly. Aby molekula mohla absorbovat v blízké UV nebo viditelné (VIS) oblasti, je nutné, aby měla dostatečně dlouhý systém konjugovaných dvojných vazeb (vazby π). Díky tomu stačí i méně energetické záření k tomu, aby mohl být elektron excitován na vyšší energetickou hladinu (elektronový přechod). Nejdůležitější π-molekulové orbitaly pro elektronové přechody jsou nejvýše obsazené molekulové orbitaly HOMO (Highest occupied molecular orbital) a nejnižší neobsazené orbitaly LUMO (Lowest unoccupied molecular orbital). Jednotlivé elektronové přechody mají přechodové dipólové momenty s rozdílnou orientací a energií. Absorpční pás Q y v červené oblasti je elektronový přechod s nejmenší energií a jeho polarizace je ve směru molekulové osy y (Obr. 10). To znamená, že k tomuto elektronovému přechodu bude docházet, pokud má vektor oscilujícího elektrického pole složku ve směru molekulové osy y. Absorpční pásy, které vznikají v důsledku B přechodů, se nazývají Soretovy pásy. Soretovy 1 Pro označení jednotlivých energetických hladin se častěji používá písmenka S namísto písmenka E. Toto označení je použito dále v textu. 16

pásy jsou v blízké UV a jejich polarizace je smíšená (Obr. 10). Tyto přechody se projeví ve spektru jako významné absorpční pásy s maximem na charakteristické vlnové délce (Obr. 11). Obr. 10 Čtyřorbitalový model s absorpčními přechody mezi jednotlivými orbitaly. Orbitaly HOMO jsou ve spodní části obrázku; orbitaly LUMO jsou v horní části obrázku. Šipky označují přechody mezi molekulovými orbitaly. Uprostřed vpravo jsou jednotlivé elektronové přechody seřazeny podle energie od nejmenšího po největší (zdroj:[10]). Obr. 11 Elektronové přechody v a spektrum BChl c. Energie elektronových přechodů je přiřazena absorpčním pásům spektra monomerního BChl c (v pravé části obrázku). BChl c byl rozpuštěn v metanolu. 17

V případě kdy se dvě molekuly dostanou k sobě na malou vzdálenost, může docházet k tzv. excitonové interakci. Ta je způsobena dipól-dipólovou interakcí (stejná jako u Försterova přenosu) mezi molekulami dimeru a má za následek rozštěpení excitačních hladin. Vlnová funkce základního stavu dimeru má tvar: G A B (1. 12) První excitovaný singletový stav dimeru může být popsán dvěma ekvivalentními vlnovými funkcemi: 1 A B 2 A B (1. 13) Stacionární stavy dimeru mohou tedy být popsány lineárními kombinacemi těchto dvou stavů: 1 ( 1 2 ) 2 1 ( 1 2 ) 2 (1. 14) Z popisu obou stacionárních stavů vyplývá, že v dimeru není excitována pouze molekula A nebo B, ale že jsou excitovány obě molekuly zároveň. Tento jev je označován jako delokalizace excitace nebo excitonový přenos. Energie příslušející oběma stacionárním excitovaným stavům je dána vztahem: E ± = E m± E (1. 15) kde E m je stacionární energie monomeru a E je interakční energie vzniklá dipól-dipólovou interakcí mezi jednotlivými molekulami dimeru. Interakční energie je dána vztahem podle zákonů klasické elektrostatiky: MAM E = 4πε r B 0 AB (1. 16) kde M A a M B jsou momenty přechodu jednotlivých molekul A a B v dimeru (rovnice 1. 5). O velikosti a smyslu (znaménko) interakční energie rozhoduje velikost a orientace momentů přechodu M A a M B. Momenty přechodů do dvou excitovaných stavů dimeru jsou dány lineární kombinací momentů přechodu molekul A a B: 1 M+ = ( MA + M B) 2 1 M = ( M A M B) (1. 17) 2 18

O dovolenosti přechodů ze základního stavu do excitovaných stavů dimeru rozhoduje prostorové uspořádání molekul v dimeru, tedy vzájemná orientace jejich přechodových momentů M A a M B. Pro zjednodušení popisu budeme uvažovat pouze čtyři případy vzájemné orientace přechodových momentů (Obr. 12). Obr. 12 Schéma čtyř alternativních možností natočení přechodových momentů molekul A a B v dimeru. Obdélníky schematicky znázorňují molekuly pigmentů BChl a šipky uvnitř směry přechodových momentů. Paralelní uspořádání označované jako H-dimer má dvě možnosti, jak mohou být k sobě natočeny přechodové momenty jednotlivých molekul: souhlasné natočení momentů přechodu (A) nebo opačné natočení (B). Uspořádání hlava-ocas nebo také J-dimer má také dvě možnosti, jak mohou být k sobě momenty natočeny (A a B). H-dimer ( paralelní uspořádání) má v případě souhlasného natočení momentů přechodu (Obr. 12 H-DIMER A) energii vyššího excitovaného stavu S 1 danou výrazem: E + = E m+ E (1. 18) A dipólový moment přechodu do tohoto stavu je dán výrazem: Energie nižšího stavu 1 2M M+ = ( MA+ M B) = A (1. 19) 2 2 S 1 je dána výrazem: E = Em E (1. 20) A dipólový moment přechodu do tohoto stavu je dán výrazem: 1 M = ( MA M B) = 0 (1. 21) 2 M A = M B, protože dimer je tvořen dvěma molekulami BChl c. Z rovnice (1. 19) a (1. 21) vyplývá, že přechod do nižší energetické hladiny 19 S 1 je zakázaný, zatímco přechod do vyšší energetické hladiny S 1 je povolený. Často se také uvádí, že se jedná o dipólově zakázaný nebo dipólově povolený přechod, protože moment přechodu je určen pomocí přechodového dipólového momentu dané molekuly (rovnice 1. 5). Při opačném natočení momentů přechodu (Obr. 12 H-DIMER B), je energie vyššího excitovaného stavu S 1 dána výrazem:

E = E ( E ) = E E (1. 22) m m Interakční energie má záporné znaménko, protože směry obou momentů jsou opačné a tedy M A = - M B jeden z momentů musí mít tedy opačné znaménko než druhý. Dipólový moment přechodu do tohoto stavu je dán výrazem: Energie nižšího stavu 1 2M M = ( MA M B) = A (1. 23) 2 2 S 1 je dána výrazem: E = E ( E ) = E E (1. 24) m A dipólový moment přechodu do tohoto stavu je dán výrazem: m 1 M+ = ( MA + M B) = 0 (1. 25) 2 Přechod do nižšího stavu je tedy opět dipólově zakázaný a přechod do vyššího excitovaného stavu je dipólově povolený. Bude tedy docházet k přechodům na vyšší excitovanou energetickou hladinu, která má vyšší energii než první excitovaná hladina monomeru. Ve spektru se tento jev projeví posunem absorpčního pásu dimeru do modré oblasti oproti absorpčnímu pásu monomeru (Obr. 13). Energetický rozdíl mezi první excitovanou hladinou monomeru S1 Energetický rozdíl mezi a vyšší excitovanou hladinou dimeru S 1 a S 1(excitonové štěpení) činí 2E. S 1 je právě excitační energie E. Obr. 13 Schematické znázornění excitonového štěpení H-dimeru. Tento jev se v optickém spektru projeví jako posun maxima absorpčního pásu dimeru do modré oblasti vůči absorpčnímu maximu monomeru (na obrázku vpravo). Dipólově povolený přechod (absorpce) je znázorněn černou šipkou. Dipólově zakázaný přechod je 20

znázorněn černou přerušovanou šipkou. Zelenou přerušovanou šipkou je znázorněna excitonová relaxace a zelenou šipkou fluorescence. Pro určení vlastností J-dimeru (uspořádání hlava-ocas ) bychom postupovali stejně a obdrželi bychom opačný výsledek než u H-dimeru. Dipólově zakázaný je přechod do vyšší hladiny S 1 zatímco přechod do nižší hladiny S 1 je dipólově povolený. Ve spektru se tento jev projeví jako posunutí absorpčního pásu dimeru do červené oblasti oproti absorpčnímu pásu monomeru (Obr. 14). Energetický rozdíl hladin mezi první excitovanou hladinou monomeru S1 a nižší excitovanou hladinou dimeru S 1 je opět E. Energetický rozdíl mezi S 1 a S1 činí 2E. U J-dimeru je excitonové štěpení dvojnásobné oproti excitonovému štěpení u H-dimeru. Obr. 14 - Schematické znázornění excitonového štěpení J-dimeru. Tento jev se v optickém spektru projeví jako posun maxima absorpčního pásu dimeru do červené oblasti vůči absorpčnímu maximu monomeru (na obrázku vpravo). Dipólově povolený přechod (absorpce) je znázorněn černou šipkou. Dipólově zakázaný přechod je znázorněn černou přerušovanou šipkou. Zelenou šipkou je znázorněna fluorescence. V agregátech se nachází v těsné blízkosti více molekul než jen dvě, ale princip excitonového štěpení je stejný jako u dimerů. Dipól-dipólová interakce tentokrát nastává mezi více dipólovými momenty molekul a podle toho dojde k rozštěpení energetické hladiny (Obr. 15). BChl v chlorosomech se nachází pouze ve formě agregátů. Například maximum absorpčního pásu Q y se u BChl c v chlorosomech nachází v intervalu 740-760 nm [2]. Samotný BChl je špatně rozpustný ve vodných roztocích z důvodu nepolárního charakteru způsobeného zejména esterifikujícím alkoholem. Ve vodném prostředí bez přítomnosti jiných látek vytváří dimery. V přítomnosti lipidů nebo karotenoidů vytváří agregáty. Agregace je také prokazatelně ovlivněna délkou esterifikujícího alkoholu BChl, které zvyšují hydrofobní efekt [11]. Důležitou úlohu při tvorbě agregátů v chlorosomech hrají karotenoidy, které navíc ještě plní funkci ochranou. Karotenoidy mají pozitivní vliv na samoorganizaci BChl agregátů a zároveň zhášejí organismu škodlivé tripletní stavy BChl a singletní stavy kyslíku, které vznikají během fotosyntetického procesu. Karotenoidy také absorbují mezi 450 a 550 nm, kde právě BChl příliš neabsorbuje [2]. 21

V nepolárních rozpouštědlech, jako je například metanol, je možné získat roztok BChl v monomerní formě. Rozpouštědla ovlivňují posun absorpčních pásů, který je závislý na polaritě rozpouštědla. Například monomerní BChl c rozpuštěný v metanolu má maximum pásu Q y na 669 nm. Obr. 15 - Schematické znázornění excitonového štěpení v agregátu. V chlorosomech dochází k posunu maxima absorpčního pásu BChl do červené oblasti oproti monomernímu BChl. Nejintenzivnější přechody nastávají tedy do nejnižších excitovaných hladin agregátu. Černá šipka znázorňuje absorpci, zelená fluorescenci, zelená přerušovaná tzv. excitonovou relaxaci. 22

3. Metody a materiály V této práci jsme zkoumali zejména optické vlastnosti různých pigmentů. Nejvhodnější metodou pro takové zkoumání je metoda optické spektroskopie. Optická spektroskopie je neinvazivní experimentální metoda využívající elektromagnetické záření (Obr. 16), které pokrývá široký spektrální obor mezi rentgenovým zářením na jedné straně a mikrovlnným zářením na straně druhé. Elektromagnetické záření je bezdotyková a ve většině případů nedestruktivní sonda, která je ideální pro zkoumání živé přírody [5]. Obr. 16 Elektromagnetické spektrum (zdroj: http://www.tzb-info.cz/t.py?t=2&i=5802). 3.1 Absorpce Absorpční metody patří mezi nejužívanější metody optické spektroskopie. Při průchodu optického záření absorbujícím prostředím dochází ke snižování intenzity záření. K útlumu záření dochází exponenciálně v závislosti na dráze, které záření urazilo v absorbujícím prostředí. Vztah popisující tento jev se nazývá Lambertův zákon: I = I0 e b( v)x (1. 26) kde I 0 je intenzita vstupujícího záření a I je intenzita záření prošlého absorbujícím prostředím vzorku. Veličina b(v) se obvykle nazývá absorpční koeficient a x je dráha, kterou záření urazilo ve vzorku. Ve většině případů platí, že absorpční koeficient je úměrný koncentraci absorbujících molekul ve vzorku. Tato závislost se nazývá Beerův zákon: cε b( v) ( v ) (1. 27) kde ε(v) je molární extinkční koeficient. Dohromady tyto dva vztahy tvoří Lambert-Beerův zákon: c ε( v) x I = I e (1. 28) 0 23

Z praktických důvodů se Lambert-Beerův zákon přepisuje do podoby: I = I 10 0 c ε 10 ( v) x (1. 29) kde ε 10 (v) se nazývá dekadický 2 molární extinkční koeficient. Pro potřeby absorpční spektroskopie se zavadí ještě jedna důležitá veličina tzv. absorbance nebo také optická hustota, která je definována vztahem: A c ε 10( v )x (1. 30) Nejjednodušší metodou určení absorbance je určení transmitance (propustnosti) T vzorku: I T = I 0 (1. 31) Absorbance je pak určena vztahem: A = log T (1. 32) Ve skutečnosti však veličiny I a I 0 není možné přímo určit, protože na stěnách kyvety, ve kterých je vzorek nejčastěji uzavřen, dochází ke ztrátě intenzity záření odrazem. V praxi se proto transmitance měří vzhledem ke slepému vzorku, referenci. Rozdíl intenzity prošlé referencí (například rozpouštědlo bez vzorku) a intenzity prošlé vzorkem v rozpouštědle, je výsledná transmitance měřeného vzorku. Pro měření a určení absorbance jsme využívali spektrometr Specord 250 od firmy Analytic Jena. 3.2 Fluorescenční excitační spektra Fluorescence je spinově dovolený zářivý přechod zpravidla z rovnovážné vibrační hladiny prvního excitovaného stavu S 1. V ojedinělých případech může docházet k fluorescenci i z vyšších nerovnovážných vibračních hladin prvního nebo vyššího excitovaného stavu. Většinou však před emisí fluorescenčního fotonu dochází k vibrační relaxaci nebo vnitřní konverzi do základní vibrační hladiny prvního excitovaného stavu. Tato důležitá zákonitost se označuje jako Kashovo pravidlo (Obr. 2) [5]. Jednou ze základních veličin popisující fluorescenci je kvantový výtěžek. Jedná se o poměr emitovaných fotonů N e a absorbovaných fotonů N a : N = N e a (1. 33) 2 Ve většině případů se slovo dekadický vynechává, přestože by mohlo dojít k zmatení. V praxi se ale téměř vždy používá dekadický molární extinkční koeficient a slovo dekadický se vynechává. 24

Kvantový výtěžek obecně závisí na vlnové délce a často se určuje jako poměr fluorescenčního excitačního spektra a absorpčního spektra. Fluorescenční excitační spektrum je závislost intenzity emise (měřená obvykle v maximu fluorescence) na vlnové délce záření excitující zkoumaný vzorek. Excitační spektra představují také vhodný způsob sledování přenosu energie mezi jednotlivými pigmenty světlosběrných antén. Jestliže je záření absorbováno jedním pigmentem a vyzářeno druhým, je zřejmé, že muselo dojít k přenosu energie. Pro názornost postupu předpokládejme, že pigment A přenáší energii na pigment B, který následně fluoreskuje. Pigment B fluoreskuje také v případě, že je přímo excitován. Při sledování přenosu energie z pigmentu A na pigment B měříme emisi v maximu fluorescence pigmentu B. Vzorek obsahující pigmenty excitujeme zářením na vlnových délkách, kde absorbuje pigment A i B. Naměřené excitační spektrum pak porovnáme s absorpčním spektrem. Absorpční spektrum je ale nutné před porovnáním transformovat na 1 T spektrum, jehož intenzita je přímo úměrná absorbovaným fotonům (rovnice 1. 32). Porovnání obou spekter provedeme tak, že obě spektra normujeme na maximum absorpce pigmentu A. Pro isolovaný pigment B by se absorpční a excitační spektrum překrývalo, protože jediná možnost, kdy molekula může fluoreskovat, je po absorbování fotonu. V případě, že pigment A nepřenáší energii na pigment B, intenzita emise je nulová při excitaci v místě absorpce pigmentu A. V případě, že přenos energie nastává z 80%, je v místě absorpce pigmentu A intenzita emise 80% vzhledem k intenzitě 1 T spektra v místě absorpce pigmentu A. Tímto způsobem je možné kvantitativně vyhodnotit účinnost přenosu z jednoho pigmentu na druhý (Obr. 17). Obr. 17 Schematické znázornění porovnání 1 T spektra (nepřerušovaná čára) s fluorescenčními excitačními spektry (přerušované čáry) reprezentující různou účinnost přenosu energie z pigmentu A na pigment B. Maximum absorpce pigmentu A je označeno písmenem A a maximum absorpce pigmentu B písmenem B. Spektra jsou normována na absorpční maximum pigmentu B. Měření fluorescenční excitačních spekter a následné porovnání s 1 T spektrem je tedy ideální způsob, jak studovat účinnost přenosu energie v umělé dvousložkové světlosběrné anténě. 25

Pro zjištění emisního maxima fluorescenčního spektra světlosběrné antény jsme měřili emisní spektra. Emisní spektra jsou měřená tak, že se vzorek excituje v oblasti absorpce pigmentu, na který se přenáší energie, a sleduje se emise v závislosti na vlnové délce. Excitační spektra byla měřena tak, že se emisní monochromátor nastavil na vlnovou délku poblíž maxima fluorescence a excitační monochromátor skenoval oblast absorpce vzorku. Emisní spektra byla měřena opačným způsobem. Excitační monochromátor byl pevně nastaven na vlnovou délku a emisním monochromátorem se skenovala oblast fluorescence vzorku. V oblasti VIS a UV je ale nutné ještě brát v úvahu, že luminiscenční aparatura je složena z dílů, které způsobují, že spektrální citlivost celé aparatury je proměnná. Selektivní spektrální citlivost je u fotonásobičů dána především chemickým složením fotokatody. Propustnost záření spektrálními zařízeními (monochromátory) je rovněž selektivní. Z těchto důvodů nejsou naměřené spektrální charakteristiky úměrné skutečnému zářivému výkonu, který je vzorkem emitován a proto je potřeba provádět korekce na tyto vlivy. Fluorescenční spektra jsme měřili na spektrofluorimetrech Fluoromax 2 a Fluoromax 3 od firmy Jobin-Yvon. Excitační fluorescenční spektra byla měřena vždy na Fluoromaxu 3. Oba spektrofluorimetry mají pro korekci čistého signálu při měření excitačních spekter referenční diodu (Obr. 18), která koriguje spektrální průběh lampy z 95 % přesností (podle manuálu). Pro korekci spektrální citlivosti fotonásobiče, který detekuje emisi, jsou spektrofluorimetry vybaveny korekčním souborem dodaným se zařízením. Obr. 18 Schematické uspořádání spektrofluorimetru. 26

3.3 Pigmenty a agregáty Pro přípravu dvousložkové antény na bázi BChl jsme použili pigment bakteriochlorofyl c (BChl c) a modifikovanou molekulu azulenu (Obr. 19). Azulen byl získán z Institute for Nanotechnology, Forschungszentrum, Karlsruhe pod názvem azulen STB-VH-022-02 3. Azulen je dobře rozpustný v některých nepolárních rozpouštědlech jako je aceton, hexan nebo tetrahydrofuran (THF). Při přípravě agregátů jsme azulen rozpouštěli v THF, protože se dobře mísí s vodou. Molekulární váha azulenu je M a = 232,33 g.mol -1. H 3 C CH 3 Obr. 19 Strukturní vzorec azulenu použitého při přípravě dvousložkové antény. Azulen byl použit za účelem vylepšení absorpce agregátů v oblasti, kde právě BChl c téměř neabsorbuje, to je přibližně v rozmezí zelené části (cca. 550 600 nm) viditelného spektra (VIS). Tento záměr se úplně nezdařil. Azulen vykazuje absorpční pás s maximem v této oblasti, ale jeho extinkční koeficient je malý. V blízké UV oblasti na 300 nm má však velmi silný absorpční pás (Graf 1). 3 Dále jen azulen 27

Absorbance [OD] 0,25 0,20 4,0x10-3 0,15 2,0x10-3 0,10 0,05 0,0 400 500 600 700 0,00 300 400 500 600 700 800 900 Graf 1 Absorpční spektrum azulenu v THF. Měřeno v 1 mm kyvetě 101x zředěné v THF. Druhou složkou připravené dvousložkové antény je BChl c (Obr. 5). Jak už bylo zmíněno (kap. 2.4.1) BChl c v přítomnosti lipidů nebo karotenoidů vytváří agregáty. Podařilo se nám prokázat, že agregáty je možné vytvořit i smícháním BChl c s azulenem (touto problematikou jsem se zabýval ve své bakalářské práci). V nepolárních rozpouštědlech je možné získat roztok BChl c v monomerní formě. Pro získání zásobního roztoku monomerního BChl c bylo potřeba zvolit takové rozpouštědlo, které je dobře mísitelné s vodou. Proto jako nepolární rozpouštědlo byl zvolen metanol. BChl c byl nejdříve rozpuštěn v metanolu a poté byl s roztokem azulenu v THF přidán do pufru, kde došlo k agregaci. Jako pufr byl použit 50 mm Tris-HCl ph 8.0. Pro rozlišení mezi roztokem monomerů, dimerů a agregátů BChl c byla použita metoda optické absorpční spektroskopie, protože jednotlivé formy BChl c mají dobře pozorovatelné rozdílné spektrální vlastnosti. Spektrální vlastnosti BChl c jsou závislé i na druhu rozpouštědla, v jakém se nacházejí, mění se především s polaritou rozpouštědla. U agregátů BChl c s azulenem dochází k výraznému posuvu pásu Q y do červené oblasti spektra oproti spektru monomerů a dimerů BChl c (Graf 2). Posun pásu Q y je závislý na množství přidaného pigmentu azulenu. K agregaci a posunu pásu Q y dochází až od určitého stechiometrického poměru azulenu a BChl c. Po dosažení určitého poměru už naopak k dalšímu posuvu pásu Q y nedochází. 28

Absorbance (a.u.) 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 400 500 600 700 800 900 Graf 2 Absorpční spektra BChl c v různých formách. Monomery BChl c v acetonu s maximem Q y na 668 nm (černě). Dimery v pufru (červeně) s maximem pásu Q y na 712 nm. Agregáty BChl c s azulenem v pufru (modře) s maximem pásu Q y na 741 nm. Normováno na maximum Soretova pásu. 29

4. Výsledky BChl c s azulenem jsme potřebovali připravit ve stechiometrickém poměru, ve kterém už azulen bezpečně indukuje agregaci. Je zřejmé, že stechiometrický poměr 1 : 1 (azulen : BChl c) splňuje dobře tuto podmínku (jak vyplývá z experimentů v mé bakalářské práci). Vyšší poměr azulenu vůči BChl c více indukuje agregaci, takže stechiometrický poměr 1 : 1 jsme stanovili jako minimální mez pro přípravu agregátů. Před smícháním pigmentu azulenu s BChl c, byly připraveny tzv. zásobní roztoky obou pigmentů rozpuštěných v nepolárních rozpouštědlech. Azulen byl rozpuštěn v THF a BChl c v metanolu. Následně musely být určeny velikosti objemů, ve kterých bylo nutné oba roztoky pigmentů smíchat, abychom dosáhli požadovaného stechiometrického poměru. Předpokládali jsme, že se extinkční koeficient pigmentů v agregátech a v zásobních roztocích nemění. V případě stechiometrického poměru 1 : 1 (azulen : BChl c) by měly být hodnoty absorbance na určité vlnové délce azulenu a BChl c ve stejném poměru, tedy 1 : 1. Hodnotu absorbance u azulenu jsme určovali v maximu absorpčního pásu na 300 nm a u BChl c v maximu pásu Q y na 669 nm. Z poměru těchto hodnot, jsme přímo určili velikosti objemů roztoků pigmentů, ve kterých jsme je následně smíchali. Při určování velikost objemů roztoků obou pigmentů, bylo žádoucí, aby množství rozpouštědla, ve kterých jsou pigmenty rozpuštěny, nepřesáhlo v pufru 1 %. Výsledný roztok jsme přidali do 3 ml pufru, takže smíchané objemy roztoků obou pigmentů nepřesahovali 30 μl. Později se nám podařilo určit extinkční koeficient azulenu v THF a bylo tedy možné zpětně určit přesný poměr, v jakém byly oba pigmenty smíchány. Navážený azulen byl rozpuštěn v přesně definovaném množství THF a byla určena koncentrace c = 11,5 mm roztoku azulenu. Pomocí rovnice (1. 29) byla určena závislost extinkčního koeficientu na vlnové délce (Graf 3). Relativní chybu určení extinkčního koeficientu jsme odhadli z chyby vážení a pipetování na 15 %. Pro vážení azulenu bylo použito váhy Kern. Extinkční koeficient azulenu na 300 nm je ε a = 33456 (M.cm) -1 a extinkční koeficient BChl c na 669 nm je ε b = 70 000 (M.cm) -1 [12]. Pomocí rovnice (1. 29) byl stechiometrický poměr azulenu : BChl c určen na 2 : 1 po zaokrouhlení. Tento stechiometrický poměr je vyšší než původně požadovaný stechiometrický poměr 1 : 1, který byl stanoven jako minimální mez pro přípravu agregátů. Agregáty se tímto způsobem podařilo připravit a proměřit jejich absorpční spektrum. Maximum pásu Q y ihned po přípravě bylo na 737 nm. Po 3 hodinách se maximum pásu Q y přesunulo na 741 nm, kde už zůstalo. Agregáty byly potom několikrát s různými časovými odstupy proměřovány (Graf 4). 30