KLASICKÉ A MOLEKULÁRN RNÍ METODY V KLINICKÉ A ONKOLOGICKÉ CYTOGENETICE. Zuzana Zemanová CENTRUM NÁDOROVN DOROVÉ CYTOGENETIKY Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK PRAHA

CYTOGENETIKA velmi úzce specializovaná vědecká disciplína zabývá se studiem struktury, funkce a evoluce chromosomů a jejich chováním m v průběhu dělend lení zárodečných i somatických buněk sleduje změny a nepravidelnosti těchto procesů, které vedou ke vzniku početn etních a strukturních odchylek chromosomů v buněč ěčných jádrechj

Základní mezníky v rozvoji lidské cytogenetiky: Stanovení přesného počtu lidských chromosomů - 1956 První popsaný syndrom spojený s trisomií chromosomu 21-1959 První popsaná specifická chromosomová aberace u nádorového onemocnění (CML, Ph-chromosom) - 1960 Pruhovací techniky barvení chromosomů - 1968 aža 1970 Molekulárn rní cytogenetika a rozvoj metody fluorescenční in situ hybridizace (FISH) - 1988

Cytogenetické vyšet etření: Klinická cytogenetika stanovení karyotypu nemocných s vrozenými vývojovými vadami, geneticky podmíněnými nými syndromy apod. Prenetáln lní diagnostika určen ení chromosomové výbavy plodů In vitro fertilizace vyšet etření oocytů,, spermií, blastomer a blastocyst Nádorová cytogenetika zpřesn esnění diagnózy a určen ení prognózy některých n nádorových n onemocnění Laboratoře e hygienické služby - testování mutagenních účinků chemických látek l na lidský organismus na úrovni chromosomů; radiační cytogenetika.

VYŠET ETŘOVANÉ TKÁNĚ: lymfocyty periferní krve buňky plodové vody buňky choriových klků buňky placenty periferní krev plodu kožní fibroblasty buňky vyšet etřovaných orgánů buňky kostní dřeně buňky solidních nádorn dorů

analýza chromosomů - ve světeln telném m mikroskopu - mitosa - buněč ěčné dělení - stadium metafáze

Somatická buňka: Diploidní sada chromosomů: 22 párůp autosomů 2 pohlavní chromosomy muž 46,XY žena 46,XX Chromosomové aberace: odchylky v počtu nebo struktuře e chromosomů (vrozené x získanz skané)

Chromosomové aberace: heterochromosomové x autosomové I. Vrozené (konstituční) odchylky jsou základem z při p vzniku chromosomáln lně podmíněných ných klinických syndromů (např. Downův syndrom); obvykle jsou přítomny ve všech v buňkách těla. t II. ZískanZ skané odchylky chromosomů nádorových buňkách; mají klonáln lní (postihují jen určit ité buněč ěčné klony). nalézáme v charakter

CHROMOSOMOVÉ ABERACE I. NUMERICKÉ ODCHYLKY - aneuploidie zmnožen ení jednotlivých chromosomů - např.. trisomie apod. (n+1) ztráta ta jednotlivých chromosomů - monosomie (n-1)

CHROMOSOMOVÉ ABERACE I. NUMERICKÉ ODCHYLKY - euploidie = početn etní změny, které postihují celou chromosomovou sadu (triploidie, tetraploidie apod.)

CHROMOSOMOVÉ ABERACE II. STRUKTURNÍ PŘESTAVBY translokace reciproká nereciproká inserce delece inverse

KLINICKÁ CYTOGENETIKA stanovení karyotypu nemocných s vrozenými vývojovými vadami stanovení karyotypu nemocných s genetickýmy podmíněnými nými syndromy poruchy fertility určen ení chromosomové výbavy plodů - prenatáln lní diagnostika

NÁDOROVÁ CYTOGENETIKA Zabývá se studiem získaných z chromosomových změn v buňkách benigních a maligních tumorů. V současn asné době byly u většiny v lidských neoplasií prokázány buňky se strukturními či i početn etními změnami karyotypu. Většinu studovaných lidských neoplasií představují hemoblastozy. Teprve v posledních letech se objevují i výsledky vyšet etření buněk k solidních nádorn dorů u většív ších souborů nemocných.

I. NÁHODNN HODNÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE V NÁDOROVÝCH BUŇKÁCH: postihují náhodně kterýkoliv chromosom nádorovn dorové buňky objevují se náhodnn hodně u různých r nemocných s různými r diagnosami II. NENÁHODN HODNÉ - SPECIFICKÉ vyskytují se u určitých konkrétn tních typů nádorů mohou se podílet na vzniku a vývoji nádorun slouží jako nezávislý diagnostický a prognostický ukazetel

CHROMOSOMOVÉ ABERACE: I. ZTRÁTA TA GENETICKÉHO MATERIÁLU monosomie, delece II. ZMNOŽEN ENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU trisomie, tetrasomie atd. duplifikace,, amplifikace triploidie,, tetraploidie atd. III. PŘEMÍSTĚNÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU translokace (reciproké,, nereciproké) inverse, inserce atd.

Konvenční cytogenetická analýza v onkohematologii: V dnešní době je nezbytnou součást stí vyšet etření nemocných s hemoblastozami. Potvrzení diagnózy Stanovení prognózy Monitorování úspěšnosti léčbyl potvrzení remise včasný záchyt z relapsu Monitorování úspěšnosti transplantace buněk k kostní dřeně (dárci opačného pohlaví,, markery, chromosomové polymorfismy)

METODY: KONVENČNÍ CYTOGENETICKÁ ANALÝZA: kultivace buněk k a zpracování buněč ěčných kultur (např.. lymfocyty periferní krve 72h, buňky kostní dřeně 24h atd.) barvení chromosomů - do r.1969 Giemsovo barvivo nebo orcein od r.1970 pruhování chromosomů - různé techniky (nejčast astěji tzv. G-pruhy; G dále d R-pruhy, R C-pruhy C atd.) vyhodnocení chromosomových aberací aberací podle ISCN nomenklatury (1995), standardizované zápisy MOLEKULÁRN RNĚ CYTOGENETICKÉ METODY (FISH)

1 Ph

Pruhování chromosomů: závisí na spiralizaci a stupni kondenzace chromosomů profáze - až 2000 pruhů, prometafáze - 850 pruhů, metafáze - 400 až 450 pruhů na haploidní sadu (1 pruh = 5 aža 10 Mb DNA)

International Standardization and Cytogenetic Nomenclature ISCN

p q 6

barvení krev, kostní dřeň medium kolchicin hypotonie fixace preparace inkubace při 37 C Postup při kultivaci a přípravě preparátů k cytogenetickému vyšetření

POČÍTA TAČOVÁ ANALÝZA OBRAZU - IKAROS

46,XX,t(9;22)(q34;q11)

Adenokarcinom pankreatu 38,X,-Y,del(2)(q33q35),der(6)r(6)(p25q21)ins(6;?)(q13;?),add(8)(p11),der(9)t(9;17)(p11;q11),der(10)t(10;17)(p11;q11),- 13,der(14;22)(q10;q10),-15,-17,-18,der(19;21)(q10;q10)del(19)(q13),-21/37,idem,-der(6)r(6)ins(6;?)/37-39,idem,del(1) (q11)/35-38,idem,add(7)(q32)/38,idem,del(7)(q32)/38,idem,dup(11)(q13q23)/38-39,idem,der(x)t(x;7)(p22;p11),der(6) t(6;19)(p21;q13),-7,der(7)t(6;7)(p21;q36),-der(14;22),+r1,+mar1/38-39,idem,der(7)del(7)(q32)ins(7;7)(q32;q11q22) ins(7;7)(q22;q11q32)ins(7;7)(q32;q32q22)t(7;?)(q22;?)t(?;19)(?;q11)/37-38,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),der(7)/39-40,idem, i(5)(p10),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+der(16)t(5;16)(q22;q13),+add(17)(p11),-20/38,idem,-der(10)t(10;17),+der(17;20) (q10;q10),+der(18)t(10;18)(q11;q11),-20/38,idem,-der(10)t(10;17),-der(14;22),+der(14;22)add(22)(q13),+der(17;20), +der(18)t(10;18),-20/40,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?)(q13;?),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+12,+add(17)(p13),-20, der(22)t(20;22)(q11;p11),+mar2/40,idem,-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?),-der(10)t(10;17),+i(10)(q10),+12,+der(17) r(17;?) (p13q25;?),-20,der(22)t(20;22),+mar2/39-40,idem,inv(4)(p11q27),-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?), der(10)t(10;17),+i(10) (q10),+12,+der(17)r(17;?),-20,der(22)t(20;22),+mar2/39,idem,der(3)r(3;?),-der(6)r(6)ins(6;?),+ins(6;?),-der(10)t(10;17), +i(10)(q10),+der(17;20),-20,+mar2/76-77,idemx2/73-75,idemx2,der(x)t(x;7)x2,der(6)t(6;19)x2,-7,-7,der(7)t(6;7)x2,- der(14;22)x2,+r1x2/73-76,idemx2,der(7)x2/73-74,idemx2,der(7)x2,-der(6)r(6)ins(6;?)/78-80,idemx2,-der(6)r(6)ins (6;?)x2,+ins(6;?)x2,-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10)x2,+12,+12,+add(17)(p13)x2,-20,-20,der(22)t(20;22)x2,+mar2x2/79-80,idemx2,-der(6)r(6)ins(6;?)x2,+ins(6;?)x2,-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10)x2,+12,+12,+der(17)r(17;?)x2,-20,-20,der(22) t(20;22)x2,+mar2x2/66-74,idemx2,-1,del(4)(q21),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22),+add (17)(p11)x2/72-74,idemx2,-1,del(4),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22)x2, +i(14)(q10)/73-74,idemx2,-1,del(4),-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+i(10)(q10),-der(14;22),+i(17)(q10)/72-73,idemx2,-1,-der(6) r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+der(10)t(10;19)(p11;q11),-der(14;22)/69-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10) t(10;17)x2,+der(10)t(10;19),-der(14;22),t(16;17)(q24;q21)/72-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2, +der(10)t(10;19),-der(14;22),+mar3,+mar4/72-73,idemx2,-1,-der(6)r(6)ins(6;?),-der(10)t(10;17)x2,+der(10)t(10;19),- der(14;22)x2,+i(14)(q10)/150-300,idemx4-8/150-200,idemx4-5,del(4),-der(10)t(10;17)x4-5,+i(10)(q10)x2-3,-der(14;22) x4-5,+i(14)(q10)x2-3/160-400,idemx4-10,der(7) del(7)(q32)ins(7;7)(q32;q11q22)ins(7;7)(q22;q11q32)ins(7;7)(q32;q32 q22)t(7;?)(q22;?)t(?;19)(?;q11) x4-10/158-300,idemx4-8,-der(6)r(6)ins(6;?)x4-8,+ins(6;?)x4-8,-der(10) t(10;17)x4-8, +i(10)(q10) -x4-8,+12,+12,+12,+12,+12,+12,+add(17)(p13)x2-4,+der(17)r(17;?)x2-4,-20,der(22)t(20;22)x4-8,+mar2x4-8/150-400,idemx4-10,-der(10)t(10;17)x4-10,+der(10)t(10;19)x2-5,-der(14;22)x2-5,+t(16;17)x2-5,+mar3x2-5,+mar4x2-5 Gorunova et al., Genes Chromosomes Cancer 26:312-321, 1999

VÝHODY KONVENČNÍ CYTOGENETICKÉ ANALÝZY: Umožň žňuje během b jednoho experimentu analyzovat celý genom Přispěla k identifikaci většiny v genů zahrnutých ve specifických přestavbp estavbách

LIMITY KONVENČNÍ CYTOGENETICKÉ ANALÝZY: Technické faktory (rozložen ení mitose, kvalita pruhování) Nízký mitotický index chromosomů v Kryptické buněč ěčné klony (patologické buňky se v kultivaci často nedělí) Kryptické translokace a inserce, subtilní přestavby Komplexní přestavby

Metody molekulárn rní cytogenetiky: Radioaktivní in situ hybridizace (ISH) od roku 1969 Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)( 1986 jednobarevná / dvoubarevná Mnohobarevná FISH (Nederlof et al.) - 1989 Komparativní genomová hybridizace (CGH)( - 1992 24 barevná FISH (mfish,( SKY ) - 1996 Mnohobarevné pruhování s vysokou resoluční schopností (mband) - 1998 MICROCHIPS, MICROARRAYS - 1998

FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE (FISH) velmi citlivá molekulárn rně-cytogenetická metoda umožň žňuje hodnotit karyotyp a detekovat numerické a strukturní chromosomové odchylky v buňkách v mitose i v nedělících ch se interfásn sních jádrech doplňuje a upřes esňuje výsledky získanz skané konvenční cytogenetickou analýzou

FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE (FISH) METAFÁZE INTERFÁZE

FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE (FISH) Cytogenetický preparát Dvouřetězcová značená DNA Denaturace buněčné DNA fixované na cytogenetickém preparátu Denaturace DNA sondy Hybridizace DNA sondy ke komplementárním úsekům cílové DNA fixované na cytogenetickém preparátu Analýza fluorescenčních signálů ve fluorescenčním mikroskopu

MOŽNOSTI APLIKACE FISH Různé biologické materiály: histologické řezy tkáňov ové preparáty (různ zně zpracované kultivované i nekultivované buňky) izolovaná buněč ěčná jádra chromosomové preparáty

FISH V ONKOCYTOGENETICE Diagnostika leukemií a preleukemií: detekce početn etních a strukturních odchylek určen ení původu marker chromosomů monitorování účinků terapie detekce residuáln lních leukemických buněk k po terapii určen ení původu buněk k po transplantaci kostní dřeně Diagnostika solidních nádorn dorů

DNA sondy pro FISH Centromerické sondy Telomerické sondy Malovací sondy pro celé chromosomy (wcp) nebo jejich části (pcp) Lokus specifické sondy Mnohobarevné malovací sondy

Sondy pro specifické chromosomové struktury: α-satelitní DNA - centromery Stanovení numerických odchylek, ověř ěření původu centromer marker- chromosomů,, určen ení původu buněk k po TKD od dárcd rců opačného pohlaví metafáze x interfáze

CENTRUM CENTRUM NÁDOROVÉ NÁDOROVN DOROVÉ CYTOGENETIKY CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN A a 1.LF UK Praha

UroVysion Abbott Vysis

TELOMERICKÉ / SUBTELOMERICKÉ SONDY

TELOMERICKÉ SONDY

SUBTELOMERICKÉ SONDY

Sondy pro jedinečné genové sekvence: tzv. lokus-specifick specifické sondy Mapování polohy genů na chromosomech, detekce strukturních přestavebp metafáze x interfáze

Lokus-specifick specifické sondy detekce strukturních přestavebp translokací inzercí amplifikací delecí inverzí

TRANSLOKACE

Ph-chromosom ASS locus ABL locus

LSI BCR/ABL ES Dual Color Translocation Probe

CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha

MLL - 11q23

TRANSLOKACE

DELECE

DELECE

DELECE

INVERZE

AMPLIFIKACE

Sondy pro mnohočetn etné chromosomové sekvence (tzv. malovací sondy): obsahují sekvence z celých chromosomů nebo jejich částí (parciáln lní sondy) Určov ování strukturních přestaveb p (translokace a delece většív šího rozsahu), identifikace původu p marker-chromosom chromosomů pouze metafáze

CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha

VÝHODY FISH: Relativně rychlý proces Detekce specifických aberací Vysoká specifita a citlivost Interfázick zická FISH Detekce delecí spojených se vznikem fúzních genů Automatické systémy pro analýzu obrazu z fluorescenčního mikroskopu

LIMITY KLASICKÉ JEDNOBAREVNÉ A DVOUBAREVNÉ FISH: Umožň žňuje sledovat jen omezený počet cílových c sekvencí fixovaných na preparátu Neposkytuje informace o celém genomu Závisí na dostupnosti DNA sond Umožnňuje detekci pouze omezeného počtu specifických aberací

VÍCEBAREVNÁ FISH

Princip kombinatoriáln lního značen ení:

mnohobarevná FISH (mfish):( simultánn nní použit ití nejméně tří různých fluorochromů ke specifickému značen ení DNA sond (kromě DAPI) První úspěšný mfish experiment: Nederlof P.M., Robinson D., Abuknesha R., Wiegant J., Hopman A.H., Tanke H.J., Raap A.K.: Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry 10: 20-27, 27, 1989. Amino methyl coumarin acetic acid AMCA Tetramethylrhodamine isothiocyanate TRITC Fluoresceine isithiocyanate - FITC

Princip kombinatoriáln lního značen ení:

mfish CENTRUM NÁDOROVN DOROVÉ CYTOGENETIKY, III. INTERNÍ KLINIKA VFN A 1.LF UK

Kombinatoriáln lní značen ení: smích cháním n fluorochromů získáme 2 n -1 různých barevných kombinací

FLUOROCHROMY PRO mfish: DIETHYLAMINOKUMARIN (DEAC, NEN Life Science Products) SPECTRUM ORANGE (VYSIS) TEXAS RED (Molecular Probes) ALEXA 488 (Molecular Probes) CY 5 (Amersham Life Sciences) DAPI (4,6 diamidino 2-phenylindol)

Y color X

47,XY,+X,t(1;5),t(3;6),t(9;22)

45,X,-X,t(3;11),del(5)(q13q33),der(10)t(X;10),del(10)(q),der(17)t(X;10 X,t(3;11),del(5)(q13q33),der(10)t(X;10),del(10)(q),der(17)t(X;10;17) ;17)

CEN mfish

Tel mfish Figures by Dr. L. Kearney, Oxford/ London, UK

LSI mfish

mband

Labeling scheme of chromosome 5:

mband

CENTRUM NÁDOROVÉ CYTOGENETIKY ÚKBLD, VFN a 1.LF UK Praha

inv(11)(p11.2q13.3)

dup p15 MLL p15 MLL 4 11 18 der(4)t(4;11) der(18)t(11;18) der(11)t(4;11)

KOMPARATIVNÍ GENOMOVÁ HYBRIDIZACE (CGH) Kohybridizace na cytogenetický preparát s normálními chromosomy Celková genomová DNA z testovaných buněk Celková genomová DNA z normálních buněk Detekce a vizualizace Buňky s normálním karyotypem Buňky s amplifikací nebo polysomií Buňky s delecí nebo monosomií

MICROCHIPS

Array CGH

VÝHODY MOLEKULÁRN RNĚ- CYTOGENETICKÝCH METOD: Umožň žňují hodnocení i velmi nekvalitních mitos, které jsou jinak pro cytogenetickou analýzu nevhodné. Poskytují informace i z nedělících ch se nebo termináln lně diferencovaných buněk. Výrazně zkracují dobu nutnou k získání a interpretaci výsledků. Metody FISH tak významně přispívají ke zpřesn esnění cytogenetického nálezu n a ke zlepšen ení a zrychlení diagnostiky a případnp padně léčby nemocných s různými r typy geneticky podmíněných ných onemocnění.